CN115856153A - 一种检测蟹可食用部分中8种雌激素残留的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测蟹可食用部分中8种雌激素残留的方法，具体包括以下步骤：(1)配制标准溶液；(2)提取双水相体系；(3)超高效液相色谱串联质谱仪测定。本发明中分离过程简单，稳定性好，杂质干扰小。目标物被高效地提取到上相有机相中，蟹肉及蟹黄蛋白质悬浮于两相中间，水溶性杂质分配在下相水相。本发明所建立的乙腈‑硫酸铵(磷酸氢二钾)‑水双水相体系，粘度低、易成相，无乳化现象。本发明中，小分子有机溶剂双水相萃取体系是一种绿色环保的萃取方法，实验过程中产生的毒性小。本发明中，提取设备简单，实验成本低，费用小。
Description
技术领域
本发明属于有机污染物残留检测技术领域，涉及一种蟹可食用部分雌激素残留的检测方法，特别涉及一种双水相萃取结合液相色谱串联质谱技术同时检测蟹可食用部分中8种雌激素含量的方法。
背景技术
蟹类的营养价值非常丰富，含有大量蛋白质、维生素和微量元素，对身体有很好的滋补作用。蟹的氨基酸组成中含有丰富的精氨酸，精氨酸能参与人体代谢和排毒工作，适量食用可促进肌体能量平衡，对体内毒素起到很好的排泄作用。蟹类的维生素A含量高于其它陆生及水生动物，维生素B2含量是肉类的5-6倍，鱼类的6-10倍，蛋类的2-3倍。蟹中还含有大量的硒，每100克的蟹中硒的含量高达56.7μg，硒可以提高人体的免疫力，还能起到预防肿瘤、抗癌的功效。
蟹类养殖过程中，对水体中的部分污染物会有富集作用。而目前水体中有多种雌激素类污染物的检出。这些水体中的污染物在蟹类生长过程中可能逐渐富集。因此，水产品中雌激素的残留检测，对人体饮食暴露风险评估和生态风险评估具有重要的意义。
双水相体系是由两种或两种以上水溶性化合物在水中以适当的浓度溶解，在一定条件下形成的互不相溶的水溶液体系。双水相萃取的基本原理同传统的液液萃取相似，即根据被分离物质在两相中不同的选择性分配来实现物质的分离。传统的液液萃取根据被分离物质在水和有机溶剂中的溶解度不同进行分配，而双水相体系中被分离物质受到离子键、氢键、疏水作用及范德华力等力的作用以及体系环境的影响，从而表现出更好的选择性。双水相萃取体系主要有高聚物-高聚物双水相体系、高聚物-无机盐双水相体系、表面活性剂双水相体系、小分子有机溶剂-无机盐双水相体系。小分子有机溶剂-无机盐双水相体系是一种新型的双水相体系具有以下特点：(1)小分子有机溶剂的粘度比聚合物小，传质速率快，分相速度快；(2)小分子有机溶剂的毒性较低，无溶剂残留；(3)原料成本低。因此，开展小分子有机溶剂-无机盐双水相体系的研发，有潜在的应用价值。
由于不同种类抗生素理化性质的差异，以及提取和净化过程的特异性，基质复杂性，以往的研究报道多数是关于少数几个雌激素的分析方法，尚未见双水相体系提取水产品中多种雌激素的报道。
发明内容
本发明的目的旨在克服现有技术的不足，提供了一种检测结果稳定、干扰小、快速、高效的同时测定蟹可食用部分8种雌激素残留的方法，即一种乙腈-硫酸铵(磷酸氢二钾)-水双水相体系提取，经超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪同时检测蟹可食用部分8种雌激素残留的方法。本发明中蟹可食用部分，包括蟹肉和蟹黄(蟹膏)，采用双水相萃取法提取，同时测定样品中8种目标雌激素的含量。选择水产养殖中常见的8种雌激素，包括天然雌激素和人工合成的雌激素，分别为辛基酚、壬基酚、双酚A、己烯雌酚、雌酮、17β-雌二醇、17α-乙炔雌二醇、雌三醇，采用单因素试验，选择最优的条件，得到最优条件下抗生素的最大萃取率。
为达到上述目的，本发明提供技术方案如下。
