CN103278586A

CN103278586A - 乳制品中双氰胺成分的提取及检测方法

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Publication number: CN103278586A
Application number: CN2013102408186A
Authority: CN
Inventors: 韩超; 陈祥准; 刘翠平; 刘滨; 朱振瓯
Original assignee: WENZHOU ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE OF PRC
Current assignee: WENZHOU ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE OF PRC
Priority date: 2013-06-14
Filing date: 2013-06-14
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2033-06-14
Also published as: CN103278586B

Abstract

本发明公开了一种乳制品中双氰胺成分的提取及检测方法，包括待测样品制备、净化、检测和回收率实验；在乳制品中加入甲酸水溶液，并经微波萃取得到待检液，并将其离心后经固相萃取，依次经水淋和洗脱溶剂洗脱得到洗脱液，将洗脱液蒸发浓缩后用乙腈溶剂稀释过滤得到待测样品溶液；配置阶梯浓度的标准工作溶液，将待测样品溶液和标准工作溶液在液相色谱-串联质谱仪上分别进样，获得工作曲线和质谱图，通过工作曲线和质谱图定性定量分析；然后称取双氰胺含量确定的乳制品，依次经上述实验步骤测得双氰胺浓度，将测定值与确定值计算得到回收率为83.6～95.7%。本发明具有提取效率高、准确定性定量测定、灵敏度高、结果准确的优点。

Description

乳制品中双氰胺成分的提取及检测方法

技术领域

本发明涉及一种双氰胺的检测方法，尤其是乳制品中双氰胺残留成分的提取及检测方法。

背景技术

双氰胺又名二氰二氨、二聚氰胺，缩写DICY或DCD，白色结晶性粉末。水中溶解度在13℃时为2.26%，在热水中溶解度较大。当水溶液在80℃时逐渐分解产生氨气。低毒，半数致死量(小鼠，经口)>4000mg/kg。空气中最高容许浓度5mg/m³。主要用作三聚氰胺的原料、染料固色剂、化肥、精细化工中间体等。目前国际标准未对食品中的双氰胺限量，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的，含有双氰胺的奶类产品可能会对婴幼儿产生副作用，婴幼儿器官的构造、发育和机能都不完善，对食品十分敏感，容易导致堵塞肾脏等情况发生。美国食品和药物管理局将双氰胺添加到安全性待检测物质名单，双氰胺的安全性遭到质疑。2013年1月25日，有媒体报道新西兰牛奶中发现了双氰胺残留物质。目前中国市场上进口的新西兰大包奶(包括脱脂奶粉、全脂奶粉)占到了中国总进口量的80%，而新西兰乳制品占到了中国全进口婴幼儿食品的40%左右，因此，建立奶制品中双氰胺残留成分的检测方法具有非常重要意义。

奶制品中双氰胺残留成分的检测方法主要包括从奶制品中提取残留的双氰胺制成检样，以及对该检样进行测试分析两个步骤，其中检样制备至关重要，直接影响后续测试分析结果的准确性。分析方法可分为定性分析、定量分析和定性定量分析技术。定性分析一般采用红外光谱、紫外光谱、质谱和核磁共振等波谱技术对目标物进行结构确定；定量分析一般采用色谱技术和光谱技术，色谱技术有气相色谱和液相色谱等方法，光谱技术有拉曼光谱法、分光光度法等方法；定性定量分析则要兼具两种技术为一体，检测结果要同时提供目标物的结构信息和数量信息，根据欧盟委员会非强制执行法案2002/657/EC的规定，对禁用药物进行确证检测的方法必须能提供结构方面的信息，且要达到该法案规定的4个确证点。

目前，由于无相关标准可循，有关奶制品中双氰胺或其他物质中的双氰胺检测方法有以下相关文献报道：

《食品化学》（Food Chem. 2013, 138: 998-1007）杂志2013年第138期998-1007页报道了采用“拉曼光谱检测奶粉中双氰胺”的方法；然而用拉曼光谱检测只能定量分析，该方法存在灵敏度低、结构确证点不足的问题，不能满足欧盟规定的4个确证点的要求，无法提供待测物的结构特征信息。

《色谱A》（J. Chromatogr. A, 2009, 1216: 5614-5618）杂志2009年第1216期5614-5618页报道了采用"超高效液相色谱检测肥料、土壤和植物样品中双氰胺的方法”；这种用超高效液相色谱检测方法也存在确证点不足，无法提供待测物结构特征信息的缺陷，另外，该报道针对的是检测肥料、土壤、和植物样品中的双氰胺含量，与检测奶制品中双氰胺成分的方法针对的对象不同。

