CN107300596B

CN107300596B - 一种适用于多种食物中有机磷酸酯阻燃剂含量检测的方法

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Publication number: CN107300596B
Application number: CN201710634191.0A
Authority: CN
Inventors: 丁锦建; 邓童庆; 王燕飞; 丁佳敏; 杨方星
Original assignee: Research Institute of Zhejiang University Taizhou
Current assignee: Research Institute of Zhejiang University Taizhou
Priority date: 2017-07-29
Filing date: 2017-07-29
Publication date: 2019-12-24
Anticipated expiration: 2037-07-29
Also published as: CN107300596A

Abstract

本发明涉及一种适用于不同食物样品基质中有机磷酸酯阻燃剂（OPFRs）同时快速测定的方法。通过改进的QuEChERS方法对食物中OPFRs残留进行提取净化，目标化合物的基质干扰得到有效去除，基质效应在92.3‑116.1%（除三苯甲基磷酸酯为65.9%），方法具有良好的选择性和稳定性，平均回收率78.6‑127.3%，相对标准偏差3.1‑9.7%。采用超高效液相色谱‑串联四级杆质谱仪（UPLC‑MS/MS）进行定性定量检测，具有很好的灵敏度，方法定量限为0.05‑0.42 ng·g^‑1。本发明实现了在不同食物样品种类的复杂基质中对痕量OPFRs的多残留同步快速检测，弥补了目前该领域技术的不足。

Description

一种适用于多种食物中有机磷酸酯阻燃剂含量检测的方法

技术领域

本发明属于有机磷酸酯阻燃剂的分析检测领域，涉及一种适用于不同食物基质的多种有机磷酸酯阻燃剂同时快速测定的方法。

背景技术

有机磷酸酯阻燃剂(Organophosphate flame retardants，OPFRs)具有良好的阻燃性能，且兼有增塑、润滑等多种功能，用途十分广泛。随着全球阻燃剂市场的不断扩大，以及卤系阻燃剂(如多溴二苯醚类等)因环境安全性等原因被限制使用，OPFRs作为一种优秀的替代品，其社会需求和产量均呈快速增长趋势。我国是OPFRs生产大国，年产能已超10万吨，而且使用量也在快速增长。绝大多数OPFRs以添加剂形式在不同材料(家具、建材、纺织品以及电子产品等)中使用，导致其在生产和使用过程中容易向周围环境释放。OPFRs的这种持续性排放已经造成了其在各种环境介质(大气、灰尘、水体等)中的广泛残留。部分OPFRs具有强烈生物效应，具有潜在人体健康威胁。

食物在生产、储存、加工等过程中不可避免地受到食物接触材料和环境介质中的OPFRs污染。早在上世纪80年代，就有学者发现食物中TnBP、TPhP和TEHP的残留，并评估了人群的膳食暴露量。然而直至目前，仍仅有少量研究调查了OPFRs在鱼类、家禽、母乳等有限的人类食物样品中的残留。制约食物中OPFRs分析的另一个原因是缺乏可靠、灵敏的分析方法。如上述鱼类、禽类中OPFRs研究采用了微波辅助萃取(MAE)-凝胶渗透色谱(GPC)/固相萃取(SPE)两步净化，GC-MS检测的方法；母乳样品采用了加速溶剂萃取(ASE)-GPC/柱层析净化，UHPLC-MS/MS检测，然而这些方法，一般仅适用于特定的样品种类，且均需耗费大量溶剂且处理时间长，同时萃取时可能引入大量脂肪、蛋白等生物大分子，需额外的净化步骤(GPC等)来降低基质效应的干扰。食物样品种类多，基质复杂，一般前处理手段难以完全排除基质效应对样品痕量OPFRs检测的干扰，且通常一种前处理方法也难以满足对不同样品基质的处理要求。

