CN113219077A - 一种动植物油脂中氯苯酚类持久性有机污染物残留量的检测方法 - Google Patents

一种动植物油脂中氯苯酚类持久性有机污染物残留量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种动植物油脂中氯苯酚类持久性有机污染物残留量的检测方法，该方法以动物油脂和植物油脂为研究对象，采用碱性甲醇溶液提取，正己烷脱脂，混合型阴离子交换固相萃取柱净化，经氮吹浓缩、酸化甲醇‑水溶液复溶后用UPLC/MS‑IT‑TOF法检测，13C6‑五氯苯酚内标法定量，该方法简单快速、回收率高、定性鉴别准确，弥补液相色谱‑串联质谱法对多氯苯酚类物质定性鉴别不准确的缺点。

Description

一种动植物油脂中氯苯酚类持久性有机污染物残留量的检测 方法
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种动植物油脂中氯苯酚类持久性有机污染物残留量的检测方法。
背景技术
2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、五氯苯酚是芳香族化合物中毒性大、污染较为严重的一类化合物，化学性质稳定，能够在环境中持久地存在，并可通过食物链在动植物体内累积，增加了其污染的危害程度。这些物质用作杀虫剂、有机溶剂和药物，普遍存在于炼油、炼焦、石化、塑胶、煤气和纸浆等工业废水和生活污水中，通过环境迁移可能会污染动植物。氯苯酚类有机物对生物组织具有较强的变性作用，对鱼类、贝类等水生生物的毒性较大。氯苯酚类有机物还可能与血液中的细胞，功能蛋白等发生作用，导致肺、肝，肾脏以及神经系统损伤。五氯苯酚和四氯苯酚还可能致白血病、淋巴瘤，因此，氯苯酚类有机污染物成为较受关注的一类优先控制的污染物。
一般而言，氯苯酚类有机物的毒性随着氯代程度的增加而增加。氯代程度越高，氯苯酚类有机物的亲脂性(亲油性)越大，被生物体摄取的可能性越大，毒性也越大。2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、五氯苯酚溶于非极性溶剂，溶于油脂中，通过环境迁移污染动植物进而可能污染动植物油脂，因此开展动植物油脂中这些物质的残留量检测对于食品安全具有重要意义。
CN201910087895.X一种水产品中五氯苯酚及其钠盐残留量的检测方法，其技术特点是样品用50％的硫酸溶液酸化后用正己烷萃取，无水硫酸镁除水，衍生化后气相色谱仪检测。
CN201510227648.7气相色谱-质谱法测定水生动物中19种氯代酚及其钠盐的方法，样品用50％的硫酸溶液在40℃恒温水浴摇床中摇荡，冷却后用二氯甲烷萃取，将有机相吸入离心管，离心管中加入质量百分浓度4％NaOH，摇荡后静置分层，弃去有机相，然后用磷酸溶液调节pH至6.2，再加入二氯甲烷-正己烷溶液摇荡后静置分层，弃去水相；有机相用饱和无水硫酸钠脱水后弃去水相，氮吹仪60℃下，将有机相浓缩，硅烷化衍生，气相色谱-质谱联用仪测定2-氯酚(2-MCP)、3-氯酚(3-MCP)、4-氯酚(4-MCP)、2,3-二氯酚(2,3-DCP)、2,4-二氯酚(2,4-DCP)、质量比1:1的2,5-二氯酚(2,5-DCP)+3,5-二氯酚(3,5-DCP)、2,6-二氯酚(2,6-DCP)、3,4-二氯酚(3,5-DCP)、2,4,6-三氯酚(2,4,6-TCP)、2,4,5-三氯酚(2,4,5-TCP)、2,3,4-三氯酚(2,3,4-TCP)、2,3,5-三氯酚(2,3,5-TCP)、2,3,6-三氯酚(2,3,6-TCP)、3,4,5-三氯酚(3,4,5-TCP)、2,3,5,6-四氯酚(2,3,5,6-TeCP)、2,3,4,6-四氯酚(2,3,4,6-TeCP)、2,3,4,5-四氯酚(2,3,4,5-TeCP)和五氯酚(PCP)。
GB 23200.92-2016《食品安全国家标准动物源性食品中五氯酚残留量的测定液相色谱-质谱法》，适用于猪肝、猪肾、猪肉、牛奶、鱼肉、虾、蟹等动物源食品中五氯酚残留的测定。其技术特点为试样中五氯酚残留用碱性乙腈水溶液提取，经MAX固相萃取柱净化，浓缩、定容后，用液相色谱-质谱仪检测和确证，外标法定量。
GB 29708-2013《食品安全国家标准动物性食品中五氯酚钠残留量的测定气相色谱-质谱法》，适用于猪的肌肉、肝脏和肾脏及鸡的肌肉和肝脏组织中五氯酚钠残留量的检测，其技术特点为样品用三氯乙酸沉淀蛋白，环己烷-乙酸乙酯溶液萃取五氯酚钠，乙酸酐-吡啶溶液衍生，气相色谱-质谱法测定，外标法定量。
SC/T 3030-2006《水产品中五氯苯酚及其钠盐残留量的测定气相色谱法》，适用于水产品中五氯苯酚及其钠盐残留量的测定，其技术特点为在酸性条件下样品中的五氯酚钠转化为五氯苯酚，用正己烷萃取，碳酸钾溶液反萃取，乙酸酐衍生化后用气相色谱法检测，外标法定量。
文献报道的研究对象主要集中在食品接触纸包装材料(纸制品、塑料制品、木制品)、地表水、生活饮用水、环境中土壤和沉积物等方面，食品中氯苯酚类检测方法报道较少。
发明专利、检测标准、文献报道的以食品中氯苯酚类化合物作为研究对象的检测方法存在以下不足：
(1)以气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法为主，其中气相色谱法、气相色谱-质谱联用法均需要对氯苯酚类化合物进行衍生化，然后再进行检测，虽然灵敏度较高，但存在步骤繁琐、衍生效率难控制、单样检测耗时长、回收率低等缺点；
(2)液相色谱法、液相色谱-串联质谱法直接测定氯苯酚类化合物，无需衍生，简单快速，但液相色谱二极管阵列检测法灵敏度低，不适用于痕量的氯苯酚化合物检测，容易导致假阴性；液相色谱-串联质谱法定性和定量能力较强，但对于不能碎裂形成子离子的多氯苯酚定性鉴别能力较差，容易受到基质中杂质的离子峰干扰，导致难以准确鉴别目标化合物。
