CN111257454B - 通过式spe/uplc-ms/ms快速测定植物油中的9种酚类抗氧化剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过式SPE/UPLC‑MS/MS快速测定植物油中的9种酚类抗氧化剂的方法，油样品中酚类抗氧化剂用酸化乙腈提取，正己烷除脂，上清液经通过式固相萃取柱净化，C18色谱柱分离，采用乙腈‑水流动相进行梯度洗脱，三重四极杆质谱电喷雾多反应监测模式(MRM)检测，外标法定量。9种抗氧化剂在各自质量浓度范围内线性关系良好，相关系数大于0.994。其中方法检出限为0.003～0.02mg/kg，定量限为0.01～0.05mg/kg。加标回收率在82.2％～115.2％之间，相对标准偏差均小于9.3％。该方法简单、高效、灵敏度高，适用于食用油中抗氧化剂的快速定性、定量分析。

Description

通过式SPE/UPLC-MS/MS快速测定植物油中的9种酚类抗氧化 剂的方法
技术领域
本发明属于食品检验领域，具体涉及一种通过式SPE/UPLC-MS/MS快速测定植物油中的9种酚类抗氧化剂的方法。
背景技术
食用油脂在加工、贮存、使用过程中极易受到光、热、酶、金属离子等作用而发生氧化酸败变质，特别是富含不饱和双键的植物油更易发生氧化变质。生产上，为防止食用油脂酸败，产生对人体有害的物质，在其中添加抗氧化剂防止或减慢油脂因空气的氧化作用变质，达到油脂原有的性质和营养价值。美国早在1947年就开始利用抗氧化剂来增加油脂的稳定性。目前没食子酸丙酯(PG)、2,4,5-三羟基苯丁酮(THBP)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、去甲二氢愈创木酸(NDGA)、叔丁基对羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基-4-羟甲基苯酚(Ionox-100)、没食子酸辛酯(OG)、2,6-二叔丁基对甲基苯酚(BHT)及没食子酸十二酯(DG)等为常用于食用油中的人工合成酚类抗氧化剂。酚类人工合成抗氧化剂抗氧化效果好、价格低廉被广泛应用于植物油的防腐败变质，常存在过量或违规使用问题。毒理学研究表明，抗氧化剂具有一定的毒性和致癌作用，如TBHQ能导致DNA损伤。许多国家对该类抗氧化剂的使用及限量做了明确规定，日本及欧盟等国家禁止任何食品中TBHQ等抗氧化。我国的食品安全国家标准GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中对部分抗氧化剂的最大使用限量做出了严格规定。食品中人工抗氧化剂的使用逐渐成为食品安全问题的焦点。
食品中抗氧化剂常用的检测方法有薄层色谱法、比色法、毛细管电泳法、气相色谱法(GC)、气相色谱串联质谱法(GC-MS)、高相液相色谱法(HPLC)和液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS)。其中，薄层色谱法和比色法在定性、定量方面存在不准确问题。气相色谱法和气相色谱串联质谱法对前处理要求高，方法相对复杂且抗干扰能力差。高相液相色谱法存在灵敏度差，定性不足等问题。液相色谱-串联质谱法因其高灵敏度、高选择性及定量定性准确等特性，已广泛应用于各种农兽残及添加剂的检测中。食用油中化学成分复杂，基质干扰严重。常用的前处理方法有液液萃取法、固相萃取柱法，凝胶色谱净化技术、固相微萃取法、基质固相分散法等，这些方法存在前处理过程复杂，耗时，需要大量有毒有机溶剂，回收率低及不能兼顾多种抗氧化剂等问题。Oasis PRiME HLB为通过型固相萃取柱，其特点是出色的除磷脂、蛋白及油脂等杂质，已有报道将其用于肉及肉制品、水产品、禽副产品等基质中兽药残留的检测。现行国家标准GB 5009.32-2016《食品安全国家标准食品中9种抗氧化剂的测定》中第二法为液相色谱-串联质谱法，方法只包括PG、THBP、NDGA、OG及DG共5种抗氧化剂，9种抗氧化剂只能用高效液相色谱法检测，极大限制了标准方法的使用。将通过式固相萃取与液相色谱-串联质谱法结合，分析植物油中酚类抗氧化剂的研究尚未见报道。
发明内容
