CN114019058A - 一种食品中氯苯酚类有机污染物的联合检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种食品中氯苯酚类有机污染物的联合检测方法，包括以下步骤：S1.样品提取；S2.样品净化：制备固相萃取柱，用酸化甲醇‑乙腈混合溶液活化固相萃取柱，当液面到达柱吸附层表面时，加入步骤S1制得的动物源待净化液或植物源待净化液，用鸡心瓶收集全部流出液，依次用酸化甲醇‑乙酸乙酯混合溶液、丙酮‑环己烷混合溶液洗脱，收集洗脱液，合并于鸡心瓶中，旋转蒸发浓缩至干，若无法浓缩至干，可加入适量乙酸乙酯继续旋转蒸发直至无液体残留，加入酸化的甲醇水混合溶液溶解残留物，过滤，制得待测液；S3.标准品制备；S4.含量测定。本发明方法简单快速、定性定量准确，适用于动物源食品或植物源食品中氯苯酚类化合物的快速检测。
Description
技术领域
本发明属于有机污染物技术检测领域，具体涉及一种食品中氯苯酚类有机污染物的联合检测方法。
背景技术
氯酚类化合物(Chlorophenols, CPs)是芳香族化合物中用途广、毒性大、污染较为严重的一类化合物，用作杀虫剂、有机溶剂和药物。氯酚类化合物（氯代苯酚）普遍存在于炼油、炼焦、石化、塑胶、煤气和纸浆等工业废水和生活污水中，CPs是一类化学性质相对稳定的化合物，能够在环境中相对持久地存在，并可通过食物链在动植物体内累积，增加了其污染的危害程度。
CN201910087895.X一种水产品中五氯苯酚及其钠盐残留量的检测方法，其技术特点是样品用50％的硫酸溶液酸化后用正己烷萃取，无水硫酸镁除水，衍生化后气相色谱仪检测。
CN201510227648.7气相色谱-质谱法测定水生动物中19种氯代酚及其钠盐的方法，样品用50%的硫酸溶液在40℃恒温水浴摇床中摇荡，冷却后用二氯甲烷萃取，将有机相吸入离心管，离心管中加入质量百分浓度4 % NaOH，摇荡后静置分层，弃去有机相，然后用磷酸溶液调节pH至6.2，再加入二氯甲烷-正己烷溶液摇荡后静置分层，弃去水相；有机相用饱和无水硫酸钠脱水后，氮吹仪60 ℃下将有机相浓缩，硅烷化衍生，气相色谱-质谱联用仪测定2-氯酚（2-MCP）、3-氯酚（3-MCP）、4-氯酚（4-MCP）、2,3-二氯酚（2,3-DCP）、2,4-二氯酚（2,4-DCP）、质量比1:1的2,5-二氯酚（2,5-DCP）+3,5-二氯酚（3,5-DCP）、2,6-二氯酚（2,6-DCP）、3,4-二氯酚（3,5-DCP）、2,4,6-三氯酚（2,4,6-TCP）、2,4,5-三氯酚（2,4,5-TCP）、2,3,4-三氯酚（2,3,4-TCP）、2,3,5-三氯酚（2,3,5-TCP）、2,3,6-三氯酚（2,3,6-TCP）、3,4,5-三氯酚（3,4,5-TCP）、2,3,5,6-四氯酚（2,3,5,6-TeCP）、2,3,4,6-四氯酚（2,3,4,6-TeCP）、2,3,4,5-四氯酚（2,3,4,5-TeCP）和五氯酚（PCP）。
GB 23200.92-2016《食品安全国家标准 动物源性食品中五氯酚残留量的测定 液相色谱-质谱法》，适用于猪肝、猪肾、猪肉、牛奶、鱼肉、虾、蟹等动物源食品中五氯酚残留的测定。其技术特点为试样中五氯酚残留用碱性乙腈水溶液提取，经混合型阴离子交换固相萃取柱（MAX柱）净化，浓缩、定容后，用液相色谱-质谱仪检测和确证，外标法定量。
GB 29708-2013《食品安全国家标准 动物性食品中五氯酚钠残留量的测定 气相色谱-质谱法》，适用于猪的肌肉、肝脏和肾脏及鸡的肌肉和肝脏组织中五氯酚钠残留量的检测，其技术特点为样品用三氯乙酸沉淀蛋白，环己烷-乙酸乙酯溶液萃取五氯酚钠，乙酸酐-吡啶溶液衍生，气相色谱-质谱法测定，外标法定量。
SC/T 3030-2006《水产品中五氯苯酚及其钠盐残留量的测定 气相色谱法》，适用于水产品中五氯苯酚及其钠盐残留量的测定，其技术特点为在酸性条件下样品中的五氯酚钠转化为五氯苯酚，用正己烷萃取，碳酸钾溶液反萃取，乙酸酐衍生化后用气相色谱法检测，外标法定量。
现有技术中，检测的主体主要集中在食品接触纸包装材料（纸制品、塑料制品、木制品）、地表水、生活饮用水、环境中土壤和沉积物等方面，食品中氯苯酚类检测方法公开较少。同时，现有技术中，以食品中氯苯酚类化合物作为对象的检测方法存在以下不足：
（1）以气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法为主，其中气相色谱法、气相色谱-质谱联用法均需要对氯苯酚类化合物进行衍生化，然后再进行检测，虽然灵敏度较高，但存在步骤繁琐、衍生效率难控制、单样检测耗时长、回收率低等缺点；
（2）液相色谱法、液相色谱-串联质谱法直接测定氯苯酚类化合物，无需衍生，简单快速，但液相色谱二极管阵列检测法灵敏度低，不适用于痕量的氯苯酚化合物检测，容易导致假阴性或假阳性；GB 23200.92-2016采用的液相色谱-串联质谱法灵敏度高，特异性强，定性和定量准确，但该标准仅适用于动物源性食品，只对五氯酚这一项指标进行检测，检测项目单一，而且实际检测回收率较低，为30-50%之间，回收率也不稳定。
（3）目前食品安全检测标准（GB 23200.92-2016）以五氯酚作为检测对象，检测项目单一，食品中多种氯苯酚类化合物的同时检测的方法较少，尚未有同时检测动物源食品和植物源食品中对氯间二甲苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚、五氯苯酚等多种氯苯酚类持久性有机污染物的标准和文献报道。
（4）欧阳培毓等在期刊《环境化学》、2016年第7期、“超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱测定沉积物中4种氯酚类物质”中建立了超高效液相色谱( UPLC)-四极杆飞行时间质谱( Q-TOF) 测定沉积物中4 种氯酚类物质苄氯酚( CP) 、二氯酚( DCP) 、六氯酚(HCP) 、溴氯芬( BCP) 的分析方法，样品用1%甲酸丙酮超声提取，强阴离子交换固相萃取柱净化富集。但是，该文献中的前处理方法、样品基质、检测项目、固相萃取柱等不适用于食品中氯苯酚类有机污染物的检测，效果不佳，需要改进。