Anastassiades等于2003年开发了经典的QuEChERS方法，样品经均质后，用乙腈基质分散萃取溶剂，采用N-丙基乙二胺(PSA)等吸附剂去除绝大部分干扰物，并通过离心去除净化，具有快速(Quick)、简单(Easy)、廉价(Cheap)、高效(Effective)、可靠(Rugged)、安全(Safe)的特点。该方法问世以来，被众多学者改进推广，已成功应用于农产品等生物介质中农药以及多种污染物残留的分析。该方法受不同食物样品基质影响较小，且采用乙腈为萃取剂能有效降低脂肪等大分子的共萃出，简化后续净化步骤，且样品处理设备简单、溶剂用量少、快速。然而目前仍没有该方法在食物样品中OPFRs的应用研究报道。本方法基于QuEChERS方法原理，建立了一种满足多种食物基质的前处理方法，并利用UPLC-MS/MS的强大定性定量功能，实现了10种常用OPFRs的多残留快速检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于不同食物基质的OPFRs多残留快速检测方法，以弥补现有技术应用范围窄、溶剂消耗量大、基质干扰严重、灵敏度低等方面的不足。

本发明采用超声辅助萃取样品中的目标物，操作简单快捷、溶剂使用量少；无水MgSO₄+PSA+C18的分散固相萃取净化，能够有效去除基质中的干扰物质；UPLC-MS/MS具有较快的分析速度，较低的检测限和高选择性和灵敏度，适用于痕量污染物的检测。

本发明采用的技术方案如下：

一种适用于不同食物基质的OPFRs多残留快速检测方法，包括以下步骤：

(1)食物样品处理：取食物样品，匀浆；

(2)提取：取匀浆样品到离心管中，加入内标混合液，平衡；加入提取溶剂，涡旋混匀，超声萃取；

(3)净化：于步骤(2)离心管中加入无水NaCl和无水MgSO₄，涡旋混匀，离心，取上清液至新离心管，加入基质分散固相萃取剂以及无水MgSO₄，涡旋混匀，离心，取上清液氮吹浓缩，用醇溶剂替换并定容，最后过滤膜，所得样品液待测定；

(4)配制基质匹配内标标准工作溶液：将空白食物混合样品按上述步骤(1)至(3)处理，用所得样品基质溶液配制OPFRs内标标准工作溶液，用醇定容并过滤；

(5)样品检测：

采用超高效液相色谱-串联四级杆质谱测定步骤(3)、(4)所得溶液中的OPFRs。

优选地，步骤(1)食物样品处理：取适量洗净阴干的新鲜食物样品可食用部分置于玻璃试管中，用匀浆机充分匀浆；

优选地，步骤(2)提取：准确移取1.0-2.0g上述步骤(1)获得的匀浆样品于具塞玻璃离心管中，加入10-25ng内标混合液，平衡15-30min；加入4-5ml 0.5％甲酸-乙腈溶液，涡旋混匀1min，超声萃取15-30min；

优选地，步骤(3)净化：于步骤(2)离心管中加入400-500mg无水NaCl和400-500mg无水MgSO₄，涡旋混匀1min，3000r·min^-1离心5min，取上清液至新离心管，加入基质分散固相萃取剂PSA 30-60mg和C18 20-40mg以及200-400mg无水MgSO₄，涡旋混匀1min，3000r·min^-1离心5min，取上清液氮吹浓缩，用甲醇溶剂替换并定容至0.5ml，最后过0.22μm滤膜，所得样品液待测定；

优选地，步骤(4)配制基质匹配内标标准工作溶液：将空白食物混合样品按上述步骤(1)至(3)处理，用所得样品基质溶液配制OPFRs内标标准工作溶液，甲醇定容并过滤；标准工作溶液中各目标物系列浓度范围在0.1-100ng·ml^-1，各标准工作溶液中内标标准物浓度相同，为20-50ng·ml^-1；

优选地，步骤(5)样品检测：采用超高效液相色谱-串联四级杆质谱测定步骤(3)、(4)所得溶液中的OPFRs。

优选地，步骤(1)所述食物包括鱼肉、畜禽肉、蔬菜、谷物、牛奶、鸡蛋、豆腐的一种或多种的混合。

优选地，所述OPFRs包括TMP、TEP、TCEP、TCPP、TDCPP、TPhP、TnBP、TBEP、TCrP、TEHP中的一种或多种的混合，更优选地，所述OPFRs同时包括TMP、TEP、TCEP、TCPP、TDCPP、TPhP、TnBP、TBEP、TCrP、TEHP。

