CN110146632B - 水产品中多种海洋生物毒素的液质联用检测法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水产品中多种海洋生物毒素的液质联用检测法，待测水产品样品用0.1vol％甲酸水溶液、乙腈多次分级提取，分层得到上层有机相和下层水相；下层水相加入MCX‑HLB串联柱，低比例甲醇水淋洗，再用经dSPE净化的有机相进行一次洗脱，再用碱性甲醇进行二次洗脱，洗脱液定容后用高效液相色谱‑串联质谱联用仪进行检测，采用外标法定量，得到待测水产品样品中各待测成分的含量。本发明可一次就检测出8种涵盖亲水及亲脂的海洋生物毒素，首次实现一步式对亲水和亲脂性海洋生物毒素的液质联用高通量定量检测。

Description

水产品中多种海洋生物毒素的液质联用检测法

技术领域

本发明涉及一种水产品中多种海洋生物毒素的液质联用检测法

背景技术

随着社会的进步和工业的发展，环境问题日益严重，一些工业废水和生活污水进入江河湖海，导致水体的富营养化，使得水体中藻类大量繁殖。尤其是许多海洋赤潮藻类可产生毒素并在贝类等海生动物中蓄积，受到毒素污染的海产品被消费者食用后可危害人体内的消化系统、神经系统或者心血管系统，导致人体中毒，甚至死亡。市售海产品中常见的海洋生物毒素种类包括麻痹性贝毒(Paralytic Shellfish Poisoning,PSP)、腹泻性贝毒(Diarrhetic Shellfish Poisoning,DSP)、记忆缺失性贝毒(Amnesic ShellfishPoisoning,ASP)、神经性贝毒(Neurotoxic Shellfish Poisoning,NSP)及河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)、西加毒素(Ciguatoxin，CTX)等。

对于水产品中海洋生物毒素检测方法主要分为生物学测试方法和化学分析法，早期应用广泛且较为成熟的有小鼠测试法、免疫分析法等生物学测试法。气相色谱法、薄层色谱法及液相色谱法等化学分析方法也有一定的报道。近年来，液相色谱-质谱联用技术已逐渐成熟，在食品农兽药残留、污染物监控、非法添加剂、生物毒素等检测领域已得到广泛应用。液质联用技术的高灵敏度和选择性使其逐渐成为水产品中海洋生物毒素检测的首选检测手段。

现行有效的国家标准有中，GB 5009.198-2016《食品安全国家标准贝类中失忆性贝类毒素的测定》，GB 5009.206-2016《食品安全国家标准水产品中河豚毒素的测定》，GB5009.212-2016《食品安全国家标准贝类中腹泻性贝类毒素的测定》，GB 5009.213-2016《食品安全国家标准贝类中麻痹性贝类毒素的测定》，GB 5009.261-2016《食品安全国家标准贝类中神经性贝类毒素的测定》，GB 5009.273-2016《食品安全国家标准水产品中微囊藻毒素的测定》，GB 5009.274-2016《食品安全国家标准水产品中西加毒素的测定》等标准分别规定了水产品中一种或者一类海洋生物毒素的检测方法。这些方法能精确的测定相应水产品中所规定海洋生物毒素的含量，但检测通量较小，无法同时测定多种或多类物质。

文献公开报道方面，Stobo A等用LC-MS法建立了贻贝、蚶、牡蛎、扇贝等样品中OA、DTXs、YTXs、PTXs和AZAs等脂溶性贝毒的检测方法；Hashimoto S等采用LC-MS/MS技术，建立了一次性检测双壳类水产品中OA、DTX、PTXs等10种毒素的方法，并同时用小鼠生物法进行对比，得出日常检测中LC-MS比小鼠生物法更为适用的结论。于慧娟等采用液相色谱-串联质谱技术对10种麻痹性贝类毒素建立了检测方法。

海洋生物毒素根据其理化性质可以分为亲水性和亲脂性，对应的麻痹性贝毒(PSP)、记忆缺失性贝毒(ASP)、河豚毒素(TTX)等属于亲水性毒素；腹泻性贝毒(DSP)、神经性贝毒(NSP)及西加毒素(CTX)等属于亲脂性毒素。对现有公开报道方法进行总结发现，除了对单种物质检测的方法，适用多种物质检测的方法所对应的目标物均属于一类或是同一理化性质的目标物，而没有建立针对两种理化性质的目标物同时进行检测的液质联用仪器方法。因此，有必要通过色谱柱的合理选择，流动相的优化及质谱参数的优化，建立可一次性完成亲水性及亲脂性海洋生物毒素高通量检测液质联用方法。