(3)以食品中氯苯酚类化合物作为研究对象的检测方法较少，多以五氯苯酚(五氯酚)作为检测对象，检测项目单一，尚未有同时检测动植物油脂食品中2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、五氯苯酚等多种氯苯酚类持久性有机污染物的方法报道。
(4)超高效液相色谱(UPLC)–离子阱(IT)-飞行时间质谱(TOF)法由于具有多级碎裂能力，再结合精确分子量，可对食品中氯苯酚类同分异构体进行精确鉴别。利用不同物质精确分子量不同的特点，可以精确的从复杂基质中鉴别多氯苯酚，尤其适用于不能碎裂形成子离子的多氯苯酚的检测，克服了液相色谱-串联质谱存在的定性鉴别不足。目前尚未有应用于动植物油脂食品中多氯苯酚类持久性有机污染物检测的发明专利、标准、文献报道。
飞行时间质谱法作为一种高灵敏度、高通量的检测方法，欧阳培毓等建立了超高效液相色谱(UPLC)-四极杆飞行时间质谱(Q-TOF)测定沉积物中4种氯酚类物质苄氯酚(CP)、二氯酚(DCP)、六氯酚(HCP)、溴氯芬(BCP)的分析方法。样品用1％甲酸丙酮超声提取，强阴离子交换固相萃取柱净化富集，以Waters HSS C18柱(2.1mm×100mm,1.8μm)为分离色谱柱，采用0.004％甲酸水(V∶V)-甲醇作为流动相进行梯度洗脱，采用四极杆飞行时间质谱检测。该方法与本发明的检测物、检测项目、前处理过程、净化方法、色谱条件、质谱方法、定量方法等均不相同。
现有技术中没有采用(UPLC)–离子阱(IT)-飞行时间质谱(TOF)建立的动植物油脂食品中2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、五氯苯酚等多氯苯酚类持久性有机污染物的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种动植物油脂中氯苯酚类持久性有机污染物残留量的检测方法，该方法以动物油脂和植物油脂为研究对象，采用碱性甲醇溶液提取，正己烷脱脂，混合型阴离子交换固相萃取柱净化，经氮吹浓缩、酸化甲醇-水溶液复溶后用UPLC/MS-IT-TOF法检测，13C6-五氯苯酚内标法定量，简单快速、回收率高、定性鉴别准确，弥补液相色谱-串联质谱法对多氯苯酚类物质定性鉴别不准确的缺点。
本发明提供的新型的精确鉴别动植物油脂等复杂基质中多氯苯酚类持久性有机污染物的检测方法，具有气相色谱法、气相色谱质谱法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等无法比拟的鉴别能力。
本发明的上述目的可以通过以下技术方案来实现：一种动植物油脂中氯苯酚类持久性有机污染物残留量的检测方法，包括以下步骤：
(1)制备样品提取液：选取动物油脂或植物油脂置于离心管A中，加入内标标准溶液，加入碱化甲醇溶液，水浴振荡，取出，加入正己烷，涡旋，离心，将正己烷层转移至离心管B中，向离心管B中加入碱化甲醇溶液重复提取一次，弃去正己烷层，将下层液体合并于离心管A中，制得样品提取液；
(2)样品提取液的净化：将步骤(1)制得的样品提取液用水稀释后，调节pH值，用混合型阴离子交换固相萃取柱净化，弃去流出液，用酸化的甲醇-乙腈混合溶液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩至干，用酸性甲醇-水溶液复溶，过滤膜，制得待测液；
(3)标准品制备：配制2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚和五氯苯酚的标准溶液，各溶液浓度范围均为5ng/mL～500ng/mL，以13C6-五氯苯酚为内标，制作标准工作曲线；
(4)含量测定：将步骤(3)中的标准品，用超高效液相色谱(UPLC)-离子阱(IT)-飞行时间质谱(TOF)法测定，制作标准曲线，选取步骤(2)制得的待测液，用超高效液相色谱(UPLC)-离子阱(IT)-飞行时间质谱(TOF)法测定，根据标准曲线，获得食品中氯苯酚类持久性有机污染物的残留量。
在上述动植物油脂中氯苯酚类持久性有机污染物残留量的检测方法中：
本发明方法针对动物油脂和植物油脂，采用碱性甲醇溶液提取，正己烷脱脂，混合型阴离子交换固相萃取柱净化，经氮吹浓缩、酸化甲醇-水溶液复溶，过滤膜后用UPLC/MS-IT-TOF法检测，13C6-五氯苯酚内标法定量。
优选的，所述步骤(1)中所述动物油脂是指可食用的动物的脂肪，固体脂肪需用组织搅碎机搅碎；植物油脂是指来源于植物的可食用的油脂，如花生油、菜籽油、玉米油、芝麻油等植物油以及植物油之间混合制得的调和油。
进一步的，步骤(1)中制备样品提取液时：所述动物油脂是指可食用的动物的脂肪，固体脂肪需用组织搅碎机搅碎；植物油脂是指来源于植物的可食用的油脂，所述来源于植物的可食用的油脂包括花生油、大豆油、菜籽油、玉米油、葵花籽油、芝麻油、橄榄油、棕榈油、亚麻籽油、棉籽油和椰子油中的一种或几种的混合所得的调和油。
优选的，步骤(1)中制备样品提取液时：所述的内标标准溶液为13C6-五氯苯酚标准溶液，内标标准溶液的加入量为经步骤(1)和步骤(2)处理后在步骤(2)的待测液中的最终浓度为20～50ng/mL；所述动物油脂或植物油脂与所述碱化甲醇溶液的用量关系为2～4g：5～10mL；所述的碱化甲醇溶液是指用浓度为2～5mol/L氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液调节甲醇的pH为11～12。
在pH为11～12的碱性甲醇溶液条件下可使2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、五氯苯酚转化为相应的钠盐或钾盐，形成离子态，在离子态条件下溶于甲醇，不溶于正己烷，利用该特点可使用正己烷去除油脂。
