CN115508470B - 一种乳粉中五氯苯酚含量的检测方法 - Google Patents

一种乳粉中五氯苯酚含量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乳粉中五氯苯酚含量的检测方法，包括以下步骤：以乳粉为研究对象，采用碱性水溶液和乙腈为萃取剂，在水浴加热超声条件下提取，提取液经调节pH值后，用填料未封尾的C18固相萃取柱富集和净化，洗脱液经氮气吹干，酸化的甲醇‑水溶液复溶后，用LC/MS‑IT‑TOF检测。本方法操作简单、回收率高、抗基质干扰能力强、飞行时间质谱高分辨率定性鉴别准确可靠，适合各种乳粉基质中痕量五氯苯酚的准确定性鉴别和定量测定。

Description

一种乳粉中五氯苯酚含量的检测方法
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种乳粉中五氯苯酚含量的检测方法。
背景技术
五氯苯酚(又称为五氯酚，pentachlorophenol，PCP)及其钠盐(五氯酚钠，又称为五氯酚酸钠，PCP-Na)曾作为杀菌剂、除草剂、杀虫剂和木材防腐剂等在全球范围内被广泛使用。由于五氯苯酚高效、廉价等特点，其在鱼塘清塘、大型木料防腐等领域仍具不可替代性，其频繁和过度使用，已导致水生和陆地生态系统的污染，成为一种普遍存在于环境介质中的污染物。五氯苯酚及其钠盐化学性质稳定，不易降解，具有持久污染性，五氯酚钠具有较好的水溶性，在环境介质中的，可通过水载体、呼吸、饮食或直接接触等方式进入食物链或生物体内，在食物链或生物体内蓄积，导致生物毒性和致畸、致癌、致突变等毒副作用，被国际癌症研究机构列2B类致癌物。
我国卫生部、农业部将五氯苯酚及其钠盐列为非法使用物质名单，自20世纪70年代开始世界各国陆续出台措施限制五氯苯酚及其钠盐的生产及使用。我国在食品安全、食品接触材料、化妆品、工作场所、环境监测等多个领域制定了五氯苯酚及其钠盐的检测标准。自2018年起，畜禽肉及其副产物等动物源性食品中五氯酚及其钠盐残留量作为食品安全监督抽检必项目，但作为动物源性食品之一的乳和乳制品(乳粉等)，目前尚未建立相关的检测方法，相关风险监测有待开展。
在食品安全领域，五氯苯酚及其钠盐常用的仪器检测方法有气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法。气相色谱法、气相色谱-质谱联用法需对五氯苯酚进行衍生，步骤繁琐；液相色谱法定性鉴别手段单一，可靠性不够强；液相色谱-串联质谱法属于低分辨率质谱，五氯苯酚结构稳定，无法碎裂获得特征子离子，只能通过四个同位素母离子找母离子(262.8/262.8、264.8/264.8、266.8/266.8、268.8/268.8)的方式定性确证，实际样品的提取离子图谱杂峰较多，当样品中五氯苯酚含量较低时268.8/268.8离子对的响应很弱，此时不能满足四个离子对同时存在的判定要求，仅靠三个同位素母离子难以做出准确的定性判断，容易导致结果误判。因此，建立高分辨率、精准的检测方法，以提供更先进的检测手段，是未来食品检测发展趋势之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种乳粉中五氯苯酚含量的检测方法，该方法回收率高、抗基质干扰能力强、飞行时间质谱高分辨率定性鉴别准确可靠，适合各种乳粉基质中痕量五氯苯酚的准确定性鉴别和定量测定。
本发明的上述目的可以通过以下技术方案来实现：一种乳粉中五氯苯酚含量的检测方法，包括以下步骤：
(1)制备样品提取液：取乳粉样品，加入碱性水溶液，涡旋溶解，水浴加热超声提取，加入乙腈，涡旋，离心，取上层液体，再用乙腈重复提取下层样品，合并两次提取的上层液体，向液体中加入酸调节pH值至酸性，涡旋，静置，加水稀释得样品提取液；
(2)样品提取液的净化：C18固相萃取柱依次用甲醇、水活化，将步骤(1)中的样品提取液转移至C18固相萃取柱中净化，弃去全部流出液，用水淋洗C18固相萃取柱，负压抽干，用洗脱溶剂洗脱C18固相萃取柱中的五氯苯酚，收集洗脱液，经浓缩、复溶后，得待测液；
(3)标准溶液制备：用甲醇稀释配制标准品中间液，用空白乳粉样品基质提取液配制一组标准溶液，用于制作与样品基质匹配的标准工作曲线；
(4)含量测定：将步骤(3)中的一组标准溶液用液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法(LC/MS-IT-TOF)测定，制作与样品基质匹配的标准工作曲线；选取步骤(2)中的待测液，用LC/MS-IT-TOF测定，以五氯苯酚的四个加合物母离子同位素峰的精确质量数和保留时间定性判断，以五氯苯酚四个加合物母离子中响应最高的同位素峰峰面积与标准工作曲线进行定量，获得乳粉中五氯苯酚的含量；
(5)分子式预测：利用液相色谱-离子阱-飞行时间质谱仪自带的FormulaPredictor分子式预测软件结合步骤(4)获得的加合物母离子同位素峰的精确质量数推测分子式，对阳性样品作进一步确证。