《色谱A》（J. Chromatogr. A 2012, 1220: 101-107）杂志2012年第1220期101-107页和《色谱A》（J. Chromatogr. A 2013, 1288: 10-20）杂志2013年第1288期10-20页报道了涡旋提取法、超声萃取法提取双氰胺制备试样，并采用“液相色谱-串联质谱法，测定鲜牛奶和含有蛋白质食品中的双氰胺的方法”；然而涡旋提取法和超声萃取法的提取效率不高，存在无法把奶制品中残留的双氰胺提取完全的问题，这样就造成最后的检测分析结果不准确的问题。此外，经上述涡旋提取法和超声萃取法提取的试样没有经过有效的净化手段，就直接进入到液相色谱-串联质谱仪中进行检测分析，由于试样溶液基体复杂，没有经过有效的净化的试样溶液会对液相色谱-串联质谱仪造成污染，降低仪器的灵敏度和使用寿命。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种奶制品中双氰胺成分的提取及检测方法，该方法具有提取效率高、可准确定性定量测定、灵敏度高、结果准确的优点。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种乳制品中双氰胺成分的提取及检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（一）待测样品的制备：称取乳制品，配制同位素内标溶液，在乳制品中加入提取溶剂和同位素内标溶液，均匀搅拌后安装于微波萃取仪中，经微波萃取后，加提取溶剂定容得到待检液；

（二）待测样品的净化：将步骤（一）中的待检液经离心得到净化液，将固定相萃取柱进行预处理，取净化液上萃取柱，经水淋洗除去固体杂质，再用洗脱溶剂洗脱萃取柱上的双氰胺得到洗脱液，将洗脱液浓缩后，用乙腈溶剂稀释并经过滤后得到待测样品溶液；

（三）待测样品的检测：配制双氰胺溶液阶梯浓度的标准工作溶液，将步骤（二）中的待测样品溶液和标准工作溶液在液相色谱-串联质谱仪上分别进样，获得以待测样品溶液中双氰胺的浓度和同位数内标溶液的浓度的比值为横坐标，再以待测样品溶液中双氰胺的峰面积和同位数内标溶液的峰面积的比值为纵坐标的工作曲线，还有获得可以确定母离子的双氰胺和同位素的一级质谱图，确定母离子后，采用子离子扫描获得二级质谱图，然后从二级质谱图中选取定量离子和定性离子，然后用工作曲线对定量离子进行定量计算获得待测样品溶液中双氰胺浓度。

作为本发明的进一步设置，所述步骤（一）中的提取溶剂为甲醇/水、乙醇/水、甲醇、甲酸水溶液中的其中一种。

作为本发明的进一步设置，所述甲酸水溶液浓度为2%～5%。

作为本发明的进一步设置，所述步骤（一）中的微波萃取温度为60～80℃。

作为本发明的进一步设置，所述步骤（一）中的同位素内标溶液为¹⁵N₄-标记双氰胺内标溶液。

作为本发明的进一步设置，所述步骤（二）中的萃取固定相为Sep-Pak AC-2 SPE柱，并通过乙腈、水对SPE柱进行活化处理。

作为本发明的进一步设置，所述步骤（二）中的洗脱溶剂为乙腈/甲醇溶液。

作为本发明的进一步设置，所述乙腈/甲醇溶液的体积比为3:2。

采用上述方案，首先，本发明通过微波萃取技术，以2%～5%的甲酸水溶液为提取溶剂，在乳制品试样中加适量同位素内标溶液和提取溶剂浸泡，经涡旋振荡后，再在微波萃取仪中按一定温度、时间和功率进行萃取制得待检液。由于奶制品基体复杂，残留成分双氰胺属于有机碱性物质，与蛋白、脂肪等极性分子间可能形成键合作用，并存在氢键、范德华力等作用力而增加溶出难度；同时双氰胺在冷水中溶解度较小而在热水中溶解度大，尤其在一定温度时会开始分解，本发明中选择微波萃取温度在60～80℃。如果采用不加温的传统的超声萃取方法，有利于双氰胺的稳定性，仅仅的超声作用施加不足以破坏双氰胺与蛋白、脂肪等极性分子间形成的键合作用，造成双氰胺解离溶出不彻底，影响提取效率，造成最终检测分析结果的准确性和重现性不好。本发明采用微波萃取，由于微波能是通过内部均匀加热加速分子运动破坏键合作用。因此在功率、温度、时间、压力可控的情况下，微波萃取可以使固体或半固体试样中的某些有机物成分与基体物质有效地分离，从而提高萃取效率，而且还能很好地重现萃取回收率。而在微波萃取中采用2%～5%甲酸水溶液为提取溶剂，有利于双氰胺质子化形成甲酸盐而提高了其溶解性和热稳定性，使其可以在较高的温度下有较大的溶解度而不会分解。与传统的超声萃取、涡旋提取相比，本发明的提取方法提取效果好，回收率可以达到83.6～95.7%；远高于超声萃取的回收率79.3-84.5%和涡旋提取的回收率75.2-81.3%。而本发明的提取方法还具有快速、节能、节省溶剂、污染小，而且有利于萃取热不稳定物质的优点。