优选的，步骤(1)中制备样品提取液时：水浴振荡时的温度为40～45℃，振荡频率为130～180转/分钟，振荡时间为0.5～1小时；所述正己烷与所述动物油脂或植物油脂之间的用量关系为1.5～3.5mL：2～4g，旋涡时以1800～2000转/分钟涡旋混合3～5分钟，离心时，6000～8000r/min离心2～5min，然后将正己烷层转移至离心管B中。
通过水浴加热振荡可加快2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、五氯苯酚转化为钠盐或钾盐，形成离子态，在离子态条件下溶于甲醇，不溶于正己烷。在此条件下可用正己烷脱脂，同时兼顾甲醇萃取和正己烷脱脂净化。1800～2000转/分钟涡旋混合可使碱化甲醇溶液与样品充分混合、充分接触，有利于提高目标化合物的萃取率。
优选的，步骤(1)中制备样品提取液时：对离心管B中的正己烷层进行重复萃取，向离心管B中加入的碱化甲醇溶液与正己烷层之间的用量关系为5～10mL：1.5～3.5mL，然后以1800～2000转/分钟涡旋混合3～5分钟，6000～8000r/min离心2～5min，弃去正己烷层，将下层碱化甲醇溶液合并于离心管A中，制得样品提取液。
对正己烷层进行重复萃取可使残留在正己烷中的目标化合物被碱化甲醇充分萃取，提高萃取回收率。
优选的，步骤(2)中样品提取液的净化时：将步骤(1)制得的样品提取液用超纯水稀释，所述样品提取液与所述超纯水之间的用量关系为10～20mL:20～40mL，调节pH值时，用浓度为2～5mol/L氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液调节用超纯水稀释后样品提取液的pH为11～12。
对样品提取液用超纯水进行稀释的目的是降低甲醇的比例，提高水的比例，有利于提高固相萃取净化回收率。稀释后的提取液调节pH为11～12可确保目标化合物处于离子态，在离子交换固相萃取净化时更容易保留在固相萃取柱上，提高回收率。
优选的，步骤(2)中样品提取液的净化时：混合型阴离子交换固相萃取柱填料是指商品化的基质为N-乙烯吡咯烷酮与二乙烯基苯按特定比例聚合再键合上季胺基团，优选采用Waters Oasis MAX混合型阴离子交换固相萃取柱，其是具有阴离子交换和反相两种吸附模式的固相萃取柱；混合型阴离子交换固相萃取柱规格为150mg/6mL～500mg/6mL(填料质量/柱体积)之间；固相萃取柱使用前需依次用6～12mL甲醇和6～12mL超纯水活化；将稀释后的样品提取液转移至固相萃取柱中，控制提取液体穿柱速度为0.5～1mL/min，弃去穿柱液，待样品提取液全部过柱后，向固相萃取柱中加入6～12mL超纯水，弃去穿柱液，负压抽干柱体中残留液体。
固相萃取柱填料质量直接影响目标化合物的萃取回收率。由于样品提取液中不可避免的存在可与固相萃取柱发生离子交换的杂质，这些杂质与目标化合物竞争吸附到固相萃取柱的填料中，当填料质量不能满足吸附杂质和目标化合物含量时，可能会出现目标化合物未能保留在填料中，导致回收率偏低，当混合型阴离子交换固相萃取柱规格为150mg/6mL～500mg/6mL(填料质量/柱体积)可获得满意回收率。
提取液中目标化合物离子与固相萃取柱填料之间的离子交换过程较慢，流速过快会导致回收率偏低，因此需控制提取液体穿柱速度为0.5～1mL/min。向固相萃取柱中加入6～12mL超纯水洗涤去除极性杂质和将填料由碱性洗涤至中性，去除残留的氢氧根离子。
优选的，步骤(2)中样品提取液的净化时：所述的酸化的甲醇-乙腈混合溶液是指先将色谱纯的甲醇与色谱纯的乙腈按照1:1～2:1体积混合，再用冰乙酸酸化，所述冰乙酸与所述甲醇-乙腈混合溶液的体积比为5～10：95～90，洗脱时所用的酸化甲醇-乙腈混合溶液体积为15～25mL，收集的洗脱液在48～55℃水浴条件下用氮气吹扫浓缩至干。
优选的，步骤(2)中样品提取液的净化时：所述的酸性甲醇-水溶液是先将色谱纯的甲醇和超纯水按照1:1～2:1混合，再加入冰乙酸酸化，冰乙酸与甲醇-水溶液之间的体积比为0.1～0.5：99.9～99.5。残留物用1～2mL酸化甲醇-水溶液复溶。用材质为聚四氟乙烯(PTFE)，孔径为0.22μm或0.45μm的针式滤器过滤，制得待测液。
优选的，步骤(3)标准品制备时：所述标准品用甲醇溶解配制标准储备溶液，再用步骤(2)所述的酸性甲醇-水溶液稀释配制2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚和五氯苯酚浓度均为5ng/mL～500ng/mL，13C6-五氯苯酚浓度为20～50ng/mL，制作标准工作曲线。
优选的，步骤(4)含量测定方法为超高效液相色谱(UPLC)-离子阱(IT)-飞行时间质谱(TOF)法，其液相色谱条件包括：色谱柱：waters ACQUITY UPLC BEH C18柱，100mm×2.1mm，1.7μm；流速：0.2～0.3mL/min；柱温：30～40℃；进样量：5～20μL；流动相A为：甲醇；流动相B为：10mmol/L乙酸铵溶液(含0.05％甲酸，体积百分含量)；梯度洗脱程序为：0.00min：A相，45％，B相，55％，2.00min：A相，45％，B相，55％，2.10min：A相，50％，B相，50％，12.00min：A相，50％，B相，50％，15.00min：A相，75％，B相，25％，18.00min：A相，75％，B相，25％，20.00min：A相，45％，B相，55％，22.00min：A相，45％，B相，55％，均为体积百分含量。
