CN112697898B - 液质联用快速测定尿液或细胞培养基中稻曲菌素a含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析化学领域，具体公开了液质联用快速测定尿液或细胞培养基中稻曲菌素A含量的方法，包括如下步骤：（1）样品预处理；（2）色谱‑质谱检测。本发明针对尿液及培养基样品中UA残留分析问题，采用HLB柱净化去除无机盐、非极性或碱性小分子等共存组分后，低比例甲醇水洗脱液再经过WAX柱富集净化，最终借助超高效液相色谱‑三重四级杆质谱联用技术成功消除样品检测时的基质效应，首次实现尿液及培养基中UA的高灵敏检测。该方法具有重新性好、灵敏度低等优点，稻曲菌素A的定量限低至50 ng/L，可以满足对尿液及细胞培养基中稻曲菌素的定量检测要求。

Description

液质联用快速测定尿液或细胞培养基中稻曲菌素A含量的 方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种尿液或细胞培养基中稻曲菌素A的检测方法。

背景技术

真菌毒素是一类由真菌产生的具有生物活性的次生代谢产物，在多种环境和生物介质中频繁检出，常被我国和欧洲食品安全局、世界卫生组织和美国食品药品监督局等国际组织及机构列为优先控制污染物。近年来，由于稻曲病(Rice False Smut)在美洲、亚洲和欧洲等水稻主产区的大面积爆发，其主要次生代谢产物-稻曲菌素(Ustiloxins)受到广泛关注。研究发现，稻曲菌素是一类有效的微管蛋白聚合抑制剂，能抑制细胞增殖甚至导致细胞凋亡，且可引起家禽肝、肾等器官病变，甚至个体死亡。水溶性稻曲菌素在水稻生长过程中很容易从稻曲球中直接迁移到稻田地表水、土壤等稻田介质中，还存在向水稻植株特别是稻谷中迁移并蓄积的隐患。作为全球水稻生产和消费的主要国家，我国可能存在大量的稻曲菌素暴露人群。目前，关于稻曲菌素在生物体内的富集情况仍是一片空白。选择性监测尿液及细胞培养基中稻曲菌素的残留情况对开展稻曲菌素在生物体如人、小鼠、细胞等中的吸收、代谢及排除动力学至关重要。因此，开发尿液或细胞培养基中稻曲菌素的分析方法对开展人体暴露水平及暴露风险评估具有重要意义。

稻曲菌素A(Ustiloxin A，UA)是现有已鉴别的6种稻曲菌素中最具代表性和毒性最强的毒素(占总量80％以上)。液相色谱-质谱联用分析法(LC-MS)由于分析技术具有高灵敏度高、高特异性等特点，目前在真菌毒素的研究等领域广受关注。虽然已有关于稻曲菌素的文献报道，但均集中在发病稻谷或稻曲球等基质干扰相对简单且含量较高的样品的含量分析。目前，针对尿液、细胞培养基等基质中稻曲菌素的残留分析尚未见报道。尿液样本成分相对复杂，含高浓度潜在干扰物质，例如钠、钾等无机离子，柠檬酸、阿魏酸、二甲基戊酸等有机弱酸、磷酸胆碱、马尿酸、氨基酸等大极性两性化合物。常规细胞培养基中也含有维生素、氨基酸、无机盐、蛋白质等易造成基质效应的干扰物。采用液质联用技术分析上述样品中大极性有机弱酸或弱碱化合物时，基质效应尤其突出，往往要求高倍数稀释待测样品提取液。因此，现有文献报道的分析方法无法实现尿液及培养基中UA的高灵敏度检测。

发明内容

针对现有的技术问题，本发明旨在提供一种液质联用测定尿液样本及细胞培养基中稻曲菌素A的方法，待测样品通过合适的前处理后消除有机酸、无机盐及蛋白质等杂质在的基质抑制效应，实现样品中UA的快速、准确、高灵敏检测。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

尿液或细胞培养基中稻曲菌素A的液质联用检测方法，包括下述步骤：

(1)样品预处理：

(a)量取尿液或细胞培养基样本，加入等体积二氯甲烷溶液涡旋，高速离心，保留上清液待净化；

(b)用含0.1％-5％(体积分数)甲酸的0.2M乙酸铵溶液稀释步骤(a)的待净化液，待净化液与乙酸铵溶液的比例为1:1～1:5(V/V)，稀释后的待净化液通过提前活化的HLB小柱，小柱用0-4mL含体积分数为0.1-0.5％甲酸的0.05-0.5M乙酸铵溶液淋洗一次，弃去淋洗液；真空泵抽干；然后采用2-4mL 20-90％甲醇-水溶液洗脱，收集洗脱液；

