CN103048401A - 化妆品中15种禁用硝基咪唑类抗生素的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种化妆品中15种禁用硝基咪唑类抗生素的测定方法。本发明的测定方法是将化妆品样品经过超声提取、高速离心及固相萃取后，用高效液相色谱-串联四极杆质谱进行检测分析。与平行操作的甲硝唑等15种禁用硝基咪唑的标准品进行比较，以保留时间和优化的监控离子对进行定性，以其中信噪比较高、峰形好及背景干扰小的离子为定量离子进行定量，然后以标准曲线进行外标法定量。其检测快速，结果准确。
Description
技术领域
本发明涉及一种化妆品中甲硝唑、4-硝基咪唑、2-甲硝咪唑、羟基甲硝唑、羟基二甲硝咪唑、二甲硝咪唑、洛硝哒唑、特尼哒唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、塞克硝唑、替硝唑、羟基异丙硝唑、奥硝唑、异丙硝唑等15种禁用硝基咪唑类抗生素的测定方法。
背景技术
随着国民生活水平的提高和人们对美的追求，化妆品特别是一些日用的护肤、美白、清洁用品等已经成为人们日常生活中不可或缺的必需品。因此，化妆品的安全性也越来越成为相关部门和广大消费者关注的热点问题。
硝基咪唑类抗生素广泛用于抗厌氧菌感染，对毛囊虫病、痤疮、酒渣鼻也有一定的疗效。因此，为增强使化妆品的祛痘和美白效果，部分化妆品生产企业在生产过程中通常加入某种或某几种硝基咪唑类抗生素药物。硝基咪唑是一类具有硝基咪唑环结构的药物，其性状为白色或淡黄色结晶，弱碱性，能和酸结合成盐，易溶于甲醇，微溶于水。它属于抗微生物药物，具有抗菌和消炎的作用。我国已明确规定化妆品中严禁添加甲硝唑等硝基咪唑类抗生素药物。在祛痘化妆品中违法添加硝基咪唑，虽然短期内可能起到除螨、祛痘的作用，但长期使用会刺激皮肤，引起接触性皮炎，严重时可导致对硝基咪唑类化合物的耐药性，造成健康隐患。因此对化妆品中是否添加硝基咪唑类等违禁药物进行监督、检测，保证化妆品卫生质量十分必要。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种化妆品中15种禁用硝基咪唑类抗生素的测定方法，其检测快速，结果准确。
一种化妆品中15种禁用硝基咪唑类抗生素的测定方法，是化妆品样品经前处理后，用液相色谱-串联四极杆质谱检测，经与平行操作的15种禁用硝基咪唑类抗生素对照品比较，以保留时间和监控离子对定性，峰面积进行定量，以标准曲线法计算含量；其中所述液相色谱的条件是：
色谱柱：规格为2.1mm×150mm×3.5μm的Waters XSELECT CSH C18色谱柱；
流动相：乙腈和0.1%甲酸-水；
柱温：30℃；
进样量：5μL；
质谱的条件是：
毛细管电压：3.0kV；
萃取电压：3V；
射频透镜电压：0.1V；
离子源温度：150℃；
脱溶剂气温度：400℃；
脱溶剂气流量：800L/hr；
锥孔气流量：50L/hr；
碰撞室压力：3.2×10-3mbar；
离子能量1：0.5V；
碰撞室入口电压：1V；
碰撞室出口电压：1V；
离子能量2：0.5V；
碰撞气体：氩气；
数据采集模式：多反应监测；
0～2.5min：不进入质谱仪分析，2.5～15min：进入质谱仪分析。
本发明的测定方法，其中所述样品为水剂类样品时，前处理的过程为：称取0.5g水剂类样品，置于10mL比色管中，加入25%甲醇/水溶液至刻度，涡旋振荡使得水剂中的基质与提取溶剂充分混匀，超声提取30min，试样全部转移至50mL离心管中，以10000r/min离心10min，取3mL上清液过Oasis HLB固相萃取柱，先用4mL20%甲醇/水淋洗，然后用8mL 90%甲醇/水进行洗脱，收集洗脱液进行旋蒸至近干，剩余部分转移至氮吹管进行氮吹干涸，准确加入3mL 10%甲醇/水溶解残渣，过0.2μm微孔滤膜得滤液待用。