本发明提供一种通过式SPE/UPLC-MS/MS快速测定植物油中的9种酚类抗氧化剂的方法，植物油样品经酸化乙腈提取，通过式Oasis PRiME HLB净化，经超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱检测，建立了同时检测植物油中9种酚类抗氧化剂的快速检测方法。采用的通过式Oasis PRiME HLB固相萃取柱无需活化和洗脱步骤，操作简单，效率高，可以有效的去除磷脂、脂肪和蛋白等干扰，降低了基体效应，提高了回收率。该方法简便快捷，灵敏度高，通量性好，检测效率高，特别适合植物油中酚类抗氧化剂的定性、定量检测。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种通过式SPE/UPLC-MS/MS快速测定植物油中的9种酚类抗氧化剂的方法，包括以下步骤：
(1)样品提取：称取植物油样品，加入含AP的0.5％甲酸-乙腈溶液，涡旋，超声，将上层提取液移出，残留油样再加入含AP的0.5％甲酸-乙腈溶液重复提取一次，合并两次提取液，加入乙腈饱和正己烷，涡旋除脂后弃去正己烷层，取乙腈层，得到提取液；
(2)净化：取提取液上Oasis PRiME HLB固相萃取柱，再加乙腈进一步淋洗，合并所用流出液，流出液于40℃氮吹浓缩至近干，甲醇复溶，加水稀释，涡旋混匀离心后，过滤膜；
(3)准确称取10mg各抗氧化剂标准物质，用甲醇溶于10mL棕色容量瓶中，定容至刻度，分别配制成标准储备液，将标准储备液用空白样品溶液逐级稀释，以各物质定量离子对的峰面积(Y)对其质量浓度(X)作标准曲线；各氧化剂为没食子酸丙酯、2,4,5-三羟基苯丁酮、叔丁基对苯二酚、去甲二氢愈创木酸、叔丁基对羟基茴香醚、2,6-二叔丁基-4-羟甲基苯酚、没食子酸辛酯、2,6-二叔丁基对甲基苯酚、没食子酸十二酯；
(4)净化后的样品进行超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱检测。
优选地，所述的色谱条件为：色谱柱：Waters HSS T3(100mm×2.1mm i.d.,1.8μm)；流动相：乙腈(A)和水(B)，梯度洗脱程序(A)：0-3min:10％→30％；3.0-5.0min:30％保持；5.0-10.0min:30％→95％；10.0-12.0min:95％保持；12.0-12.1min:95％→10％；12.1-14.0min:10％保持；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样体积：2μL。
优选地，所述的质谱条件为：离子源:电喷雾离子源(H-ESI)；离子化模式:负离子模式(ESI-)；毛细管电压:2.4KV；锥孔电压:40V；脱溶剂气温度500℃；离子源温度:150℃；脱溶剂气流速:850L/Hr；锥孔气流速:150L/Hr；碰撞气流速:0.12mL/min；扫描方式:多反应监测(MRM)。
优选地，所述的样品提取的具体方法为：称取均匀植物油样品1g于50mL聚丙烯具塞离心管中，加入10mL含50μg/mLAP的0.5％甲酸-乙腈(体积比)溶液，涡旋5min，超声10min，8000r/min离心5min，将上层提取液移至出，残留油样再加入8mL含50μg/mLAP的0.5％甲酸-乙腈(体积比)溶液重复提取一次，合并两次提取液，加入10mL乙腈饱和正己烷，涡旋除脂后弃去正己烷层，取乙腈层定容至20mL。
优选地，所述的样品净化的具体方法为：准确取5mL提取液上Oasis PRiME HLB固相萃取柱，再加3mL乙腈进一步淋洗，合并所用流出液，流出液于40℃氮吹浓缩至近干，用1mL甲醇复溶后，加1mL水稀释，涡旋混匀离心后，过0.22μm微孔滤膜。
有益效果
建立采用通过式固相萃取柱净化，超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)同时测植物油中9种酚类抗氧化剂检测方法。油样品中酚类抗氧化剂用酸化乙腈提取，正己烷除脂，上清液经Oasis PRIME HLB通过式固相萃取柱净化，C18色谱柱分离，采用乙腈-水流动相进行梯度洗脱，三重四级杆质谱电喷雾多反应监测模式(MRM)检测，外标法定量。结果表明：采用本实验建立的方法，没食子酸丙酯(PG)、2,4,5-三羟基苯丁酮(THBP)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、去甲二氢愈创木酸(NDGA)、叔丁基对羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基-4-羟甲基苯酚(Ionox-100)、没食子酸辛酯(OG)、2,6-二叔丁基对甲基苯酚(BHT)及没食子酸十二酯(DG)等9种抗氧化剂在各自质量浓度范围内线性关系良好，相关系数(R2)大于0.994。