步骤(3)中质谱条件包括：离子源：ESI，负离子模式检测；采用自动扫描采集，加热模块温度：200～250℃；CDL温度：200～250℃；雾化器流速：1.3～1.5L/min；干燥气压力：100～120kPa；离子源电压：4.5kV；检测器电压：1.6～1.7kV；校准方法：自动调谐优化电压；外标法校准质量数；MS1采集范围为m/z 200～500，重复扫描3～5次，离子累积时间：20～50msec；MS2采集范围:m/z 50～500，重复扫描3～5次，离子累积时间：20～50msec，CID能量:10～30％，以MS1(一级质谱)色谱峰的峰面积进行13C6-五氯苯酚内标法定量。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)弥补动植物油脂中多氯苯酚类持久性有机污染物检测方法缺失，本发明应用超高效液相色谱(UPLC)-离子阱(IT)-飞行时间质谱(TOF)法建立了动植物油脂食品中2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、五氯苯酚等多氯苯酚类持久性有机污染物残留量同时检测方法，弥补超高效液相色谱(UPLC)-离子阱(IT)-飞行时间质谱(TOF)法检测氯苯酚类化合物的技术方法空白，完善检测方法体系；
(2)复杂基质中精准定性鉴别目标化合物，本发明利用飞行时间质谱技术，根据不同物质具有不同精确分子量的特点，精准的在复杂基质中鉴别不能碎裂形成子离子的多氯苯酚类物质，完全克服了液相色谱-串联质谱法对不能碎裂形成子离子的物质的定性鉴别不准确的缺点，目前尚未有应用于动植物油脂食品中多氯苯酚类持久性有机污染物检测的发明专利、标准、文献报道；
(3)利用物质形态转换，兼顾萃取和净化的前处理方法，解决动植物油脂中多氯苯酚有效萃取问题，根据动植物油脂食品特点，在水浴振荡条件下，采用了氢氧化钾或氢氧化钠溶液碱化甲醇使目标化合物形成易溶于水的钾盐或钠盐，形成离子态游离出来，在离子态条件下溶于甲醇，不溶于正己烷，在此条件下可用正己烷脱脂，该方法同时兼顾甲醇萃取和正己烷脱脂净化；
(4)13C6-五氯苯酚内标法定量，不受样品基质影响，定量更准确，本发明采用了13C6-五氯苯酚为内标物质对2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、五氯苯酚进行定量检测，不受样品基质影响，提高了超高效液相色谱(UPLC)-离子阱(IT)-飞行时间质谱(TOF)法定量准确度；
(6)酸化有机溶剂复溶，聚四氟乙烯(PTFE)材质滤器过滤，解决了滤器吸附问题，本发明采用酸化甲醇-水溶液作为复溶溶剂，再结合聚四氟乙烯(PTFE)材质，孔径为0.22μm或0.45μm的针式滤器过滤复溶液，避免了采用尼龙材质有机相滤膜对目标化合物的吸附作用导致的检测结果回收率低或无回收率。
附图说明
图1为实施例1中2,3,5,6-四氯苯酚(峰1)、2,3,4,6-四氯苯酚(峰2)、五氯苯酚(峰3)、2,3,4,5-四氯苯酚(峰4)、13C6-五氯苯酚(峰5)标准溶液定性和定量离子色谱图；
图2为实施例1中2,3,5,6-四氯苯酚标准溶液曲线图；
图3为实施例1中2,3,4,6-四氯苯酚标准溶液曲线图；
图4为实施例1中五氯苯酚标准溶液曲线图；
图5为实施例1中2,3,4,5-四氯苯酚标准溶液曲线图；
图6为实施例1中2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚特征离子质谱图；
图7为实施例1中五氯苯酚特征离子质谱图；
图8为实施例1中花生油空白样品中2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、五氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚定量离子色谱图；
图9为实施例1中花生油基质添加标准品(100μg/kg)定量离子色谱图；
图10为实施例1中2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、五氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚准品定量离子色谱图；
图11为实施例2中猪油空白样品中2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚、五氯苯酚定量离子色谱图；
图12为实施例2中猪油空白样品添加标准品(100μg/kg)定量离子色谱图。
具体实施方式
以下列举具体实施例对本发明进行说明。需要指出的是，实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供植物油脂(花生油)食品中氯苯酚类持久性有机污染物残留量检测方法，具体包括如下：
1试剂和耗材
试剂：甲醇、乙腈、乙酸铵、正己烷均为色谱纯；冰乙酸为分析纯；使用的水为超纯水。
耗材：50mL聚乙烯塑料离心管；孔径为0.22μm的聚四氟乙烯(PTFE)针式滤器过滤；1mL一次性针式注射器；混合型阴离子交换固相萃取柱，规格150mg/6mL；一次性塑料吸管。
2仪器设备
超高效液相色谱(UPLC)–离子阱(IT)-飞行时间质谱(TOF)仪，带电喷雾离子源；自动涡旋混合器；水浴振荡器；高速离心机；氮吹仪；电子天平：精度0.01g和0.00001g
3标准品
3.1标准品：2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、五氯苯酚纯度要求≥94.0％；13C6-五氯苯酚标准品，纯度要求≥99.0％。
3.2储备液配制：精密称取上述标准品10mg分别置于100mL容量瓶中，加入甲醇溶解，分别配得浓度为100μg/mL，-18℃条件下保存。
