CN103616344B - 一种藏药材塞北紫堇的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种塞北紫堇药材的检测方法，其采用紫外分光光度法测定其总生物碱的含量，包括配置原阿片碱对照品溶液、制备标准溶液制作标准曲线和样品溶液的制备，样品溶液配制方法为将塞北紫堇药材细粉处用甲醇回流提取，过滤后的残渣用硫酸溶液溶解，获得样品溶液，在410nm波长处测其吸收度，根据标准曲线计算药材中的总生物碱含量。本发明使用原阿片碱作为对照，在供试品的制备中采用加热回流利用和硫酸溶液溶解的方式除去干扰因素，并利用生物碱与溴甲酚绿和磷酸盐缓冲液发生特征反应，采用二氯甲烷萃取特征反应的产物进行测定，由于二氯甲烷只对特征反应中生成的产物进行萃取，避免了非生物碱类成分的干扰，增加了结果的准确性及科学性。

Description

一种藏药材塞北紫堇的检测方法

技术领域

本发明涉及一种药材的检测方法，具体地说，涉及一种藏药材塞北紫堇的检测方法。

背景技术

紫堇属全球约320种，主要产于亚洲，我国约200余种，全国均有分布，以西南部种类分布最多，其中青藏高原约120余种，仅西藏就多达94种。塞北紫堇为罂科紫堇属植物塞北紫堇（别名赛北紫堇）的干燥全草，分布在青海、西藏、甘肃、四川等地，为藏成药中的常用药，数据显示有25%的藏成药中含有该药材，用于治疗各种出血、肝炎、胆囊炎、流感等疾病，也有将其用于治疗跌打损伤或其它外伤、发烧、肠胃炎等。

从目前对该属植物的化学成分研究结果来看，本属植物主要含原托品碱类、原小檗碱类、苯酚异喹啉类、苯骈菲啶类、卞基异喹啉类、阿朴碱类、螺苄异喹啉类、枯拉灵类等结构类型的生物碱。该属植物及其提取物大多具有广泛的药理活性，如调节心血管系统、抗菌等。李吉昌等人发表的《赛北紫堇的生物碱成分研究》对采自云南省迪庆藏族自治州香格里拉县的赛北紫堇的根进行了提取分离和结构鉴定，首次报道了从其中分离并鉴定出7种生物碱。该文献的主要目的是对塞北紫堇植株中的有效成分进行鉴定，确定其中所含生物碱的具体种类，其对采摘植株是否是塞北紫堇的质量控制是由迪庆自治洲藏医院扎西泽仁医师凭经验确定的，并没有具体的检测方法，而塞北紫堇标准收载于《青海省藏药炮制规范》2010年版第60页，现行质量标准相对落后，仅有性状、薄层鉴别项，没有任何含量测定指标，并且由于紫堇属植物种类繁多，性状结构基本类似，面对大量的备选紫堇属药材植物，不能准确的鉴别出塞北紫堇，有效的控制成药的质量。此外藏成药中多将生长于西藏的塞北紫堇作为原料药入味，但是根据植物生长机理可知，即使是同一种植物，由于其使用的部位不同，生成的环境不同，则植株中有效成分及其含量也会存在一定的差异，造成塞北紫堇质量参差不齐，因此需要对该种植物进行严格筛选，保证以其为原料的成药的安全性、有效性。

李吉昌、林跃华等人发表的《紫外分光光度法测定赛北紫堇中总生物碱含量》中采用对照品盐酸小檗碱作为对照品制备标准曲线，但本实验采用超声后过氧化铝柱的办法制备样品，使用盐酸小檗碱为对照品，使用直接测定的办法对赛北紫堇全草中的总生物碱含量进行测定，由于全草中含有大量的叶绿素，直接测定的方法无法避免叶绿素等有色杂质的干扰，即直接测定法无法保证其他非生物碱的的吸收干扰，尤为重要的是，塞北紫堇中并不存在盐酸小檗碱，使用盐酸小檗碱来作为对照品进行总生物碱的测定，明显是不科学的。