本发明的测定方法，其中所述样品为香波类样品时，前处理的过程为：称取0.5g香波类样品，置于10mL比色管中，加入25%甲醇/水溶液至刻度，涡旋振荡使得水剂中的基质与提取溶剂充分混匀，超声提取30min，试样全部转移至50mL离心管中，以10000r/min离心10min，取3mL上清液过Oasis HLB固相萃取柱，先用4mL20%甲醇/水淋洗，然后用8mL 90%甲醇/水进行洗脱，收集洗脱液进行旋蒸至近干，剩余部分转移至氮吹管进行氮吹干 涸，准确加入3mL 10%甲醇/水溶解残渣，过0.2μm微孔滤膜得滤液待用。
本发明的测定方法，其中所述样品为膏霜类样品时，前处理的过程为：称取0.5g膏霜类样品，置于10mL比色管中，加入25%甲醇/水溶液至刻度，涡旋振荡使得水剂中的基质与提取溶剂充分混匀，超声提取30min，试样全部转移至50mL离心管中，以10000r/min离心10min，取3mL上清液过Oasis HLB固相萃取柱，先用4mL20%甲醇/水淋洗，然后用8mL 90%甲醇/水进行洗脱，收集洗脱液进行旋蒸至近干，剩余部分转移至氮吹管进行氮吹干涸，准确加入3mL 10%甲醇/水溶解残渣，过0.2μm微孔滤膜得滤液待用。
本发明的测定方法，其中所述样品为散粉类样品时，前处理的过程为：称取0.5g散粉类样品，置于10mL比色管中，加入50%甲醇/水溶液至刻度，涡旋振荡使得水剂中的基质与提取溶剂充分混匀，超声提取30min，试样全部转移至50mL离心管中，以10000r/min离心10min，取3mL上清液过Oasis HLB固相萃取柱，先用4mL20%甲醇/水淋洗，然后用8mL 90%甲醇/水进行洗脱，收集洗脱液进行旋蒸至近干，剩余部分转移至氮吹管进行氮吹干涸，准确加入3mL 10%甲醇/水溶解残渣，过0.2μm微孔滤膜得滤液待用。
本发明的测定方法是将化妆品样品经过超声提取、高速离心及固相萃取后，用高效液相色谱-串联四极杆质谱进行检测分析。与平行操作的甲硝唑等15种禁用硝基咪唑的标准品进行比较，以保留时间和优化的监控离子对进行定性，以其中信噪比较高、峰形好及背景干扰小的离子为定量离子进行定量，然后以标准曲线进行外标法定量。本方法对氯甲硝唑、苯硝咪唑的检出限为2ng/mL，定量下限为5ng/mL；二甲硝唑、羟基异丙硝唑的检出限为1ng/mL，定量下限为2ng/mL；2-甲硝咪唑、羟基二甲硝咪唑、洛硝哒唑、塞克硝唑、替硝唑、奥硝唑的检出限为0.5ng/mL，定量下限为1ng/mL；4-硝基咪唑、羟基甲硝唑、甲硝唑、特尼哒唑的检出限为0.25ng/mL，定量下限为0.5ng/mL；异丙硝唑的检出限为0.1ng/mL，定量下限为0.2ng/mL。若取0.5g化妆品进行测定，本方法对氯甲硝唑、苯硝咪唑的检出浓度为0.4μg/g，最低定量浓度为0.1μg/g；洛硝哒唑、羟基异丙硝唑的检出浓度为0.05μg/g，最低定量浓度为0.1μg/g；4-硝基咪唑、2-甲硝咪唑、羟基甲硝唑、羟基二甲硝咪唑、甲硝唑、二甲硝唑特尼哒唑、塞克硝唑、替硝唑、奥硝唑的检出浓度为0.03μg/g，最低定量浓度为0.04μg/g；异丙硝唑的检出浓度为0.005μg/g，最低定量浓度为0.01μg/g。
附图说明
