CN110412181A - 一种南极磷虾中PAEs和BHT的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种南极磷虾中PAEs和BHT的检测方法。邻苯二甲酸酯是一种常用的增塑剂，具有类雌性激素和抗雄性激素的作用，可干扰机体内的内分泌系统。2,6‑二叔丁基对甲酚是一种常见的酚类抗氧化剂，可作为食品添加剂防止食物酸败，但目前尚不允许将BHT添加至海产品中，而PAEs由于与塑料之间的结合能力弱，易释放至水体中从而沉积在海洋动物中。本公开提供了一种南极磷虾中PAEs和BHT的检测方法，通过有机溶剂提取浓缩后经固相萃取净化，再通过气相‑质谱进行检测。本公开提供的检测方法具有良好的检测精度，南极磷虾作为一种良好的药物/保健品原料，提供精确可靠的检测方法具有推广意义。
Description
技术领域
本公开属于南极磷虾中污染物检测技术领域，具体涉及一种南极磷虾中邻苯二甲酸酯与2,6-二叔丁基对甲酚的检测方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
邻苯二甲酸酯(Phthalate Esters,PAEs)又称酞酸酯，常见的PAEs有16种，通常作为增塑剂应用。动物实验研究表明，PAEs具有类雌性激素作用和抗雄激素作用，可干扰机体的内分泌系统、生殖系统等，对于水体中的沉水植物、无脊椎动物、脊椎动物也存在显著的影响。由工业生产形成的微塑性碎片(<5mm)可在陆地和海洋环境中迁移和积累，加之PAEs和塑料的结合力较弱，易释放到环境中，并通过多种途径至南冰洋，有研究报道在冻干南极磷虾制品中检测出了邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl Phthalate,DBP)。
2,6-二叔丁基对甲酚(Butylated Hydroxytoluene,BHT)是一种常见的酚类抗氧化剂，属于环境雌激素，可作为食品添加剂用于防止食品的腐败酸败与变质，延长货架期。但BHT具有急、慢性毒性与促癌性，主要表现在对动物肝脏及肺的器质性和功能性等的损伤，目前还未允许BHT出现在鲜水产以及冷冻水产品中。
目前已有的PAEs检测方法主要针对饮食、饮水等样品，常用的前处理方法包括索氏提取、液液振荡萃取、凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatography,GPC)、固相萃取(Solid Phase Extraction,SPE)等。南极磷虾的基质复杂、油脂含量丰富，通常采用固相萃取作为南极磷虾的前处理分析方法。针对BHT的检测方法通常采用薄层色谱、比色法、红外光谱、高效液相色谱、GC-MS等方法检测。专利CN201711116714.9中提供了一种针对海产品中邻苯二甲酸酯的固相萃取-气质联用检测方法，通过超声提取待测样品的有机提取液，通过浓缩固相萃取净化后经气-质联用进行检测，对16种邻苯二甲酸酯回收率可以达到74～116％。
发明内容
南极磷虾是维持南冰洋生态系统稳定的关键物种，也是重要的医药原料来源。为了保证生态环境及南极磷虾作为医药加工原料的安全问题，发明人认为提供南极磷虾中邻苯二甲酸酯及2,6-二叔丁基对甲酚的检测方法具有重要的意义。为了实现该目的，本公开提供了南极磷虾中邻苯二甲酸酯的检测方法，检测准确性相比背景技术中所述专利得到进一步的提升；另外，本公开还提供了南极磷虾中2,6-二叔丁基对甲酚的检测方法。
为了实现上述技术效果，本公开提供以下技术方案：
本公开第一方面，提供一种南极磷虾中邻苯二甲酸酯的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：向待测南极磷虾中加入乙腈进行超声提取，将乙腈提取液浓缩后经固相萃取洗脱，再通过气相-质谱进行检测。
本领域公知，精确的检测方法依赖于可靠的方法学，试剂和材料的选择都会影响到检测的精确度。本公开提供的检测方法，提取物通过固相萃取后经气相-质谱检测，检测精度超过现有技术中固相萃取-气相-质谱检测方法，且检测工艺更为简化。
优选的，所述超声条件为：20～30℃、250～350W、35～45kHz的条件下超声25～35min。