前处理技术对于检测方法的开发极为重要，其中提取后的净化手段非常关键，固相萃取技术是食品检测中的一项重要的前处理净化技术，目前应用广泛的主要有C18、HLB、MCX(强阳离子交换柱)、MAX(强阴离子交换柱)、WCX(弱阳离子交换柱)、WAX(弱阴离子交换柱)等。现有公开的文献及标准中，C18、HLB及MCX固相萃取均有应用，主要是用于富集及净化水介质提取液中的有机目标物，特别是海洋生物毒素中的亲水性目标物。如GB5009.213-2016《食品安全国家标准贝类中麻痹性贝类毒素的测定》中，将HLB固相萃取柱应用于贝类中麻痹性贝类毒的检测。相比于其他的净化技术，固相萃取净化技术具有较高的净化效率，能有效的解决因基质效应引起的质谱检测响应问题，减少背景干扰。

基质分散固相萃取技术(dSPE)是一种在动物源食品检测领域高通量检测前处理应用较多的前处理技术。QuEChERS技术(quick，easy，cheap，effective，rugged，safe)是一种典型的dSPE技术，因其具有快速、简单、便宜、有效、耐用和安全可靠等特点而得名。Monica Mattarozzi等采用QuEChERS法对贝类海产品中的8种PSP毒素完成了前处理，并采用高分辨质谱技术进行测定；Rubies A等采用QuEChERS法完成了海产品中脂溶性贝类毒素的前处理。可见，QuEChERS法在海产品中海洋生物毒素的高通量检测中已得到初步探索，在亲脂性海洋生物毒素的检测中具有较好的效果。

针对水产品的复杂基质，在提取液进行仪器分析前必须进行充分净化，脂肪等杂质强烈的基质效应，可降低目标物在液质联用仪检测过程中的离子化效率，严重影响检测效果。若单独选用以上某一种净化方法，一方面可能净化效果不达要求；另一方面必将对亲水性及亲脂性两类理化性质相反的目标物中的某一类产生较大损失。因此，有必要建立一种新的前处理方法，结合仪器方法的优化，实现对水产品基质中亲水性及亲脂性海洋生物毒素的高通量定量检测。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种能够同时检测水产品中多种海洋生物毒素的方法，尤其是提供一种适用于水产品基质中海洋生物毒素检测的前处理方法。

本发明采用的技术方案是：

水产品中多种海洋生物毒素的液质联用检测法，所述海洋生物毒素包括：柱孢毒素(CYN)、软骨藻酸(DA)、脱氨甲酰基石房蛤毒素(dc-STX)、膝沟藻毒素(GTX)、鳍藻毒素(DTX)、冈田软海绵酸(OA)、微囊藻毒素LR(LR)、微囊藻毒素RR(RR)，其中鳍藻毒素(DTX)、冈田软海绵酸(OA)为亲脂性的，其余为亲水性的，所述方法包括以下步骤：

(1)样品提取

称取待测水产品样品2.00g，加入2mL 0.1vol％甲酸水溶液，涡旋振荡1min，再加入5mL乙腈，涡旋振荡1min，超声5min，离心分离得到上清液A和残渣A，残渣A用1mL0.1vol％甲酸水溶液提取后离心分离得到上清液B和残渣B，残渣B用3mL乙腈提取、离心分离得到上清液C，将上清液A、B、C合并，加入0.1g甲酸铵，涡旋振荡1min，离心，得到的上清液分层，得到上层有机相D和下层水相E，待用；

(2)净化

将MCX柱(强阳离子交换柱)在上，HLB柱(亲水-亲脂平衡柱)在下，进行串联，活化后，将下层水相E倒入串联柱体系中，抽干，用5mL水和5mL体积比为2：8的甲醇-水溶液各淋洗一次，弃去淋洗液，抽干；

将上层有机相D加入500mg中性氧化铝粉，15mg石墨化炭黑粉，涡旋振荡1min，离心取上清液，作为第一次洗脱剂加入串联柱体系中进行第一次洗脱，洗脱液接收瓶中预先加入0.5mL二甲亚砜；然后再用6mL体积比95：5的甲醇-氨水溶液进行第二次洗脱，所得洗脱液蒸至近干后用体积比5：5的乙腈-0.1vol％甲酸水溶液的混合溶液定容至2mL，过0.22μm尼龙滤膜过滤，得到供试品溶液；