图1是15种禁用硝基咪唑化合物的MRM色谱图；其中1.4-硝基咪唑(4-Nitroimidazole)；2.2-甲硝咪唑(Menidazole)；3.羟基甲硝唑(1-(2-Hydroxyethyl)-2-hydroxymethyl-5-nitroimidazole)；4.羟基二甲硝唑 (2-Hydroxymethyl-1-methyl-5-nitroimidazole)；5.甲硝唑(Metronidazole)；6.二甲硝咪唑(Dimetridazole)；7.洛硝哒唑(Ronidazole)；8.特呢哒唑(Ternidazole)；9.塞克硝唑(Secnidazole)；10.苯硝咪唑(5-Nitrobenzimidazole)；11.氯甲硝唑(1-Methyl-5-chloro-4-nitroimidazole)；12.替硝唑(Tinidazole)；13.羟基异丙硝唑(Ipronidazole-OH)；14.奥硝唑(Ornidazole)；15.异丙硝唑(Ipronidazole)
图2是15种禁用硝基咪唑类抗生素在Oasis HLB(6cc，500mg)柱上的洗脱曲线；
图3是不同体积的90%甲醇-水对异丙硝唑的洗脱效果；
图4是水剂类空白样品的多反应监测色谱图；
图5是水剂类空白样品添加标准品浓度为0.1μg/g的多反应监测色谱图；
图6是香波类空白样品的MRM色谱图；
图7是香波类空白样品添加标准品浓度为0.1μg/g的多反应监测色谱图；
图8是散粉类空白样的MRM色谱图；
图9是散粉类空白样品添加标准品浓度为0.1μg/g的多反应监测色谱图；
图10是膏霜类空白样品的MRM色谱图；
图11是散粉类空白样品添加标准品浓度为0.1μg/g的多反应监测色谱图。
具体实施方式
为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明：
一、试剂和材料
1甲醇，色谱纯。
2乙腈，色谱纯。
3乙醇，分析纯。
4甲酸，色谱纯。
54-硝基咪唑，纯度97%。
62-甲硝咪唑，纯度99%。
7羟基甲硝唑，纯度99.3%。
8羟基二甲硝咪唑，纯度98.5%。
9甲硝唑，纯度99.5%。
10二甲硝咪唑，纯度98.5%。
11洛硝哒唑，纯度99.5%。
12特尼哒唑，纯度99.8%。
13氯甲硝咪唑，纯度98%。
14苯硝咪唑，纯度98.5%。
15塞克硝唑，纯度99.6%。
16替硝唑，纯度99.7%。
17羟基异丙硝唑，纯度99.8%。
18奥硝唑，纯度98.5%。
19异丙硝唑，纯度99.8%。
20空白化妆品样品：被检测不含目标化合物成分的化妆品。
21固相萃取柱：Oasis HLB，6cc，500mg。
22 15种硝基咪唑类抗生素的标准储备溶液：准确称取10mg(精确至0.0001g)硝基咪唑抗生素标准品，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释种刻度，混匀，得到每种硝基咪唑浓度为1000μg/mL的标准储备液。
23 15种硝基咪唑类抗生素的混合标准储备液：分别精密量取每种硝基咪唑抗生素的标准储备液各5mL置于100mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，混匀，得到50μg/mL的硝基咪唑混合标准储备液。
24 15种硝基咪唑类抗生素的标准工作液：精密量取一定体积的混合标准储备液置于10mL容量瓶中，用10%甲醇/水稀释至刻度，使得各硝基咪唑抗生素的浓度分别为0.1μg/L、0.2μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L、1000μg/L。
二、仪器和设备
1液相色谱-串联四极杆质谱仪。
2分析天平：感量为0.001g。
3分析天平：感量为0.0001g。
4超纯水器。
5涡旋振荡器。
6精密移液器。
7超声波清洗机。
8通风柜。
9旋转蒸发仪。
10氮吹仪：配有加热装置。
11高速冷冻离心机。
三、分析步骤
1样品预处理