3.3混合标准品中间液：分别吸取2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、五氯苯酚标准储备液200μL置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，配得2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、五氯苯酚浓度均为2μg/mL的混合标准中间溶液，4℃条件下保存。
3.4 13C6-五氯苯酚内标中间液：吸取13C6-五氯苯酚标准储备液200μL置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，配得浓度为2μg/mL的13C6-五氯苯酚内标中间液，4℃条件下保存。
3.513C6-五氯苯酚内标使用液：吸取内标中间液2.0mL置于10mL容量瓶中，用含冰乙酸0.1％的甲醇-水溶液(1:1)稀释定容，配得浓度为0.4μg/mL的13C6-五氯苯酚内标使用液，4℃条件下保存。
3.6混合标准品工作曲线：用含冰乙酸0.1％的甲醇-水溶液(1:1)稀释配制2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、五氯苯酚浓度范围均为5ng/mL～500ng/mL标准工作曲线，标准工作曲线每个浓度点中13C6-五氯苯酚内标浓度均为20ng/mL。
4样品前处理
(1)样品提取液：称取混匀的花生油2g(精确至0.01g)置于50mL聚乙烯塑料离心管A中，加入50μL13C6-五氯苯酚内标使用液，加入5mL用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH为11～12的碱化甲醇溶液，涡旋混合均匀，40℃水浴振荡，振荡频率为130转/分钟，振荡时间为0.5小时。取出冷却至室温，加入1.5mL正己烷，1800转/分钟涡旋混合3分钟，6000r/min离心5min，将正己烷层转移至50mL聚乙烯塑料离心管B中，向离心管B中加入5mL用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH为11～12的碱化甲醇溶液，重复提取一次，以1800转/分钟涡旋混合3分钟，6000r/min离心5min，弃去正己烷层，将下层碱化甲醇溶液合并于离心管A中，制得样品提取液约为10mL。
(2)样品提取液的净化：向离心管A的样品提取液中加入20mL超纯水稀释，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH为11～12，分多次转移至经过活化处理(以填料质量/柱体积计算，固相萃取柱使用前需依次用6～12mL甲醇和6～12mL超纯水活化)的混合型阴离子交换固相萃取柱(规格150mg/6mL，Waters Oasis MAX混合型阴离子交换固相萃取柱)中，控制提取液体穿柱速度为0.5mL/min，弃去穿柱液，待样品提取液全部过柱后，向固相萃取柱中加入6mL超纯水，弃去穿柱液，负压抽干柱体中残留液体。用15mL含有5％冰乙酸的甲醇-乙腈混合溶液(1:1)洗脱保留在固相萃取柱上的目标化合物，控制洗脱液流出速度为0.5mL/min，用玻璃试管收集洗脱液，在48℃水浴条件下氮气吹扫浓缩至干，加入1.0mL含有0.1％冰乙酸的甲醇-水溶液(1:1)复溶残留物，用孔径为0.22μm的聚四氟乙烯(PTFE)针式滤器过滤，制得待测液，用超高效液相色谱(UPLC)-离子阱(IT)-飞行时间质谱(TOF)检测。
5仪器条件
5.1液相色谱条件
色谱柱：waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；
流速：0.2mL/min；
柱温：30℃；
进样量：20μL；
流动相A为：甲醇；流动相B为：10mmol/L乙酸铵溶液(含0.05％甲酸)；
梯度洗脱程序见表1。
表1梯度洗脱程序
Figure BDA0002991784760000111
Figure BDA0002991784760000121
5.2质谱条件
离子源：ESI，负离子模式检测；采用自动扫描采集，加热模块温度：200℃；CDL温度：200℃；雾化器流速：1.5L/min；干燥气压力：100kPa；离子源电压：4.5kV；检测器电压：1.7kV；校准方法：自动调谐优化电压；外标法校准质量数；MS1采集范围为m/z 200～500，重复扫描3次，离子累积时间：30msec；MS2采集范围:m/z 50～500，重复扫描3次，离子累积时间：30msec，CID能量:10％。以MS1(一级质谱)进行13C6-五氯苯酚内标法定量。主要质谱参数见表2。
表2多氯苯酚化合物质谱参数
Figure BDA0002991784760000122
注：带“*”的为定量离子。
6线性范围和方法检出限
向空白花生油样品中添加2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚浓度均为10μg/kg，五氯苯酚添加浓度为5μg/kg，按照具体实施方式操作，获得色谱图，对定量离子的色谱峰计算信噪比，信噪比(S/N)均大于10，因此，花生油中2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚的检出限均为10μg/kg，五氯苯酚的检出限为5μg/kg。
2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、五氯苯酚的标准曲线线性范围为5ng/mL～500ng/mL。2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、五氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、13C6-五氯苯酚标准溶液定性和定量离子色谱图如图1所示，标准曲线图见图2、图3、图4、图5，特征离子质谱图见图6、图7。