HLB柱活化条件为：依次量取1-4mL甲醇、1-4mL含有0.1％-5％(体积分数)甲酸的0.05-0.5M乙酸铵溶液缓冲液通过HLB柱；

(c)将步骤(b)所得的待净化液用氨水溶液调节pH至4-6并通过提前活化的WAX柱，并依次采用1-4mL pH＝4-6甲酸溶液、1-4mL甲醇溶液、1-4mL含0.01％-0.5％(体积分数)甲酸的甲醇溶液淋洗小柱，弃去淋洗液，真空泵抽干；最后用1-4mL0.5-5％的氨化甲醇(V/V)溶液洗脱；所得洗脱液氮气吹干后用0-10％甲醇-水溶液复溶，高速离心，将上清液转移至内插管中用于LC-MS/MS检测；

WAX活化条件为：依次量取2-4mL甲醇、2-4mLpH＝4-6甲酸水溶液通过WAX柱；

(2)LC-MS/MS测定样品中稻曲菌素的含量：

液相色谱采用ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm,1.8μm)色谱柱，流动相为甲醇(A)和0.01％-0.1％甲酸水(B)；柱温为30-45℃；进样体积为1-5μL；流速为0.2-0.45mL/min。流动相采用LC-MS级甲醇(A)和0.01％甲酸-水(B)，运行梯度为0-0.5min,5-20％A；0.5-7min,20％-40％A；7-9min,40-98％A；9-12min,98-100％A；12-15min,5-20％A；

LC-MS/MS检测条件为：WatersACQUITY

H-Plus(UHPLC)超高效液相色谱串联

TQ-XS三重四级杆质谱(Milford,MA,USA)进行检测；其中，质谱采用电喷雾(ESI+)离子源，多反应监测(MRM)模式检测扫描目标分析物。

质谱条件：离子源为ESI(+)，毛细管电压为1.0KV，脱溶剂温度为300℃，锥孔电压为30V，脱溶剂流速和碰撞气流速分别为600和150L/h；多级反应监测。

以上所述的方法中，优选的，UA的定性和定量离子对分别为m/z 674.30>209.00和m/z674.30>187.00，碰撞电压分别为32V和40V；

以上所述的方法中，优选的，在步骤(1)(b)中HLB柱的上样时的稀释液为含0.5％甲酸的0.2M乙酸铵溶液、含体积分数为0.5％甲酸的0.2M乙酸铵溶液为淋洗溶剂、30％甲醇-水为洗脱溶剂；

以上所述的方法中，优选的，在步骤(1)(b)中WAX柱中的上样溶液的pH为5、含0.2％甲酸的甲醇溶液为淋洗液，1％氨化甲醇为WAX柱的洗脱液；

以上所述的方法中，优选的，HLB柱的品牌，型号为waters,60mg，3CC；WAX柱购自安谱，CNW,200mg,3CC；

以上所述的方法中，优选的，HLB柱活化条件为：依次量取2mL甲醇、2mL含有0.5％(体积分数)甲酸的0.2M乙酸铵溶液缓冲液通过HLB柱；WAX活化条件为：依次量取2mL甲醇、2mLpH＝5.0甲酸水溶液通过WAX柱；

以上所述的方法中，优选的，UA的具体质谱参数：

UA检测的质谱分析条件

上述的培养基为生化领域常用的细胞培养基，包括含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基、Mepp培养基、Spp培养基、含10％胎牛血清的DMEM培养基等。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1.本发明首次建立了尿液样本中稻曲菌素液质检测法，能高选择性监测人体尿液及小鼠尿液样本中稻曲菌素A，对开展稻曲菌素在人体暴露水平和健康风险评价的研究具有重要意义。

2.本发明方法检测尿液中稻曲菌素具有灵敏度高、重复性好等优势，加标回收率在85％-95％之间，定量检测限范围在0.05-100μg/L之间，基质效应在80-91％之间，可能准确测定人体及小鼠尿液中痕量的稻曲菌素。

3.本发明方法检测细胞培养基中稻曲菌素具有灵敏度高、重复性好等优势，加标回收率在85％-95％之间，定量检测限范围在0.05-100μg/L之间，基质效应在80-91％之间，可能准确测定尿液中痕量的稻曲菌素。