发明内容

本发明的所要解决的技术问题是现行的塞北紫堇质量标准相对落后，仅有性状、薄层鉴别项，没有任何含量测定指标，不能准确有效的控制药材的质量，进而提供一种藏药材塞北紫堇的质量检测方法。

为此，本发明采取的技术方案为：

一种塞北紫堇药材的检测方法，包括采用紫外分光光度法测定其总生物碱的含量，其步骤如下，

（1）第一对照品溶液的配置，称取干燥至恒重的原阿片碱5-8mg，加体积份数比1%的硫酸溶液1-3ml使溶解，用水定容至100ml，摇匀，即得；

（2）标准溶液的制备，吸取对照品溶液0、1、2、3、4、5ml，分别置分液漏斗中，各加0.1%溴甲酚绿试液2-4ml、磷酸盐缓冲液2-3ml，用水补足溶液至10ml。加二氯甲烷10ml，振摇2min，静置，分出有机层于400nm-450nm波长处测定吸收度，绘制标准曲线；

（3）样品溶液的制备，取塞北紫堇药材细粉1-5g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，称定所述塞北紫堇药材细粉与甲醇的总重量，加热回流1小时，过滤得到第一滤液，取所述第一滤液25ml，蒸干，得到残渣，所述残渣用体积份数比10%的硫酸溶液1ml溶解，再用水稀释并定容至5ml后，过滤得到第二滤液即所需的样品溶液；

（4）测定，精密吸取所述样品溶液1ml置分液漏斗中按所述步骤（2）的方法测定吸收度，并由标准曲线求算含量；以干燥的塞北紫堇药材计算，生物碱总含量以原阿片碱（C20H19NO5）计，不得少于0.5%。

上述塞北紫堇药材的检测方法中，所述紫外分光光度法测定其总生物碱的含量，包括如下步骤，

（1）第一对照品溶液的配置称取干燥至恒重的原阿片碱5mg，加体积份数比1%的硫酸溶液1ml使溶解，用水定容至100ml，摇匀，即得。

（2）标准溶液的制备吸取对照品溶液0、1、2、3、4、5ml，分别置分液漏斗中，各加0.1%溴甲酚绿试液2ml、磷酸盐缓冲液2ml，用水补足溶液至10ml。加二氯甲烷10ml，振摇2min，静置，分出有机层于400nm-450nm波长处测定吸收度，绘制标准曲线。

（3）样品溶液的制备取塞北紫堇药材细粉1-5g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，称定所述塞北紫堇药材细粉与甲醇的总重量，加热回流1小时，过滤得到第一滤液，取所述第一滤液25ml，蒸干，得到残渣，所述残渣用体积份数比10%的硫酸1ml溶解，再用水稀释并定容至5ml后，过滤得到第二滤液即所需的样品溶液。

（4）测定精密吸取所述样品溶液1ml置分液漏斗中，按所述步骤（2）的方法测定吸收度，并由标准曲线求算含量。

上述塞北紫堇药材的检测方法中，所述紫外分光光度法测定其总生物碱的含量，包括如下步骤，

（1）第一对照品溶液的配置称取干燥至恒重的原阿片碱5mg，加体积份数比1%的硫酸溶液1ml使溶解，用水定容至100ml，摇匀，即得；

（2）标准溶液的制备吸取对照品溶液0、1、2、3、4、5ml，分别置分液漏斗中，各加0.1%溴甲酚绿试液2ml、磷酸盐缓冲液2ml，用水补足溶液至10ml。加二氯甲烷10ml，振摇2min，静置，分出有机层于，410nm波长处测定吸收度，绘制标准曲线；

（3）样品溶液的制备取塞北紫堇药材细粉1.5g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，称定所述塞北紫堇药材细粉与甲醇的总重量，加热回流1小时，过滤得到第一滤液，取所述第一滤液25ml，蒸干得到残渣，所述残渣用体积份数比10%的硫酸1ml溶解，再用水稀释并定容至5ml后，过滤得到第二滤液即所需的样品溶液；