一种检测蟹可食用部分中8种雌激素残留的方法，具体包括以下步骤：
(1)配制标准溶液：标准品均用甲醇配制成100.00mg/L的储备液，内标物配置成10.00mg/L的溶液，-20℃避光冷藏保存，使用前稀释。
(2)提取双水相体系：
a.称取匀浆后的蟹肉(1.0g)和蟹黄/蟹膏(0.5g)样品于玻璃离心管中，加入指示回收率的内标物，涡旋混匀；
b.加入一定比例的有机溶剂-水溶液作为提取液，涡旋混合后静置；加入分相盐，涡旋混匀后静置得到液-液两相体系；
c.取上层液体，氮吹，获得残渣；将残渣用一定浓度的有机溶剂溶解、定容，正己烷除脂，取下清液过滤至进样小瓶，待测。
(3)超高效液相色谱串联质谱仪(UPLC-MS/MS)测定：
采用内标法，用超高效液相色谱串联质谱仪，定量检测蟹可食用部分中8种抗生素；所述的8种抗生素分别为辛基酚、壬基酚、双酚A、己烯雌酚、雌酮、17β-雌二醇、17α-乙炔雌二醇、雌三醇。
进一步地，步骤(2)中，萃取前分别加入100ng的NP-d8、OP-d7、BPA-d16、EE2-D4、DES-D8、E2-D3、E3-D3这8种内标物指示回收率。
进一步地，步骤(2)中，所述的有机溶剂-水溶液为体积浓度为75％的乙腈-水溶液。
进一步地，步骤(2)中，所述的提取液添加量为10mL，可适当根据样品量进行调整，一般为样品重量的10-20倍。
进一步地，步骤(2)中，加入提取溶剂后的静置时间为45min。
进一步地，步骤(2)中，所述的分相盐为硫酸铵(磷酸氢二钾)，添加量为1.8g。根据提取液量，分相盐可按比例适当增加或减少，分相盐应过饱和析出。
进一步地，步骤(2)中，加入分相盐后的静置时间为2.5-3h，乙腈和目标物进入到上相，考虑到分子运动的快慢，静置时间不宜过短。
进一步地，步骤(2)中，过滤使用针式过滤器过滤至棕色进样小瓶，针式过滤器选用孔径为0.22μm的有机相(尼龙)滤膜。
进一步地，步骤(3)中，选用岛津30A超高效液相色谱串联质美国AB公司的AB5500Q-trap质谱仪进行检测，色谱柱选用Waters Acquity UPLC BEH C18柱(0.7μm,2.1×100mm)；
进一步地，步骤(3)中，液相色谱分离参数为：流动相：A为0.1％氨水溶液，B为乙腈；梯度：0-2min 95％A；2.0-2.5min50％A；2.5-3.5min 50％A；3.5-4.0min5％A；4.0-6.0min5％A；6.0-6.1min 95％A；6.1-10.0min95％A流速0.3mL·min-1，进样量：5μL。质谱条件为：电离方式：ESI—；离子源温度为550℃，喷雾电压为-4500V，气帘气压力(CUR)为35psi，喷雾器压力(GS1)为50psi。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明中，双水相体系两相界面的张力低于有机溶剂与水之间的界面张力，从而在提取时两相的分散阻力小，使得目标物的传质速率快，提取效率高。
(2)本发明中，目标雌激素在两相中的分配行为受提取液种类及比例、分相盐、体系pH等多种因素的影响。因此，可通过调节各影响因素使目标抗生素分离达到最佳回收率。
(3)本发明中，分离过程简单，稳定性好，杂质干扰小。目标物被高效地提取到上相有机相中，蟹肉及蟹黄蛋白质悬浮于两相中间，水溶性杂质分配在下相水相。
(4)本发明所建立的乙腈-硫酸铵(磷酸氢二钾)-水双水相体系，粘度低、易成相，无乳化现象。
(5)本发明中，小分子有机溶剂双水相萃取体系是一种绿色环保的萃取方法，实验过程中产生的毒性小。
(6)本发明中，提取设备简单，实验成本低，费用小。
附图说明
图1为不同提取溶剂对8种雌激素的加标回收率统计分析图。
图2为不同净化方法对8种雌激素的加标回收率统计分析图。