4.本发明采用2种固相微萃取联用法对尿液及细胞培养基中稻曲菌素A进行高特异性浓缩。第一步采用甲酸-乙酸铵缓冲溶液调节两性化合物UA呈电中性，并且借助HLB对电中性的UA进行富集。在该体系中，无机盐、有机碱及有机强酸等带电小分子干扰物在HLB上基本不保留，且小极性代谢产物在HLB柱上难洗脱，减少了待测样品中的共存组分。第二步采用了WAX阴离子交换柱实现对待测样品中中性或碱性大极性物质的有效去除，进一步实现对待测样品中UA的净化和富集，最大程度上降低样品的基质效应和基线噪音。

附图说明

图1为不同甲酸-水体系中UA在HLB柱上的穿透能力示意图。

图2为不同甲醇-水体系对UA的洗脱能力示意图。

图3为氨水浓度对UA洗脱效果的影响示意图。

图4为阳性人体尿液选择离子监测图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

尿液或细胞培养基中稻曲菌素A的液质联用检测方法，包括下述步骤：

(1)样品预处理：

(a)设立二组待测样品，每组三个平行样品，每组待测样本体积为1.0mL，第一组样品不加任何物质；第二组样品中加入5μL浓度为100ppbUA的标准溶液使得待测液中UA的终浓度为0.5μg/L，涡旋1min后放置至4℃冰箱中平衡30min，得到尿液预处理液，作为试样备用；

所述的待测样品为：不含UA的人体尿液、小鼠尿液或细胞培养基(含10％胎牛血清的DMEM培养基)。

(b)分别向试样中加入1mL二氯甲烷溶液涡旋1min，12000rpm离心10min，将上清液转移至干净的玻璃管中待净化；

(c)用3mL含体积分数为0.5％甲酸的0.2M乙酸铵溶液稀释步骤(b)的待净化液，稀释后的待净化液以1mL/min流速通过提前活化的HLB小柱，小柱用2mL含体积分数为0.5％甲酸的0.2M乙酸铵溶液以1mL/min的流速淋洗一次，弃去淋洗液，真空泵抽干20min，然后采用2mL 30％甲醇-水(V/V)溶液洗脱(流速控制在1mL/min以内)，收集洗脱液，待进一步净化；

HLB柱的品牌，型号为waters,60mg，3CC；

HLB柱活化条件为：依次量取2mL甲醇、2mL含有0.5％(体积分数)甲酸的0.2M乙酸铵溶液缓冲液以1mL/min的流速通过HLB柱；

(d)将步骤(c)所得的待净化液用0.5％的氨水溶液调节pH至5并以1mL/min的流速通过提前活化的WAX柱，并依次采用2mL pH＝5.0甲酸溶液、2mL甲醇溶液、2mL含0.2％(体积分数)甲酸的甲醇溶液以1mL/min的流速淋洗小柱，弃去淋洗液，真空泵抽干20min。最后用2mL 1％的氨化甲醇(V/V)溶液洗脱(洗脱速度控制在1mL/min内)，所得洗脱液氮气吹干后用50μL 5％甲醇-水溶液复溶，12000rpm离心，将上清液转移至内插管中用于LC-MS/MS检测。

WAX柱购自安谱，CNW,200mg,3CC；

WAX活化条件为：依次量取2mL甲醇、2mLpH＝5.0甲酸水溶液以1mL/min的流速通过WAX柱；

(2)LC-MS/MS测定样品中稻曲菌素的含量：

5％甲醇-水梯度稀释UA的标准溶液(1000μg/L)，使得UA的浓度为0.05-100μg/L，借助LC-MS/MS检测溶液在不同浓度UA存在时的总离子流图。随后以浓度为横坐标，以定量离子对的选择检测图的峰面积为纵坐标，建立UA的标准曲线。

液相色谱采用ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm,1.8μm)色谱柱，流动相为甲醇(A)和0.01％甲酸水(B)；柱温为40℃；进样体积为2μL；流速为0.3mL/min。流动相采用LC-MS级甲醇(A)和0.01％甲酸-水(B)，运行梯度为0min,5％A；0.5min,5％A；7min,40％A；9min,98％A；12min,98％A；12.2min,5％A；15min,5％A。

LC-MS/MS检测条件为：Waters ACQUITY

H-Plus(UHPLC)超高效液相色谱串联

TQ-XS三重四级杆质谱(Milford,MA,USA)进行检测。其中，质谱采用电喷雾(ESI+)离子源，多反应监测(MRM)模式检测扫描目标分析物。质谱条件：离子源为ESI(+)，毛细管电压为1.0KV，脱溶剂温度为300℃，锥孔电压为30V，脱溶剂流速和碰撞气流速分别为600和150L/h；多级反应监测，定性和定量离子对分别为m/z674.30>209.00和m/z 674.30>187.00，碰撞电压分别为32V和40V。