水剂类：称取0.5g(精确至0.001g)水剂类样品，置于10mL比色管中，加入25%甲醇/水溶液至刻度，涡旋振荡使得水剂中的基质与提取溶剂充分混匀，超声提取30min，试样全部转移至50mL离心管中，以10000r/min离心10min，取3mL上清液过Oasis HLB(6cc，500mg)固相萃取柱(预先用5mL甲醇活化，5mL水平衡)，先用4mL 20%甲醇/水淋洗，然后用8mL 90%甲醇/水进行洗脱，收集洗脱液进行旋蒸至近干，剩余部分转移至氮吹管进行氮吹干涸，准确加入3mL 10%甲醇/水溶解残渣，过0.2μm微孔滤膜，滤液按选定的仪器的工作条件进行测定。
香波类：称取0.5g(精确至0.001g)香波类样品，置于10mL比色管中，加入25%甲醇/水溶液至刻度，涡旋振荡使得水剂中的基质与提取溶剂充分混匀，超声提取30min，试样全部转移至50mL离心管中，以10000r/min离心10min，取3mL上清液过Oasis HLB(6cc，500mg)固相萃取柱(预先用5mL甲醇活化，5mL水平衡)，先用4mL 20%甲醇/水淋洗，然后用8mL 90%甲醇/水进行洗脱，收集洗脱液进行旋蒸至近干，剩余部分转移至氮吹管进行氮吹干涸，准确加入3mL 10%甲醇/水溶解残渣，过0.2μm微孔滤膜，滤液按选定的仪器的工作条件进行测定。
膏霜类：称取0.5g(精确至0.001g)膏霜类样品，置于10mL比色管中，加入25%甲醇/水溶液至刻度，涡旋振荡使得水剂中的基质与提取溶剂充分混匀，超声提取30min，试样全部转移至50mL离心管中，以10000r/min离心10min，取3mL上清液过Oasis HLB(6cc，500mg)固相萃取柱(预先用5mL甲醇活化，5mL水平衡)，先用4mL 20%甲醇/水淋洗，然后用8mL 90%甲醇/水进行洗脱，收集洗脱液进行旋蒸至近干，剩余部分转移至氮吹管进行氮吹干涸，准确加入3mL 10%甲醇/水溶解残渣，过0.2μm微孔滤膜，滤液按选定的仪器的工作条件进行测定。
散粉类：称取0.5g(精确至0.001g)散粉类样品，置于10mL比色管中，加入50%甲醇/水溶液至刻度，涡旋振荡使得水剂中的基质与提取溶剂充分混匀，超声提取30min，试样全部转移至50mL离心管中，以10000r/min离心10min，取3mL上清液过Oasis HLB (6cc，500mg)固相萃取柱(预先用5mL甲醇活化，5mL水平衡)，先用4mL 20%甲醇/水淋洗，然后用8mL 90%甲醇/水进行洗脱，收集洗脱液进行旋蒸至近干，剩余部分转移至氮吹管进行氮吹干涸，准确加入3mL 10%甲醇/水溶解残渣，过0.2μm微孔滤膜，滤液按选定的仪器的工作条件进行测定。
2液相色谱/质谱参考条件
2.1色谱参考条件
色谱柱：Waters XSELECT CSH C18色谱柱(2.1mm×150mm×3.5μm，表面带电杂化颗粒三键键合碳十八键合相)或具有同等柱效的色谱柱；
流动相：乙腈(A)和0.1%甲酸-水(B)；
梯度洗脱程序见表1；
表1 梯度洗脱条件
| Time(min) | Flow(mL/min) | A(%) | B(%) |
| 0.00 | 0.25 | 5.0 | 95.0 |
| 2.00 | 0.25 | 5.0 | 95.0 |
| 17.00 | 0.25 | 35.0 | 65.0 |
| 19.00 | 0.25 | 95.0 | 5.0 |
| 20.00 | 0.25 | 95.0 | 5.0 |
| 20.10 | 0.25 | 5.0 | 95.0 |
| 22.00 | 0.25 | 5.0 | 95.0 |
注：对于梯度洗脱条件，操作者可根据实际样品的不同而选择最佳色谱分离条件，使得禁用硝基咪唑类成分与其他组分峰获得分离。
柱温：30℃；
进样量：5μL。
2.2质谱参考条件
毛细管电压(Capillary)：3.0kV；
萃取电压(Extractor)：3V；
射频透镜电压(RF Lens)：0.1V；