图3为不同PSA用量对2种加标浓度下8种雌激素的加标回收率统计分析图。
具体实施方式
本发明实施例中的检测蟹可食用部分中8种雌激素残留的方法，具体包括以下步骤：(1)配制标准溶液：标准品均用甲醇配制成100.00mg/L的储备液，内标物配置成10.00mg/L的溶液，-20℃避光冷藏保存，使用前稀释。(2)提取双水相体系：a.称取匀浆后的蟹肉(1.0g)和蟹黄/蟹膏(0.5g)样品于玻璃离心管中，萃取前分别加入100ng的NP-d8、OP-d7、BPA-d16、EE2-D4、DES-D8、E2-D3、E3-D3这8种内标物指示回收率，涡旋混匀；b.加入体积浓度为75％的乙腈-水溶液作为提取液，提取液添加量为10mL，涡旋混合后静置45min；加入硫酸铵(磷酸氢二钾)，添加量为1.8g，涡旋混匀后静置2.5-3h得到液-液两相体系；c.取上层液体，氮吹，获得残渣；将残渣用一定浓度的有机溶剂溶解、定容，正己烷除脂，取下清液过滤至进样小瓶，待测，过滤使用针式过滤器过滤至棕色进样小瓶，针式过滤器选用孔径为0.22μm的有机相(尼龙)滤膜。(3)超高效液相色谱串联质谱仪(UPLC-MS/MS)测定：采用内标法，用超高效液相色谱串联质谱仪，定量检测蟹可食用部分中8种抗生素；所述的8种抗生素分别为辛基酚、壬基酚、双酚A、己烯雌酚、雌酮、17β-雌二醇、17α-乙炔雌二醇、雌三醇。选用岛津30A超高效液相色谱串联质美国AB公司的AB 5500Q-trap质谱仪进行检测，色谱柱选用Waters Acquity UPLC BEH C18柱(0.7μm,2.1×100mm)；液相色谱分离参数为：流动相：A为0.1％氨水溶液，B为乙腈；梯度：0-2min 95％A；2.0-2.5min50％A；2.5-3.5min 50％A；3.5-4.0min5％A；4.0-6.0min5％A；6.0-6.1min 95％A；6.1-10.0min95％A流速0.3mL·min-1，进样量：5μL。质谱条件为：电离方式：ESI—；离子源温度为550℃，喷雾电压为-4500V，气帘气压力(CUR)为35psi，喷雾器压力(GS1)为50psi。
实施例1：提取条件优化
蟹肉和蟹黄/蟹膏的基质复杂，主要以蛋白质为主，同时还含有脂肪、糖类、无机盐、水分等化合物。这些样品基质会影响待测物的提取效率，使检测结果产生误差，同时也会污染仪器，直接影响检测效率和准确率。因此，在污染物残留分析中，样品的前处理技术非常关键，主要目的是将目标化合物与样品基质分离，去除杂质干扰。同时，目标抗生素的种类多，物化性质差异大，为了实现蟹肉和蟹黄/蟹膏肉中多种抗生素提取效率的最大化，本发明采用单因素实验分别优化了双水相萃取体系中的提取溶剂、水相比例和分相盐。
(1)提取溶剂的选择：
提取溶剂的选择对目标物的提取效率具有重要的影响，需要考虑到目标物的理化性质、基质组成及成相能力。
本方法选择了构成小分子有机溶剂-无机盐双水相体系常见的3种有机溶剂，分别为甲醇、乙腈和异丙醇作为提取溶剂，加标回收率结果显示如图1所示，甲醇作为提取溶剂时无法有效提取AOZ和CTC，异丙醇作为提取溶剂时无法有效提取AOZ和DOX，其它抗生素的加标回收率范围分别为16.3-118.1％、46.9-100.2％、57.1-136.8％，这3种提取溶剂对磺胺类均有较好的回收率。从图2所示的绝对回收率来看，甲醇作为提取溶剂时对氟喹诺酮类有明显的基质效应，表现为信号增强，异丙醇同样使喹诺酮类的信号增强，说明醇类不适用于氟喹诺酮类的提取。从分相现象上来看，3种提取溶剂在分相盐的作用下均能形成双水相，相对密度均小于水，有利于分相后形成稳定的上相，在双水相的形成速度上乙腈＞甲醇＞异丙醇，亲水性越强形成双水相的能力越弱，且3种提取溶剂的粘度大小为异丙醇＞甲醇＞乙腈，由于乙腈的粘度低，提取过程中更有利于物质传递。综上，选用乙腈作为提取溶剂。