本发明应用离子阱-飞行时间质谱技术结合C18固相萃取技术，建立了乳粉中五氯苯酚检测方法，提供一种高分辨率的精准的定性鉴别和定量测定新方法，弥补乳粉中五氯苯酚检测方法缺失。本发明采用五氯苯酚四个同位素母离子的精确质量数(精确至小数点后四位)定性判断特异性更强，提取离子图谱无其它任何杂峰，完全排除杂质干扰，定性判断更加准确可靠。本发明建立的方法暂未见文献、标准或专利报道。进一步的，本发明提供的乳粉中五氯苯酚含量的检测方法，包括以下步骤：
(1)制备样品提取液：称取适量乳粉样品，加入碱性水溶液，涡旋溶解，水浴加热超声提取，加入乙腈，涡旋，离心，取液体转移至塑料离心管中，再用乙腈重复提取样品，合并液体，向液体中加入酸调节pH值至酸性，涡旋，静置，最后加水稀释制得样品提取液；
(2)样品提取液的净化：C18固相萃取柱依次用甲醇、水活化，样品提取液转移至C18固相萃取柱中净化，弃去全部流出液，用水淋洗C18固相萃取柱，负压抽干，用洗脱液洗脱C18固相萃取柱中的五氯苯酚，收集洗脱液，经浓缩、复溶后，制得待测液；
(3)标准溶液制备：用甲醇稀释配制标准品中间液，用空白乳粉样品基质提取液配制一组标准溶液，用于制作与样品基质匹配的标准工作曲线；
(4)含量测定：将步骤(3)中的一组标准溶液用液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法(LC/MS-IT-TOF)测定，制作与样品基质匹配的标准工作曲线；选取步骤(2)中的待测液，用LC/MS-IT-TOF测定，以五氯苯酚的四个加合物母离子同位素峰的精确质量数和保留时间定性判断，以五氯苯酚加合物母离子中响应最高的、质荷比(m/z)为264.8316～264.8398的同位素峰峰面积与相应的标准品浓度绘制基质匹配标准工作曲线进行定量，获得乳粉中五氯苯酚残留量；
(5)分子式预测：利用LC/MS-IT-TOF仪器自带的Formula Predictor分子式预测软件结合步骤(4)获得的加合物母离子同位素峰的精确质量数推测分子式，对阳性样品作进一步确证。
本发明方法针对乳粉样品，采用碱性水溶液溶解，在水浴加热超声条件下使五氯苯酚以盐的形式游离出来，再以乙腈提取和沉淀蛋白，离心，获得提取液，调节提取液pH至酸性，加水稀释后用C18固相萃取柱净化，经浓缩、复溶后，用LC/MS-IT-TOF法检测，四个加合物母离子同位素峰的精确质量数(精确至小数点后四位)、保留时间以及分子式预测定性确证，以264.8316～264.8398的离子峰的峰面积进行定量
在上述乳粉中五氯苯酚含量的检测方法中：
优选的，步骤(1)中所述乳粉样品为以生牛乳或生羊乳为原料或主要原料，添加或不添加其它其它营养素、食品添加剂等，经加工制成的粉状产品，包括各类配方奶粉。
优选的，步骤(1)中所述碱性水溶液是浓度为30～100mmol/L碳酸钠溶液、浓度为50～200mmol/L碳酸氢钠溶液、浓度为30～100mmol/L碳酸钾溶液、浓度为20～50mmol/L氢氧化钠溶液或氨水溶液，其中氨水溶液是指由含氨量为25％～27％的氨水与水按比例混合配制，两者体积比为1：9～4：1。
本发明碱性水溶液可充分溶解乳粉样品，同时可使样品中以结合态或以五氯苯酚酸式形式存在的五氯苯酚转化为易溶于水的五氯酚酸盐(五氯酚酸钠、五氯酚酸钾或五氯苯酚铵盐等)，提高检测准确度。
优选的，步骤(1)中所述乳粉样品与所述碱性水溶液的用量关系为1～2g：4～8mL；在此用量关系下，可以使乳粉样品充分溶解，有利于充分提取样品中的五氯苯酚。
优选的，步骤(1)中所述碱性水溶液与所述乙腈的体积比为1：1～1.2；在此范围的比例下可获得澄清提取液，继续增加乙腈比例，未对沉淀蛋白起更有益的作用，反而会增加检测成本和污染环境。
推荐的，所述乙腈为色谱纯级别，避免分析纯可能带来的本底干扰。
推荐的，乙腈重复提取下层样品时乙腈的用量为2～4mL。
五氯苯酚极性较强，但在碱性条件下转化为五氯苯酚盐后，则极性增强，易溶于甲醇、乙腈，但乙腈对乳粉的蛋白质沉淀效果明显优于甲醇，获得的提取液更澄清，避免了由于蛋白质沉淀不完全，导致堵塞固相萃取柱，因此，选择乙腈作为有机相提取试剂和蛋白沉淀剂。
优选的，步骤(1)中水浴加热超声提取时，水浴温度为45～55℃，超声波的频率为35～45khz，超声提取时间为20～35min；涡旋时推荐采用市场上商品化的自动涡旋混合器以2000～2500r/min剧烈涡旋提取3～5min；离心为低温离心，离心时温度为4～8℃，转速为9000～10000r/min，离心时间为3～5min。
作为本发明的一种优选的实施方式，步骤(1)中离心后液体可转移至50～100mL塑料离心管中。
水浴加热超声起到加速五氯苯酚转化为相应的盐溶于水溶液中，提高萃取回收率，低温条件下高转速离心，可使固液分层明显，提取液更澄清。
优选的，步骤(1)中向液体中加入酸调节pH值至酸性时，采用的酸为磷酸、盐酸、硫酸、冰乙酸或甲酸；调节pH值至1.5～4；静置时间为5～10min；加水稀释使液体总体积为50～60mL，得提取液，提取液中乙腈的体积比例不超过液体总体积25％。
优选的，所述酸为分析纯级。