其中方法检出限(S/N＝3)为0.003～0.02mg/kg，定量限(S/N＝10)为0.01～0.05mg/kg。在0.05、5.0、50.0mg/kg三个添加水平下，9种抗氧化剂平均加标回收率在82.2％～115.2％之间，相对标准偏差(RSD)均小于9.3％。采用的通过式Oasis PRiME HLB固相萃取柱无需活化和洗脱步骤，操作简单，效率高，可以有效的去除磷脂、脂肪和蛋白等干扰，降低了基体效应，提高了回收率。该方法简单、高效、灵敏度高，适用于食用油中抗氧化剂的快速定性、定量分析。
附图说明
图1 9种抗氧化剂标准溶液MRM色谱图；
图2不同提取溶剂对抗氧化剂提取效率比较(A：不同抗氧化剂回收率；B：不同提取溶剂与甲醇提取回收率比较因子图)；
图3甲醇和乙腈作为提取溶剂时全扫描图；
图4不同除脂方式对抗氧化剂回收率的影响；
图5不同净化方式对抗氧化剂回收率的影响；
图6 9种抗氧化剂不同定容溶液中色谱峰不对称因子As图；
图7植物油中9种抗氧化剂基质效应评价图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
1.实验部分
1.1仪器与试剂
ACQUITYTM UPLC I-Class超高效液相色谱仪和Xevo TQ-S质谱仪，配有电喷雾(ESI)电离源和MasslynxTM色谱工作站(美国Waters公司)；色谱柱：AcquityUPLC BEH C18(100mm×2.1mm,1.7μm)。Sigma 3-18K高速冷冻离心机(德国Sigma公司)；超声波清洗器(宁波新芝生物科技有限公司)；MS3涡旋混合器(IKA公司)，N-EVAP-45位氮吹仪(美国Organomation公司)；SQP-电子天平(塞多利斯科学仪器有限公司)；超纯水(Milli-Q超纯水机)。
所需油样品均为市售。没食子酸丙酯(PG)、2,4,5-三羟基苯丁酮(THBP)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、去甲二氢愈创木酸(NDGA)、叔丁基对羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基-4-羟甲基苯酚(Ionox-100)、没食子酸辛酯(OG)、2,6-二叔丁基对甲基苯酚(BHT)及没食子酸十二酯(DG)等均购自北京曼哈格生物科技有限公司，纯度≥98％，没食子酸丙酯(PG)购自Dr.Ehrenstorfer公司，纯度≥95％；均4℃保存；L-抗坏血酸棕榈酸酯(AP)购自TCI公司，纯度＞97％；甲醇、乙腈、正己烷(色谱纯，德国默克公司)；甲酸(色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司)；水为超纯水；氮气(>99.999％)；固相萃取柱：
Figure BDA0002383607310000041
PRiME HLB,200mg/6mL，有机微孔滤膜(0.22μm,购自上海安谱科学仪器有限公司)。
准确称取10mg(精确至0.1mg)各抗氧化剂标准物质，用甲醇溶于10mL棕色容量瓶中，定容至刻度，分别配制成浓度为1mg/mL的标准储备液，于－18℃避光保存。移取各标准储备液用甲醇(含50μg/mLAP)稀释到适当的浓度得到抗氧化剂混合标准工作液，冷冻避光保存。
1.2色谱条件
色谱柱：Waters HSS T3(100mm×2.1mm i.d.,1.8μm)；流动相：乙腈(A)和水(B)，梯度洗脱程序(A)：0-3min:10％→30％；3.0-5.0min:30％保持；5.0-10.0min:30％→95％；10.0-12.0min:95％保持；12.0-12.1min:95％→10％；12.1-14.0min:10％保持。流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样体积：2μL。
1.3质谱条件
离子源:电喷雾离子源(H-ESI)；离子化模式:负离子模式(ESI-)；毛细管电压:2.4KV；锥孔电压:40V；脱溶剂气温度500℃；离子源温度:150℃；脱溶剂气流速:850L/Hr；锥孔气流速:150L/Hr；碰撞气流速:0.12mL/min；扫描方式:多反应监测(MRM)；抗氧化剂的定性定量离子对、裂解电压、驻留时间及碰撞能量见表2。