(2)净化过程的优化
蛋白质和其他主要动物组织成分均会对分析产生影响，因此需要对提取液进行有效净化后进行上机分析。
我们分别测试了5中不同的净化方法，具体为：
A.取双水相的上清液，经过0.22μm滤膜过滤后分析；
B.取双水相的上清液1mL加入2mL正己烷，涡轮混合3min,，3000h/r离心5min，取下层溶液，经过0.22μm滤膜过滤后分析；
C.取双水相的上清液2毫升加入150mg C18粉涡轮混合3min,，3000h/r离心5min，取上清液，经过0.22μm滤膜过滤后分析；
D.取双水相的上清液2毫升加入150mg PSA粉涡轮混合3min,，3000h/r离心5min，取上清液，经过0.22μm滤膜过滤后分析；
E.取双水相的上清液2毫升加入100mgPSA粉和100mgC18粉，涡轮混合3min,，3000h/r离心5min，取上清液，经过0.22μm滤膜过滤后分析。
5种净化方法的回收率如图2所示。从图中可知：
A方法对OP和NP的回收率均高于120％，而对E1的净化回收率低于60％，表明仅进行双水相萃取不进行进一步净化尚不能清除萃取液中的相关干扰，基质效应仍较强。
B方法对OP、NP和BPA的回收率均高于120％，与A方法相比，B方法对E1的回收率有了较大提高，表明加入正己烷后能够去除部分干扰，但仍有较高的基质效应。
C方法对OP和NP的回收率均高于120％，而对BPA和DES的净化回收率低于80％，表明加入150mg C18粉后能够去除部分干扰，但基质效应仍较强。
D方法对大部分雌激素的回收率均介于80％-120％之间，但对NP的回收率高达165.9％，表明加入150mg PSA分后能够去除部分干扰，但基质效应仍较强。
E方法对所有目标雌激素的回收率俊杰与96.36％-116.1％之间，表明结合C18粉和PSA粉，能够有效去除提取液中的基质干扰。
(3)PSA粉用量的优化
为了进一步提高目标雌激素的净化效率，对E方法中PSA的用量进行了进一步优化，分别采用100mg和150mg PSA粉进行净化，结果如图3所示。从图中可以看出，添加100mgPSA粉可以有效去除提取液中的基质干扰，在100ng/g添加量时的回收率为91.0-105.3％，在200ng/g添加量时的回收率为94.4％-128.6％。而将PSA粉添加量提高至150mg时，在100ng/g添加量时的回收率为70.7-118.6％，在200ng/g添加量时的回收率为75.2％-128.8％。
结果表明采用100mg的PSA更有利于目标雌激素的净化。
实施例2：检测方法的建立：
(1)HPLC MS/MS检测方法：
根据目标物的性质，选择ESI-电离模式进行检测。
液相色谱分离参数为：流动相：A为0.1％氨水溶液，B为乙腈；梯度：0-2min95％A；2.0-2.5min50％A；2.5-3.5min 50％A；3.5-4.0min5％A；4.0-6.0min5％A；6.0-6.1min95％A；6.1-10.0min95％A流速0.3mL·min-1，进样量：5μL。
质谱条件为：电离方式：ESI—；离子源温度为550℃，喷雾电压为-4500V，气帘气压力(CUR)为35psi，喷雾器压力(GS1)为50psi。
各激素的质谱检测条件，如表1所示。
表1 8种雌激素的质谱检测条件
注：*表示定量离子；**表示定量离子对应的碰撞能量。
(2)标准曲线、检出限和定量限
将8种雌激素混合标准溶液用80％的甲醇-水溶液稀释成一系列浓度梯度(1.37、4.12、12.35、37.04、111.11、333.33、500μg·L-1)，内标以100.0μg·L-1的浓度添加到标准品中，用内标法以理论浓度为横坐标，响应值(响应值＝目标物峰面积/内标物峰面积)为纵坐标绘制7点标准曲线，得到标准曲线和相关系数(R2)。