在碱性提取液中五氯苯酚以盐的形式存在，此时为离子态，试验结果表明以离子态形式存在时，在C18固相萃取柱中的保留能力较差，回收率仅有20％～30％。将碱性提取液的pH值用酸调节为1.5～4，静置5～10min，使五氯酚酸盐完全转化为五氯苯酚，可显著提高在C18固相萃取柱中的保留能力，回收率达到80％以上。
优选的，碱性提取液加酸调节pH值过程中，采用一边轻轻摇动提取液，一边缓慢滴加酸，避免酸与碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸钾溶液发生剧烈反应产生大量二氧化碳气体，导致液体涌出离心管。使用C18固相萃取柱净化前，应通过加水稀释的方式控制提取液中乙腈的比例不超过液体总体积的25％，否则目标化合物回收率下降。
优选的，步骤(2)中所述C18固相萃取柱是指柱填料C18表面的硅羟基未经过封尾(封端)处理的C18固相萃取柱，填料质量为0.5～2g，固相萃取柱体积为5～12mL；C18固相萃取柱活化时甲醇和水的用量分别为柱体积的1～1.5倍和1～2倍；提取液过柱净化的流出速度控制在0.5～1mL/min之间；待样品提取液全部过柱后，以柱体积的1.5～2倍水淋洗C18固相萃取柱，负压抽干5～10min。
试验结果表明，当C18固相萃取柱的填料质量为0.5～2g时，可应对各种复杂乳粉基质，为五氯苯酚提供足够的萃取结合位点，确保高回收率，避免了杂质竞争保留导致目标化合物保留位点减少回收率变差，因此，填料质量越大更有利于提高目标化合物回收率，但同时也会增加经济成本。
C18固相萃取柱活化时甲醇和水的用量分别为柱体积的1～1.5倍和1～2倍即可将填料中的活性基团充分活化，增大与样品提取液的接触面积，从而确保较高回收率。
优选的，步骤(2)中所述洗脱溶剂为甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸乙酯-二氯甲烷混合溶液或乙酸乙酯-甲醇混合溶液；所述乙酸乙酯-二氯甲烷混合溶液或乙酸乙酯-甲醇混合溶液中所述乙酸乙酯占乙酸乙酯-二氯甲烷混合溶液或乙酸乙酯-甲醇混合溶液总体积的50～75％；洗脱溶剂体积用量为8～10mL，洗脱溶剂在35～40℃水浴条件下保温，分四次洗脱固相萃取柱中五氯苯酚；收集洗脱液并在50～55℃水浴条件下氮气吹干，用1～2mL体积百分含量为50～70％的含酸甲醇水溶液复溶，其中酸为甲酸，甲酸的体积百分含量为0.1％，过有机系滤膜，制得待测液。
甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸乙酯-二氯甲烷混合溶液、乙酸乙酯-甲醇混合溶液分别作为洗脱溶剂均能将保留在C18固相萃取柱上的五氯苯酚充分洗脱，洗脱回收率均能达80％以上，因此，上述溶剂均可作为洗脱溶剂。洗脱溶剂温度对洗脱回收率有较大影响，当室内温度低于15℃时，洗脱回收率约为47％～56％之间，当洗脱溶剂在35～40℃水浴条件下保温，分次趁热洗脱，回收率可达到80％以上。水浴氮吹温度50～55℃可加快浓缩，且对五氯苯酚不存在降解等影响。在酸性条件下，可避免五氯苯酚被有机系滤膜吸附导致结果不准确，因此，在体积百分含量为50～70％的甲醇水溶液中添加0.1％甲酸，用于复溶氮吹后的残留物。
优选的，步骤(3)中用甲醇稀释配制标准中间溶液，用不含五氯苯酚的空白乳粉样品基质提取液稀释配制一组浓度范围为5～1000ng/mL的标准溶液，用于制作与样品基质匹配的标准工作曲线。
推荐的，甲醇为色谱纯的甲醇。
作为本发明的一种优选的实施方式，商品化的五氯苯酚标准溶液浓度为1000μg/mL，用色谱纯的甲醇稀释配制标准中间溶液，再用不含五氯苯酚的乳粉样品基质(空白乳粉样品基质)提取液稀释配制一组浓度范围为5～1000ng/mL的系列保准溶液。
优选的，步骤(4)中用液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法测定时，其液相色谱条件包括：色谱柱：KinetexC18，规格100×2.1mm，1.7μm；流速：0.15～0.20mL/min；柱温：30～40℃；进样量：20～50μL；流动相A为：甲醇-乙腈混合溶液(体积比8：2)；流动相B为：一级水或含0.05～0.1％(体积百分含量)甲酸的水溶液；梯度洗脱程序为：0.00min：A相，45％，B相，55％；2.00min：A相，45％，B相，55％；3.00min：A相，90％，B相，10％；11.00min：A相，90％，B相，10％；11.10min：A相，45％，B相，55％；12.00min：A相，45％，B相，55％；均为体积百分含量。