优选地，步骤(2)中有机溶剂中添加适量的酸，所述的酸为有机酸，选自甲酸、乙酸、三氟乙酸等，所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈等。

优选地，步骤(3)中分散固相萃取剂为同时包含PSA、C18；更优选地，步骤(3)中无水NaCl、无水MgSO₄、分散固相萃取剂PSA、C18的用量分别为400-500mg，400-500mg，30-60mg，20-40mg。

优选地，步骤(3)中样品转移时，用1-2ml 0.5％甲酸-乙腈溶液润洗原容器，润洗液离心取上清液合并到新容器。

优选地，步骤(3)中浓缩样品时氮吹至近干，剩余样品液体积50-100μL时进行溶剂替换。

优选地，步骤(4)中混合食物样品由与步骤(1)中等量的鱼肉、畜禽肉、蔬菜、谷物、牛奶、鸡蛋、豆腐的一种或多种的混合充分匀浆而成，优选地，选自由等量鱼肉、鸡肉、猪肉、蔬菜、牛奶充分匀浆而成的。

优选地，步骤(4)中基质匹配内标标准工作溶液中目标化合物浓度系列在0.1-100ng·ml^-1，内标物浓度与步骤(2)添加量一致，在20-50ng·ml^-1。

优选地，步骤(5)中目标物检测方法包括定性检测和定量检测；

优选地，定性检测：检测步骤(3)得到的样品液中目标化合物，若目标物总离子流色谱峰保留时间与基质标准工作溶液中一致，且定性、定量离子对均在此保留时间检出，则判断检出该目标化合物。

优选地，定量检测：检测步骤(4)得到的各浓度基质匹配内标工作液，以基质标准工作液中各浓度目标物与各自内标物定量离子对色谱峰面积比值对其相应浓度进行回归分析，得到内标标准工作曲线；将在相同条件下测得的步骤(3)样品液中目标物与各自内标物定量离子对色谱峰面积比值代入标准曲线，得到样品液中目标物含量，然后根据样品液所代表的试样质量及回收率计算得到样品中目标物含量。

优选地，步骤(5)检测条件为：

色谱参数：

色谱柱：Waters BEH C18柱(2.1mm×100mm×1.7μm)；

柱温：40℃；

进样量：2μL；

流动相：A：超纯水+0.1％甲酸，B：乙腈+0.1％甲酸；

流速：0.3ml·min^-1；

表1：梯度洗脱程序

时间(min)	A(％)	B(％)
			0	90	10
3	45	55
			6	45	55
6.5	0	100
			9.5	0	100
10	90	10
			11	90	10

质谱参数：

离子源：电喷雾电离，正电离模式(ESI+)；

质谱检测方式：多反应选择离子监测(MRM)；

毛细管电压：3.5kV；

脱溶剂气：氮气，流速800L·h^-1，温度为350℃；

碰撞气：氩气；

表2各OPFRs的定性离子对、定量离子对、碰撞能量

本发明具有如下优点：

(1)本发明采用改进QuEChERS方法对食物样品进行前处理，一方面以乙腈为基础萃取剂，降低基质干扰物的共萃取，同时使用PSA和C18两种分散萃取吸附剂，有效去除不同性质的干扰杂质，大大提高了方法灵敏度；另一方面大大降低方法溶剂使用量少、操作简单、快速、重现性好，适合大通量的食物OPFRs残留快速分析要求。方法基质效应在92.3-116.1％(除三苯甲基磷酸酯为65.9％)，平均回收率78.6-127.3％，相对标准偏差3.1-9.7％。

(2)本发明采用超高效液相色谱-串联四级杆质谱对目标物进行定性定量分析，在11min内实现10种OPFRs及其内标物同时快速分析，比普通液相色谱和气相色谱-质谱大大缩短了分析时间，适合大通量的食物检测，定性、定量更加准确。方法定量限为0.05-0.42ng·g^-1。