其次，本发明还对由微波萃取得到的待检液进行净化处理，该净化处理包括纯化和富集的过程。第一步纯化：先将待检液经离心初步净化，然后将离心后的净化液通过固相萃取分离的方法依次经过水淋洗、乙腈/甲醇混合液洗脱；第二步富集：将第一步中纯化的待检液浓缩蒸干，然后加入乙腈溶液溶解、经0.45μm微孔滤膜过滤，得到净化的待检液。该净化后的待检液则不会对检测仪器造成污染。本发明中固相萃取的SPE柱为Sep-Pak AC-2 SPE柱，Waters Sep-Pak AC-2为反相柱、硅胶键合型C18固定相的固相萃取柱，由于双氰胺和其他杂质的极性大小存在差异，在固相萃取柱上吸附产生保留差异，然后通过优选的乙腈/甲醇混合洗脱液选择性地洗脱双氰胺，达到净化富集双氰胺的目的。故对于双氰胺而言，Sep-Pak AC-2 SPE柱的净化处理效果好。

再次，本发明对于奶制品中双氰胺成分的定性定量检测分析是通过液相色谱-串联质谱仪分析。先配置一组阶梯形的标准工作溶液，然后将标准工作液和待检液在液相色谱-串联质谱仪上分别进样。待检液中出现的色谱峰保留时间与标准工作溶液一致，允许偏差小于±2.5 %，该色谱峰所对应的质谱定性离子的相对丰度与浓度相当的标准工作溶液的相对丰度一致，而且相对丰度偏差不超过规定，则可确定该待检液中含有双氰胺。根据标准工作溶液得出的数据以双氰胺的浓度和¹⁵N₄-标记双氰胺的浓度的比值为横坐标，分别以双氰胺的峰面积和¹⁵N₄-标记双氰胺的峰面积的比值为纵坐标得到工作曲线，用工作曲线对待检液得出的数据进行定量计算。另外，在质谱定量分析中，有两种方法分别是内标法和外标法。内标法是将一定量的同位素标记物质作内标物，加入到准确称量的试样中，根据被测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比，来计算被测组分的含量。选择内标物有4个要求：1.内标物应是该试样中不存在的纯物质；2.它必须完全溶于试样中，并与试样中各组分的色谱峰能完全分离；3.加入内标物的量应接近于被测组分；4.色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近，或在几个被测组分色谱峰中间。外标法是用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法。由于内标法是通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差，其测定结果较为准确。而外标法虽然简便，但进样量要求十分准确，要严格控制在与标准物相同的操作条件下进行，否则造成分析误差，得不到准确的测量结果。由于液相色谱-串联质谱法基体效应的影响，采用外标法进行定量，结果不准确。采用同位素¹⁵N₄-标记双氰胺为内标物进行定量，克服了外标法定量不准确的问题，本发明中内标法测定的回收率达到83.6～95.7%，远高于外标法测定的回收率64.2～72.4%。