表1 9种抗氧化剂的质谱参数
Table 1 Optimized parameters of MS/MS fornine antioxidants
Figure BDA0002383607310000051
*Quantitativeproduct
1.4样品前处理
1.4.1样品提取
称取均匀油样品1g(精确至0.0001g)于50mL聚丙烯具塞离心管中，加入10mL含50μg/mLAP的0.5％甲酸-乙腈(体积比)溶液，涡旋5min，超声10min，8000r/min离心5min，将上层提取液移至出，残留油样再加入8mL含50μg/mLAP的0.5％甲酸-乙腈(体积比)溶液重复提取一次，合并两次提取液。加入10mL乙腈饱和正己烷，涡旋除脂后弃去正己烷层，取乙腈层定容至20mL，待净化。
1.4.2净化
准确取5mL提取液上Oasis PRiME HLB固相萃取柱，再加3mL乙腈进一步淋洗，合并所用流出液，流出液于40℃氮吹浓缩至近干，用1mL甲醇复溶后，加1mL水稀释，涡旋混匀离心后，过0.22μm微孔滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。
2结果与讨论
2.1仪器条件优化
2.1.1质谱条件优化
9种抗氧化剂均为含有不同酚羟基数的化合物，在ESI源下易电离形成负离子。将1μg/mL的9种抗氧化剂标准溶液通过蠕动泵注入质谱仪，通过一级质谱扫描获得相应的母离子，并通过优化喷雾电压、喷雾器温度等质谱参数获得最优离子源参数；随后通过子离子扫描选择信号强且稳定的碎片离子，分别确定定性离子及定量离子，进一步优化裂解电压、碰撞能量等参数，得到目标化合物的MRM质谱参数，具体见表1。
分析抗氧化剂结构式及质谱图发现，9种化合物均易失去H+形成[M-H]–的准分子离子峰，且因为多个酚羟基的存在，使得准分子离子峰成簇状存在(与同位素分布有所不同)，如PG会出现211.3[M-H]–、210.3[M-2H]–，在子离子中也会出现这种情况，这种簇状碎片离子峰共存的情况有助于我们对酚类抗氧化剂更好的辅助定性。通过实验发现其丢1个H+的[M-H]–碎片离子更稳定，推测原因是，丢失1个H+的带电碎片若进一步丢失离子或碎片在能量需求上会提高。二级碎裂方面，首先PG、OG及DG三种化合物均含有3个酚羟基，有相同的母体骨架。分析结果发现相似结构特征所产生的的离子碎片呈现出相同的规律，三种化合物二级碎片均为丢掉其支链结构，产生信号较强的碎片离子169.3[M-C3H6-H]–和124.1[M-C4H7O2-H]–。同理，依次分析其他几种抗氧化剂裂解规律，虽然母体骨架同PG不同，但其主要裂解规律均是丢失不同的支链结构得到信号强且稳定的碎片离子。此外BHT只有1个酚羟基，结构稳定，不易电离，电离结果发现[M-H]–碎片为其响应最高，最稳定碎片，确定其为定量离子，[M-OH]–为其定性离子。总之，通过对不同抗氧化剂裂解规律进行分析发现，化合物的质谱裂解表现同其结构特征密切相关，对于我们化合物准确定性具有较好确证作用。
2.1.2色谱条件优化
9种抗氧化剂极性差异大，在色谱柱上保留行为也有较大差异，常规C18色谱柱即能对所有化合物保留，但不同色谱柱在分离度和峰形上差别比较大。分别对BEH C18(50mm×2.1mm,1.7μm)、BEH C18(75mm×2.1mm,1.7μm)、BEH C18(100mm×2.1mm,1.7μm)、HSS T3(100mm×2.1mm,1.7μm)进行考察。发现，在相同色谱条件下，BEH C18短柱对9种抗氧化剂不能很好的分离，且峰拖尾严重，BEH C18(100mm×2.1mm,1.7μm)虽然分离上达到了要求，但是对于含酚羟基较多的PG、THBP、OG、及DG等化合物仍存在较严重的拖尾。HSS T3色谱柱具有消除酚类化合物或有机酸等化合物拖尾严重的问题，满足我们的要求。流动相方面，分别考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-10mmol/L醋酸铵溶液、乙腈-0.05％甲酸水溶液几种流动相对目标物的影响，结果发现乙腈较甲醇有更好的洗脱效果和峰形。加入适当甲酸在修饰峰形上效果更明显，但加入酸后部分抗氧化剂响应为降低，特别是BHT响应下降特别明显；加入醋酸铵后峰形拖尾严重，响应降低，因此选择乙腈-水为流动相。实验发现若检测目标物中不涉及BHT的情况下，可选择BEH C18(100mm×2.1mm,1.7μm)和乙腈-0.05％甲酸水溶液组合。对于9种抗氧化剂的同时检测，采用HSS T3(100mm×2.1mm,1.7μm)和乙腈-水的组合更合适，通过优化梯度洗脱程序，使目标物与杂质组分有效地分离，且峰形良好，满足要求，见图1。