采用信噪比法(S/N)确定仪器的检出限和定量限，以3倍信噪比估算检出限(LOD)，10倍信噪比估算定量限(LOQ)。8种雌激素的标准曲线、相关系数、检出限和定量限如表3所示。
表3 8种雌激素的标准曲线、相关系数、检出限和定量限
(3)回收率
采用确定的前处理方法和检测方法，对蟹肉及蟹黄样品进行加标回收率实验。设置2组加标浓度，分别为50ng·g-1和100ng·g-1200ng·g-1每组样品做3个平行，计算加标回收率(RE)和相对标准偏差(RSD)。
加标回收率(RE％)的计算公式如下：
其中，C0为混合标准溶液的浓度，μg·L-1；C1为未加入混合标准溶液样品的检测浓度，μg·L-1；C2为加入混合标准溶液样品的检测浓度，μg·L-1；V0为混合标准溶液的体积，L；V1为未加入混合标准溶液样品的上机前定容体积，L；V2为加入混合标准溶液样品的上机前定容体积，L。
本方法考察了蟹肉及蟹黄中8种雌激素2个浓度的加标回收率，结果如4表所示。蟹肉和蟹黄中各抗生素的加标回收率分别为75.7-105.6％和85.1-114.1％，相对标准偏差均低于10％，加标回收率存在差异，说明不同抗生素存在不同的基质干扰；通过添加内标物计算加标回收率，并用其对检验结果进行校正，可以在一定程度上降低基质干扰带来的影响。
表4蟹肉及蟹黄样品中不同加标浓度的加标回收率及相对标准偏差
实施例3：实际样品的测定
采集上海市某水产养殖区不同种类的蟹，先采用本发明的前处理方法对目标物进行提取和净化，再采用本发明的检测方法对样的实际浓度进行检测分析，以考察本方法对不同种类蟹的适用性。
具体按以下步骤实施：
(1)抗生素的提取：双水相萃取和净化
称取匀浆后的蟹肉(1.0g)和蟹黄/蟹膏(0.5g)样品于玻璃离心管中，加入指示回收率的内标物，涡旋混匀；加入75％乙腈0.1％氨水(V/V)作为提取液，涡旋混合后静置；加入分相盐，涡旋混匀后静置得到液-液两相体系取双水相的上清液2毫升加入100mgPSA粉和100mgC18粉，涡轮混合3min,，3000h/r离心5min，取上清液，经过0.22μm滤膜过滤后分析。
(2)超高效液相色谱串联质谱仪(UPLC-MS/MS)测定
采用内标法，用超高效液相色谱串联质谱仪，定量检测蟹可食用部分中8种雌激素。
液相色谱分离参数为：流动相：A为0.1％氨水溶液，B为乙腈；梯度：0-2min95％A；2.0-2.5min50％A；2.5-3.5min 50％A；3.5-4.0min5％A；4.0-6.0min5％A；6.0-6.1min95％A；6.1-10.0min95％A流速0.3mL·min-1，进样量：5μL。
质谱条件为：电离方式：ESI—；离子源温度为550℃，喷雾电压为-4500V，气帘气压力(CUR)为35psi，喷雾器压力(GS1)为50psi。
表6蟹肉及蟹黄样品中8种雌激素素的含量
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明。对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的前提下，可以对已描述的实例做出的各种化、修改、替换和变型，应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种检测蟹可食用部分中8种雌激素残留的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制标准溶液：标准品均用甲醇配制成100.00mg/L的储备液，内标物配置成10.00mg/L的溶液，-20℃避光冷藏保存，使用前稀释；