离子源温度(Source Temperature)：150℃；
脱溶剂气温度(Desolvation Temperature)：400℃；
脱溶剂气流量(Desolvation Gas Flow)：800L/hr；
锥孔气流量(Cone Gas Flow)：50L/hr；
碰撞室压力(Vacuum)：3.2×10-3mbar；
低质量端1分辨率(LM 1Resolution)：3.0；
高质量端1分辨率(HM 1Resolution)：15.0；
离子能量1(Ion Energy 1)：0.5V；
碰撞室入口电压(Entrance)：1V；
碰撞室出口电压(Exit)：1V；
低质量端2分辨率(LM 2Resolution)：3.0；
高质量端2分辨率(HM 2Resolution)：15.0；
离子能量2(Ion Energy 2)：0.5V；
碰撞气体(Collision Gas)：氩气；
数据采集模式(Data Acquisition)：MRM(多反应监测)。
0～2.5min：不进入质谱仪分析，2.5～15min：进入质谱仪分析。
15种硝基咪唑类抗生素的质谱参数见表2。15种硝基咪唑类抗生素的多反应监测色谱图见图1。
表2 15种禁用硝基咪唑类抗生素的质谱相关参数
*：定量离子对(Quantitative transition)
3定性判定
液相色谱-串联四极杆质谱对样品进行定性测定，在相同试验条件下，样品中被测禁用硝基咪唑类物质的质量色谱峰保留时间与标准溶液中对应物质的质量色谱峰保留时间应一致(变化范围在±2.5%之内)；样品色谱图中所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过表3规定范围，则可以判断样品中存在对应的禁用硝基咪唑类物质。
表3 定性判定时相对离子丰度的最大允许偏差
| 相对离子丰度(k) | k≥50% | 50%>k≥20% | 20%>k≥10% | k≤10% |
| 允许的最大偏差 | ±20% | ±25% | ±30% | ±50% |
4定量测定
在液相色谱-串联四极杆质谱分析条件下，用系列浓度基质标准工作溶液分别进样，以系列浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，建立基质标准曲线。取处理得到的待测溶液进样5μL，按“6”项公式计算，得出样品中禁用硝基咪唑的质量分数。
5平行试验
按照所建立的方法操作，对同一样品独立进行测定，获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算数平均值的10%。
6计算
w＝ρV/m
式中：
w——化妆品样品中硝基咪唑抗生素的质量分数，μg/g；
ρ——从标准工作曲线中得出的试样中硝基咪唑抗生素的浓度，μg/mL；
V——试样定容体积，mL；
m——试样取样质量，g。
7回收率和精密度
本方法在低、中、高3个添加水平范围内的平均提取回收率为80.00%~98.52%，相对标准偏差均小于5%，平均方法回收率为85.42%~108.33%，并且相对标准偏差均小于5%。
四、方法的选择与优化
1提取溶剂的选择
分别称取空白样品(水剂类、散粉类、香波类和膏霜类)各12份，每份0.50g(精确至0.001g)，置于10mL比色管中，向每份空白样品中各加入浓度为2.5μg/mL的15种硝基咪唑抗生素混合标准溶液400μL，涡旋振荡混匀。向每份样品中分别加入甲醇、乙醇、乙腈、甲醇与水的混合液(V:V＝1:1)、乙醇与水的混合液(V:V＝1:1)、乙腈与水的混合液(V:V＝1:1)，每两份为一组平行样品，涡旋振荡混匀，定容至10mL，分别超声提取30min，放置室温。将所有样品转移至具塞塑料离心管中，以10000r/min离心10min，上清液经0.2μm滤膜过滤，滤液作为试样，进行液相色谱-串联四极杆质谱分析。