UA检测的质谱分析条件

采用加标回收法和标准加入法分别评价方法的回收率和样品的基质效应(参照《Waters样品前处理及色谱柱手册》)。

本实施例人体尿液的加标回收率为92.1％；基质效应为88.5％；定量检测下限为50ng/L(人体尿液样品中可检测到的UA的最低值)；小鼠尿液的加标回收率为81.4％；基质效应为81.1％；定量检测下限为50ng/L；细胞培养基的加标回收率为95.2％；基质效应为98.5％；定量检测下限为10ng/L。由此可见，本方法的准确性较好，灵敏度较高。

实施例2：

不同品牌和功能的HLB柱对UA最终检测灵敏度的影响：

申请人将实施例1所述方法，步骤(1)(c)中的HLB柱进行了替换，分别为：安谱HLB柱(CNW,200mg，6cc)，Waters HLB柱(Oasis,200mg，6cc)。

实验发现，Waters HLB柱(Oasis,200mg，6cc)虽然UA具有较好的保留能力，但提取后的待测样品的基线噪音明显高于Waters HLB柱(Oasis,60mg，3cc)，这可能是大体积填料对大极性的杂质保留能力变强导致洗脱液中干扰物变多。安谱HLB柱(CNW,200mg，6cc)对UA的保留能力相对Waters HLB柱(Oasis,60mg，3cc)较差，当上样溶液体积超过4mL时，UA会发生穿透小柱现象，导致UA的回收率下降。

实施例3：

HLB柱的上样、淋洗和洗脱溶液对结果的影响：

本实施例对步骤(1)(c)中的上样和洗脱液进行了替换，以考察不同的溶液对UA分离的影响：

选用空白尿液样本(不含UA)，UA的添加后的终浓度为500ng/L：

UA为两性分子，pKa1和pKa2分别为1.05和8.80，在自由溶液中的带电性质取决于溶液pH。本申请对比了上样溶液乙酸铵缓冲液中甲酸的体积分数对UA在HLB柱上吸附能力的影响，结果如图所1示。当甲酸浓度为5％时，UA能轻易穿透HLB柱，这可能是由于UA在5％甲酸溶液中带正电荷。当甲酸浓度为0.1％时，UA在第6-10mL流出液中均有检出，这可能是由于在该条件下UA部分带负电因而在HLB柱上弱保留。当甲酸浓度为0.5％(溶液pH＝2.5)，上样体积小于8mL时，HLB柱对UA的保留效率高达95％，表明该条件可满足实验要求。

随后，本申请考察了不同比例甲醇-水混合溶剂对UA的洗脱能力，结果如图2所示。当淋洗液中的甲醇体积分数大于等于5％时，UA开始被洗脱液从HLB固相萃取小柱中洗脱；当甲醇体积分数大于30％时，吸附在HLB柱上的UA能被完全洗脱。因此为降低样品的基线噪音，后续实验中依次选用含0.5％(体积分数)甲酸的0.2M乙酸铵溶液为上样溶液、含0.5％(体积分数)甲酸的0.2M乙酸铵溶液为淋洗溶剂、含30％甲醇-水为洗脱溶剂。

实施例4：

不同品牌及功能的离子交换柱对UA的吸附影响：

申请人将实施例1所述方法，步骤(1)(d)中的WAX柱进行了替换，替换的离子交换柱分别为Waters Oasis WAX混合型弱阴离子交换柱(200mg,3CC)，Strata-X-AW(200mg,3CC)。

实验发现，Waters Oasis WAX混合型弱阴离子交换柱(200mg,3CC)和Strata-X-AW(200mg,3CC)对UA基本没有保留能力，这可能是上述两个品牌的WAX柱具有较低的pKa。

实施例5：

WAX柱中不同的上样条件、洗脱条件对灵敏度的影响：：

本实施例对步骤(1)(d)中的上样液和洗脱液进行了替换，以考察不同的溶液对UA分离的影响：

首先，对比了上样溶液pH值对UA在弱阴离子交换柱WAX上吸附效果的影响。实验结果表明，当上样溶液的pH在4-6之间时，UA在WAX柱上具有良好的保留能力；当溶液的pH过高或过低时其保留能力都很弱。

随后，对比了淋洗溶液甲醇中甲酸含量对UA在弱阴离子交换柱WAX上吸附效果的影响。实验结果表明，当甲醇中甲酸含量低于或等于0.5％时，UA在WAX柱上具有良好的保留能力，当甲醇中甲酸大于等于2％时，UA在WAX柱上基本无保留能力。此外，申请人发现当采用0.2％甲酸-甲醇淋洗WAX柱时，待测样品的基质效应明显降低，有效提高了方法的灵敏度。