(3)高效液相色谱-串联质谱联用仪检测

将供试品溶液用高效液相色谱-串联质谱联用仪进行检测，采用外标法定量，得到待测水产品样品中各待测成分的含量。

进一步，所述步骤(3)中，高效液相色谱-串联质谱联用仪的检测条件如下：

A.高效液相色谱分离

色谱柱：Hypersile Gold C8色谱柱，流动相A：含有2mmol甲酸铵+0.1vol％甲酸的水溶液；流动相B：2mmol甲酸铵+0.1vol％甲酸的乙腈-水溶液，其中乙腈与水的体积比为95:5；流速：0.3mL/min；进样量：10μL；洗脱程序见表1。

表1 HPLC洗脱程序

时间(min)	A％	B％
			0.00	95	5
4	95	5
			7	5	95
13	5	95
			13.1	95	5
18	95	5

B.质谱检测

质谱条件：采用正负离子同时扫描，在多反应监控(MRM)模式下对目标物进行定量分析。电喷雾离子源条件如下：

a)喷雾电压(IS)：4500V；

b)离子源温度：450℃；

c)碰撞气(CAD)为10psi；

d)气帘气(CUR)为25psi；

e)雾化气(GS1)为60psi；

f)辅助加热气(GS2)为60psi。

进一步，所述步骤(3)中，外标法定量的操作步骤为：将供试品溶液用高效液相色谱-质谱联用仪进行检测，得到供试品溶液的提取离子流色谱图，供试品溶液的各待测成分的的峰面积与与其对应的标准品的标准曲线比较，计算得到供试品溶液中各待测成分的浓度，相应换算得到待测水产品样品中各待测成分的含量。

待测水产品样品中各待测成分的含量根据如下计算公式(1)得到：

X＝C*V/m，式中：

X－待测水产品样品中待测成分含量，单位为μg/kg；

C－供试品溶液中待测成分的浓度，根据标准曲线计算得到，单位为μg/L

V—定容体积，单位为mL；

m－待测水产品样品质量，单位为g。

进一步，本发明方法中，离心一般都是以9000r/min离心5min。

所述步骤(1)中，残渣A用1mL0.1vol％甲酸水溶液提取，一般操作是涡旋振荡1min，超声5min。

所述步骤(1)中，残渣B用3mL乙腈提取，一般操作是涡旋1min，超声5min。

所述步骤(2)中，串联柱上样前需要进行活化，所述活化操作为：依次加入5mL甲醇，5mL水，5mL0.1vol％甲酸水溶液，进行活化。

所述步骤(2)中，洗脱液接收瓶中预先加入0.5mL二甲亚砜，是为了提高混合溶剂对目标物的溶解性，后期浓缩时确保目标物不析出。

与现有技术相比，本发明的优点在于：一方面，现有公开的海洋生物毒素液质联用检测方法，只针对亲水或亲脂一类理化性质的目标物进行检测，本发明通过色谱柱的合理选择、流动相的优化及质谱参数的优化，建立了可一次性检测涵盖亲水及亲脂理化性质的8种海洋生物毒素的液质联用仪器方法；另一方面，本发明首次将dSPE技术与固相萃取技术进行了结合，实现了对水产品基质的充分净化，针对性的减少了目标物在净化过程中的损失，并可实现对亲水及亲脂理化性质目标物的“一站式”提取和净化。

具体来说，本发明方法步骤的创新点在于：

(1)前处理技术创新过程具体描述如下：本方法采用分级提取原理对海产品基质中理化性质各异的目标物进行充分提取。第一步采用了0.1vol％甲酸水溶液使样品酸化及分散，并且对部分结构中含有氨基的碱性亲水性目标物如CYN、dcSTX、GTX等离子化后进行提取。在该体系中，DA等弱酸性亲水性目标物以分子态形式存在，降低了在水溶液体系中的溶解性，因此在第二步采用了2.5倍体积的乙腈，一方面实现对以上物质的充分提取，同时也辅助水系提取液实现对LR、RR等分子量较大的亲水性物质的充分提取；另一方面可沉淀蛋白，使提取液澄清。在完成第二步提取后，采用0.1vol％甲酸水溶液重复提取一次，提高提取回收率。第三步采用乙腈再次提取，对残渣中OA、DTX等部分亲脂性目标物及分子量较大的目标物进行辅助提取。三部分提取液混合后，有机组分对提取液中的残余蛋白质杂质进行二次变性沉淀，完成辅助净化。加入甲酸铵使水相和有机相分层，各目标物根据理化性质差异各自进入相应的溶剂体系，使不同相的净化方式和净化载体选择具有较好的针对性。