因此，急需建立一种可对食品中氯苯酚类同分异构体进行精确鉴别的高灵敏度、高通量的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以新型的固相萃取柱净化，基于高分辨飞行时间质谱UPLC/MS-IT-TOF的食品中氯苯酚类持久性有机污染物残留量的检测方法，具有方法新颖，前处理简单、定性定量准确可靠等特点。该方法获得的提取液直接以新型的固相萃取柱净化，经旋转蒸发浓缩后，用酸化的甲醇水溶液溶解，再以UPLC/MS-IT-TOF法检测，通过保留时间、特征离子精确质荷比、分子式预测相结合进行精准定性，特征离子的峰面积进行准确定量。
本发明可以通过以下技术方案来实现：
一种食品中氯苯酚类有机污染物的联合检测方法，包括以下步骤：
S1.样品提取：选取动物源食品或植物源食品，用组织搅碎机搅碎，称取适量样品置于塑料离心管中，加入酸化甲醇-乙腈混合溶液和无水硫酸钠，均质，涡旋提取，离心，取清液于离心管中；样品残渣用酸化甲醇-乙酸乙酯混合溶液和无水硫酸钠重复提取一次，离心，收集清液，合并于同一个离心管中，制得动物源待净化液或植物源待净化液。
S2.样品净化：制备固相萃取柱，用酸化甲醇-乙腈混合溶液活化固相萃取柱，当液面到达柱吸附层表面时，加入步骤S1制得的动物源待净化液或植物源待净化液，用鸡心瓶收集全部流出液，依次用酸化甲醇-乙酸乙酯混合溶液、丙酮-环己烷混合溶液洗脱，收集洗脱液，合并于鸡心瓶中，旋转蒸发浓缩至干，若无法浓缩至干，可加入适量乙酸乙酯继续旋转蒸发直至无液体残留，加入酸化的甲醇水混合溶液溶解残留物，过滤，制得待测液。
S3.标准品制备：7种氯苯酚标准品分别用甲醇溶解配得标准品储备液，各取适量标准品储备液混合，用甲醇稀释配制混合标准品中间液，最后用空白样品基质提取液稀释配制对氯间二甲苯酚浓度范围为20-500 ng/mL；2,4,5-三氯苯酚和2,4,6-三氯苯酚浓度范围均为10-500 ng/mL；2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚以及五氯苯酚的浓度范围均为5-500 ng/mL，用以制作混合标准溶液工作曲线。
S4.含量测定：将步骤S3中的标准品，用超高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法（UPLC/MS-IT-TOF）测定，制作标准曲线；选取步骤S2制得的待测液，用超高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法测定，根据标准工作曲线，获得食品中氯苯酚类持久性有机污染物的残留量。以保留时间、特征离子精确质荷比（m/z）以及分子式预测软件相结合定性确证。
在上述食品中氯苯酚类持久性有机污染物残留量的检测方法中：
优选的，步骤S1中所述动物源食品包括水产品、畜禽肌肉、畜禽内脏等；所述植物源食品包括水果和蔬菜。所述的动物源食品或植物源食品用组织搅碎机粉碎后称取2-3g，精确至0.01g。
优选的，步骤S1所述的酸化甲醇-乙腈混合溶液中，甲醇与乙腈之间的体积比例为1:1-2:1，乙酸或甲酸与甲醇-乙腈混合溶液的体积比例为0.1-1.0:99.9-99.0。酸化甲醇-乙酸乙酯混合溶液中，甲醇与乙酸乙酯体积比例为1:1-2:1，乙酸或甲酸与甲醇-乙酸乙酯混合溶液的体积比例为0.1-1.0:99.9-99.0。称取样品的质量与单次加入的提取液体积之间的比例为2-3g:5-10mL。所述的无水硫酸钠需在100-120℃条件下烘干3-5h。称取样品的质量与无水硫酸钠的质量的比例为2-3g:3-5g。
优选的，步骤S1中样品先用均质器均质提取10-30秒，再以转速1500-2000r/min涡旋提取5-10min，然后在8000-9000r/min离心2-3min，收集清液于塑料离心管中。
优选的，步骤S1中样品残渣重复提取，加入提取液体积为5-10mL，加入无水硫酸钠质量为1-2g。
优选的，步骤S2所述的酸化甲醇-乙腈混合溶液与步骤S1所述的酸化甲醇-乙腈混合溶液相同，加入体积为2-5mL。所述的固相萃取柱是新型的针对食品中氯苯酚类化合物净化的固相萃取柱。所述的固相萃取柱内的填料为无水硫酸钠和聚酰胺粉，二者之间的质量比为2-6:0.3-1.0。所述固相萃取柱中按由下至上的顺序由筛板、无水硫酸钠、筛板、聚酰胺粉、筛板组成；无水硫酸钠质量与提取液体积之间的比例为2-6g:10-20mL。
优选的，步骤S2所述收集从固相萃取柱流出的全部流出液，用鸡心瓶收集，在45-55℃水浴条件下旋转蒸发浓缩至干。若无法浓缩至干，可加入乙酸乙酯，使提取液中残留的水分与乙酸乙酯形成共沸物，通过旋转蒸发除去。鸡心瓶中残留水分的体积与乙酸乙酯体积比约为1mL:10-20mL。
优选的，步骤S2所述的酸化的甲醇水混合溶液中甲醇与超纯水之间的体积比例为1:1-1.5:1，混合后再加入乙酸或甲酸，乙酸或甲酸与甲醇水混合溶液之间的体积比为0.05-0.2:99.95-99.8；取1-2mL酸化的甲醇-水混合溶液溶解鸡心瓶中残留物。使用商品化的0.22μm孔径的有机型滤头过滤，制得的待测液可直接用UPLC/MS-IT-TOF检测。
优选的，步骤S3中所述的对氯间二甲苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚、五氯苯酚等7种氯苯酚类持久性有机污染物的标准品用色谱纯甲醇溶解配制标准品储备液，采用按照步骤S1和步骤S2所述方法制得的不含氯苯酚物质的样品基质待测液（即是空白样品基质待测液）稀释配制匹配样品基质的混合标准溶液工作曲线，消除基质影响，其中对氯间二甲苯酚浓度范围为20-500 ng/mL；2,4,5-三氯苯酚和2,4,6-三氯苯酚浓度范围均为10-500 ng/mL；2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚以及五氯苯酚的浓度范围均为5-500 ng/mL。