(3)本发明可同时满足鱼肉类、畜禽肉类、蔬菜类、谷物类、蛋奶类等不同类型的食物分析。

附图说明

图1为由等量鱼肉、鸡肉、猪肉、蔬菜、牛奶充分匀浆而成的混合食物基质匹配内标标准溶液10种OPFRs(10ng·ml^-1)总离子流色谱图。

图2为由等量鱼肉、鸡肉、猪肉、蔬菜、牛奶充分匀浆而成的混合食物基质匹配内标标准溶液7种内标(20ng·ml^-1)总离子流色谱图。

图3为实施例鸡肉样品中实测10种OPFRs总离子流色谱图。

图4为实施例鸡肉样品中7种基质添加内标(添加浓度20ng·ml^-1)总离子流色谱图。

图5为实施例青菜样品中实测10种OPFRs总离子流色谱图。

图6为实施例青菜样品检测内标标准溶液7种基质添加内标(添加浓度20ng·ml^-1)总离子流色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。

仪器和试剂

(1)仪器

超高效液相色谱(Acquity，美国Waters公司)，电喷雾电离(ESI)串联三重四极杆质谱(Xevo TQ-S，美国Waters公司)；氮吹浓缩仪(N-EVAP-12，美国Organomation公司)；T10高速分散机(德国IKA公司)；低速离心机(Centrifuge5430，德国Eppendorf公司)；分析天平(220g/0.1mg，ME204，瑞士Mettler-Toledo公司)。

(2)试剂

使用溶剂均为LC-MS级。纯甲醇购自美国FisherScientific，乙腈和二氯甲烷(Dichloromethane，DCM)购自J.T.Baker公司。甲酸(99％)购自百灵威。填料PSA购自美国Agilent公司，C18购自美国Welch公司，分析纯无水MgSO₄、NaCl均用乙腈洗涤、晾干，无水MgSO₄及NaCl 450℃烘烤4h以去除可能残留的有机物。

OPFRs标准品分别购自德国Dr.Ehrenstorfer公司和美国Accustandard公司。内标标准品分别购自美国Cambridge Isotope Laboratories和Sigma-Aldrich。

标准品分别用乙腈配制质量浓度为1-2mg·ml^-1的储备液，于-20℃保存。配制混合标准溶液和低浓度单标时用甲醇稀释。

实施例1

本实施例着重于分析方法基质效应、加标回收率和制作标准工作曲线。

步骤(1)：混合样品处理

取等量鱼肉、鸡肉、猪肉、青菜、牛奶各10g，混合后充分匀浆；

步骤(2)：提取

准确称取匀浆液1.0g于10ml具塞玻璃离心管，分别编号为A1-A7，B1-B7，其中A1-A7分别添加50μL不同浓度(1、5、10、50、100、500、1000ng·ml^-1)标准物质混合溶液和20μL内标混合溶液(1000ng·ml^-1)，A1-A7和B1-B7均加入4ml0.5％甲酸-乙腈，涡旋混匀1min，超声萃取10-15min。另取10ml离心管，编号C1-C7，加入4ml含0.5％甲酸的乙腈，涡旋混匀1min，超声萃取10-15min。

步骤(3)：净化

A1-A7，B1-B7和C1-C7中均加入400mg无水NaCl和400mg无水MgSO₄，涡旋混匀1min。在3000r·min^-1下离心5min，取上清液至相应编号的新离心管中。原离心管用2ml0.5％甲酸-乙腈润洗后，再次离心取上清液，合并两次上清液。在所有样品上清液中加入50mg PSA，30mg C18，200mg无水MgSO₄，涡旋混匀1min，3000r·min^-1离心5min后取上清液至相应编号的玻璃氮吹管中。原离心管用2ml0.5％甲酸-乙腈润洗后，再次离心取上清液，合并两次上清液，氮吹浓缩至近干，A1-A7样品用甲醇复溶至0.5ml，B1-B7和C1-C7样品分别加入50μL不同浓度(1、5、10、50、100、500、1000ng·ml^-1)标准物质混合溶液和20μL内标混合溶液(1000ng·ml^-1)，用甲醇定容至0.5ml。所有样品过0.22μm滤膜，所得样品液待测定。

步骤(3)：检测

样品检测方法参数同发明内容说明。

步骤(4)：标准曲线绘制

将样品系列A1-A7，B1-B7及C1-C7均以各目标化合物与相应内标物定量离子对的色谱峰面积比为纵坐标，目标物浓度为横坐标，绘制标准曲线，其中曲线B为标准物质工作曲线，各曲线相关系数R²分别为A：0.985-0.999，B：0.996-0.999，C：0.993-0.999。