2.2前处理条件优化
2.2.1提取剂的优化
食用油脂肪含量高，基质复杂，且9种酚类抗氧化剂性质差异较大，如何高效率、低杂质的提取是实验的关键第一步。分别考察了甲醇、乙腈、0.1％酸化乙腈、0.2％酸化乙腈、0.5％酸化乙腈、1％酸化乙腈作为提取剂的提取效果。结果发现，纯甲醇提取效率明显高于乙腈，但对提取液进行全扫描发现，甲醇提取的总离子响应为乙腈的2倍以上，且干扰峰更多，这应该是质子性溶剂甲醇对酚类抗氧化剂提取效果提升的同时对植物油中的杂质也有所提高。
如何将提取效率同降低共萃物同时兼顾，我们尝试在乙腈中加入不同浓度的甲酸，以期达到改变目标物化学行为的目的。由图2A可以看出，随着加入甲酸后，抗氧化剂提取效率有明显的提高，分析原因应该是对于弱酸性抗氧化剂，酸度的提高可以提高其分子状态所占比，表现为在非质子溶剂乙腈中溶解度提高。为了较直观的比较几种提取溶剂提取效率，设定乙腈提取效率为1，其他提取溶剂的提取效率与其比值为比较因子f，见图2B。通过分析比较因子发现，随着甲酸浓度的提高，提取效率提高，不同酸度提取溶剂提取效率趋势一致，其中DNGA变化最为明显，从其结构分析，含有4个酚羟基可能受酸的影响最大。而酸含量当达到1％后，部分化合物回收率反而有些降低，推测原因可能是酸含量过高对质谱响应有一定的抑制作用。综合考虑，选择0.5％的甲酸-乙腈为提取溶剂。
2.2.2提取体积及提取次数的优化
以0.5％的甲酸-乙腈为提取剂，考察不同提取体积不同抗氧化剂提取效率的影响。分别对提取1次、2次、3次提取次数进行考察发现提取2次回收率明显高于1次，进一步增加提取次数，回收率无明显提高，因此以0.5％的甲酸-乙腈提取两次对植物油中抗氧化剂进行处理。
2.2.3除脂方式的选择
正己烷作为除脂的一种常用方式，在现行国家标准中也是利用正己烷进行除脂。然而我们在实验中发现，当乙腈作为提取溶剂时，正己烷除脂后部分氧化剂会产生一定的损失。将正己烷萃取液氮吹，复溶后检测，图4折线为正己烷中溶解的抗氧化剂所占比例，发现BHT损失20％以上，其他抗氧化剂也有不同程度的损失，分析发现损失明显的BHA、Ionox-100、BHT、DG几种抗氧化剂在结构上由于苯环上有不同数量的叔丁基或烷基长链的取代而极性相对较低，更易溶于低极性的正己烷。当提取溶剂中加入一定的酸后，正己烷除脂并没有引起回收率降低，部分回收率反而有所提高，推测原因应该是酸度的提高使得酚羟基更高比例成分子状态而参与自身的电荷传递，提高了极性，酸度和极性的双重作用减少了目标物的损失。因此，本实验选择酸性乙腈提取后，正己烷进行除脂净化。
2.2.4固相萃取柱的选择
植物油中含有高含量的脂肪等杂质，直接提取不经净化容易污染仪器，堵塞色谱柱，带来严重基质效应，影响定量结果的准确性。文献报道对食品中抗氧化剂净化方式有直接提取、C18和HLB固相萃取柱，本实验对直接提取、C18、HLB固相萃取柱、中性氧化铝柱、氨基柱及PRiME HLB固相萃取柱几种前处理净化手段进行比较。选择空白花生油基质分别在加标回收、净化液全扫描及基质效应等方面进行比较。结果显示，几种净化方式在抗氧化剂保留上有较大差异、表现为回收率存在一定的差异。首先国标GB5009.32-2016中所用的C18固相萃取柱净化方式对植物油存在一定的缺陷，C18对9种抗氧化剂的保留不强，超过50％含量的目标物在上样过程中损失，在洗脱步骤仅有6.95％～53％含量的目标物，有的文献将这两部分合并后浓缩，实验发现两部分合并后回收率提高了但净化效果却大大下降。同样，实验发现氨基柱和中性氧化铝两种常用除脂固相柱在对不同抗氧化剂保留上表现出了不同的选择性，各自分别对的BHA、Ionox-100、BHT和BHA、Ionox-100、BHT、TBHQ有一定的回收率，其他抗氧化剂几乎无回收率，分析原因是两种正相模式固相萃取柱对于结构上含酚羟基多的极性稍强抗氧化剂作用力太强，不容易洗脱下来。