优选的，步骤(4)中用液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法测定时，质谱条件包括：离子源：ESI，负离子模式检测；采用自动扫描采集，加热模块温度：180～200℃；CDL温度：180～200℃；雾化器流速：1.2～1.5L/min；干燥气压力：110～130kPa；离子源电压：4.5kV；检测器电压：1.7～1.8kV；校准方法：自动调谐优化电压；三氟乙酸钠校准质量数；MS1采集范围为m/z 250～300，重复扫描2～3次，离子累积时间：30～40msec；CID能量:15～25％；以五氯苯酚的一级质谱(MS1)加合物同位素离子的精确质量数(精确至小数点后四位)和保留时间定性判断；五氯苯酚四个加合物同位素离子(一级离子MS1)的精确质量数范围分别为：262.8316～262.8398、264.8316～264.8398、266.8316～266.8398、268.8316～268.8398；以264.8316～264.8398的离子峰的峰面积进行定量，其它其它离子峰及其精确质量数和保留时间作为定性判断依据。
由于五氯苯酚分子结构对称，十分稳定，无论是液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)还是液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法(LC/MS-IT-TOF)法均无法使五氯苯酚分子碎裂产生二级离子碎片，因此，这两种仪器检测方法均只能采用五氯苯酚的四个加合物离子同位数峰进行4点确证，但LC-MS/MS属于低分辨率质谱，五氯苯酚加合物母离子同位素峰的质量数仅精确至小数点后1位，容易受样品杂质离子干扰，导致假阳性，结果误判。本发明采用基于飞行时间质谱的LC/MS-IT-TOF检测，以五氯苯酚的四个加合物母离子同位素峰的精确质量数(精确至小数点后四位)、保留时间以及分子式预测等手段对复杂乳粉基质中五氯苯酚精准鉴别和定量测定，具有现有文献或检测标准所述的气相色谱法、气相色谱质谱法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等无法比拟的高分辨率鉴别能力，解决了假阳性，结果误判等风险，是一种新型的检测手段。
优选的，步骤(5)分子式预测具体包括：根据五氯苯酚分子式C6HCl5O，设定化合物组成元素为C、H、Cl、O，原子个数范围设为C:0～10；H:0～10；Cl:0～6；O:0～2；丢失电荷设为H-；应用氮规则筛查，筛查误差为5～20ppm；五氯苯酚4个加合物同位素离子同时存在前提下，设置电荷数量为1，选择质量数为262.8316～262.8398的加合物离子进行分子式预测，若结果仅有一个分子式且与五氯苯酚分子式一致，则可验证样品中含有五氯苯酚。
本发明方法针对目前尚未有乳粉中五氯苯酚含量的检测标准或文献报道，提供了一种乳粉中五氯苯酚含量的检测方法，弥补检测方法缺失，该方法以乳粉(此处所述的乳粉是指以生牛(羊)乳为原料或主要原料，添加或不添加其它其它营养素、食品添加剂等，经加工制成的粉状产品，包括各类配方奶粉)为研究对象，样品采用碱性水溶液溶解，在水浴加热超声条件下使五氯苯酚转化为易溶于水的五氯酚酸盐游离到碱性水溶液中，再以乙腈提取和沉淀蛋白，调节提取液的pH至酸性，将极性的五氯酚酸盐转化为五氯苯酚，加水稀释后用C18固相萃取柱萃取和净化，经浓缩、复溶后，用LC/MS-IT-TOF法检测，本方法操作简单、回收率高、抗基质干扰能力强、飞行时间质谱高分辨率定性鉴别准确可靠，适合各种乳粉基质中痕量五氯苯酚的准确定性鉴别和定量测定。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)弥补检测方法空白，适用范围广，本发明以乳粉基质作为研究对象，应用LC/MS-IT-TOF法建立了乳粉中五氯苯酚污染物残留量检测方法，弥补乳粉中五氯苯酚检测方法空白，建立的方法适用范围广，适用于各种乳粉，对于蛋白质含量高达18％以上的乳粉，同样具有良好的回收率、精密度和灵敏度；
(2)本发明的检测方法原理与现有标准GB 23200.92-2016、GB 29708-2013、SC/T3030-2006有很大差异，且回收率达到80％以上，优于现有标准的回收率30％～60％之间；
(3)LC/MS-IT-TOF高分辨率精准鉴别和定量测定，本发明采用基于飞行时间质谱的LC/MS-IT-TOF检测，以五氯苯酚的四个加合物母离子同位素峰的精确质量数(精确至小数点后四位)、保留时间以及分子式预测等手段可对复杂乳粉基质中五氯苯酚精准鉴别和定量测定；具有现有文献或检测标准报道的气相色谱法、气相色谱质谱法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等无法比拟的高分辨率鉴别能力，解决了假阳性，结果误判等风险，是一种新型的检测手段；即使无标准品，利用各同位素准分子离子峰的精确质量数和丰度比例，也能对目标化合物进行筛查和确证；
(4)碱性水溶液转换目标化合物极性，乙腈高效萃取，利用五氯苯酚在酸性和碱性条件下理化性质差异较大和乳粉蛋白含量高的特点，采用碱性水溶液溶解样品，在水浴加热超声条件下使结合态或以五氯苯酚酸式形式存在的五氯苯酚转化为易溶于水的五氯苯酚盐(如：五氯酚钠、五氯酚钾或五氯酚铵盐等)，再以乙腈提取和沉淀蛋白，实现了乳粉中五氯苯酚的高效萃取，回收率达80％以上；
(5)转换目标化合物极性，C18固相萃取柱高效萃取和净化，本发明将碱性提取液的pH值调节为1.5～4，使极性的五氯苯酚盐转化为五氯苯酚，然后再用C18固相萃取柱萃取和净化，可显著提高五氯苯酚的回收率至80％以上，解决了碱性条件下C18固相萃取回收率低难题；