针对PAEs检测，现有技术中常用的提取试剂包括乙腈、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷以及不同配比的混合溶剂等，且试剂的选择还会影响后续固相萃取的活化问题。本公开针对上述提取试剂进行考察，研究结果表明采用乙腈作为提取试剂能够充分的将待测物质溶出，并且作为后续洗脱活化试剂，能够实现良好的回收率。
优选的，乙腈提取液浓缩后经固相萃取洗脱具体步骤如下：将乙腈提取液去除水份后浓缩至无溶剂，加入乙腈复溶并定容得到乙腈浓缩液，将已经浓缩液通过固相萃取柱净化。
进一步优选的，所述乙腈提取物液除去水份的方式为：向乙腈提取物中加入无水硫酸钠。
进一步优选的，所述固相萃取柱为PAS/silica玻璃固相萃取柱，通过二氯乙烷、乙腈活化，采用乙腈作为洗脱液进行洗脱。
优选的，所述通过气相-质谱进行检测的具体步骤如下：获得固相萃取洗脱液后吹干，加入正己烷定容，进行气相-质谱检测。
进一步优选的，所述气相色谱采取程序式升温，升温方式如下：起始温度为55～65℃，保持0.8～1.2min，以18～22℃/min的速率升温至220℃，保持0.8～1.2min，再以4～6℃/min的速率升温至290℃，保持7～8min。
进一步优选的，所述气相色谱参数如下：色谱柱为HP-5MS石英毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度为300℃；分流进样，分流比为10:1，进样量为1μL；载气为高纯He(>99.999％)，恒流模式：流速为1mL/min。
进一步优选的，所述质谱条件为：电离方式为电子轰击电离源，电离能量为70eV；传输线温度为280℃，离子源温度为300℃；四极杆温度为150℃，检测方式为选择性离子检测方式。
优选的，上述检测方法中所使用的乙腈、正己烷、乙酸乙酯、环己烷、二氯乙烷均通过炭吸附高温蒸馏处理。
进一步优选的，所述炭吸附高温蒸馏处理步骤如下：将待处理试剂、活性炭、氧化铝、柠檬酸加入反应釜中加热，使待处理试剂的蒸汽通过冷凝柱中的活性炭后回流。
本公开第二方面，提供一种南极磷虾中2,6-二叔丁基对甲酚的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：向待测南极磷虾中加入二氯甲烷进行超声提取，将二氯甲烷提取液浓缩后经凝胶渗透色谱洗脱，再通过气相-质谱进行检测。
优选的，所述超声条件为：20～30℃、250～350W、35～45kHz的条件下超声25～35min。
优选的，所述将二氯甲烷提取液浓缩后经凝胶渗透色谱洗脱的具体步骤如下：将二氯甲烷提取液除水后浓缩至无溶剂，加入二氯甲烷复溶得到二氯甲烷浓缩液，将二氯甲烷浓缩液通过固相萃取柱净化。
进一步优选的，所述固相萃取柱为Florisil固相萃取柱，采用正己烷活化，采用二氯甲烷-乙酸乙酯作为洗脱液进行洗脱。
优选的，所述通过气相-质谱进行检测的具体步骤如下：获得固相萃取洗脱液后吹干，加入正己烷定容，进行气相-质谱检测。
进一步优选的，所述气相色谱采取程序式升温，升温方式如下：65～75℃保持1min，以8～12℃/min升至190～210℃保持3.5～4.5min，再以8～12℃/min升至275～285℃保持3.5～4.5min。
进一步优选的，所述气相色谱参数如下：色谱柱为5％苯基-甲基聚硅氧烷毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气为载气(He)，纯度≥99.999％，流速为1.00mL/min；进样口温度为230℃；进样量为1μL；进样方式为无分流进样，1min后打开阀。
进一步优选的，所述质谱条件为：离子源为电子轰击电离源；电离能量为70eV；离子源温度为230℃；GC-MS接口温度为280℃；溶剂延迟时间为8min；检测方式为选择性离子检测方式，每种化合物选择一个定量离子，2～3个定性离子。
与现有技术相比，本公开的有益效果是：
1.本公开提供了一种南极磷虾中PAEs的检测方法，加标回收率可达到80.32～104.36％，相对标准偏差为1.16～9.40％，是一种精确、便捷的检测方法，相比背景技术中提到的专利检测方法精确度更高。