表3线性方程、相关系数
序号 化合物名称 线性回归方程 相关系数R
1 2,3,5,6-四氯苯酚 y＝14733.98x+52621.30 0.999
2 2,3,4,6-四氯苯酚 y＝14358.53x-26528.98 0.999
3 五氯苯酚 y＝35574.85x+492328.3 0.999
4 2,3,4,5-四氯苯酚 y＝32558.31x+120535.2 0.999
7加标回收率及精密度
以花生油为例考察加标回收率及精密度。向阴性样品中添加三水平浓度，每水平平行测定6次。2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚的添加水平为25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg，五氯苯酚的添加水平为5μg/kg、10μg/kg、50μg/kg。回收率范围在71.2％～88.3％之间，相对标准偏差范围在3.9％～6.1％之间，具体回收率、精密度见表4。
图8为花生油空白样品中2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、五氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚定量离子色谱图，图9为花生油基质添加标准品(100μg/kg)定量离子色谱图。图10为2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、五氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚准品定量离子色谱图。
表4花生油添加标准物质的回收率与精密度
Figure BDA0002991784760000131
8定性鉴别
以标准物质的精确分子量、保留时间、分子式作为定性标准。当样品中精确分子量、保留时间、分子式预测符合以下条件时，即可判定样品中含有多氯苯酚。
与标准物质的精确分子量比较：误差容量≤20ppm；
与标准物质的保留时间比较：≤5％；
与标准物质的MS1、MS2质谱图比较：离子碎片、离子丰度比一致；
与标准物质分子式比较：通过软件自带的分子式预测获得的分子式与标准物质分子式一致。
9定量计算
计算公式为：
X＝C×V×F/m
其中：
X：样品中多氯苯酚的含量(μg/kg)
C：从标准工作曲线得到被测组分的浓度(ng/mL)
m：取样质量(g)
V：定容体积(mL)
F：稀释因子
结果扣除空白值后保留至小数点后1位。
10实际样品检测
应用本实施例方法对花生油、菜籽油、玉米油、大豆油、调和油等共20批样品进行检测，20批次样品未检出2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、五氯苯酚。
对比例1
本对比例检测方法大体与实施例1相同，不同之处在于样品前处理步骤中将40℃水浴振荡换成室温水浴振荡提取，水浴振荡时间一致，检测结果表明在相同的加标浓度下40℃水浴振荡回收率比室温水浴振荡的回收率高约30％。原因可能是室温水浴振荡条件下，氯苯酚类化合物转化为钠盐或钾盐的速度慢，导致回收率低。40℃水浴振荡可加速转化为钠盐或钾盐，因此回收率高。
对比例2
本对比例检测方法大体与实施例1相同，不同之处在于样品前处理步骤中将提取液碱化甲醇溶液换成甲醇，检测结果表明在相同的加标浓度下，碱化甲醇溶液提取回收率比甲醇的高60％。原因可能是甲醇提取时，以分子态形式存在的氯苯酚化合物溶解于油和正己烷中，不能被甲醇充分萃取，导致回收率低。碱化甲醇溶液提取则可使样品中氯苯酚类化合物转化为离子态，在离子态条件下，氯苯酚类化合物不溶于油和正己烷，因此被碱化甲醇充分萃取，回收率高。
实施例2
动物油脂(猪油)食品中氯苯酚类持久性有机污染物残留量检测方法。
1试剂和耗材
同实施例1。
2仪器设备
同实施例1。
3标准品
同实施例1。
4样品前处理
固体状猪油需用组织捣碎机搅碎均匀，再称样。其余步骤同实施例1。
5仪器条件
同实施例1。
6线性范围和方法检出限
向空白猪油样品中添加2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚浓度均为10μg/kg，五氯苯酚添加浓度为5μg/kg，按照具体实施方式操作，获得色谱图，对定量离子的色谱峰计算信噪比，信噪比(S/N)均大于10，因此，花生油中2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚的检出限均为10μg/kg，五氯苯酚的检出限为5μg/kg。
2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、五氯苯酚的标准曲线线性范围为5ng/mL～500ng/mL。
表5线性方程、相关系数
Figure BDA0002991784760000151
Figure BDA0002991784760000161
7加标回收率及精密度
以猪油为例考察加标回收率及精密度。向阴性样品中添加三水平浓度，每水平平行测定6次。2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚的添加水平为25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg，五氯苯酚的添加水平为5μg/kg、10μg/kg、50μg/kg。回收率范围在73.2％～86.5％之间，相对标准偏差范围在4.5％～6.2％之间，具体回收率、精密度见表6。