(6)提供多种溶剂控温洗脱方案，回收率高，本发明采用温度约为35～40℃的甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸乙酯-二氯甲烷混合溶液、乙酸乙酯-甲醇混合溶液分别作为洗脱溶剂，洗脱能力强，同时可减少洗脱液用量，五氯苯酚回收率80％以上；
(7)解决有机系滤膜吸附目标化合物问题，体积百分含量为50～70％甲醇水溶液中添加0.1％甲酸，用于复溶氮吹后的残留物，解决了五氯苯酚被有机系滤膜吸附导致结果不准确问题；
(8)分子式匹配法验证，本发明利用LC/MS-IT-TOF仪器自带的Formula Predictor分子式预测软件，根据五氯苯酚分子式C6HCl5O，设定化合物组成元素为C、H、Cl、O，原子个数范围设为C:0～10；H:0～10；Cl:0～6；O:0～2；丢失电荷设为H-；应用氮规则筛查，筛查误差为5～20ppm；五氯苯酚四个加合物同位素离子同时存在前提下，设置电荷数量为1，仅选择质量数范围为262.8316～262.8398的加合物离子质量数进行分子式预测，若仅有一个预测结果且与五氯苯酚分子式一致，则可验证样品中含有五氯苯酚。
附图说明
图1为实施例1中五氯苯酚四个加合物同位素离子峰；
图2为实施例1中五氯苯酚的基质匹配标准工作曲线图；
图3为实施例1中五氯苯酚标准品特征离子质谱图；
图4为实施例1中添加五氯苯酚标准品的中老年配方奶粉提取特征离子图；
图5为实施例1中空白中老年配方奶粉样品中五氯苯酚定量离子色谱图；
图6为实施例1中空白中老年配方奶粉添加标准品定量离子色谱图；
图7为实施例1中五氯苯酚标准溶液定量离子色谱图；
图8为实施例1中空白中老年配方奶粉添加标准品的定性、定量离子色谱图；
图9为实施例1中空白中老年配方奶粉样品五氯苯酚的定性、定量离子色谱图；
图10为实施例1中空白乳粉样品添加五氯苯酚标准品的Formula Predictor分子式预测结果图。
具体实施方式
以下列举具体实施例对本发明进行说明。需要指出的是，实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例以高蛋白质的中老年配方奶粉(蛋白质含量为18.1％)作为检测对象，提供乳粉中五氯苯酚含量的检测方法，具体包括如下：
1试剂和耗材
试剂：甲醇、乙腈、乙酸乙酯均为色谱纯；甲酸为优级纯；磷酸、无水碳酸钠均为分析纯；使用的水为一级水。
耗材：50mL聚乙烯塑料离心管；孔径为0.22μm的聚四氟乙烯(PTFE)针式滤器过滤；1mL一次性针式注射器；C18交换固相萃取柱(未封尾)，规格1g/12mL；一次性塑料吸管；玻璃试管(氮吹管)。
2仪器设备
岛津液相色谱–离子阱-飞行时间质谱仪(LC/MS-IT-TOF)，带电喷雾离子源；KEYINTECH自动涡旋混合器，最大转速3000r/min；优莱博(Julabo)SW23水浴恒温振荡器；艾本德(eppendorf)高速离心机，最大转速10000r/min；氮吹仪；得泰(Detelogy)FV64自动氮吹浓缩仪；雷磁PHS-3C pH计；梅特勒电子天平：精度0.01g和0.00001g；固相萃取装置。
3标准品
3.1标准品：五氯苯酚储备液浓度为1000μg/mL，-18℃条件下保存。
3.2标准品中间液：吸取五氯苯酚标准储备液20μL置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，配得浓度为2μg/mL标准中间溶液，4℃条件下保存。
3.3基质匹配标准工作曲线：用空白乳粉样品基质提取液稀释配制一组浓度范围为5～1000ng/mL的标准溶液，用于配制基质匹配标准工作曲线。
4样品前处理
(1)制备样品提取液：称取乳粉样品2g(精确至0.01g)，置于50mL聚乙烯离心管中，加入8mL浓度为30mmol/L的碳酸钠溶液，用自动涡旋混合器以2000r/min涡旋3min，使样品完全溶解，然后置于45℃水浴超声(超声频率35khz)提取20min，加入9mL色谱纯乙腈，2500r/min涡旋3min后，在离心温度为8℃，转速为9000r/min，离心5min，液体转移至另一个50mL聚乙烯塑料离心管中，再用3mL色谱纯乙腈重复提取样品一次，合并液体于50mL聚乙烯塑料离心管中，一边轻轻摇动离心管，一边向液体中缓慢滴加磷酸约4mL，使液体pH值为1.5～4，摇匀，静置5min，最后用一级水稀释至离心管的50mL刻度，使乙腈体积比例不超过总体积的25％，制得样品提取液，待净化。
(2)样品提取液的净化：C18固相萃取柱依次用12mL色谱纯甲醇、15mL一级水活化。将步骤(1)制得的样品提取液分次转移至C18固相萃取柱中，控制液体流出速度不超过1mL/min，弃去全部流出液，待所有样品提取液全部过柱后，用18mL一级水分2次淋洗C18固相萃取柱，弃去淋洗液，负压抽干不少于5min。将色谱纯乙酸乙酯放在35℃水浴中保温，分4次洗脱C18固相萃取柱中的五氯苯酚，每次2mL，用氮吹管收集全部洗脱液，50℃水浴条件下用氮气吹干、用1.0mL70％(体积百分含量)甲醇水溶液(含0.1％(体积百分含量)甲酸)复溶，过0.22μm有机系滤膜，制得待测液，供LC/MS-IT-TOF检测。