2.本公开还提供了一种南极磷虾中BHT的检测方法，本公开提供的方法加标回收率为88.65～94.12％，RSD为2.52～5.74％，检测精确度良好。本领域内针对南极磷虾中BHT的检测研究较为空白，本公开提供检测方法为BHT的应用及食品添加剂的使用安全具有重要的意义。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为实施例1中16种PAEs标准品的色谱图；
图2为实施例1中经空白溶剂处理后的溶剂色谱图；
其中，图2(a)为环己烷-无水乙醇(8:2,v/v)混合溶液色谱图；
图2(b)为乙酸乙酯溶剂色谱图；
图2(c)为乙腈的色谱图；
图3为实施例1中经(a)固相萃取柱和(b)GPC净化后的色谱图；
图3(a)为经PAS/silica玻璃固相萃取柱净化后的色谱图；
图3(b)为经GPC净化后的色谱图。
图4为实施例1中南极磷虾样品中PAEs的色谱图；
图5为实施例2中BHT标准品的色谱图；
图6为实施例2中经过Florisil固相萃取柱和HLB固相萃取柱净化后的BHT色谱图；
其中，图6(a)为经过Florisil固相萃取柱净化后的BHT色谱图；
图6(b)为HLB固相萃取柱净化后的BHT色谱图；
图7为不同净化条件对南极磷虾中BHT的提取回收率。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中存在针对PAEs的检测方法精度不足，针对BHT的检测方法研究较为欠缺。为了解决如上的技术问题，本公开提出了一种南极磷虾中PAEs和BHT的检测方法。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。
实施例1
1材料、仪器与试剂
1.1样品材料
新鲜的南极磷虾由辽宁渔业集团于2018年第一季度在中国南极长城站(48.1区)附近的海域捕捞，体长为25～57mm。捕捞后的南极磷虾迅速于-80℃下冷冻保存，立即运回实验室并继续保存于-80℃下直至进一步分析。
1.2主要仪器设备
表1仪器设备
1.3标准品、主要试剂与材料
1.3.1标准品
含16种PAEs的混合标准溶液(正己烷为溶剂，浓度为1000mg/L，纯度均大于98％，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司)：DMP、DEP、DAP、DIBP、DBP、BMPP、DEEP、DPP、DHXP、BBP、DBEP、DCHP、DEHP、DPHP、DNOP及DNP。
1.3.2主要试剂与材料
表2试剂与材料
2实验方法与步骤
2.1标准系列溶液的配制
准确吸取1.00mL混合标准溶液，用正己烷定容至10mL，于4℃冰箱中避光保存。使用时用正己烷稀释成不同浓度梯度(0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00μg/mL)的标准系列溶液。
2.2空白溶剂处理
采用活性炭吸附高温蒸馏的方法进行空白溶剂处理：分别将500mL乙腈、15g粉末状活性炭、15g中性氧化铝、0.25g柠檬酸加入蒸馏烧瓶中，将10g颗粒状活性炭加入蒸馏柱中，将蒸馏烧瓶、蒸馏柱等一系列蒸馏装置组装完毕后，通入冷凝水，打开水浴锅，当水浴锅温度升至95℃时，热的乙腈气体经过布满颗粒状活性炭的蒸馏柱后被冷凝水冷凝，得到的第一次蒸馏液按照上述操作重复一次，得到不含PAEs的乙腈。以相同方法制备不含PAEs的乙酸乙酯、环己烷-无水乙醇(8:2,v/v)混合溶液。将上述纯化后的试剂用于后续实验。
2.3实验样品前处理及南极磷虾中邻苯二甲酸酯的检测
将新鲜的南极磷虾研磨至肉糜状，准确称取3组20g样品，分别与50mL纯化后的乙腈在玻璃离心管中混合，在25℃、300W、40kHz的条件下超声30min，以4800r/min离心10min，收集上清液。将上述过程重复三次。合并上清液，用无水硫酸钠(马弗炉中450℃烘烤4h)除去水分后在70℃下经旋转蒸发器浓缩至近干。将浓缩物复溶在乙腈中并调节体积至6mL，通过PAS/silica玻璃固相萃取柱净化，具体操作如下：用5mL二氯甲烷和5mL乙腈活化PAS/silica玻璃固相萃取柱，加入液体样品(收集流出液)，用5mL乙腈洗脱PAS/silica玻璃固相萃取柱(收集流出液)。将两次收集的流出液合并，在40℃下氮吹至干，用正己烷将体积调节至2mL，进行GC-MS检测。所有实验过程均在不接触任何塑料产品的情况下进行，以避免污染。