由回收率比较图5可以看到，HLB固相萃取柱对所有抗氧化剂都有一定的保留，但回收率有一定的差别，TBHQ、BHA、BHT、Ionox-100四种抗氧化剂回收率小于40％，PG、THBP、NDGA、BHA、OG、DG回收率在60％～80％，分析原因可能是HLB为亲水亲脂平衡共聚合填料，含有特定比例的亲水基和疏水基：疏水性的二乙烯基苯结构保留非极性化合物，亲水性的N-乙烯基吡咯烷酮结构保留极性化合物，HLB的保留强弱与抗氧化剂的结构或酚羟基个数有一定的关系。PRiME HLB填料是在亲水-亲脂共聚物填料HLB基础上开发的反相固相萃取净化材料，具有极强水浸润性，无需活化和平衡步骤，操作简单，效率高，净化过程只吸附杂质，目标成分不保留，该种净化手段有效净化了样品，同时提高了分析的通量性。PRiME HLB对所有抗氧化剂回收率满意，体现了其较好的通量性。此外，基质效应考察结果发现，PRiMEHLB净化效果超过C18和HLB。对PRiME HLB过程进行优化发现，直接上样收集后有几种抗氧化剂有小于10％的损失，需要进一步的乙腈洗脱，因此本净化过程合并两次洗脱液后回收率和净化效果均满意。因此本研究选择用酸化乙腈提取后，取一部分上PRiME HLB固相萃取柱净化。
2.2.5样品定容液的选择
分别对乙腈、甲醇、甲醇-水(体积比，80+20)、甲醇-水(体积比，50+50)、甲醇-水(体积比，20+80)几种定容溶剂进行考察。结果发现不同的溶剂定容液，色谱峰形和质谱信号的有一定的差异。质谱响应上，甲醇与乙腈相比目标物响应高，不同比例甲醇水响应变化不大，当甲醇比例降到20％时响应有所下降，应该是水比例升高不利于目标物在离子源上雾化导致响应有所下降。峰形方面，以色谱峰的不对称因子(As)对色谱峰进行评价，As＝b/a，a为10％峰高处前半峰的宽度，b为同高度处后半峰的宽度，当As大于1时为拖尾峰，当As小于1时前延峰。从表2可以看到以PG、THBP、TBHQ、NDGA几种保留弱的抗氧化剂受溶剂效应影响大，在高比例有机相中有明显前延峰，降低有机相比例，前延峰得到较好改善。PG、THBP、TBHQ、NDGA、DG等几个化合物有稍微峰拖尾，在可接受范围。分析原因应该为极性稍大的几种抗氧化剂在色谱上保留弱更容易受产生明显的溶剂效应；峰拖尾为弱酸性化合物的典型峰特征，与其结构中酚羟基的取代数有一定的关系。综合考虑，选择甲醇-水(体积比，50+50)溶液作为样品定容液。
表2 9种抗氧化剂不同定容溶液中色谱峰不对称因子As表
Table 2 The Asymmetry factor(As)of different solvents to nineantioxidants
Figure BDA0002383607310000091
2.3线性范围、相关系数及定量限
将标准储备液用空白样品溶液逐级稀释浓度为1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50、100、250、500、1000ng/mL的系列标准工作溶液。按浓度由低到高依次测定，以各物质定量离子对的峰面积(Y)对其质量浓度(X)作标准曲线，其线性相关系数均大于0.994。采用空白基质加标的方法，以信噪比S/N＝10得到目标物的定量限(LOQ)，以信噪比S/N＝3得到目标物的检出限(LOD)。结果见表3，9种抗氧化剂检出限在0.003-0.02mg/kg之间，定量限在0.01-0.05mg/kg之间，与现行方法比较具有较高灵敏度，表4。
表3 9种抗氧化剂的回归方程、线性相关系数、线性范围、检出限及定量限
Table 2 Linear equation,Correlation coefficient,Linear range,limitsof detection and quantitation of nine antioxidants
Figure BDA0002383607310000111
表4 9种抗氧化剂在现有标准及文献中的定量限(mg/kg)
Table 3 The LOQ ofnine antioxidants in references
Figure BDA0002383607310000112
*括号中为SN/T 3849-2014第二法(液质法，第一法为液相法定量限为20mg/kg)的定量限文献1：张璐,孔祥虹,李建华,et al.固相萃取-超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法同时测定食品中13种抗氧化剂[J].分析试验室,2014(1):43-47.