步骤(5)：方法基质效应、加标回收率、方法定量限的计算

根据各响应曲线的斜率，可以分别计算方法基质效应(Matrix effect，ME)、绝对回收率(Absolute recovery，Ra)、相对回收率(Relative recovery，Rr)：

ME＝SlopeB/SlpoeC 公式1

Ra＝SlopeA/SlopeB 公式2

Rr＝SlopeA/SlopeC 公式3

其中SlopeA、SlopeB、SlopeC分别为样品A、样品B和样品C得到经内标校正的相对响应曲线的斜率。

质谱仪器检测限(Instrument detection limits，IDLs)计算方法为：连续测定5次进样的不同浓度(c：0.5、1、5ng·ml^-1)溶剂加标样品的仪器绝对响应值平均值和相对标准偏差(Relative standard deviation，RSD)，检测限计算公式为：

其中t_α为响应值在99％置信区间，自由度为5情况下的t检验分布区间值。取不同加标浓度计算值的最小值作为IDL。并根据IDL和相应的相对回收率计算得到方法定量限(Methodquantification limits，MQLs)。计算公式为：

MQL＝3×(IDL×0.5ml)/(1g×Rr) 公式5

本实施例中各OPFRs方法基质效应、加标回收率、仪器检测限和方法定量限如表3。

表3方法基质效应、回收率及检测限

实施例2

本实施例为本发明应用于鸡肉中的OPFRs检测。

步骤(1)：鸡肉样品处理

取洗净后鸡胸肉5g，充分匀浆；

步骤(2)：提取

准确称取鸡肉匀浆液1.0g共3份分别于10ml具塞玻璃离心管中，分别添加20μL内标混合溶液(1000ng·ml^-1)，加入4ml 0.5％甲酸-乙腈，涡旋混匀1min，超声萃取10-15min。

步骤(3)：净化

平行样品中均加入300mg无水NaCl和300mg无水MgSO₄，涡旋混匀1min。在3000r·min^-1下离心5min，取上清液至相应新离心管中。原离心管用2ml0.5％甲酸-乙腈润洗后，再次离心取上清液，合并两次上清液。上清液中加入40mg PSA，40mg C18，200mg无水MgSO₄，涡旋混匀1min，3000r·min^-1离心5min后取上清液至相应编号的玻璃氮吹管中。原离心管用2ml 0.5％甲酸-乙腈润洗后，再次离心取上清液，合并两次上清液，氮吹浓缩至近干，样品用甲醇复溶至0.5ml，样品过0.22μm滤膜，所得样品液待测定。

步骤(4)：检测

样品检测方法参数同发明内容说明。

实施例3

本实施例为本发明应用于青菜中的OPFRs检测。

步骤(1)：青菜样品处理

取洗净后青菜5g，充分匀浆；

步骤(2)：提取

准确称取1青菜匀浆液1.0g共3份分别于10ml具塞玻璃离心管中，分别添加20μL内标混合溶液(1000ng·ml^-1)，加入4ml 0.5％甲酸-乙腈，涡旋混匀1min，超声萃取10-15min。

步骤(3)：净化

平行样品中均加入300mg无水NaCl和400mg无水MgSO₄，涡旋混匀1min。在3000r·min^-1下离心5min，取上清液至相应新离心管中。原离心管用2ml0.5％甲酸-乙腈润洗后，再次离心取上清液，合并两次上清液。上清液中加入50mg PSA，30mg C18，200mg无水MgSO₄，涡旋混匀1min，3000r·min^-1离心5min后取上清液至相应的玻璃氮吹管中。原离心管用2ml0.5％甲酸-乙腈润洗后，再次离心取上清液，合并两次上清液，氮吹浓缩至近干，样品用甲醇复溶至0.5ml，样品过0.22μm滤膜，所得样品液待测定。