南极磷虾中PAEs的含量通过以下公式获得：
其中，M1是南极磷虾中PAEs的含量(μg/kg)，C是检测样品中PAEs的浓度(μg/mL)，C0是空白溶剂中PAEs的浓度(μg/mL)，V是上机定容体积(mL)，m是样品质量(g)，1000是换算系数。
2.4气相色谱质谱联用及凝胶渗透色谱的仪器条件
2.4.1色谱分析条件
色谱柱为HP-5MS石英毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度为300℃；分流进样，分流比为10:1，进样量为1μL；升温程序：起始温度为60℃，保持1min，以20℃/min的速率升温至220℃，保持1min，再以5℃/min的速率升温至290℃，保持7.5min。载气为高纯He(>99.999％)，恒流模式：流速为1mL/min。
2.4.2质谱分析条件
电离方式为电子轰击电离源，电离能量为70eV；传输线温度为280℃，离子源温度为300℃；四极杆温度为150℃。检测方式为选择性离子检测方式。
2.4.3凝胶渗透色谱净化条件
凝胶渗透色谱柱为300mm×25mm玻璃柱；填料为25g多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯(Bio-Beads S-X3)；流动相为乙酸乙酯-环己烷(1:1,v/v)混合溶液；流速为4.70mL/min；预淋洗时间为10s；净化除杂质时间为1000s；主要收集时间为1000s；尾流时间为300s；浓缩器温度为35℃，于19kPa下预浓缩，最后于21kPa下缓慢浓缩定容至1mL。
2.5不同成熟期、性别的南极磷虾个体中邻苯二甲酸酯的检测
2.5.1对南极磷虾进行分期、分雌雄工作
根据文献记载，通过对体长的测量，将南极磷虾的生长阶段分为六个生长期，第零期：6.7±1.2mm、第一期：28.7±3.0mm、第二期：36.0±2.9mm、第三期：43.6±3.3mm、第四期：50.3±1.9mm、第五期：54.2±2.2mm，从第一期开始检测，共检测5个期。通过测量南极磷虾的甲壳长度和宽度，并将测量值带入公式：D＝-1.04－0.416RCL+0.265RCW，雌性结果为正值，平均为0.27；雄性结果为负值，平均为-0.19。根据上述方法完成对南极磷虾的分期、分雌雄工作。
2.5.2不同期、性别的南极磷虾个体中邻苯二甲酸酯的检测
将分期、分雌雄后的南极磷虾各自研磨至肉糜状，不同生长期、性别的南极磷虾个体各准确称取3组，每组20g，按本实施例所述的样品前处理方法进行操作。不同生长期、性别的南极磷虾个体中PAEs的含量通过表3及以下公式获得：
表3 20克南极磷虾样本对应的个体数量
其中，M2是不同生长期、性别的南极磷虾个体中PAEs的含量(μg/kg)，C是检测样品中PAEs的浓度(μg/mL)，C0是空白溶剂中PAEs的浓度(μg/mL)，V是上机定容体积(mL)，m是样品质量(g)，x是20g样品所需的南极磷虾个体数量(表3)，1000是换算系数。
3结果与讨论
3.1 16种邻苯二甲酸酯标准品的实验结果
16种PAEs的标准曲线、标准品色谱图、保留时间及线性方程等其他实验结果如下表所示：
表4 16种PAEs的检测结果
如图1所示，本实施例中检测条件将16种PAEs标准品分离成功。表4中为16种PAEs的保留时间、线性方程、相关系数及其他实验结果，相关系数均大于0.9977，检测限和定量限分别对应3和10倍信噪比(Signal-Noise Ratio,S/N)，南极磷虾样品中PAEs的检测限和定量限分别为0.20～1.10μg/kg和0.67～3.70μg/kg。
3.2空白溶剂处理结果
环己烷-无水乙醇(8:2,v/v)混合溶液、乙酸乙酯和乙腈经活性炭吸附高温蒸馏处理后的实验结果如图2、表5所示：
表5空白溶剂处理结果
ND：未检出
1-原始试剂中PAEs的浓度
2-第一次处理后蒸馏液中PAEs的浓度
3-第二次处理后蒸馏液中PAEs的浓度
表5显示原始实验溶剂中存在PAEs，因此需要对原始实验溶剂进行活性炭吸附高温蒸馏的空白溶剂处理工作，以除去PAEs。空白处理后溶剂中的PAEs降低至未检出水平(图2、表5)，实验结果显示该方法可有效的从原始实验溶剂中去除PAEs。
3.3提取条件的选择
3.3.1提取溶剂的选择