文献2：凌云,储晓刚,张峰,等.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定调味料中的17种防腐剂和抗氧化剂[J].色谱(8):723-730
2.4回收率和精密度
分别在花生油、玉米油、大豆油中添加0.05、0.5、5.0mg/kg三个浓度水平的9种抗氧化剂标准溶液，每个浓度水平重复测定6次，按照1.2所述前处理方法进行提取净化，最后经UPLC-MS/MS测定，回收率及精密度的数据如表5所示，加标回收率在82.2％～115.2％范围内，相对标准偏差均小于9.3％。
表5不同食用油中9种抗氧化剂加标回收率及精密度(n＝6)
Table 4 Average recoveries and RSDs of nine antioxidants in oilsample matrices(n＝6)
Figure BDA0002383607310000121
2.5基质效应
液相色谱-串联质谱具有较高的灵敏度，但基于其检测原理，存在一定的基质效应(Matrix effrct,ME)，我们通过正己烷除脂结合PRiME HLB对样品提取液净化后，可以较好的去除盐、蛋白、脂肪及磷脂等干扰成分，降低样品的基质效应。本文通过提取后添加法定量评价9种抗氧化剂在食用油中的基质效应。本方法分别测定了空白样品处理液与纯溶剂中添加同水平目标成分的响应值，计算二者的相对比值来评价基质效应(Matrix Effect,ME):ME％＝(空白基质匹配标准溶液响应/纯溶剂标准溶液响应-1)×100％。绝对值越大表示基质效应越强，ME为负值表示存在基质抑制；ME为正值表示存在基质增强，零为无基质效应。采用如上所述方法对花生油(HS)、玉米油(YM)、橄榄油(GL)、大豆油(DD)及调和油(TH)5种植物油中9种抗氧化剂的基质效应进行评价，见图6。研究发现，不同抗氧化剂在不同植物油中基质效应存在一定的差异，基质效应较小的为花生油和玉米油，基质效应稍严重的为橄榄油和调和油，分析原因可能与不同植物油中杂质差异有关。不同抗氧化剂在不同植物油中受影响程度不同，在色谱上出峰晚的抗氧化剂基质效应更明显。本实验采用空白基质匹配校正曲线定量，以减少基质干扰对结果的影响。
2.6实际样品测定
采用本试验建立的分析方法对市场上购买的玉米油、调和油、花生油等20批次样品进行分析，有6批次植物油检出抗氧化剂，1批次花生油中PG、Ionox-100、DG含量分别为0.05mg/kg、0.12mg/kg、0.15mg/kg；2批次胡麻油中Ionox-100含量分别为3.15mg/kg和27.6mg/kg；1批次牡丹籽油中BHT含量为36.0mg/kg；2批次紫苏油中NDGA含量分别为6.03mg/kg和14.8mg/kg。
3结论
本文建立了采用新型通过式固相萃取柱净化，超高效液相色谱-串联质谱分析植物油中9种抗氧化剂的通量检测方法。该方法通过保留杂质的通过式净化手段，结合高灵敏度的UPLC-MS/MS检测方法，实现了不同植物油基质中9种抗氧化剂的同时检测。该方法样品前处理简便快速，定性、定量准确，可满足植物油中9种抗氧化剂的快速检测，大幅提高了检测效率，降低了检测成本。
对比例1
对市场上购买的玉米油、调和油、花生油等20批次样品进行分析，方法为：将实施例1中的提取剂替换为乙腈时，其他条件不变，结果显示，BHT损失20％以上，其他抗氧化剂也有不同程度的损失，而且抗氧化剂的含量检出限高，不适用于低含量样品。并且由于植物油基质复杂干扰因素多，使得其检测准确度不高，由此可见将提取剂替换为乙腈，抗氧化剂的溶出率低，提取效果不好，是不适于低含量抗氧化剂的检测的。对试样进行加标回收实验，发现回收率为71.09％～88.10％，回收率偏低，此方法技术效果差。
对比例2
对市场上购买的玉米油、调和油、花生油等20批次样品进行分析，方法为：将实施例1中的前处理过程的净化手段替换为C18、HLB固相萃取柱、中性氧化铝柱、氨基柱时，C18对9种抗氧化剂的保留不强，超过50％含量的目标物在上样过程中损失，在洗脱步骤仅有6.95％～53％含量的目标物；实验发现氨基柱和中性氧化铝两种常用除脂固相柱在对不同抗氧化剂保留上表现出了不同的选择性，各自分别对的BHA、Ionox-100、BHT和BHA、Ionox-100、BHT、TBHQ有一定的回收率，其他抗氧化剂几乎无回收率；HLB固相萃取柱对所有抗氧化剂都有一定的保留，但回收率有一定的差别，TBHQ、BHA、BHT、Ionox-100四种抗氧化剂回收率小于40％，PG、THBP、NDGA、BHA、OG、DG回收率在60％～80％，PRiME HLB对所有抗氧化剂回收率满意，体现了其较好的通量性。