优选的，步骤S4含量测定中液相色谱条件包括：C18 色谱柱，优选的，本发明采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱，规格100 mm×2.1 mm，1.7 µm；流速：0.2 mL/min；柱温：25℃-30℃；进样量：20μL；流动相A为：甲醇；流动相B为：10mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%乙酸，体积百分含量）；梯度洗脱程序为：0.00 min：A相，55%，B相，45%；3.00 min：A相，55%，B相，45%；5.00 min：A相，60%，B相，40%；12.00 min：A相，60%，B相，40%；12.10 min：A相，90%，B相，10%；14.00 min：A相，90%，B相，10%；14.10 min：A相，55%，B相，45%；16.00 min：A相，55%，B相，45%，均为体积百分含量，在该液相色谱条件下可使2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚同分异构体，2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚同分异构体完全分离。
优选的，步骤S4中质谱条件包括：离子源：ESI，负离子模式检测；采用自动扫描采集，加热模块温度：200 ℃；CDL温度：200 ℃；雾化器流速：1.5 L/min；干燥气压力：100kPa-120 kPa；离子源电压：-4.5 kV；检测器电压：1.7 kV；校准方法：自动调谐优化电压；外标法校准质量数；特征离子（准分子离子MS1）采集范围为m/z 140-500，重复扫描3次-5次，离子累积时间：20 msec-40 msec；二级碎片离子（MS2）采集范围:m/z 70-500，重复扫描3次-5次，离子累积时间：30 msec-50 msec，CID（诱导碰撞解离）能量:10 %-70 %，可根据定性定量需要调整CID碰撞能量，当碰撞能量为10%-30%之间时可获得氯苯酚物质响应较高的特征离子色谱峰，可用于定量；当碰撞能量为30%-70%之间时可获得特征离子碎裂的离子碎片信息，有助于提高分子式预测的准确度，用于辅助定性确证。
优选的，步骤S4中所述对氯间二甲苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚、五氯苯酚以特征离子（准分子离子峰）峰面积进行外标法定量，采用氯苯酚类化合物的保留时间、特征离子的精确质荷比（m/z，精确至小数点后四位）以及分子式预测软件相结合进行定性确证。其中对氯间二甲苯酚的特征离子的精确质荷比（m/z）为155.0321和157.0264，以155.0321为定量离子；2,4,5-三氯苯酚与2,4,6-三氯苯酚为同分异构体，两者的特征离子的精确质荷比（m/z）均为194.9165、196.9167和198.9115，以196.9167为定量离子；2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚为同分异构体，三者的特征离子的精确质荷比（m/z）均为228.8775、230.8770、232.8724和234.8694，以230.8770为定量离子；五氯苯酚的特征离子的精确质荷比（m/z）为262.8393、264.8375、266.8322和268.8293，以264.8375为定量离子。所述的7种氯苯酚类持久性有机污染物的特征离子的精确质荷比（m/z）偏差范围允许在±15ppm范围内。
本发明中，采用的超高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法（UPLC/MS-IT-TOF），由于具有多级碎裂能力，再结合特征离子的精确质荷比（m/z），可对食品中氯苯酚类同分异构体进行精确鉴别，是一种高灵敏度、高通量的检测方法。现有技术中，尚未有公开应用UPLC/MS-IT-TOF检测动物源性、植物源性食品中对氯间二甲苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚、五氯苯酚等多种氯苯酚类持久性有机污染物的技术方案。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、方法适用范围广。与GB 23200.92-2016相比，本发明的方法适用范围更广。首次建立适用于动物源性食品（包括水产品、畜禽肌肉、畜禽内脏等）和植物源性食品（包括水果和蔬菜）中7种氯苯酚类持久性有机污染物的检测方法。
2、仪器检测方法新。尚未见应用基于高分辨率飞行时间质谱的超高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法（UPLC/MS-IT-TOF）同时检测动物源性、植物源性食品中对氯间二甲苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚、五氯苯酚等多种氯苯酚类持久性有机污染物的现有技术公开，弥补UPLC/MS-IT-TOF检测氯苯酚类化合物的方法空白，提供了一种新型的定性鉴别手段，完善检测方法体系。
3、样品提取方法简单快速。根据动物源性食品中蛋白质含量高的特点和氯苯酚类化合物易溶于甲醇、乙腈的性质，采用了酸化甲醇-乙腈混合溶液以及酸化甲醇-乙酸乙酯混合溶液作为提取液。在酸性条件下，氯苯酚类物质以分子态存在，有利于提高萃取率；甲醇、乙腈既可以作为提取试剂，又可以沉淀蛋白，具有净化和提高萃取率的作用；样品提取后即可进行净化，方法步骤简单快速。
4、样品净化方法新，简单快速。发明人通过大量创造性试验，制备得到针对食品中氯苯酚类化合物净化的新型固相萃取柱，克服了阴离子交换固相萃取柱回收率不稳定，净化步骤繁琐等缺点，为食品中氯苯酚类化合物检测提供了一种新型的净化方法，该净化方法简单快速，回收率高。
5、采用添加乙酸乙酯的方式，解决了旋转蒸发浓缩过程中残留水分难蒸干，容易暴沸等问题，为旋转蒸发浓缩去除水分提供了一种新思路。