(2)关键的净化过程是将dSPE法的净化技术与固相萃取技术进行了融合。对于有机相的净化，创新了一种dSPE净化体系，采用一定比例的中性氧化铝及石墨化炭黑粉末对提取液的有机相进行净化，去除脂肪、色素等杂质，并将该净化后的有机相作为洗脱液对固相萃取柱进行洗脱。对于水相的净化，创新了固相萃取柱的使用方法，开拓了MCX和HLB固相萃取的新的应用方式，将MCX和HLB固相萃取柱进行串联使用，并改进了传统的上样和洗脱模式。传统的MCX(混合型阳离子交换柱)柱，其使用方法是将上样液酸化，对于含氨基等PKa值大于7的碱性水溶性物质，以阳离子状态溶解于上样液中，并与MCX柱中的固定相磺酸基团结合，得到保留；对于含羧基等PKa值小于7的酸性水溶性物质，将以分子态的形式溶于上样液中，部分可与MCX柱固定相结合被保留，另外一部分随流出液流失。可见，在传统使用过程中，中性及酸性物质被舍弃或用甲醇淋洗液淋洗舍弃。本方法将传统的固相萃取流程净化进行了创新，将HLB柱下接于MCX柱以下，对水相流出液中的中性及酸性有机化合物进行二次保留，使经过MCX柱一次保留后流失下来的中性及酸性有机化合物进行二次保留。传统的MCX柱采用中性甲醇进行淋洗后用碱性甲醇进行洗脱。本方法创新了淋洗和洗脱流程，采用低比例甲醇水进行淋洗，防止了HLB柱中的中性及酸性组分随淋洗液流失，而部分杂质可被淋洗液带走。淋洗结束后用经dSPE净化的有机相提取液进行一次洗脱，将MCX及HLB中保留的酸性和中性有机化合物进行洗脱，再用碱性甲醇进行二次洗脱，使MCX中保留的碱性物质解除与磺酸基团的结合，进而被洗脱，实现了不同理化性质的两类物质的一步式提取净化。

(3)净化后洗脱液再通过LC-MS/MS检测，可以一次就检测出8种涵盖亲水及亲脂的海洋生物毒素，首次实现一步式对亲水和亲脂性海洋生物毒素的液质联用高通量定量检测。

附图说明

图1 8种海洋生物毒素液质联用XIC图。

具体实施方式

下面以具体实施例来对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1

检测对象如表2所示，所检测物质理化性质涵盖了亲水性及亲脂性。

表2标准物质列表

(1)材料和设备

主要试剂和材料：

如非特别说明，所列试剂均为色谱纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

乙腈，甲醇：HPLC级；氨水、甲酸、甲酸铵、二甲基亚砜：分析纯。0.1vol％甲酸：取1mL甲酸，用超纯水定容止1000mL。甲醇-氨水(95+5)：95mL甲醇加入5mL氨水。流动相A：含有2mmol甲酸铵+0.1vol％甲酸的水溶液：取0.126g甲酸铵，1mL甲酸，用超纯水定容止1000mL；流动相B：2mmol甲酸铵+0.1vol％甲酸的乙腈-水溶液：取0.126g甲酸铵，1mL甲酸，用乙腈+超纯水(体积比95：5)定容止1000mL。HLB、MCX固相萃取柱(3cc)；标准物质：柱孢毒素、软骨藻酸、脱氨甲酰基石房蛤毒素、膝沟藻毒素、鳍藻毒素、冈田软海绵酸、微囊藻毒素LR、微囊藻毒素RR溶液。

仪器设备：

5500^TM三重四极杆LC/MS/MS高效液相色谱-质谱联用仪；Hypersile Gold C8色谱柱(150mm x 2.1mm，3μm，美国Thermo Fisher)；电子天平：感量分别为0.1mg和0.01g；超纯水器；旋涡混合仪；超声波清洗仪；超低温冰箱；旋转蒸发仪；15ml具刻度离心管。