步骤(4)：检测

样品检测方法参数同发明内容说明。

Claims

1.一种适用于不同食物基质的OPFRs多残留快速检测方法，包括以下步骤：

(1)食物样品处理：取食物样品，匀浆；

(2)提取：取匀浆样品到离心管中，加入内标混合液，平衡；加入提取有机溶剂，涡旋混匀，超声萃取；

(3)净化：于步骤(2)离心管中加入无水NaCl和无水MgSO₄，涡旋混匀，离心，取上清液至新离心管，加入同时包含PSA、C18的基质分散固相萃取剂以及无水MgSO₄，涡旋混匀，离心，取上清液氮吹浓缩，用醇溶剂替换并定容，最后过滤膜，所得样品液待测定；

(5)样品检测：采用超高效液相色谱-串联四级杆质谱实现10种OPFRs及其内标物同时快速分析，测定步骤(3)、(4)所得溶液中的OPFRs，所述OPFRs同时包括TMP、TEP、TCEP、TCPP、TDCPP、TPhP、TnBP、TBEP、TCrP、TEHP；

该步骤的检测条件为：

色谱参数：

色谱柱：2.1mm×100mm×1.7μm的Waters BEH C18柱；

柱温：40℃；

进样量：2μL；

流动相：A：超纯水+0.1％甲酸，B：乙腈+0.1％甲酸；

流速：0.3ml·min^-1；

表1：梯度洗脱程序

质谱参数：

离子源：电喷雾电离，正电离模式；

质谱检测方式：多反应选择离子监测；

毛细管电压：3.5kV；

脱溶剂气：氮气，流速800L·h^-1，温度为350℃；

碰撞气：氩气。

2.如权利要求1所述一种适用于不同食物基质的OPFRs多残留快速检测方法，其特征在于，

步骤(1)食物样品处理：取适量洗净阴干的新鲜食物样品可食用部分置于玻璃试管中，用匀浆机充分匀浆；

步骤(2)提取：准确移取1.0-2.0g上述步骤(1)获得的匀浆样品于具塞玻璃离心管中，加入10-25ng内标混合液，平衡15-30min；加入4-5ml0.5％甲酸-乙腈溶液，涡旋混匀1min，超声萃取15-30min；

步骤(3)净化：于步骤(2)离心管中加入400-500mg无水NaCl和400-500mg无水MgSO₄，涡旋混匀1min，3000r·min^-1离心5min，取上清液至新离心管，加入基质分散固相萃取剂PSA30-60mg和C18 20-40mg以及200-400mg无水MgSO₄，涡旋混匀1min，3000r·min^-1离心5min，取上清液氮吹浓缩，用甲醇溶剂替换并定容至0.5ml，最后过0.22μm滤膜，所得样品液待测定；

步骤(4)配制基质匹配内标标准工作溶液：将空白食物混合样品按上述步骤(1)至(3)处理，用所得样品基质溶液配制OPFRs内标标准工作溶液，甲醇定容并过滤；标准工作溶液中各目标物系列浓度范围在0.1-100ng·ml^-1，各标准工作溶液中内标标准物浓度相同，为20-50ng·ml^-1；

步骤(5)样品检测：采用超高效液相色谱-串联四级杆质谱测定步骤(3)、(4)所得溶液中的OPFRs。

3.如权利要求1-2任一所述的适用于不同食物基质的OPFRs多残留快速检测方法，其特征在于，步骤(1)所述食物包括鱼肉、畜禽肉、蔬菜、谷物、牛奶、鸡蛋、豆腐的一种或多种的混合。

4.如权利要求1-2任一所述的适用于不同食物基质的OPFRs多残留快速检测方法，其特征在于，步骤(3)中样品转移时，用1-2ml 0.5％甲酸-乙腈溶液润洗原容器，润洗液离心取上清液合并到新容器；步骤(3)中浓缩样品时氮吹至近干，剩余样品液体积50-100μL时进行溶剂替换。

5.如权利要求1-2任一所述的适用于不同食物基质的OPFRs多残留快速检测方法，其特征在于，步骤(5)中样品检测方法包括定性检测和定量检测。

6.如权利要求1-2任一所述的适用于不同食物基质的OPFRs多残留快速检测方法，其特征在于，步骤(4)中食物混合样品选自由等量鱼肉、鸡肉、猪肉、蔬菜、牛奶充分匀浆而成的。