附图说明

附图1为本发明具体实施例中的双氰胺(A)和¹⁵N₄-标记双氰胺(B))结构图；

附图2为本发明具体实施例中双氰胺(A)、¹⁵N₄-标记双氰胺(B)二级质谱图；

附图3为本发明具体实施例中内标工作曲线；

附图4为本发明具体实施例中外标标准曲线；

附图5为本发明具体实施例中双氰胺和¹⁵N₄-标记双氰胺(10 μg/L)标准工作溶液的MRM色谱图。

具体实施方式

本发明的具体实施例如下所述：

一、仪器与试剂的准备：

（一）Agilent1200 高效液相色谱仪(美国Agilent公司)、API 4000电喷雾串联质谱(美国AB应用生物系统公司)；Milli-Q超纯水器((美国Millipore公司)；超声波清洗器(Elma P300 H，德国Elma 公司)，Waters Sep-Pak AC-2固相萃取柱，甲醇、乙腈均为色谱纯(德国MERCK公司)；甲酸、乙酸、乙酸铵(美国Alfa Aesar公司)；其它试剂均为分析纯。实验用奶粉样品购自附近超市。双氰胺标准品购自中国食品药品检定研究院，¹⁵N₄-标记双氰胺标准品购自Toronto research chemicals Inc (Canada)，纯度≥99 %，(其结构分别如图1所示)。用乙腈配制成质量浓度为200 mg/L的双氰胺标准储备液；使用时，用乙腈稀释上述双氰胺标准储备液，配制成1.06, 2.12，4.24, 8.48，42.4 μg/L的双氰胺标准工作溶液，其中¹⁵N₄-标记双氰胺浓度为40 μg/L。

（二）色谱条件：MERCK ZIC HILIC column (2.1×150 mm，3.5 μm)；流动相：A为20 mmol乙酸铵，B为乙腈。体积比为：10:90A/B (v/v)，等度洗脱20 min；流速：250 μL/min；进样量为5 μL，柱温30 °C 。

质谱条件：电喷雾离子源：正离子扫描；离子源温度550 °C ；电喷雾电压5000 V；雾化气(GS1) 压力50 psi；辅助气流速(GS2) 40 psi；气帘气压力10 psi；碰撞气CAD20 psi。

二、样品处理与净化：

实验步骤：分别准确称取1.0 g奶制品于微波萃取罐中，加入400 μL 的1 mg/L ¹⁵N₄-标记双氰胺内标溶液或不加内标溶液，加入20 mL提取溶剂，漩涡振荡1 min，安装于微波萃取仪中，在5 min中内升温至60～80 oC，保持25 min，微波萃取功率为600 W。萃取完毕后，转移至25 mL容量瓶并用提取溶剂定容得到待检液。

然后，依次用10 mL乙腈、10 mL水对Waters Sep-Pak AC-2固相萃取柱进行活化。

取5 mL待检液上萃取柱，先用10 mL水淋洗，再用30 mL洗脱溶剂洗脱得到洗脱液，将洗脱液用旋转蒸发仪浓缩近干后，准确加入2 mL乙腈溶解残渣，过0.45 μm微孔滤膜后得到待测样品溶液，供液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）测定。具体实验组见表1：表1不同实验条件对照组

三、待测样品溶液的检测

将标准工作溶液和待测样品溶液分别进液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）测定。使标准工作溶液和待测样品溶液通过流动注射泵连续进样，调谐质谱参数。使用ESI源和大气压化学电离APCI源在正离子模式下进行全扫描以选择适当的定性、定量离子和电离方式进行检测。

由于现有市场上可以买到的奶粉对双氰胺的含量监控比较严格，故上述九组实验都未检测到双氰胺的成分(即双氰胺的含量都小于本方法的检测限10 μg kg^-1)。现于上述实验的基础上，再在每组实验中人为添加（100 μg kg^-1）的双氰胺，然后按照步骤一、二、三依次进行实验，经液相色谱-串联质谱仪测定后获得质谱图如图2所示。

在ESI源的正离子模式下，双氰胺呈现出最佳响应，准分子离子[M+H]+1是响应强度最高的离子。根据欧盟2002/657/EC指令规定，对于质谱确证方法必须达到4个确证点的要求，低分辨液相色谱-串联质谱仪检测应在确定母离子的基础上选择两个以上的子离子。在确定母离子后，采用子离子扫描方式进行二级质谱分析。然后在二级质谱分析图（图2）上分别选取丰度较强的主要碎片离子作为定量离子见表2所示，然后将高效液相色谱和三重四级杆质谱仪联机，对离子源温度、毛细管电压、去簇电压、碰撞电压、去溶剂气温度及流量、锥孔气流量进行优化，使样品溶液中的离子化效率达到最佳。

表2双氰胺和 ¹⁵ N ₄ -标记双氰胺的质谱分析参数

*为定量离子对。

由图2以及图5可知，在相同实验条件下，样品中双氰胺的保留时间，与双氰胺标准溶液的保留时间偏差在±2.5%之内；双氰胺的质谱定性离子至少包括一个母离子和两个子离子，且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的双氰胺标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，因此可判定待测样品溶液中存在对应的双氰胺成分。