本申请对比了洗脱溶液中氨水浓度对UA洗脱效果的影响。如图所3示，当氨水体积分数大于等于1％时，UA可以被有效地洗脱。但当洗脱溶剂中氨水体积分数大于2％时，样品存在明显的基质抑制效应。随后，本申请分别考察了1％氨化甲醇和1％氨化乙腈对UA的洗脱效果，结果表明乙腈体系对UA的洗脱能力相对较低(回收率低于60％)，这可能是由于UA在乙腈中的溶解度相对较差。因此为进一步提高方法的灵敏度，后续实验中选用2mL1％氨化甲醇为WAX柱的洗脱溶剂。

实施例6：

不同的液相色谱柱对灵敏度的影响：

改变实施例1步骤1.4中液相色谱中色谱柱种类及流动相梯度，其余步骤与参数与实施例1相同。

色谱柱具体型号为：ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1mm×100mm,1.7μm)，ACQUITYUPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm,1.8μm)

实验结果表明，在大多数流动相条件下C18色谱柱对UA的保留能力都很差。此外，当以甲醇和0.01％甲酸-水为流动相时，待测样品中UA均存在严重的基质抑制效应，降低方法灵敏度。当以T3为色谱分离柱时，UA具有较好的峰形，均能与待测样品中的杂质实现较好的基线分离，大大增加了方法的灵敏度。

实施例7：

实际人体尿液中稻曲菌素A的定量检测。

随机收集经常食用大米的人群尿液样本72份，使用实施例1方法进行样品净化、富集和检测。

采用该方法测得尿液中稻曲菌素A的含量为0-518.9ng/L，检出率为30％。图4为人体尿液中稻曲菌素A为172.6ng/L的选择离子检测图。

Claims (1)

1.一种尿液或细胞培养基中稻曲菌素A的液质联用检测方法，包括下述步骤：

(1)样品预处理：

(a)量取尿液或细胞培养基样本，加入等体积二氯甲烷溶液涡旋，高速离心，保留上清液待净化；

(b)用含体积分数为0.5％的甲酸的0.2M乙酸铵溶液稀释步骤(a)的待净化液，待净化液与乙酸铵溶液的体积比为1:1～1:5，稀释后的待净化液通过提前活化的HLB小柱，小柱用2mL含体积分数为0.5％甲酸的0.2M乙酸铵溶液淋洗一次，弃去淋洗液；真空泵抽干；然后采用2-4mL 30％甲醇-水溶液洗脱，收集洗脱液；

HLB柱活化条件为：依次量取1-4mL甲醇、1-4mL含有0.5％甲酸的0.2M乙酸铵溶液缓冲液通过HLB柱；

(c)将步骤(b)所得的待净化液用氨水溶液调节pH至4-6并通过提前活化的WAX柱，并依次采用1-4mL pH＝4-6甲酸溶液、1-4mL甲醇溶液、1-4mL含体积分数为0.2％甲酸的甲醇溶液淋洗小柱，弃去淋洗液，真空泵抽干；最后用1-4mL 1％的氨化甲醇溶液洗脱；所得洗脱液氮气吹干后用0-10％甲醇-水溶液复溶，高速离心，将上清液转移至内插管中用于LC-MS/MS检测；

WAX活化条件为：依次量取2-4mL甲醇、2-4mL pH＝4-6甲酸水溶液通过WAX柱；(2)LC-MS/MS测定样品中稻曲菌素的含量：

液相色谱采用ACQUITY UPLC HSS T3柱，为2.1mm×100mm,1.8μm色谱柱，流动相A为甲醇，流动相B为0.01％-0.1％甲酸水；柱温为30-45℃；进样体积为1-5μL；流速为0.2-0.45mL/min；运行梯度为0min,5％A；0.5min,5％A；7min,40％A；9min,98％A；12min,98％A；12.2min,5％A；15min,5％A；

LC-MS/MS检测条件为：Waters ACQUITY

H-Plus超高效液相色谱串联

TQ-XS三重四级杆质谱进行检测；其中，质谱采用电喷雾离子源，多反应监测模式检测扫描目标分析物；

质谱条件：离子源为ESI+，毛细管电压为1.0KV，脱溶剂温度为300℃，脱溶剂流速和碰撞气流速分别为600和150L/h；检测稻曲菌素A的质谱参数为：

以上所述的方法中，所述的HLB柱的品牌，型号为waters,60mg，3CC；WAX柱购自安谱，CNW,200mg,3CC。

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