6、本发明开发的液相色谱条件可使2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚同分异构体，2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚同分异构体的色谱峰完全分离。
7、本发明提供了对氯间二甲苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚、五氯苯酚的特征离子的精确质荷比（m/z，精确至小数点后四位）数据，为拓展至食品相关产品、化妆品等领域提供快速筛查数据库。
附图说明
图1为实施例1中7种氯苯酚标准溶液特征离子色谱图；图2为实施例1中对氯间二甲苯酚标准溶液曲线图；图3为实施例1中2,4,6-三氯苯酚标准溶液曲线图；图4为实施例1中2,4,5-三氯苯酚标准溶液曲线图；图5为实施例1中2,3,5,6-四氯苯酚标准溶液曲线图；图6为实施例1中2,3,4,6-四氯苯酚标准溶液曲线图；图7为实施例1中五氯苯酚标准溶液曲线图；图8为实施例1中2,3,4,5-四氯苯酚标准溶液曲线图；图9为实施例1中2,4,5-三氯苯酚和2,4,6-三氯苯酚同分异构体的分离效果色谱图；图10为实施例1中2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚和2,3,5,6-四氯苯酚同分异构体分离效果色谱图；图11为实施例1中对氯间二甲苯酚特征离子质谱图；图12为实施例1中2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚特征离子质谱图；图13为实施例1中2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚特征离子质谱图；图14为实施例1中五氯苯酚特征离子质谱图；图15 为实施例1中罗非鱼空白样品定量离子色谱图；图16为实施例1中罗非鱼基质添加标准品（200μg/kg）定量离子色谱图；图17为实施例1中罗非鱼基质添加标准品（200μg/kg）特征离子色谱图；图18为实施例1中检出五氯苯酚的猪肝样品的定量离子色谱图；图19为实施例1中含有五氯苯酚的猪肝样品通过分子式预测软件预测到的五氯苯酚分子式；图20为实施例2中芥菜空白样品定量离子色谱图；图21为实施例2中芥菜基质添加标准品（200μg/kg）定量离子色谱图；图22为实施例2中芥菜基质添加标准品（200μg/kg）特征离子色谱图；图23为实施例3中苹果空白样品定量离子色谱图；图24为实施例3中苹果基质添加标准品（200μg/kg）的定量离子色谱图；图25为实施例3中苹果基质添加标准品（200μg/kg）特征离子色谱图；图26为固相萃取柱的结构示意图。
具体实施方式
以下列举具体实施例对本发明进行说明。需要指出的是，实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供动物源性食品中氯苯酚类有机污染物残留量检测方法，本实施例以罗非鱼为检测对象，具体包括如下：
1 试剂和耗材
1.1本发明使用的试剂：甲醇、乙腈、丙酮、甲酸、乙酸、乙酸铵均为色谱纯；无水硫酸钠、乙酸乙酯均为分析纯；使用的水为超纯水。
1.2本发明使用的耗材：0.22μm有机系滤膜；50mL塑料离心管；10mL容量瓶；鸡心瓶；1.5mL进样瓶；1.0mL一次性针式注射器。
2 仪器设备
超高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱仪（UPLC/MS-IT-TOF），配置ESI离子源；超声波清洗机；自动涡旋混合器；循环水式真空泵；旋转蒸发仪；均质器；组织捣碎机；20位固相萃取装置；电子天平：感量分别为0.1mg和10mg；移液器；吸量管。
3 标准品
3.1标准品：对氯间二甲苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚、五氯苯酚标准品，纯度要求≥94.0%。
3.2 储备液配制：精密称取上述标准品10mg分别置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解，分别配得储备液浓度为1000μg/mL，-18℃条件下保存。
3.3 混合标准品中间液：分别吸取对氯间二甲苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚、五氯苯酚标准储备液200μL置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，配得对氯间二甲苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚、五氯苯酚浓度均为20μg/mL的混合标准中间溶液，4℃条件下保存。
3.4 混合标准品使用液：吸取混合标准中间溶液2.5mL置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，配得对氯间二甲苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚、五氯苯酚浓度均为5μg/mL混合标准品使用液。
3.5 混合标准品工作曲线：采用按样品提取和样品净化步骤制得的不含氯苯酚物质的样品基质待测液（即是空白样品基质待测液）稀释配制混合标准溶液工作曲线配制对氯间二甲苯酚浓度范围为20-500 ng/mL；2,4,5-三氯苯酚和2,4,6-三氯苯酚浓度范围均为10-500 ng/mL；2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚以及五氯苯酚的浓度范围均为5-500 ng/mL。7种氯苯酚标准溶液特征离子色谱图见图1，标准溶液曲线图见图2-图8。
4 样品前处理