(2)样品前处理

称取待测样品2.00g于15mL离心管中，加入2mL 0.1vol％甲酸溶液，涡旋振荡1min，加入5mL乙腈，涡旋振荡1min，超声5min，以9000r/min离心5min，上清液转移至另一15mL离心管中。残渣加入1mL0.1vol％甲酸溶液，涡旋振荡1min，超声5min，以9000r/min离心5min，上清液合并到第一次提取液中。残渣再加入3mL乙腈，涡旋1min，超声5min，以9000r/min离心5min，上清液合并到第一次提取液中。合并液体加入0.1g甲酸铵，涡旋振荡1min，以9000r/min离心5min，所得上清液分层分为上层有机相和下层水相。取出上层有机相到另一15mL离心管中，下层水相倒入到串联的MCX-HLB固相萃取体系中(MCX在上，HLB在下)(固相萃取体系预先用5mL甲醇，5mL水，5mL0.1vol％甲酸水溶液依次活化)，抽干。用5mL水和5mL甲醇-水(体积比2：8)各淋洗一次，弃去淋洗液，抽干。下接鸡心瓶用于接收洗脱液，并加入0.5mL二甲亚砜。有机相加入500mg中性氧化铝粉，15mg石墨化炭黑粉，涡旋振荡一分钟，以9000r/min离心5min，取上清液，作为洗脱剂，第一次洗脱固相萃取体系，再用6mL甲醇-氨水(95:5,v/v)第二次洗脱固相萃取体系，洗脱液旋转蒸发至近干。用甲醇-0.1vol％甲酸(5:5,v/v)定容至2mL，过0.22μm尼龙滤膜过滤，得到供试品溶液供LC-MS/MS检测。

(3)混合标准溶液的配制

A.混合标准溶液组成：

1组：DTX、OA、LR、RR吸取一定量各单标溶液，用乙腈配制成浓度为500ng/mL的混合标准溶液。

2组：DA、CYN、dcSTX、GTX：吸取一定量各单标溶液，用乙腈配制成浓度为1000ng/mL的混合标准溶液。

以上混合标准溶液有效期均为3个月。

(4)高效液相色谱-质谱联用仪测定

A.高效液相分离

色谱柱：Hypersile Gold C8色谱柱，若测定激素成分则采用的型号为150mmx2.1mm,3μm；

流动相A：含有2mmol甲酸铵+0.1％甲酸的水溶液；流动相B：2mmol甲酸铵+0.1％甲酸的乙腈-水溶液，其中乙腈与水的体积比为95:5；

流速：0.3mL/min；

进样量：10μL；

表3 HPLC洗脱程序如下

Time(min)	A％	B％
			0.00	95	5
4	95	5
			7	5	95
13	5	95
			13.1	95	5
18	95	5

B.质谱检测

质谱条件：采用正负离子同时扫描，在多反应监控(MRM)模式下对目标物进行定量分析。电喷雾离子源条件如下：

g)喷雾电压(IS)：4500V；

h)离子源温度：450℃；

i)碰撞气(CAD)为10psi；

j)气帘气(CUR)为25psi；

k)雾化气(GS1)为60psi；

l)辅助加热气(GS2)为60psi；

(5)浓度计算方法

分别对各个标准品，按照标准品溶液中的浓度和测得的峰面积，绘制标准曲线，分别得到上述8种标准品的标准曲线；

根据供试品溶液测得的各待测成分的峰面积及其对应的标准品的标准曲线，计算出供试品溶液中各待测成分的浓度，再按照如下计算公式(1)得到待测样品中各待测成分的含量。

样品中待测物的含量根据如下计算公式(1)得到：

X＝C*V/m，式中：

X－试样中待测成分含量，单位为μg/kg；

C－供试品溶液中待测成分浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为μg/L

V－定容体积，单位为mL；

m－试样质量，单位为g。

8种海洋毒素的MRM模式质谱参数如表4，保留时间、检出限、定量限如下表5：

表4分析物MRM模式定量和确证参数

表5：各物质方法参数

实施例2方法学验证

分别选取黄鱼、蛏子空白基质，吸取适量混合标准溶液，使样品中目标物浓度为定量限的1、2、5倍，按上述方法的处理过程操作，测定后计算样品添加的回收率及相对标准偏差。

表6加标回收结果

结果显示，所有上述化合物回收率范围均在60.9％-109.1％之间，精密度范围在5.9％-16.9％，基本满足方法学验证要求。

实施例3实际样品检测结果：

对市场上的水产品黄鱼和蛏子进行8种海洋毒素检测，所得结果如下表7

表7样品测试结果

Claims (2)