5仪器条件
5.1液相色谱条件
色谱柱：Kinetex C18，规格100×2.1mm，1.7μm；
流速：0.2mL/min；
柱温：30℃；
进样量：20μL；
流动相A为：甲醇-乙腈混合溶液(体积比8:2)；流动相B为：0.05％甲酸水溶液；梯度洗脱程序见表1。
表1梯度洗脱程序
时间/min A相/％ B相/％
0.00 45 55
2.00 45 55
3.00 90 10
11.00 90 10
11.10 45 55
12.00 45 55
5.2质谱条件
离子源：ESI，负离子模式检测；采用自动扫描采集，加热模块温度：200℃；CDL温度：200℃；雾化器流速：1.5L/min；干燥气压力：110kPa；离子源电压：4.5kV；检测器电压：1.7kV；校准方法：自动调谐优化电压；三氟乙酸钠校准质量数；MS1采集范围为m/z 250～300，重复扫描2～3次，离子累积时间：30msec；CID能量:15％。主要质谱参数见表2。
表2质谱参数
Figure BDA0003855709420000121
注：带“*”的为定量离子。
6线性范围和方法检出限
向空白中老年配方奶粉中添加五氯苯酚添加浓度为5μg/kg，按照本实施例检测，获得色谱图，对定量离子的色谱峰计算信噪比，信噪比(S/N)均大于10，因此，乳粉中五氯苯酚的检出限为5μg/kg。
用空白中老年配方奶粉提取液稀释配制五氯苯酚的基质匹配标准工作曲线，线性范围为5ng/mL～1000ng/mL，线性方程为Y＝21497.47X+586998.1，相关系数R为0.998符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》附录F.2校准曲线要求。五氯苯酚4个加合物同位素离子峰如图1所示，五氯苯酚的基质匹配标准工作曲线图见图2，五氯苯酚标准品特征离子质谱图见图3，添加五氯苯酚标准品的中老年配方奶粉提取特征离子图见图4。
7加标回收率及精密度
向空白中老年配方奶粉中添加三水平浓度标准品，每水平平行测定6次。五氯苯酚标准品的添加水平为5μg/kg、10μg/kg、50μg/kg。回收率范围在91.2％～103.3％之间，相对标准偏差范围在5.9％～6.5％之间，具体回收率、精密度见表4。
图5为空白中老年配方奶粉样品中五氯苯酚定量离子色谱图，图6为空白中老年配方奶粉添加标准品定量离子色谱图，图7为五氯苯酚标准溶液定量离子色谱图，图8为空白中老年配方奶粉添加标准品的定性、定量离子色谱图，图9为空白中老年配方奶粉样品五氯苯酚的定性、定量离子色谱图。图10为空白乳粉样品添加五氯苯酚标准品的FormulaPredictor分子式预测结果图，结果表明，以262.8385精确质量数进行分子式预测，预测到的分子式与五氯苯酚分子式一致。
表4加标回收率与精密度
Figure BDA0003855709420000131
8定性鉴别
以五氯苯酚标准物质的四个加合物母离子同位素峰的精确质量数(精确至小数点后四位)、保留时间以及分子式预测结果作为定性标准。定性判定的三个条件：当样品中同时存在与五氯苯酚标准物质一致的四个加合物母离子同位素峰，且四个加合物母离子对应的精确质量数在262.8316～262.8398、264.8316～264.8398、266.8316～266.8398、268.8316～268.8398范围内；保留时间与标准物质的保留时间比较在±2.5％范围内；分子式预测结果仅有一个分子式且与五氯苯酚分子式一致，同时满足上述三个条件时，即可判定乳粉样品中含有五氯苯酚。
9定量计算
计算公式为：
X＝C×V×F/m
其中：
X：样品中五氯苯酚的含量(μg/kg)
C：从标准工作曲线得到五氯苯酚浓度(ng/mL)
m：取样质量(g)
V：定容体积(mL)
F：稀释因子
计算结果保留两位有效数字。
10实际样品检测
应用本实施例方法对20批乳粉样品(婴幼儿配方乳粉1段6批次，2段6批次，3段4批次，中老年乳粉4批次)和添加了五氯苯酚标准品的空白乳粉样品进行检测，然后按“8定性鉴别”条件进行判断，经鉴别20批次乳粉样品均未检出五氯苯酚；添加了五氯苯酚标准品的空白乳粉样品符合“8定性鉴别”三个条件，检出五氯苯酚与实际情况一致，说明方法准确可靠。
对比例1
本对比例主要是比较样品提取液的酸碱性对目标化合物在C18固相萃取柱(未封尾)上回收率的影响。本对比例检测方法大体与实施例1相同，不同之处在于制备样品提取液步骤不加酸调节pH值，保留提取液呈碱性，此时提取液中五氯苯酚以五氯酚酸盐的离子态形式存在，用C18固相萃取柱萃取和净化，结果表明回收率约为20％～30％，因此，为了提高C18固相萃取柱的萃取回收率，应将样品提取液的pH值由碱性调节至1.5～4，使极性的五氯酚酸盐转化为五氯苯酚，提高目标化合物在C18固相萃取柱上的保留能力，回收率达80％以上。
对比例2