4.1 样品提取：取可食用的具有代表性的动物源性食品罗非鱼约300g，用组织捣碎机粉碎均匀，称取2g样品（精确至0.01g）置于50mL塑料离心管中，加入5mL含有0.5%乙酸的甲醇-乙腈混合溶液和3g无水硫酸钠，均质10s，1500 r/min涡旋提取5min，8000r/min离心2min，收集清液于50mL塑料离心管中；样品残渣再加入5mL含有0.5%乙酸的甲醇-乙酸乙酯混合溶液和1g无水硫酸钠，1500 r/min涡旋提取5min，8000r/min离心2min，收集清液，合并于同一个50mL塑料离心管中，制得动物源性食品待净化液。
4.2 样品净化；
4.2.1 固相萃取柱制备：采用干式填充方法。取10mL注射器，由下往上依次放入筛板，接着加入2g无水硫酸钠，放入筛板，加入聚酰胺粉0.4g，放入筛板，压实填料，制得固相萃取柱。所述固相萃取柱1中按由下至上的顺序由筛板11、无水硫酸钠12、筛板11、聚酰胺粉13、筛板11组成。
4.2.2 固相萃取柱活化：加入2mL含有0.5%乙酸的甲醇-乙腈混合溶液活化萃取柱。
4.2.3 样品净化：向固相萃取柱中加入制得的动物源待净化液，控制流速约为1mL/min，用鸡心瓶收集全部流出液，依次用2mL0.5%乙酸甲醇-乙酸乙酯混合溶液、5mL丙酮-环己烷混合溶液（体积比6:4）洗脱，收集所有洗脱液合并于鸡心瓶中，45℃水浴条件下旋转蒸发浓缩至干，若无法浓缩至干，可加入10mL乙酸乙酯继续旋转蒸发直至无液体残留，加入1.0mL含有0.1%乙酸的甲醇-水混合溶液（甲醇与水之间的体积比例为1:1）溶解残留物，超声10min，1500 r/min涡旋1min，用1.0mL一次性针式注射器吸取溶解物，用0.22μm有机系滤膜过滤至1.5mL进样瓶中，制得待测液。
5 仪器条件
5.1 液相色谱条件：色谱柱：waters ACQUITY UPLC BEH C18柱 (100 mm×2.1 mm，1.7 µm )；流速：0.2 mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL；流动相A为：甲醇；流动相B为：10mmol/L乙酸铵溶液；梯度洗脱程序见表1。
2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚同分异构体和2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚同分异构体的分离效果色谱图见图9和图10。
表1 梯度洗脱程序
5.2 质谱条件：离子源：ESI，负离子模式检测；采用自动扫描采集，加热模块温度：200 ℃；CDL温度：200 ℃；雾化器流速：1.5 L/min；干燥气压力：100 kPa；离子源电压：-4.5kV；检测器电压：1.7 kV；校准方法：自动调谐优化电压；外标法校准质量数；特征离子（准分子离子MS1）采集范围为m/z 140-500，重复扫描3次，离子累积时间：20 msec；二级碎片离子（MS2）采集范围:m/z 70-500，重复扫描3次，离子累积时间：30 msec，CID能量:10 %，以特征离子（准分子离子峰）峰面积进行外标法定量。7种氯苯酚类持久性有机污染物的特征离子的精确质荷比（m/z）偏差范围均在±15ppm范围内。主要质谱参数见表2。7种氯苯酚化合物的特征离子色谱图见图11-14。
表2 7种氯苯酚化合物UPLC/MS-IT-TOF质谱参数
注：带“*”的为定量离子，也是子离子的母离子。
6线性范围和方法检出限
向不含氯苯酚类物质的动物源性食品（罗非鱼）中添加对氯间二甲苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚浓度均为20μg/kg，五氯苯酚添加浓度为5μg/kg，按照具体实施方式操作，获得色谱图，对定量离子的色谱峰计算信噪比，信噪比 (S/N)均大于3，因此，动物源性食品中对氯间二甲苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚的检出限均为20μg/kg，五氯苯酚的检出限为5μg/kg。
动物源性食品（罗非鱼）空白样品基质待测液配制的标准曲线线性范围：对氯间二甲苯酚浓度范围为20-500 ng/mL；2,4,5-三氯苯酚和2,4,6-三氯苯酚浓度范围均为10-500ng/mL；2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚以及五氯苯酚的浓度范围均为5-500 ng/mL。在本实施例条件下，以7种氯苯酚标准溶液的峰面积（y）为纵坐标，浓度（x，ng/mL）为横坐标作线性回归方程。表3为罗非鱼基质中7种氯苯酚标准溶液线性回归方程及相关系数。
表3 罗非鱼基质中7种氯苯酚标准溶液线性回归方程及相关系数
| 序号 | 化合物名称 | 线性回归方程 | 相关系数R |
| 1 | 对氯间二甲苯酚 | <i>y</i>=15225.92<i>x</i>-277423.3 | 0.998 |
| 2 | 2,4,5-三氯苯酚 | <i>y</i>=7996.060<i>x</i>-47060.12 | 0.999 |
| 3 | 2,4,6-三氯苯酚 | <i>y</i>=29357.69<i>x</i>-387450.8 | 0.998 |
| 4 | 2,3,4,5-四氯苯酚 | <i>y</i>=48202.58<i>x</i>+347068.8 | 0.999 |
| 5 | 2,3,4,6-四氯苯酚 | <i>y</i>=49051.74<i>x</i>+349245.9 | 0.999 |
| 6 | 2,3,5,6-四氯苯酚 | <i>y</i>=105880.0<i>x</i>+1380862.2 | 0.999 |
| 7 | 五氯苯酚 | <i>y</i>=104252.5<i>x</i>-582445.2 | 0.999 |
7 加标回收率及精密度
以不含氯苯酚类物质的动物源性食品罗非鱼为例考察加标回收率及精密度。向样品中添加三水平浓度，每水平平行测定6次（n=6），对氯间二甲苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚的添加水平为20μg/kg、50μg/kg、100μg/kg，五氯苯酚的添加水平为5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg。回收率范围在60.2%-83.7%之间，相对标准偏差范围在5.2%-7.4%之间，具体回收率、精密度见表4。