对比例3
对9种抗氧化剂标准溶液进行分析，方法为：将实施例1中的定容溶液更换为乙腈时，以PG、THBP、TBHQ、NDGA几种保留弱的抗氧化剂受溶剂效应影响大，在高比例有机相中有明显前延峰，影响目标物的定性分析及准确定量。同时，将定容溶剂更换为乙腈时，目标物的质谱响应下降，降低了分析的灵敏度。最后，对市场上购买的玉米油、调和油、花生油等20批次样品进行分析时，发现由于植物油样品基质复杂性，将定容溶剂更换为乙腈时，不能有效的对目标物进行准确定性和定量，严重影响了植物油中抗氧化剂的检测，此方法技术效果差。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (4)

1.一种通过式SPE/ UPLC-MS/MS快速测定植物油中的9种酚类抗氧化剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）样品提取：称取植物油样品，加入含AP 的0.5%甲酸-乙腈溶液，涡旋，超声，将上层提取液移出，残留油样再加入含AP 的0.5%甲酸-乙腈溶液重复提取一次，合并两次提取液，加入乙腈饱和正己烷，涡旋除脂后弃去正己烷层，取乙腈层，得到提取液；
（2）净化：取提取液上Oasis PRiME HLB固相萃取柱，再加乙腈进一步淋洗，合并所有流出液，流出液于40℃氮吹浓缩至近干，甲醇复溶，加水稀释，涡旋混匀离心后，过滤膜；
（3）准确称取10 mg各抗氧化剂标准物质，用甲醇溶于10mL棕色容量瓶中，定容至刻度，分别配制成标准储备液，将标准储备液用空白样品溶液逐级稀释，以各物质定量离子对的峰面积Y对其质量浓度X作标准曲线；各氧化剂为没食子酸丙酯、2,4,5-三羟基苯丁酮、叔丁基对苯二酚、去甲二氢愈创木酸、叔丁基对羟基茴香醚、2,6-二叔丁基-4-羟甲基苯酚、没食子酸辛酯、2,6-二叔丁基对甲基苯酚、没食子酸十二酯；
（4）净化后的样品进行超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱检测；
色谱条件为：色谱柱：Waters HSS T3，尺寸为100 mm×2.1 mm i. d., 1.8 μm；流动相：乙腈A和水B，梯度洗脱程序：0-3 min: 10% A→30%A；3.0-5.0 min: 30% A保持；5.0-10.0 min: 30% A→95% A；10.0-12.0 min: 95% A保持； 12.0-12.1 min: 95% A→10% A；12.1-14.0 min:10% A保持；流速：0.3 mL/min；柱温：35 ℃；进样体积：2 μL。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，质谱条件为：离子源: 电喷雾离子源H-ESI；离子化模式: 负离子模式ESI-；毛细管电压: 2.4 KV；锥孔电压: 40 V；脱溶剂气温度500 ℃；离子源温度: 150 ℃；脱溶剂气流速: 850 L/Hr；锥孔气流速: 150 L/Hr；碰撞气流速: 0.12 mL/min；扫描方式: 多反应监测MRM。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，样品提取的具体方法为：称取均匀植物油样品1 g于50 mL聚丙烯具塞离心管中，加入10 mL含50 μg/mL AP 的0.5%甲酸-乙腈（体积比）溶液，涡旋5 min，超声10 min，8000 r/min离心5 min，将上层提取液移至出，残留油样再加入8 mL 含50 μg/mL AP 的0.5%甲酸-乙腈（体积比）溶液重复提取一次，合并两次提取液，加入10 mL乙腈饱和正己烷，涡旋除脂后弃去正己烷层，取乙腈层定容至20 mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，样品净化的具体方法为：准确取5 mL提取液上Oasis PRiME HLB固相萃取柱，再加3 mL乙腈进一步淋洗，合并所用流出液，流出液于40℃氮吹浓缩至近干，用1 mL甲醇复溶后，加1 mL水稀释，涡旋混匀离心后，过0.22 µm微孔滤膜。
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