本对比例检测方法大体与实施例1相同。本对比例是比较封尾C18固相萃取柱与不封尾C18固相萃取柱对五氯苯酚萃取回收率差异。采用阴性乳粉样品添加标准品，添加量为50μg/kg，按实施例1方步骤进行提取，分别以填料质量均为1g的封尾与不封尾C18固相萃取柱进行萃取和净化，结果表明封尾C18固相萃取柱回收率仅有33％～45％之间，不封尾C18固相萃取柱回收率为80％以上，其原因可能是填料不封尾的C18固相萃取柱硅羟基数量更多，提供更多与五氯苯酚相互作用的活性位点，因此，回收率更高。
对比例3
本对比例是比较当室内温度为15℃或以下时，洗脱溶剂控温35～40℃与不控温对目标化合物洗脱效果影响。本对比例检测方法大体与实施例1相同，不同之处在于样品提取液净化步骤的洗脱溶剂乙酸乙酯不控温，直接洗脱C18固相萃取柱上的五氯苯酚。检测结果表明洗脱液温度对洗脱回收率有较大影响，当室内温度低于15℃时，洗脱回收率约为47％～56％之间，当洗脱液在35～40℃水浴条件下保温，分次趁热洗脱，回收率可达到80％以上，因此，提高洗脱液温度可增强洗脱能力，减少洗脱液用量。
实施例2
本实施例以高蛋白质的中老年配方奶粉(蛋白质含量为18.1％)添加标准物质方式，按实施例1的检测方法，比较甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸乙酯-二氯甲烷混合溶液(1:1，体积比)、乙酸乙酯-甲醇混合溶液(1:1，体积比)分别作为洗脱溶剂对保留在C18固相萃取柱上五氯苯酚的洗脱能力，以回收率表示，结果见表5。各洗脱液回收率均在80％以上，其中乙酸乙酯回收率最高。
表5不同洗脱液洗脱能力比较
洗脱液名称 添加水平/μg/kg 平均回收率/％(n＝3)
甲醇 50 90.2
丙酮 50 93.2
乙酸乙酯 50 103.3
二氯甲烷 50 84.5
乙酸乙酯-二氯甲烷混合溶液(1:1，体积比) 50 88.3
乙酸乙酯-甲醇混合溶液(1:1，体积比) 50 89.6
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处是将实施例1前处理步骤的30mmol/L的碳酸钠溶液改为浓度为30mmol/L氢氧化钠溶液，其余方法、过程均与实施例1相同。结果表明，线性范围、方法检出限与实施例1一致，但加标回收率和精密度存在差异，本实施例的加标回收率如表6所示。
表6加标回收率与精密度
Figure BDA0003855709420000151
Figure BDA0003855709420000161
由表6回收率及精密度可知，改用30mmol/L氢氧化钠溶液后，回收率比实施例1有所下降，但回收率仍然符合GB/T 27404-2008的附录F之F.1回收率范围60％～120％要求。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种乳粉中五氯苯酚含量的检测方法，其特征是包括以下步骤：
(1)制备样品提取液：取乳粉样品，加入碱性水溶液，涡旋溶解，水浴加热超声提取，加入乙腈，涡旋，离心，取上层液体，再用乙腈重复提取下层样品，合并两次提取的上层液体，向液体中加入酸调节pH值至酸性，涡旋，静置，加水稀释得样品提取液；
(2)样品提取液的净化：C18固相萃取柱依次用甲醇、水活化，将步骤(1)中的样品提取液转移至C18固相萃取柱中净化，弃去全部流出液，用水淋洗C18固相萃取柱，负压抽干，用洗脱溶剂洗脱C18固相萃取柱中的五氯苯酚，收集洗脱液，经浓缩、复溶后，得待测液；
(3)标准溶液制备：用甲醇稀释配制五氯苯酚标准品中间液，用空白乳粉样品基质提取液配制一组标准溶液，用于制作与样品基质匹配的标准工作曲线；
(4)含量测定：将步骤(3)中的一组标准溶液用液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法测定，制作与样品基质匹配的标准工作曲线；选取步骤(2)中的待测液，用LC/MS-IT-TOF测定，以五氯苯酚的四个加合物母离子同位素峰的精确质量数和保留时间定性判断，以五氯苯酚四个加合物母离子中响应最高的同位素峰峰面积与标准工作曲线进行定量，获得乳粉中五氯苯酚的含量；
(5)分子式预测：利用液相色谱-离子阱-飞行时间质谱仪自带的Formula Predictor分子式预测软件结合步骤(4)获得的加合物母离子同位素峰的精确质量数推测分子式，对阳性样品作进一步确证。
2.根据权利要求1所述的乳粉中五氯苯酚含量的检测方法，其特征是：步骤(1)中所述碱性水溶液是浓度为30～100mmol/L碳酸钠溶液、浓度为50～200mmol/L碳酸氢钠溶液、浓度为30～100mmol/L碳酸钾溶液、浓度为20～50mmol/L氢氧化钠溶液或氨水溶液，其中氨水溶液是指由含氨量为25％～27％的氨水与水按比例混合配制，两者体积比为1：9～4：1；步骤(1)中所述乳粉样品与所述碱性水溶液的用量关系为1～2g：4～8mL；所述碱性水溶液与所述乙腈的体积比为1：1～1.2。