罗非鱼空白样品定量离子色谱图见图15；罗非鱼基质添加标准品（200μg/kg）的定量离子色谱图见图16，特征离子色谱图见图17。
表4罗非鱼样品添加标准物质的回收率与精密度
8定性鉴别
氯苯酚类化合物的保留时间、特征离子的精确质荷比（m/z，精确至小数点后四位）以及分子式预测软件相结合进行定性确证。当样品中保留时间、特征离子的精确质荷比、分子式预测符合以下条件时，即可判定样品中含有氯苯酚物质。
与标准物质的特征离子的精确质荷比比较：误差容量≤15 ppm；与标准物质的保留时间比较：≤5%；与标准物质的特征离子质谱图比较：离子碎片一致；与标准物质分子式比较：通过软件自带的分子式预测获得的分子式与标准物质分子式一致。
9定量计算
计算公式为：X=C×V×F/m；其中：X：样品中7种氯苯酚物质的含量（μg/kg），C：从标准工作曲线得到被测组分的浓度（ng/mL），m：取样质量（g），V：定容体积（mL），F：稀释因子，结果扣除空白值后保留至小数点后1位。
10 实际样品检测
应用本实施例方法对动物源性食品水产品（罗非鱼、鲫鱼、虾等）、畜禽肌肉（猪肉、牛肉、鸡肉等）、畜禽内脏（猪肝、鸡肝等）等共40批样品进行检测，发现1批次猪肝样品检出五氯苯酚，含量为5.2μg/kg，其余样品均为未检出氯苯酚类物质。检出五氯苯酚的猪肝样品的定量离子色谱图见图18，图19为该猪肝样品通过分子式预测软件预测到的五氯苯酚分子式。
实施例2
本实施例提供植物源性食品中氯苯酚类有机污染物残留量检测方法，本实施例以芥菜为检测对象，具体包括如下：
1 试剂和耗材：同实施例1；2 仪器设备：同实施例1；3 标准品：同实施例1。
4 样品前处理
4.1 样品提取：取代表性的植物源性蔬菜食品芥菜约300g，用组织捣碎机粉碎均匀，其余步骤与实施例1相同。
4.2 样品净化
4.2.1 固相萃取柱制备：固相萃取柱采用干式填充方法，取10mL注射器，由下往上依次放入筛板，接着加入4g无水硫酸钠，放入筛板，加入聚酰胺粉0.8g，放入筛板，压实填料，制得固相萃取柱。
4.2.2 固相萃取柱活化：与实施例1相同。
4.2.3 样品净化：与实施例1相同。
5 仪器条件：同实施例1。
6线性范围和方法检出限
向不含氯酚类物质的植物源性食品（芥菜）中添加对氯间二甲苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚浓度均为20μg/kg，五氯苯酚添加浓度为5μg/kg，按照具体实施方式操作，获得色谱图，对定量离子的色谱峰计算信噪比，信噪比 (S/N)均大于3，因此，植物源性食品中对氯间二甲苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚的检出限均为20μg/kg，五氯苯酚的检出限为5μg/kg。
用植物源性食品（芥菜）空白样品基质待测液配制的标准曲线线性范围：对氯间二甲苯酚浓度范围为20-500 ng/mL；2,4,5-三氯苯酚和2,4,6-三氯苯酚浓度范围均为10-500ng/mL；2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚以及五氯苯酚的浓度范围均为5-500 ng/mL。在本实施例条件下，以7种氯苯酚标准溶液的峰面积（y）为纵坐标，浓度（x，ng/mL）为横坐标作线性回归方程。表4为芥菜基质中7种氯苯酚标准溶液线性回归方程及相关系数。
表4 芥菜基质中7种氯苯酚标准溶液线性回归方程及相关系数
| 序号 | 化合物名称 | 线性方程 | 相关系数R |
| 1 | 对氯间二甲苯酚 | <i>y</i>=16215.72<i>x</i>-276543.6 | 0.998 |
| 2 | 2,4,5-三氯苯酚 | <i>y</i>=7876.26<i>x</i>-47660.12 | 0.999 |
| 3 | 2,4,6-三氯苯酚 | <i>y</i>=29407.71<i>x</i>-387560.3 | 0.998 |
| 4 | 2,3,4,5-四氯苯酚 | <i>y</i>=48161.58<i>x</i>+347424.3 | 0.999 |
| 5 | 2,3,4,6-四氯苯酚 | <i>y</i>=49131.71<i>x</i>+349351.7 | 0.999 |
| 6 | 2,3,5,6-四氯苯酚 | <i>y</i>=105740.7<i>x</i>+1384722.1 | 0.999 |
| 7 | 五氯苯酚 | <i>y</i>=104332.4<i>x</i>-582347.4 | 0.998 |
7 加标回收率及精密度
以不含氯苯酚类物质的植物源性食品芥菜为例考察加标回收率及精密度。向样品中添加三水平浓度，每水平平行测定6次（n=6），对氯间二甲苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚的添加水平为20μg/kg、50μg/kg、100μg/kg，五氯苯酚的添加水平为5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg。回收率范围在71.2%-85.7%之间，相对标准偏差范围在5.8%-7.8%之间，具体回收率、精密度见表5。
芥菜空白样品定量离子色谱图见图20；芥菜基质添加标准品（200μg/kg）的定量离子色谱图见图21，特征离子色谱图见图22。
表5芥菜样品添加标准物质的回收率与精密度
8定性鉴别：同实施例1。
9定量计算：同实施例1。
10 实际样品检测
应用本实施例方法对植物源性食品蔬菜（芥菜、生菜、西洋菜、菠菜等）共20批样品进行检测，所测样品均未检出氯苯酚类物质。
实施例3
本实施例提植物源性食品中氯苯酚类有机污染物残留量检测方法，本实施例以苹果为检测对象，具体包括如下：