(2)提取双水相体系，包括以下三个步骤：
a.称取匀浆后的蟹肉1.0g和蟹黄/蟹膏0.5g样品于玻璃离心管中，加入指示回收率的内标物，涡旋混匀；
b.加入有机溶剂-水溶液作为提取液，涡旋混合后静置；加入分相盐，涡旋混匀后静置得到液-液两相体系；
c.取上层液体，氮吹，获得残渣；将残渣用有机溶剂溶解、定容，正己烷除脂，取下清液过滤至进样小瓶，待测；
(3)采用超高效液相色谱串联质谱仪(UPLC-MS/MS)测定：
采用内标法，用超高效液相色谱串联质谱仪，定量检测蟹可食用部分中8种抗生素；所述的8种抗生素分别为辛基酚、壬基酚、双酚A、己烯雌酚、雌酮、17β-雌二醇、17α-乙炔雌二醇、雌三醇。
2.根据权利要求1所述的检测蟹可食用部分中8种雌激素残留方法，其特征在于：所述步骤(2)中，萃取前分别加入100ng的NP-d8、OP-d7、BPA-d16、EE2-D4、DES-D8、E2-D3、E3-D3这8种内标物指示回收率。
3.根据权利要求1所述的检测蟹可食用部分中8种雌激素残留方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述有机溶剂-水溶液为体积浓度为75％的乙腈-水溶液。
4.根据权利要求1所述的检测蟹可食用部分中8种雌激素残留方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述的提取液添加量为10mL，可适当根据样品量进行调整，一般为样品重量的10-20倍。
5.根据权利要求1所述的检测蟹可食用部分中8种雌激素残留方法，其特征在于：所述步骤(2)中，加入提取溶剂后的静置时间为45min。
6.根据权利要求1所述的检测蟹可食用部分中8种雌激素残留方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述的分相盐为硫酸铵(磷酸氢二钾)，添加量为1.8g；根据提取液量，分相盐可按比例适当增加或减少，分相盐应过饱和析出。
7.根据权利要求1所述的检测蟹可食用部分中8种雌激素残留方法，其特征在于：所述步骤(2)中，加入分相盐后的静置时间为2.5-3h，乙腈和目标物进入到上相，考虑到分子运动的快慢，静置时间不宜过短。
8.根据权利要求1所述的检测蟹可食用部分中8种雌激素残留方法，其特征在于：所述步骤(2)中，过滤使用针式过滤器过滤至棕色进样小瓶，针式过滤器选用孔径为0.22μm的有机相(尼龙)滤膜。
9.根据权利要求1所述的检测蟹可食用部分中8种雌激素残留方法，其特征在于：所述步骤(3)中，选用岛津30A超高效液相色谱串联质美国AB公司的AB 5500Q-trap质谱仪进行检测，色谱柱选用Waters Acquity UPLC BEH C18柱(0.7μm,2.1×100mm)。
10.根据权利要求1所述的检测蟹可食用部分中8种雌激素残留方法，其特征在于：所述步骤(3)中，液相色谱分离参数为：流动相：A为0.1％氨水溶液，B为乙腈；梯度：0-2min 95％A；2.0-2.5min50％A；2.5-3.5min 50％A；3.5-4.0min5％A；4.0-6.0min5％A；6.0-6.1min95％A；6.1-10.0min95％A流速0.3mL·min-1，进样量：5μL；质谱条件为：电离方式：ESI-；离子源温度为550℃，喷雾电压为-4500V，气帘气压力(CUR)为35psi，喷雾器压力(GS1)为50psi，辅助气压力(GS2)为50psi，碰撞气CAD为Medium，碰撞气为高纯氮气。
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