实验结果表明，四种类型的化妆品空白样品均以甲醇与水的混合液(V:V＝1:1)提取效果最好，然后，再对甲醇与水的比例进行优化，分别考察了25%甲醇/水、50%甲醇/水、75%甲醇/水和100%甲醇对空白样品加标的提取效果。由于硝基咪唑类物质微溶于水，因此，实验中未设置纯水作为提取溶剂。结果表明，散粉类空白加标样品以50%甲醇/水提取效果最佳，水剂、香波、膏霜类空白加标样品以25%甲醇/水提取效果最佳。
2提取时间的选择
分别称取空白样品(水剂类、散粉类、香波类和膏霜类)各12份，每份0.50g(精确至0.001g)，置于10mL比色管中，向每份空白样品中各加入浓度为2.5μg/mL的15种硝基咪唑抗生素混合标准溶液400μL，涡旋振荡混匀。向每份水剂类、香波类和膏霜类样品中加入25%甲醇/水，散粉类样品中加入50%甲醇/水，每两份为一组平行样品，涡旋振荡混匀，定容至10mL，分别进行提取10min，20min，30min，40min，50min和60min，放置室温。将所有样品转移至具塞塑料离心管中，以10000r/min离心10min，上清液经0.2μm滤膜过滤，滤液作为试样，进行液相色谱-串联四极杆质谱分析。
实验结果表明，当超声提取30min时，目标化合物已基本提取完全。
3净化条件的优化
实验主要考察了Oasis HLB(6cc，200mg及6cc，500mg)、Agilent Bond Elut PLEXA及Sep-Pak C18几种固相萃取柱，实验结果表明，Oasis HLB(6cc，500mg)柱对所有目标化 合物均有所保留，因此，本实验选用该固相萃取柱作为净化柱。
采用Oasis HLB(6cc，500mg)固相萃取柱，考察了不同配比的甲醇-水溶液(0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%甲醇-水溶液，用量均为4mL)淋洗系统，分析比较不同淋洗系统的淋洗效果。洗脱曲线见下图2，图中显示，随着淋洗系统中甲醇的比例逐渐增大，目标化合物越多被洗脱下来。当20%甲醇-水作为淋洗液时，目标化合物仍保留在固相萃取柱上，不会被洗脱下来，而当30%甲醇-水作为淋洗液时，少量目标化合物会被洗脱下来。因此，选用20%甲醇-水作为淋洗液去除样品中的杂质，从而抑制样基质效应。4mL 90%甲醇-水溶液可将大部分的目标化合物完全洗脱下来，只有异丙硝唑仍未洗脱完全，增加洗脱液的用量，发现当用8mL 90%甲醇-水洗脱时，异丙硝唑即被洗脱完全，见图3。因此，选用4mL20%甲醇-水作为淋洗液，8mL90%甲醇-水作为洗脱液。
五、实验室内验证
1方法的特异性
分别取具代表性的空白样品基质及空白基质添加混合对照品的样品，按照确定的样品预处理方法处理后，进行检测。多反应监测色谱图见图4至图5-图11。
2线性及线性范围
2.1标准溶液的配制
2.1.1 15种硝基咪唑抗生素的标准储备溶液：准确称取10mg(精确至0.0001g)硝基咪唑抗生素标准品，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释种刻度，混匀，得到每种硝基咪唑抗生素浓度为1000μg/mL的标准储备液。
2.1.2 15种硝基咪唑抗生素的混合标准储备液：分别精密量取每种硝基咪唑抗生素的标准储备液各5mL置于100mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，混匀，得到50μg/mL的硝基咪唑抗生素混合标准储备液。