1 试剂和耗材：同实施例1；2 仪器设备：同实施例1；3 标准品：同实施例1。
4 样品前处理
4.1 样品提取：取植物源性食品苹果300g，带皮切碎，再用组织捣碎机粉碎均匀，称取3g样品（精确至0.01g）置于50mL塑料离心管中。其余步骤与实施例1相同。
4.2 样品净化
4.2.1 固相萃取柱制备：固相萃取柱采用干式填充方法，取10mL注射器，由下往上依次放入筛板，接着加入6g无水硫酸钠，放入筛板，加入聚酰胺粉0.6g，放入筛板，压实填料，制得固相萃取柱。
4.2.2 固相萃取柱活化：与实施例1相同。
4.2.3 样品净化：与实施例1相同。
5 仪器条件：同实施例1。
6线性范围和方法检出限
向不含氯苯酚类物质的苹果样品中添加对氯间二甲苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚浓度均为20μg/kg，五氯苯酚添加浓度为5μg/kg，按照具体实施方式操作，获得色谱图，对定量离子的色谱峰计算信噪比，信噪比 (S/N)均大于3，因此，植物源性食品中对氯间二甲苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚的检出限均为20μg/kg，五氯苯酚的检出限为5μg/kg。
用植物源性食品（苹果）空白样品基质待测液配制的标准曲线线性范围：对氯间二甲苯酚浓度范围为20-500 ng/mL；2,4,5-三氯苯酚和2,4,6-三氯苯酚浓度范围均为10-500ng/mL；2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚以及五氯苯酚的浓度范围均为5-500 ng/mL。在本实施例条件下，以7种氯苯酚标准溶液的峰面积（y）为纵坐标，浓度（x，ng/mL）为横坐标作线性回归方程。表6为苹果基质中7种氯苯酚标准溶液线性回归方程及相关系数。
表6 苹果基质中7种氯苯酚标准溶液线性回归方程及相关系数
| 序号 | 化合物名称 | 线性方程 | 相关系数R |
| 1 | 对氯间二甲苯酚 | <i>y</i>=15915.62<i>x</i>-277041.6 | 0.998 |
| 2 | 2,4,5-三氯苯酚 | <i>y</i>=7756.24<i>x</i>-47769.52 | 0.999 |
| 3 | 2,4,6-三氯苯酚 | <i>y</i>=28909.74<i>x</i>-388461.3 | 0.998 |
| 4 | 2,3,4,5-四氯苯酚 | <i>y</i>=48068.18<i>x</i>+347527.5 | 0.999 |
| 5 | 2,3,4,6-四氯苯酚 | <i>y</i>=49436.61<i>x</i>+348941.3 | 0.999 |
| 6 | 2,3,5,6-四氯苯酚 | <i>y</i>=106143.7<i>x</i>+1383821.1 | 0.998 |
| 7 | 五氯苯酚 | <i>y</i>=104562.2<i>x</i>-583445.6 | 0.999 |
7 加标回收率及精密度
以不含氯苯酚类物质的植物源性食品苹果为例考察加标回收率及精密度。向样品中添加三水平浓度，每水平平行测定6次（n=6），对氯间二甲苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚的添加水平为20μg/kg、50μg/kg、100μg/kg，五氯苯酚的添加水平为5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg。回收率范围在70.3%-84.7%之间，相对标准偏差范围在4.7%-6.4%之间，具体回收率、精密度见表7。
苹果空白样品定量离子色谱图见图23；基质添加标准品（200μg/kg）的定量离子色谱图见图24，特征离子色谱图见图25。
表7苹果基质添加标准物质的回收率与精密度
8定性鉴别：同实施例1。
9定量计算：同实施例1。
10 实际样品检测
应用本实施例方法对植物源性食品水果（苹果、梨、番石榴等）共15批样品进行检测，所测样品均为未检出氯苯酚类物质。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种食品中氯苯酚类有机污染物的联合检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.样品提取：选取动物源食品或植物源食品，用组织搅碎机搅碎，称取适量样品置于塑料离心管中，加入酸化甲醇-乙腈混合溶液和无水硫酸钠，均质，涡旋提取，离心，取清液于离心管中；样品残渣用酸化甲醇-乙酸乙酯混合溶液和无水硫酸钠重复提取一次，离心，收集清液，合并于同一个离心管中，制得动物源待净化液或植物源待净化液；
S2.样品净化：制备固相萃取柱，用酸化甲醇-乙腈混合溶液活化固相萃取柱，当液面到达柱吸附层表面时，加入步骤S1制得的动物源待净化液或植物源待净化液，用鸡心瓶收集全部流出液，依次用酸化甲醇-乙酸乙酯混合溶液、丙酮-环己烷混合溶液洗脱，收集洗脱液，合并于鸡心瓶中，旋转蒸发浓缩至干，若无法浓缩至干，可加入适量乙酸乙酯继续旋转蒸发直至无液体残留，加入酸化的甲醇水混合溶液溶解残留物，过滤，制得待测液；
S3.标准品制备：7种氯苯酚标准品分别用甲醇溶解配得标准品储备液，各取适量标准品储备液混合，用甲醇稀释配制混合标准品中间液，最后用空白样品基质提取液稀释配制对氯间二甲苯酚浓度范围为20-500 ng/mL；2,4,5-三氯苯酚和2,4,6-三氯苯酚浓度范围均为10-500 ng/mL；2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚以及五氯苯酚的浓度范围均为5-500 ng/mL，用以制作混合标准溶液工作曲线；
S4.含量测定：将步骤S3中的标准品，用超高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法测定，制作标准曲线；选取步骤S2制得的待测液，用超高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法测定，根据标准工作曲线，获得食品中氯苯酚类持久性有机污染物的残留量。