本实施例以南极磷虾样品的加标回收率作为指标，比较了环己烷-无水乙醇(8:2,v/v)混合溶液、乙酸乙酯及乙腈对南极磷虾样品加标(加标水平为5μg/kg)回收率的提取效果。每组实验平行做三次。净化使用PAS/silica玻璃固相萃取柱，其活化溶剂为5mL二氯甲烷和5mL乙腈，洗脱溶剂为5mL乙腈。经GC-MS上机检测分析，确定最终提取回收率。
检测结果表明，环己烷-无水乙醇(8:2,v/v)混合溶液作为提取溶剂时，PAEs的提取回收率较低(多数低于70％)，此结果推测是PAEs属中等极性有机化合物，而环己烷极性较弱，难以从南极磷虾样品中充分提取PAEs，且无水乙醇有较强的亲水性，可渗透到南极磷虾内部与水互溶，使后期提取液的水分难以去除，同时残留的水分对色谱柱有一定的损坏；乙酸乙酯作为提取溶剂时，大多数PAEs的提取回收率高于80％，而少部分PAEs如：DMP、DEP、DIBP、DBP、DEHP的提取回收率低于80％，相对于乙腈作为提取溶剂而言，乙酸乙酯的提取结果欠佳；而乙腈作为提取溶剂时，PAEs的提取回收率均高于80％，为82.12～98.97％，相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)小于10％，为1.46～7.98％，满足分析检测的要求。综合考虑，选择乙腈为本实施例最佳提取溶剂。
3.3.2净化条件的选择
南极磷虾样品基质较复杂，富含油脂、色素等与PAEs性质相似的物质，因此在实验前处理过程中，提取溶剂会将目标物与油脂、色素等干扰杂质一并提取，使提取液颜色深、透明度低，若提取液不经过净化直接上机检测，会使最终的色谱图杂峰变多、基线不平稳、损坏色谱柱，甚至缩短色谱柱的使用寿命。在检测油脂含量丰富的样品中PAEs时，通常使用的净化条件为PAS/silica玻璃固相萃取柱、GPC，因此本实施例中比较了PAS/silica玻璃固相萃取柱及GPC对南极磷虾样品加标(加标水平为5μg/kg)回收率的提取效果。每组实验平行做三次。本实施例中以乙腈作为提取溶剂，考察不同净化条件对色谱图中杂质峰及提取回收率的影响。其中PAS/silica玻璃固相萃取柱在使用时，用5mL二氯甲烷和5mL乙腈活化，用5mL乙腈洗脱；GPC的净化条件如上所述。经GC-MS上机检测分析，不同净化条件得到的提取回收率、最终色谱图(图3)。
如图3显示，GPC净化效果不充分、杂质吸附效果较差、基质干扰较严重、色谱图基线不平稳、杂峰数量多，且在保留时间为16min、18min左右的基线干扰较严重，此结果推测是GPC含浓缩的环节，而南极磷虾样品中含有丰富的油脂、色素，这无疑增加GPC的净化负担；而经PAS/silica玻璃固相萃取柱净化后的色谱图基线平稳、无过多的杂峰，其净化效果优于GPC。除DEP、DAP、BMPP外，PAS/silica玻璃固相萃取柱净化后的提取回收率均高于GPC，大于80％，为81.16～98.87％，RSD为1.41～8.96％。综合考虑，选择PAS/silica玻璃固相萃取柱为本实验最佳净化条件，并用于后续不同生长期、性别的南极磷虾个体中PAEs的检测实验。
3.4方法的精密度与准确度
为验证上述实验方法的准确度与精密度，按上述的前处理与检测方法进行5μg/kg、15μg/kg、25μg/kg三个不同水平的加标回收实验，每个水平做三组平行实验，测得的平均回收率及RSD如表6所示，16种PAEs的加标回收率为80.32～104.36％，RSD为1.16～9.40％，低于10％，能够满足检测要求。
表6南极磷虾样品加标回收率与精确度考察结果
3.5南极磷虾中邻苯二甲酸酯的检测结果
采用最佳方法进行检测，南极磷虾中PAEs检测结果如图4所示，16种PAEs仅检出DIBP、DBP、DEHP三种，其余PAEs在南极磷虾中均未检出。
通过计算，本实施例采集的20g新鲜南极磷虾样品中DIBP、DBP、DEHP的含量分别为14.55μg/kg、364.50μg/kg、21.56μg/kg，超出了卫生部公告中规定的食品及食品添加剂中DBP、DEHP的最大残留量。
上述考察结果显示，采用乙腈提取、PAS/silica玻璃固相萃取柱净化的效果最佳，样品加标回收率为80.32～104.36％，RSD为1.16～9.40％。该方法是一种精确、便捷、适用于南极磷虾的PAEs提取检测方法。