图11为猪油空白样品中2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚、五氯苯酚定量离子色谱图。图12为猪油空白样品添加标准品(100μg/kg)定量离子色谱图。
表6猪肉样品添加标准物质的回收率与精密度
Figure BDA0002991784760000162
8定性鉴别
同实施例1。
9定量计算
同实施例1。
10实际样品检测
应用本实施例方法对猪油、牛油、鸡油等共15批样品进行检测，均未检出2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、五氯苯酚。
实施例3
以实施例1所述的花生油为研究对象，比较实施例1和实施例3的碱化甲醇提取液的体积、水浴振荡温度、固相萃取柱规格、洗脱液用量等关键前处理条件对食品中氯苯酚类持久性有机污染物残留量检测结果的影响。
1试剂和耗材
同实施例1。
2仪器设备
同实施例1。
3标准品
同实施例1。
4样品前处理
(1)样品提取液：称取混匀的花生油2g(精确至0.01g)置于50mL聚乙烯塑料离心管A中，加入50μL13C6-五氯苯酚内标使用液，加入10mL用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH为11～12的碱化甲醇溶液，涡旋混合均匀，45℃水浴振荡，振荡频率为130转/分钟，振荡时间为0.5小时。取出冷却至室温，加入1.5mL正己烷，1800转/分钟涡旋混合3分钟，6000r/min离心5min，将正己烷层转移至50mL聚乙烯塑料离心管B中，向离心管B中加入10mL用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH为11～12的碱化甲醇溶液，重复提取一次，以1800转/分钟涡旋混合3分钟，6000r/min离心5min，弃去正己烷层，将下层碱化甲醇溶液合并于离心管A中，制得样品提取液约为20mL。
(2)样品提取液的净化：向离心管A的样品提取液中加入40mL超纯水稀释，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH为11～12，分多次转移至经过活化处理的混合型阴离子交换固相萃取柱(规格500mg/6mL)中，控制提取液体穿柱速度为0.5mL/min，弃去穿柱液，待样品提取液全部过柱后，向固相萃取柱中加入6mL超纯水，弃去穿柱液，负压抽干柱体中残留液体。用25mL含有5％冰乙酸的甲醇-乙腈混合溶液(1:1)洗脱保留在固相萃取柱上的目标化合物，控制洗脱液流出速度为0.5mL/min，用玻璃试管收集洗脱液，在48℃水浴条件下氮气吹扫浓缩至干，加入1.0mL含有0.1％冰乙酸的甲醇-水溶液(1:1)复溶残留物，用孔径为0.22μm的聚四氟乙烯(PTFE)针式滤器过滤，制得待测液，用超高效液相色谱(UPLC)-离子阱(IT)-飞行时间质谱(TOF)检测。
5仪器条件
同实施例1。
6关键前处理条件检测结果比较
向空白花生油样品中添加2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚标准品，添加水平均为50μg/kg，五氯苯酚的添加水平为10μg/kg，分别按照实施例1和实施例3的前处理方法处理样品，用超高效液相色谱(UPLC)-离子阱(IT)-飞行时间质谱(TOF)检测，关键前处理条件检测结果比较以回收率表示，见表7，由表7数据可知，在实施例3的前处理条件下2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、五氯苯酚回收率均有所提高，提高值不超过5％，但固相萃取柱填料质量越大柱容量就越大，净化复杂基质样品时目标化合物回收率会更稳定。
表7关键前处理条件检测结果比较
序号 化合物名称 实施例1 实施例3
1 2,3,5,6-四氯苯酚 79.6％ 83.7％
2 2,3,4,6-四氯苯酚 82.3％ 86.5％
3 2,3,4,5-四氯苯酚 83.4％ 86.2％
4 五氯苯酚 87.7％ 88.9％
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种动植物油脂中氯苯酚类持久性有机污染物残留量的检测方法，其特征是包括以下步骤：
(1)制备样品提取液：选取动物油脂或植物油脂置于离心管A中，加入内标标准溶液，加入碱化甲醇溶液，水浴振荡，取出，加入正己烷，涡旋，离心，将正己烷层转移至离心管B中，向离心管B中加入碱化甲醇溶液重复提取一次，弃去正己烷层，将下层液体合并于离心管A中，制得样品提取液；
(2)样品提取液的净化：将步骤(1)制得的样品提取液用水稀释后，调节pH值，用混合型阴离子交换固相萃取柱净化，弃去流出液，用酸化的甲醇-乙腈混合溶液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩至干，用酸性甲醇-水溶液复溶，过滤膜，制得待测液；
(3)标准品制备：配制2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚和五氯苯酚的标准溶液，各溶液浓度范围均为5ng/mL～500ng/mL，以13C6-五氯苯酚为内标，制作标准工作曲线；
(4)含量测定：将步骤(3)中的标准品，用超高效液相色谱(UPLC)-离子阱(IT)-飞行时间质谱(TOF)法测定，制作标准曲线，选取步骤(2)中的待测液，用超高效液相色谱(UPLC)-离子阱(IT)-飞行时间质谱(TOF)法测定，根据标准曲线，获得食品中氯苯酚类持久性有机污染物的残留量。