1.水产品中多种海洋生物毒素的液质联用检测法，所述海洋生物毒素为：柱孢毒素CYN、软骨藻酸DA、脱氨甲酰基石房蛤毒素dc-STX、膝沟藻毒素GTX、鳍藻毒素DTX、冈田软海绵酸OA、微囊藻毒素LR、微囊藻毒素RR，其中鳍藻毒素DTX、冈田软海绵酸OA为亲脂性的，其余为亲水性的；具体操作为以下步骤：

(1)样品提取

称取待测水产品样品2.00g，加入2mL 0.1vol％甲酸水溶液，涡旋振荡1min，再加入5mL乙腈，涡旋振荡1min，超声5min，离心分离得到上清液A和残渣A，残渣A用1mL0.1vol％甲酸水溶液提取后离心分离得到上清液B和残渣B，残渣B用3mL乙腈提取、离心分离得到上清液C，将上清液A、B、C合并，加入0.1g甲酸铵，涡旋振荡1min，离心，得到的上清液分层，得到上层有机相D和下层水相E，待用；

(2)净化

将MCX柱在上，HLB柱在下，进行串联，活化后，将下层水相E倒入串联柱体系中，抽干，用5mL水和5mL体积比为2：8的甲醇-水溶液各淋洗一次，弃去淋洗液，抽干；所述活化操作为：依次加入5mL甲醇，5mL水，5mL 0.1vol％甲酸水溶液，进行活化；

将上层有机相D加入500mg中性氧化铝粉，15mg石墨化炭黑粉，涡旋振荡1min，离心取上清液，作为第一次洗脱剂加入串联柱体系中进行第一次洗脱，洗脱液接收瓶中预先加入0.5mL二甲亚砜；然后再用6mL体积比95：5的甲醇-氨水溶液进行第二次洗脱，所得洗脱液蒸至近干后用体积比5：5的乙腈-0.1vol％甲酸水溶液的混合溶液定容至2mL，过0.22μm尼龙滤膜过滤，得到供试品溶液；

(3)高效液相色谱-串联质谱联用仪检测

将供试品溶液用高效液相色谱-串联质谱联用仪进行检测，采用外标法定量，得到待测水产品样品中各待测成分的含量；

外标法中，标准品的标准溶液如下配制：

1组：鳍藻毒素、冈田软海绵酸、微囊藻毒素LR和微囊藻毒素RR：吸取一定量各单标溶液，用乙腈配制成浓度为500ng/mL的混合标准溶液；

2组：软骨藻酸、柱孢毒素、脱氨甲酰基石房蛤毒素、膝沟藻毒素：吸取一定量各单标溶液，用乙腈配制成浓度为1000ng/mL的混合标准溶液；

高效液相色谱-串联质谱联用仪的检测条件如下：

A.高效液相色谱分离

色谱柱：HypersilGold C8色谱柱，150mm x 2.1mm，3μm；流动相A：含有2mmol甲酸铵+0.1vol％甲酸的水溶液；流动相B：2mmol甲酸铵+0.1vol％甲酸的乙腈-水溶液，其中乙腈与水的体积比为95:5；流速：0.3mL/min；进样量：10μL；洗脱程序见下表：

HPLC洗脱程序

时间min A％ B％ 0.00 95 5 4 95 5 7 5 95 13 5 95 13.1 95 5 18 95 5

B.质谱检测

质谱条件：采用正负离子同时扫描，在多反应监控MRM模式下对目标物进行定量分析，电喷雾离子源条件如下：

a)喷雾电压IS：4500V；

b)离子源温度：450℃；

c)碰撞气CAD为10psi；

d)气帘气CUR为25psi；

e)雾化气GS1为60psi；

辅助加热气GS2为60psi；

8种海洋毒素的MRM模式定量和确证参数如下表所示

2.如权利要求1所述的水产品中多种海洋生物毒素的液质联用检测法，其特征在于所述步骤(3)中，外标法定量的操作步骤为：将供试品溶液用高效液相色谱-质谱联用仪进行检测，得到供试品溶液的提取离子流色谱图，供试品溶液的各待测成分的峰面积与其对应的标准品的标准曲线比较，计算得到供试品溶液中各待测成分的浓度，相应换算得到待测水产品样品中各待测成分的含量；

待测水产品样品中各待测成分的含量根据如下计算公式得到：

X＝C*V/m，式中：

X－待测水产品样品中待测成分含量，单位为μg/kg；

C－供试品溶液中待测成分的浓度，根据标准曲线计算得到，单位为μg/L

V—定容体积，单位为mL；

m－待测水产品样品质量，单位为g。

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