实施例2
1材料、试剂与仪器
1.1样品材料
新鲜的南极磷虾由辽宁渔业集团于2018年第一季度在中国南极长城站(48.1区)附近的海域捕捞，体长为25～57mm。捕捞后的南极磷虾迅速于-80℃下冷冻保存，立即运回并继续保存于-80℃下直至进一步分析。
1.2主要仪器设备
表7仪器设备
1.3标准品、主要试剂与材料
1.3.1标准品
BHT标准品，纯度>99.5％，购自南京泰谱瑞仪器设备有限公司。
1.3.2主要试剂与材料
表8试剂与材料
2实验方法与步骤
2.1标准系列溶液的配制
准确称取10.0mg BHT标准品，用甲醇溶解并定容至10mL，于4℃条件下避光保存。使用时用甲醇稀释成不同浓度梯度(0.05、0.10、0.50、1.00μg/mL)的标准系列溶液。
2.2样品前处理及南极磷虾中2,6-二叔丁基对甲酚的检测
将新鲜的南极磷虾研磨至肉糜状，准确称取3组20g样品，分别与50mL二氯甲烷在玻璃离心管中混合，在25℃、300W、40kHz的条件下超声30min，以2500r/min离心10min，收集上清液。将上述过程重复三次。合并三次上清液，用无水硫酸钠(马弗炉中450℃烘烤4h)除去水分后在60℃下经旋转蒸发器浓缩至近干。将浓缩物复溶在二氯甲烷中并调节体积至6mL，然后通过Florisil固相萃取柱净化，具体操作如下：用5mL正己烷活化Florisil固相萃取柱，加入液体样品(收集流出液)，用6mL二氯甲烷-乙酸乙酯(1:1,v/v)混合溶液洗脱Florisil固相萃取柱(收集流出液)。将两次收集的流出液合并，在40℃下氮吹至干，用正己烷将体积调节至2mL，进行GC-MS检测。
南极磷虾中BHT的含量通过以下公式获得：
其中，M3是南极磷虾中BHT的含量(μg/kg)，C是检测样品中BHT的浓度(μg/mL)，C0是空白溶剂中BHT的浓度(μg/mL)，V是上机定容体积(mL)，m是样品质量(g)，1000是换算系数。
2.3气相色谱质谱联用的仪器条件
2.3.1色谱分析条件
色谱柱为5％苯基-甲基聚硅氧烷毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；升温程序为70℃保持1min，以10℃/min升至200℃保持4min，再以10℃/min升至280℃保持4min；载气为载气(He)，纯度≥99.999％，流速为1.00mL/min；进样口温度为230℃；进样量为1μL；进样方式为无分流进样，1min后打开阀。
2.3.2质谱分析条件
离子源为电子轰击电离源；电离能量为70eV；离子源温度为230℃；GC-MS接口温度为280℃；溶剂延迟时间为8min；检测方式为选择性离子检测方式，每种化合物选择一个定量离子，2～3个定性离子。
2.4不同成熟期、性别的南极磷虾个体中2,6-二叔丁基对甲酚的检测
2.4.1不同生长期、性别的南极磷虾个体中2,6-二叔丁基对甲酚的检测
将分期、分雌雄后(方法同实施例1)的南极磷虾研磨至肉糜状，每个期、性别的南极磷虾准确称取3组，每组20g，按上述前处理方法进行操作。不同生长期、性别的南极磷虾个体中BHT的含量通过表9及以下公式获得：
表9 20克南极磷虾样本对应的个体数量
其中，M4是不同生长期、性别的南极磷虾个体中BHT的含量(μg/kg)，C是检测样品中BHT的浓度(μg/mL)，C0是空白溶剂中BHT的浓度(μg/mL)，V是上机定容体积(mL)，m是样品质量(g)，x是20g样品所需的南极磷虾个体数量(表3-3)，1000是换算系数。
3结果与讨论
3.1 2,6-二叔丁基对甲酚标准品的实验结果
BHT的标准曲线、标准品色谱图、保留时间及线性方程等其他实验结果如下图表所示(图5、表10)：
表10 BHT的检测结果
采用最佳的实验条件，通过一系列不同浓度梯度(0.05、0.10、0.50、1.00μg/mL)的BHT标准系列溶液得出的标准曲线如表10所示，BHT标准品的色谱图如图5所示，表10列出了BHT的保留时间、线性方程、相关系数及其他实验结果。相关系数为0.9983。检测限和定量限分别对应于3和10倍S/N，磷虾样品中BHT的检测限和定量限分别为0.30μg/kg和1.00μg/kg。
3.2提取条件的选择
3.2.1提取溶剂的选择