2.根据权利要求1所述的动植物油脂中氯苯酚类持久性有机污染物残留量的检测方法，其特征是：步骤(1)中制备样品提取液时：所述的内标标准溶液为13C6-五氯苯酚标准溶液，内标标准溶液的加入量为经步骤(1)和步骤(2)处理后在步骤(2)的待测液中的最终浓度为20～50ng/mL；所述动物油脂或植物油脂与所述碱化甲醇溶液的用量关系为2～4g：5～10mL；所述的碱化甲醇溶液是指用浓度为2～5mol/L氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液调节甲醇的pH为11～12。
3.根据权利要求1所述的动植物油脂中氯苯酚类持久性有机污染物残留量的检测方法，其特征是：步骤(1)中制备样品提取液时：水浴振荡时的温度为40～45℃，振荡频率为130～180转/分钟，振荡时间为0.5～1小时；所述正己烷与所述动物油脂或植物油脂之间的用量关系为1.5～3.5mL：2～4g，旋涡时以1800～2000转/分钟涡旋混合3～5分钟，离心时，6000～8000r/min离心2～5min。
4.根据权利要求1所述的动植物油脂中氯苯酚类持久性有机污染物残留量的检测方法，其特征是：步骤(1)中制备样品提取液时：对离心管B中的正己烷层进行重复萃取，向离心管B中加入的碱化甲醇溶液与正己烷层之间的用量关系为5～10mL：1.5～3.5mL，然后以1800～2000转/分钟涡旋混合3～5分钟，6000～8000r/min离心2～5min，弃去正己烷层，将下层碱化甲醇溶液合并于离心管A中，制得样品提取液。
5.根据权利要求1所述的动植物油脂中氯苯酚类持久性有机污染物残留量的检测方法，其特征是：步骤(2)中样品提取液的净化时：将步骤(1)制得的样品提取液用超纯水稀释，所述样品提取液与所述超纯水之间的用量关系为10～20mL:20～40mL，调节pH值时，用浓度为2～5mol/L氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液调节用超纯水稀释后样品提取液的pH为11～12。
6.根据权利要求1所述的动植物油脂中氯苯酚类持久性有机污染物残留量的检测方法，其特征是：步骤(2)中样品提取液的净化时：所述混合型阴离子交换固相萃取柱的填料是指商品化的基质为N-乙烯吡咯烷酮与二乙烯基苯按比例聚合再键合上季胺基团，具有阴离子交换和反相两种吸附模式的固相萃取柱，所述混合型阴离子交换固相萃取柱规格为150mg/6mL～500mg/6mL，以填料质量/柱体积计算，固相萃取柱使用前需依次用6～12mL甲醇和6～12mL超纯水活化，将稀释后的样品提取液转移至固相萃取柱中，控制液体穿柱速度为0.5～1mL/min，弃去穿柱液，待样品提取液全部过柱后，向固相萃取柱中加入6～12mL超纯水，弃去穿柱液，负压抽干柱体中残留液体。
7.根据权利要求1所述的动植物油脂中氯苯酚类持久性有机污染物残留量的检测方法，其特征是：步骤(2)中样品提取液的净化时：所述的酸化的甲醇-乙腈混合溶液是指先将色谱纯的甲醇与色谱纯的乙腈按照1:1～2:1体积混合，再用冰乙酸酸化，所述冰乙酸与所述甲醇-乙腈混合溶液的体积比为5～10：95～90，洗脱时所用的酸化甲醇-乙腈混合溶液体积为15～25mL，收集的洗脱液在48～55℃水浴条件下用氮气吹扫浓缩至干。
8.根据权利要求1所述的动植物油脂中氯苯酚类持久性有机污染物残留量的检测方法，其特征是：步骤(2)中样品提取液的净化时：所述的酸性甲醇-水溶液是先将色谱纯的甲醇和超纯水按照1:1～2:1混合，再加入冰乙酸酸化，冰乙酸与甲醇-水溶液之间的体积比为0.1～0.5：99.9～99.5，残留物用1～2mL酸化甲醇-水溶液复溶，用材质为聚四氟乙烯(PTFE)、孔径为0.22μm或0.45μm的针式滤器过滤，制得待测液。
9.根据权利要求1所述的动植物油脂中氯苯酚类持久性有机污染物残留量的检测方法，其特征是：步骤(4)含量测定方法为超高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法，其液相色谱条件包括：色谱柱：waters ACQUITY UPLC BEH C18柱，100mm×2.1mm，1.7μm；流速：0.2～0.3mL/min；柱温：30～40℃；进样量：5～20μL；流动相A为：甲醇；流动相B为：10mmol/L乙酸铵溶液(含0.05％甲酸，体积百分含量)；梯度洗脱程序为：0.00min：A相，45％，B相，55％，2.00min：A相，45％，B相，55％，2.10min：A相，50％，B相，50％，12.00min：A相，50％，B相，50％，15.00min：A相，75％，B相，25％，18.00min：A相，75％，B相，25％，20.00min：A相，45％，B相，55％，22.00min：A相，45％，B相，55％，均为体积百分含量。
10.根据权利要求1所述的动植物油脂中氯苯酚类持久性有机污染物残留量的检测方法，其特征是：步骤(4)中质谱条件包括：离子源：ESI，负离子模式检测；采用自动扫描采集，加热模块温度：200～250℃；CDL温度：200～250℃；雾化器流速：1.3～1.5L/min；干燥气压力：100～120kPa；离子源电压：4.5kV；检测器电压：1.6～1.7kV；校准方法：自动调谐优化电压；外标法校准质量数；MS1采集范围为m/z 200～500，重复扫描3～5次，离子累积时间：20～50msec；MS2采集范围:m/z 50～500，重复扫描3～5次，离子累积时间：20～50msec，CID能量:10～30％，以MS1(一级质谱)进行13C6-五氯苯酚内标法定量，所述氯苯酚类持久性有机污染物包括2,3,5,6-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚和五氯苯酚。
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