2.根据权利要求1所述的食品中氯苯酚类有机污染物的联合检测方法，其特征在于，步骤S1中所述动物源食品包括水产品、畜禽肌肉、畜禽内脏中的任一种；所述植物源食品包括水果、蔬菜；所述的动物源食品或植物源食品用组织搅碎机粉碎后称取2-3g，精确至0.01g；样品先用均质器均质提取10-30秒，再以转速1500-2000r/min涡旋提取5-10min，然后在8000-9000r/min离心2-3min，收集清液于塑料离心管中；样品残渣重复提取，提取液体积为5-10mL，无水硫酸钠质量为1-2g。
3.根据权利要求1所述的食品中氯苯酚类有机污染物的联合检测方法，其特征在于，步骤S1所述的酸化甲醇-乙腈混合溶液中，甲醇与乙腈之间的体积比例为1:1-2:1，乙酸或甲酸与甲醇-乙腈混合溶液的体积比例为0.1-1.0:99.9-99.0；酸化甲醇-乙酸乙酯混合溶液中，甲醇与乙酸乙酯体积比例为1:1-2:1，乙酸或甲酸与甲醇-乙酸乙酯混合溶液的体积比例为0.1-1.0:99.9-99.0；称取样品的质量与单次加入的提取液体积之间的比例为2-3g:5-10mL；称取样品的质量与无水硫酸钠的质量比例为2-3g:3-5g。
4.根据权利要求1所述的食品中氯苯酚类有机污染物的联合检测方法，其特征在于，所述的固相萃取柱内的填料为无水硫酸钠和聚酰胺粉，二者之间的质量比为2-6:0.3-1.0。
5.根据权利要求4所述的食品中氯苯酚类有机污染物的联合检测方法，其特征在于，所述固相萃取柱中按由下至上的顺序由筛板、无水硫酸钠、筛板、聚酰胺粉、筛板组成；无水硫酸钠质量与提取液体积之间的比例为2-6g:10-20mL。
6.根据权利要求5所述的食品中氯苯酚类有机污染物的联合检测方法，其特征在于，步骤S2所述收集从固相萃取柱流出的全部流出液，用鸡心瓶收集，在45-55℃水浴条件下旋转蒸发浓缩至干；若无法浓缩至干，加入乙酸乙酯，使提取液中残留的水分与乙酸乙酯形成共沸物，通过旋转蒸发除去；鸡心瓶中残留液体体积与加入的乙酸乙酯体积比约为1mL:10-20mL。
7.根据权利要求3所述的食品中氯苯酚类有机污染物的联合检测方法，其特征在于，步骤S2所述的酸化甲醇-乙腈混合溶液与步骤S1所述的酸化甲醇-乙腈混合溶液相同，加入体积为2-5mL；酸化甲醇-乙酸乙酯混合溶液与步骤S1的酸化甲醇-乙酸乙酯混合溶液相同，使用体积为2-5mL；丙酮-环己烷混合溶液中丙酮与环己烷之间的比例为7:3-1:1，使用体积为5-10mL。
8.根据权利要求7所述的食品中氯苯酚类有机污染物的联合检测方法，其特征在于，步骤S2所述的酸化的甲醇水混合溶液中，甲醇与超纯水之间的体积比例为1:1-1.5:1；乙酸或甲酸与甲醇水混合溶液之间的体积比为0.05-0.2:99.95-99.8；取1-2mL酸化的甲醇水混合溶液溶解鸡心瓶中残留物；使用商品化的0.22μm孔径的有机型滤头过滤，制得的待测液直接检测。
9.根据权利要求1所述的食品中氯苯酚类有机污染物的联合检测方法，其特征在于，步骤S4含量测定中，液相色谱条件包括：C18 色谱柱；流速：0.2 mL/min；柱温：25℃-30℃；进样量：20μL；流动相A为：甲醇；流动相B为：10mmol/L乙酸铵溶液；梯度洗脱程序为：0.00min：A相，55%，B相，45%；3.00 min：A相，55%，B相，45%；5.00 min：A相，60%，B相，40%；12.00min：A相，60%，B相，40%；12.10 min：A相，90%，B相，10%；14.00 min：A相，90%，B相，10%；14.10min：A相，55%，B相，45%；16.00 min：A相，55%，B相，45%，均为体积百分含量，在该液相色谱条件下可使2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚同分异构体，2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚同分异构体完全分离；
质谱条件包括：离子源：ESI，负离子模式检测；采用自动扫描采集，加热模块温度：200℃；CDL温度：200 ℃；雾化器流速：1.5 L/min；干燥气压力：100 kPa-120 kPa；离子源电压：-4.5 kV；检测器电压：1.7 kV；校准方法：自动调谐优化电压；外标法校准质量数；特征离子采集范围为m/z 140-500，重复扫描3次-5次，离子累积时间：20 msec-40 msec；MS2采集范围:m/z 70-500，重复扫描3次-5次，离子累积时间：30 msec-50 msec，CID 能量:10 %-70 %。
10.根据权利要求9所述的食品中氯苯酚类有机污染物的联合检测方法，其特征在于，步骤S4中所述对氯间二甲苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚、五氯苯酚以特征离子峰面积进行外标法定量，采用氯苯酚类化合物的保留时间、特征离子的精确质荷比以及分子式预测软件相结合进行定性确证；其中对氯间二甲苯酚的特征离子的精确质荷比为155.0321和157.0317，以155.0321为定量离子；2,4,5-三氯苯酚与2,4,6-三氯苯酚为同分异构体，两者的特征离子的精确质荷比均为194.9255、196.9232和198.9192，以196.9232为定量离子；2,3,4,5-四氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、2,3,5,6-四氯苯酚为同分异构体，三者的特征离子的精确质荷比均为228.8821、230.8797、232.8771和234.8724，以230.8797为定量离子；五氯苯酚的特征离子的精确质荷比为262.8439、264.8406、266.8371和268.8357，以264.8406为定量离子。
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