选择合适的提取溶剂对目标化合物具有良好的萃取性能和实验准确度。BHT属于油溶性抗氧化剂，不溶于水，溶于有机溶剂。提取油脂含量丰富的食品中BHT时，通常用到的提取溶剂为乙腈、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷以及按不同比例配制的混合溶剂。在提取BHT时，考虑到乙腈的极性相对较强，除了目标化合物BHT外，还能将南极磷虾中色素等非目标物一并提取出来，使提取液颜色较深。本文以南极磷虾样品的加标回收率为指标，比较了乙酸乙酯、甲醇及二氯甲烷对南极磷虾样品加标(加标水平为5μg/kg)回收率的提取效果。每组实验平行做三次。净化使用Florisil固相萃取柱，使用时用5mL正己烷活化，用6mL二氯甲烷-乙酸乙酯(1:1,v/v)混合溶液洗脱。经GC-MS上机检测分析，检测最终的提取回收率。
甲醇作为提取溶剂时，BHT的提取回收率较低，此结果推测是甲醇的极性较强，能够将南极磷虾中大量的色素等非目标物与BHT一并提取至提取液中，使提取液呈现浑浊、颜色深的状态，增加了后续净化的工作难度，并影响最终的提取回收率；乙酸乙酯与二氯甲烷作为提取溶剂时，提取回收率均高于80％，其中二氯甲烷的提取回收率相对较高，为97.20％，RSD为1.60％，因此选择二氯甲烷为本实施例最佳提取溶剂，并用于后续不同生长期、性别的南极磷虾个体中BHT的检测实验。
3.2.2净化条件的选择
提取溶剂可以从实验样品中提取极性杂质、油以及目标化合物等，因此在上机检测之前需要进一步净化提取液。在检测富含油脂的食品中BHT等酚类化合物时，通常使用的净化条件为Florisil固相萃取柱、HLB固相萃取柱。其中，Florisil是一种常用的高选择性吸附剂，由硫化钠、氧化镁和二氧化硅组成，具有强极性，可从非极性溶液里萃取出极性化合物。HLB的亲脂亲水平衡填料经过独特的共聚合技术制备而成，含特定比例的疏水基和亲水基，其中疏水性的二乙烯基苯保留非极性化合物，亲水性的N-乙烯基吡咯烷酮保留极性化合物。HLB具有优良的水润湿性，可以借助水相对亲水-亲脂的平衡进行调节，从而获得理想的选择性。因此本实施例比较了以上两种固相萃取柱对南极磷虾样品加标(加标水平为5μg/kg)回收率及色谱图中杂峰的影响效果。其中，Florisil固相萃取柱的具体操作如下：用5mL正己烷活化固相萃取柱，加入液体样品(收集流出液)，用6mL二氯甲烷-乙酸乙酯(1:1,v/v)混合溶液洗脱固相萃取柱(收集流出液)。将两次收集的流出液合并，在40℃下氮吹至干，用正己烷将体积调节至2mL，进行GC-MS检测；HLB固相萃取柱具体操作如下：用5mL乙酸乙酯、5mL甲醇、10mL超纯水活化固相萃取柱，加入液体样品(收集流出液)，用6mL乙酸乙酯洗脱固相萃取柱(收集流出液)。将两次收集的流出液合并，在40℃下氮吹至干，用正己烷将体积调节至2mL，进行GC-MS检测，不同净化条件得到的色谱图及提取回收率如下所示(图6、图7)。
如图6所示，HLB固相萃取柱的净化效果相比于Florisil固相萃取柱而言，杂质吸附效果不佳、基线干扰较为严重、基线不平稳，在保留时间为11min左右出现明显的杂峰，说明HLB固相萃取柱对油脂、色素含量丰富的南极磷虾样品的净化能力不佳。如图7所示，经Florisil固相萃取柱净化后的提取回收率高于HLB固相萃取柱，为91.07％，RSD为4.55％。综合考虑，选择Florisil固相萃取柱为本实验最佳的净化条件，并用于后续不同生长期、性别的南极磷虾个体中BHT的检测实验。
3.3方法的精密度与准确度
为验证上述实验方法的准确度与精密度，按上述的前处理与检测方法进行2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg三个不同水平的加标回收实验，每个水平做三组平行实验，测得的平均回收率为88.65～94.12％，RSD为2.52～5.74％，能够满足检测要求。
3.4南极磷虾中2,6-二叔丁基对甲酚的检测结果
采用上述的最佳方法进行检测，在南极磷虾中检测出了BHT，其保留时间为10.38min，与表10的结果一致。