2.1.3 15种硝基咪唑抗生素的标准工作液：精密量取一定体积的混合标准储备液置于10mL容量瓶中，用10%甲醇/水稀释至刻度，使得各硝基咪唑抗生素的浓度分别为0.1μg/L、0.2μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L、1000μg/L。
2.2线性及线性范围
在选定的色谱质谱条件下，配制不同浓度的混合标注工作溶液，依次进样，以测得目标 物的峰面积为纵坐标(y)，以所测目标物的浓度为横坐标(x)，建立标准曲线，并进行线性分析得到线性方程和回归系数(r)，实验结果显示，15种硝基咪唑在0.5~500μg/L之间呈良好的线性关系，线性方程及相关系数见表4。
表4 15种硝基咪唑抗生素的线性回归方程、相关系数及线性范围
3检出限、定量下限、检出浓度及最低定量浓度
逐级稀释并检测15种硝基咪唑抗生素混合标准溶液，以所测目标物峰信噪比为10:1时目标物的浓度确定为本方法对该化合物的定量下限，以所测目标物峰信噪比为3:1时目标物的浓度确定为本方法对对该化合物的检出限，结果见表5。
向不含15种禁用硝基咪唑抗生素的空白样品定量添加该15种化合物，按照确定的前处理方法处理后，以所测目标物峰信噪比为10:1时目标物的浓度确定为本方法对该化合物的最低定量浓度，以所测目标物峰信噪比为3:1时目标物的浓度确定为本方法对对该化合物的最低检出浓度，结果见表5。
表5 15种禁用硝基咪唑抗生素的检出限、定量下限、检出浓度及最低定量浓度
4精密度及稳定性
4.1日内精密度及稳定性
制备高低两种不同浓度的日内稳定性样品，分别在0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h按照选定的色谱质谱条件进行测定，所测得的峰面积代入随行的标准曲线中，计算相对标准偏差RSD，实验结果见表6，表明样品处理后室温放置24h是稳定的。
4.2日间精密度及稳定性
制备高、低两种不同浓度的日间稳定性样品，连续7天分别按照选定的色谱质谱条件进行测定，所测得的峰面积代入随行的标准曲线中，计算RSD，实验结果见表6，表明样品处理后4℃放置7天是稳定的。
表6 日内和日间精密度及稳定性(n＝7)
由上表可见，本方法的日内及日间精密度均符合《化妆品及其原料中禁限用物质检测方法验证技术规范》的要求，即目标物含量大于1μg/g时精密度的相对标准偏差应不超过5%。5回收率及精密度
称取经测定不含15种禁用硝基咪唑抗生素的空白化妆品0.5g，平行6份，分别添加低、中、高三个浓度标准混合溶液，涡旋振荡混匀，按照本实验确定的实验方法进行测定，将所测目标化合物的峰面积代入随行的溶液标准曲线和方法标准曲线，计算出相应目标化合物的回收率及精密度值，结果见表7~10。
表7 水剂类空白化妆品添加15种禁用硝基咪唑抗生素的回收率及精密度
表8 香波类空白化妆品添加15种禁用硝基咪唑抗生素的回收率及精密度
表9 膏霜类空白化妆品添加15种禁用硝基咪唑抗生素的回收率及精密度
表10 散粉类空白化妆品添加15种禁用硝基咪唑抗生素的回收率及精密度
注：平均提取回收率，即所测目标化合物的浓度用溶液标准曲线计算所得；方法回收率，即所测目标化合物的浓度用基质标准曲线计算所得。
由上表可见，对于15种禁用硝基咪唑类抗生素，本方法在低、中、高3个添加水平范围内的平均提取回收率为80.00%~98.52%，相对标准偏差均小于5%，平均方法回收率为85.42%~108.33%，并且相对标准偏差均小于5%。
本发明中涉及的%如无特殊说明，均指的是质量百分比。以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (5)
1.化妆品中15种禁用硝基咪唑类抗生素的测定方法，其特征在于：化妆品样品经前处理后，用液相色谱-串联四极杆质谱检测，经与平行操作的15种禁用硝基咪唑类抗生素对照品比较，以保留时间和监控离子对定性，峰面积进行定量，以标准曲线法计算含量；其中所述液相色谱的条件是：