表3 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差

然后，以待测样品溶液与内标物峰面积之比(y)为纵坐标，以分析物与内标物质量浓度之比(X)为横坐标进行回归分析，获得内标工作曲线（见图3），然后用内标工作曲线对待测样品溶液进行定量计算。其中还有一组是不加内标物的实验九，根据外标标准曲线（见图4）对待测样品溶液进行定量计算得到双氰胺含量如表4所示：

表4 实验结果数据

由该结果得知，实验一与实验二（变量是固态奶和液态奶）对比可知，该方法不仅可以检测固定奶制品中双氰胺含量，同时还可以检测液态奶的双氰胺含量；实验一与实验三和实验四（变量是微波萃取温度）对比可知，该方法在温度为80℃的时候，萃取效果比较好；实验一与实验五（变量是甲酸水溶液的浓度不同）对比可知，甲酸水溶液浓度在5%时提取效果为佳；实验一与实验六、实验七、实验八（变量是提取溶剂不同）对比可知，提取溶剂甲酸比甲醇/水、乙醇/水、纯甲醇的提取效果好；实验一与实验九（变量是内标测定还是外标测定）对比可知，内标法的测定结果较准确。

四、回收率实验

实验步骤：采用上述经步骤一、二、三中经测定不含有双氰胺的奶粉样品，分别称取四组奶粉试样，每组分别包括九个奶粉试样，在奶粉试样中按低、中、高的3个添加水平添加不同浓度的双氰胺标准溶液，按上述步骤一、步骤二、步骤三的方法进行对照实验检测，用液相色谱-串联四级杆质谱进样测定，计算低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率。内标物选择¹⁵N₄-标记双氰胺，提取溶剂选择5%甲酸水溶液，第一组组采用微波萃取，温度80℃，并通过内标法测定；第二组组采用微波萃取，温度80℃，并通过外标法测定；第三组采取超声萃取，超声温度60℃，并通过内标法测定；第四组采取涡旋提取，并通过内标法测定；然后对四组实验均采用固相萃取柱萃取，其中洗脱溶剂选择乙腈/甲醇体积比3:2，其余测定步骤均相同。结果见表5、表6、表7和表8。

由表5和表6结果可见内标法的回收率(83.6～95.7%)远高于外标法的回收率(64.2-72.4%)。故内标法测定的方法更为准确。由表5与表7、表8对比可知，超声萃取内标法测定的回收率为：79.3～84.5，涡旋提取内标法测定的回收率为：75.2～81.3%，故微波萃取方法的提取效率更高。结果表明，双氰胺在1.0-42 μg/L范围内具有良好的线性，R²≥0.9998(见图3)。以3倍信噪比(S/N)为方法检出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N)为方法定量限(LOQ)，经样品添加确定双氰胺的检出限为3.0 ng/g，定量限(LOQ)为10 ng/g。

表5奶制品中双氰胺经微波萃取的添加回收率（内标法）实验结果(n=6)

表6奶制品中双氰胺经微波萃取的添加回收率（外标法）实验结果(n=6)

表7奶制品中双氰胺经超声萃取的添加回收率（内标法）实验结果(n=6)

表8奶制品中双氰胺经涡旋提取的添加回收率（内标法）实验结果(n=6)

Claims

1.一种乳制品中双氰胺成分的提取及检测方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的乳制品中双氰胺成分的提取及检测方法，其特征在于：所述步骤（一）中的提取溶剂为甲醇/水、乙醇/水、甲醇、甲酸水溶液中的其中一种。

3.根据权利要求2所述的乳制品中双氰胺成分的提取及检测方法，其特征在于：所述甲酸水溶液浓度为2%～5%。

4.根据权利要求1所述的乳制品中双氰胺成分的提取及检测方法，其特征在于：所述步骤（一）中的微波萃取温度为60～80℃。

5.根据权利要求1所述的乳制品中双氰胺成分的提取及检测方法，其特征在于：所述步骤（一）中的同位素内标溶液为¹⁵N₄-标记双氰胺内标溶液。

6.根据权利要求1所述的乳制品中双氰胺成分的提取及检测方法，其特征在于：所述步骤（二）中的萃取固定相为Sep-Pak AC-2 SPE柱，并通过乙腈、水对SPE柱进行活化处理。

7.根据权利要求1所述的乳制品中双氰胺成分的提取及检测方法，其特征在于：所述步骤（二）中的洗脱溶剂为乙腈/甲醇溶液。

8.根据权利要求7所述的乳制品中双氰胺成分的提取及检测方法，其特征在于：所述乙腈/甲醇溶液的体积比为3:2。