通过计算得出，本实施例中采集的20g新鲜南极磷虾样品中BHT的含量为7.69μg/kg。超出了我国规定的BHT在食品中最大允许使用量(0.20g/kg)。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种南极磷虾中邻苯二甲酸酯的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：向待测南极磷虾中加入乙腈进行超声提取，将乙腈提取液浓缩后经固相萃取洗脱，再通过气相-质谱进行检测。
2.如权利要求1所述南极磷虾中邻苯二甲酸酯的检测方法，其特征在于，所述超声条件为：20～30℃、250～350W、35～45kHz的条件下超声25～35min。
3.如权利要求1所述南极磷虾中邻苯二甲酸酯的检测方法，其特征在于，乙腈提取液浓缩后经固相萃取洗脱具体步骤如下：将乙腈提取液去除水份后浓缩至无溶剂，加入乙腈复溶并定容得到乙腈浓缩液，将已经浓缩液通过固相萃取柱净化；
优选的，所述所述乙腈提取物液除去水份的方式为：向乙腈提取物中加入无水硫酸钠；
优选的，所述固相萃取柱为PAS/silica玻璃固相萃取柱，通过二氯乙烷、乙腈活化，采用乙腈作为洗脱液进行洗脱。
4.如权利要求1所述南极磷虾中邻苯二甲酸酯的检测方法，其特征在于，所述通过气相-质谱进行检测的具体步骤如下：获得固相萃取洗脱液后吹干，加入正己烷定容，进行气相-质谱检测；
优选的，所述气相色谱采取程序式升温，升温方式如下：起始温度为55～65℃，保持0.8～1.2min，以18～22℃/min的速率升温至220℃，保持0.8～1.2min，再以4～6℃/min的速率升温至290℃，保持7～8min；
优选的，所述气相色谱参数如下：色谱柱为HP-5MS石英毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度为300℃；分流进样，分流比为10:1，进样量为1μL；载气为高纯He(>99.999％)，恒流模式：流速为1mL/min；
优选的，所述质谱条件为：电离方式为电子轰击电离源，电离能量为70eV；传输线温度为280℃，离子源温度为300℃；四极杆温度为150℃，检测方式为选择性离子检测方式。
5.一种南极磷虾中2,6-二叔丁基对甲酚的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：向待测南极磷虾中加入二氯甲烷进行超声提取，将二氯甲烷提取液浓缩后经凝胶渗透色谱洗脱，再通过气相-质谱进行检测。
6.如权利要求5所述南极磷虾中2,6-二叔丁基对甲酚的检测方法，其特征在于，所述超声条件为：20～30℃、250～350W、35～45kHz的条件下超声25～35min。
7.如权利要求5所述南极磷虾中2,6-二叔丁基对甲酚的检测方法，其特征在于，所述将二氯甲烷提取液浓缩后经凝胶渗透色谱洗脱的具体步骤如下：将二氯甲烷提取液除水后浓缩至无溶剂，加入二氯甲烷复溶得到二氯甲烷浓缩液，将二氯甲烷浓缩液通过固相萃取柱净化；
优选的，所述固相萃取柱为Florisil固相萃取柱，采用正己烷活化，采用二氯甲烷-乙酸乙酯作为洗脱液进行洗脱。
8.如权利要求5所述南极磷虾中2,6-二叔丁基对甲酚的检测方法，其特征在于，所述通过气相-质谱进行检测的具体步骤如下：获得固相萃取洗脱液后吹干，加入正己烷定容，进行气相-质谱检测；
优选的，所述气相色谱采取程序式升温，升温方式如下：65～75℃保持1min，以8～12℃/min升至190～210℃保持3.5～4.5min，再以8～12℃/min升至275～285℃保持3.5～4.5min。
9.如权利要求8所述南极磷虾中2,6-二叔丁基对甲酚的检测方法，其特征在于，所述气相色谱参数如下：色谱柱为5％苯基-甲基聚硅氧烷毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气为高纯He，纯度≥99.999％，流速为1.00mL/min；进样口温度为230℃；进样量为1μL；进样方式为无分流进样，1min后打开阀。
10.如权利要求8所述南极磷虾中2,6-二叔丁基对甲酚的检测方法，其特征在于，所述质谱条件为：离子源为电子轰击电离源；电离能量为70eV；离子源温度为230℃；GC-MS接口温度为280℃；溶剂延迟时间为8min；检测方式为选择性离子检测方式，每种化合物选择一个定量离子，2～3个定性离子。
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