色谱柱：规格为2.1mm×150mm×3.5μm的Waters XSELECT CSH C18色谱柱；
流动相：乙腈和0.1%甲酸-水；
柱温：30℃；
进样量：5μL；
质谱的条件是：
毛细管电压：3.0kV；
萃取电压：3V；
射频透镜电压：0.1V；
离子源温度：150℃；
脱溶剂气温度：400℃；
脱溶剂气流量：800L/hr；
锥孔气流量：50L/hr；
碰撞室压力：3.2×10-3mbar；
离子能量1：0.5V；
碰撞室入口电压：1V；
碰撞室出口电压：1V；
离子能量2：0.5V；
碰撞气体：氩气；
数据采集模式：多反应监测；
0～2.5min：不进入质谱仪分析，2.5～15min：进入质谱仪分析。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述样品为水剂类样品时，前处理的过程为：称取0.5g水剂类样品，置于10mL比色管中，加入25%甲醇/水溶液至刻度，涡旋振荡使得水剂中的基质与提取溶剂充分混匀，超声提取30min，试样全部转移至50mL离心管中，以10000r/min离心10min，取3mL上清液过Oasis HLB固相萃取柱，先用4mL 20%甲醇/水淋洗，然后用8mL 90%甲醇/水进行洗脱，收集洗脱液进行旋蒸至近干，剩余部分转移至氮吹管进行氮吹干涸，准确加入3mL 10%甲醇/水溶解残渣，过0.2μm微孔滤膜得滤液待用。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述样品为香波类样品时，前处理的过程为：称取0.5g香波类样品，置于10mL比色管中，加入25%甲醇/水溶液至刻度，涡旋振荡使得水剂中的基质与提取溶剂充分混匀，超声提取30min，试样全部转移至50mL离心管中，以10000r/min离心10min，取3mL上清液过Oasis HLB固相萃取柱，先用4mL 20%甲醇/水淋洗，然后用8mL 90%甲醇/水进行洗脱，收集洗脱液进行旋蒸至近干，剩余部分转移至氮吹管进行氮吹干涸，准确加入3mL 10%甲醇/水溶解残渣，过0.2μm微孔滤膜得滤液待用。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述样品为膏霜类样品时，前处理的过程为：称取0.5g膏霜类样品，置于10mL比色管中，加入25%甲醇/水溶液至刻度，涡旋振荡使得水剂中的基质与提取溶剂充分混匀，超声提取30min，试样全部转移至50mL离心管中，以10000r/min离心10min，取3mL上清液过Oasis HLB固相萃取柱，先用4mL 20%甲醇/水淋洗，然后用8mL 90%甲醇/水进行洗脱，收集洗脱液进行旋蒸至近干，剩余部分转移至氮吹管进行氮吹干涸，准确加入3mL 10%甲醇/水溶解残渣，过0.2μm微孔滤膜得滤液待用。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述样品为散粉类样品时，前处理的过程为：称取0.5g散粉类样品，置于10mL比色管中，加入50%甲醇/水溶液至刻度，涡旋振荡使得水剂中的基质与提取溶剂充分混匀，超声提取30min，试样全部转移至50mL离心管中，以10000r/min离心10min，取3mL上清液过Oasis HLB固相萃取柱，先用4mL 20%甲醇/水淋洗，然后用8mL 90%甲醇/水进行洗脱，收集洗脱液进行旋蒸至近干，剩余部分转移至氮吹管进行氮吹干涸，准确加入3mL 10%甲醇/水溶解残渣，过0.2μm微孔滤膜得滤液待用。
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