3.根据权利要求1所述的乳粉中五氯苯酚含量的检测方法，其特征是：步骤(1)中水浴加热超声提取时，水浴温度为45～55℃，超声波的功率为35～45khz，超声提取时间为20～35min；涡旋时采用自动涡旋混合器以2000～2500r/min剧烈涡旋提取3～5min；离心为低温离心，离心时温度为4～8℃，转速为9000～10000r/min，离心时间为3～5min。
4.根据权利要求1所述的乳粉中五氯苯酚含量的检测方法，其特征是：步骤(1)中向液体中加入酸调节pH值至酸性时，采用的酸为分析纯级的磷酸、盐酸、硫酸、冰乙酸或甲酸；调节pH值至1.5～4；静置时间为5～10min；加水稀释使液体总体积为50～60mL，得提取液，提取液中乙腈的体积比例不超过液体总体积25％。
5.根据权利要求1所述的乳粉中五氯苯酚含量的检测方法，其特征是：步骤(2)中所述C18固相萃取柱是指柱填料C18表面的硅羟基未经过封尾处理的C18固相萃取柱，填料质量为 0.5～2g，固相萃取柱体积为5～12mL；C18固相萃取柱活化时甲醇和水的用量分别为柱体积的1～1.5倍和1～2倍；提取液过柱净化的流出速度控制在0.5～1mL/min之间；待样品提取液全部过柱后，以柱体积的1.5～2倍水淋洗C18固相萃取柱，负压抽干5～10min。
6.根据权利要求1所述的乳粉中五氯苯酚含量的检测方法，其特征是：步骤(2)中所述洗脱溶剂为甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸乙酯-二氯甲烷混合溶液或乙酸乙酯-甲醇混合溶液；所述乙酸乙酯-二氯甲烷混合溶液或乙酸乙酯-甲醇混合溶液中所述乙酸乙酯占乙酸乙酯-二氯甲烷混合溶液或乙酸乙酯-甲醇混合溶液总体积的50～75％；洗脱溶剂体积用量为8～10mL，洗脱溶剂在35～40℃水浴条件下保温，分四次洗脱固相萃取柱中五氯苯酚；收集洗脱液并在50～55℃水浴条件下氮气吹干，用1～2mL体积百分含量为50～70％的含酸甲醇水溶液复溶，其中酸为甲酸，甲酸的体积百分含量为0.1%，过有机系滤膜，制得待测液。
7.根据权利要求1所述的乳粉中五氯苯酚含量的检测方法，其特征是：步骤(3)中用甲醇稀释配制标准中间溶液，用不含五氯苯酚的空白乳粉样品基质提取液稀释配制一组浓度范围为5～1000ng/mL的标准溶液，用于制作与样品基质匹配的标准工作曲线。
8.根据权利要求1所述的乳粉中五氯苯酚含量的检测方法，其特征是：步骤(4)中用液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法测定时，其液相色谱条件包括：色谱柱：KinetexC18，规格100×2.1mm，1.7μm；流速：0.15～0.20mL/min；柱温：30～40℃；进样量：20～50μL；流动相A为：甲醇-乙腈混合溶液，甲醇和乙腈的体积比8：2；流动相B为：一级水或含体积百分含量为0.05～0.1％甲酸的水溶液；梯度洗脱程序为：0.00min：A相，45％，B相，55％；2.00min：A相，45％，B相，55％；3.00min：A相，90％，B相，10％；11.00min：A相，90％，B相，10％；11.10min：A相，45％，B相，55％；12.00min：A相，45％，B相，55％；均为体积百分含量。
9. 根据权利要求1所述的乳粉中五氯苯酚含量的检测方法，其特征是：步骤(4)中用液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法测定时，质谱条件包括：离子源：ESI，负离子模式检测；采用自动扫描采集，加热模块温度：180～200℃；CDL温度：180～200℃；雾化器流速：1.2～1.5L/min；干燥气压力：110～130kPa；离子源电压：4.5kV；检测器电压：1.7～1.8kV；校准方法：自动调谐优化电压；三氟乙酸钠校准质量数；MS1采集范围为m/z 250～300，重复扫描2～3次，离子累积时间：30～40msec；CID能量:15～25％；以五氯苯酚的一级质谱MS1加合物同位素离子的精确质量数和保留时间定性判断，其中精确质量数为精确至小数点后四位；五氯苯酚四个加合物同位素离子一级离子MS1的精确质量数范围分别为：262.8316～262.8398、264.8316～264.8398、266.8316～266.8398、268.8316～268.8398；以264.8316～264.8398的离子峰的峰面积进行定量，其它离子峰及其精确质量数和保留时间作为定性判断依据。
10. 根据权利要求9所述的乳粉中五氯苯酚含量的检测方法，其特征是：步骤(5)分子式预测具体包括：根据五氯苯酚分子式C6HCl5O，设定化合物组成元素为C、H、Cl、O，原子个数范围设为C:0～10；H:0～10；Cl:0～6；O:0～2；丢失电荷设为H-；应用氮规则筛查，筛查误差为 5～20ppm；五氯苯酚四个加合物同位素离子同时存在前提下，设置电荷数量为1，选择质量数为262.8316～262.8398的加合物离子进行分子式预测，若结果仅有一个分子式且与五氯苯酚分子式一致，则可验证样品中含有五氯苯酚。
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