（4）测定精密吸取所述样品溶液1ml置分液漏斗中按所述步骤（2）的方法测定吸收度，并由标准曲线求算含量。

上述塞北紫堇药材的检测方法中，所述磷酸盐缓冲液由38g磷酸二氢钠与5.04g磷酸氢二钠，加水定容至1000ml，摇匀配制得到。

上述塞北紫堇药材的检测方法中，所述方法还包括采用高效液相色谱法测定原阿片碱的含量的步骤，其包括，

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以由体积份数比0.2%冰醋酸与体积份数比0.5%三乙胺的缓冲溶液形成的pH为6.0的第一混合溶液与乙腈形成的第二混合液为流动相，其中所述第一混合溶液与乙腈的体积比为（70-80）：（20-30），检测波长为280-290nm；理论板数按原阿片碱峰计算应不低于3000；

第二对照品溶液的制备取原阿片碱对照品5mg，加体积份数比1%硫酸使溶解，用水定容至100ml，即得；

供试品溶液的制备取所述塞北紫堇药材细粉1-5g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，称定所述塞北紫堇药材与甲醇的总重量得到第一总重量，加热回流1小时，放冷，再次称定所述塞北紫堇药材与甲醇的总重量得到第二总重量，并用甲醇补足第二总重量中减失的重量使其与第一总重量相等，摇匀，过滤得到第三滤液，取所述第三滤液25ml，蒸干得到第一残渣。所述第一残渣用体积份数比10%的硫酸1ml溶解，用水稀释并定容至10ml后，过滤得到第四滤液即所需的供试品溶液；

测定法分别精密吸取第二对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

以干燥的塞北紫堇药材计算，塞北紫堇含原阿片碱（C20H19NO5），不得少于0.5mg/g。

上述塞北紫堇药材的检测方法中，所述高效液相色谱法测定原阿片碱含量的步骤，包括，

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以由体积份数比0.2%冰醋酸与体积份数比0.5%三乙胺的缓冲溶液形成的pH为6.0的第一混合溶液与乙腈形成的第二混合液为流动相，其中所述第一混合溶液与乙腈的体积比为75：25，检测波长为289nm；理论板数按原阿片碱峰计算不低于3000；

第二对照品溶液的制备取原阿片碱对照品5mg，加体积份数比1%硫酸使溶解，用水定容至100ml，即得；

供试品溶液的制备取所述塞北紫堇药材细粉2.5g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，称定所述塞北紫堇药材与甲醇的总重量得到第一总重量，加热回流1小时，放冷，再次称定所述塞北紫堇药材与甲醇的总重量得到第二总重量，并用甲醇补足第二总重量中减失的重量使其与第一总重量相等，摇匀，过滤得到第三滤液，取所述第三滤液25ml，蒸干得到第一残渣。所述第一残渣用体积份数比10%的硫酸1ml溶解，用水稀释并定容至10ml后，过滤得到第四滤液即所需的供试品溶液；

测定法分别精密吸取第二对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

上述塞北紫堇药材的检测方法中，所述高效液相色谱法测定原阿片碱的含量，包括，

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以由体积份数比0.2%冰醋酸与体积份数比0.5%三乙胺的缓冲溶液形成的pH为6.0的第一混合溶液与乙腈形成的第二混合液为流动相，其中所述第一混合溶液与乙腈的体积比为75：25；检测波长为289nm；理论板数按原阿片碱峰计算不低于3000；

第二对照品溶液的制备取原阿片碱对照品5mg，加体积份数比1%硫酸使溶解，用水定容至100ml，即得；

供试品溶液的制备取所述塞北紫堇药材细粉2g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，称定所述塞北紫堇药材与甲醇的总重量得到第一总重量，加热回流1小时，放冷，再次称定所述塞北紫堇药材与甲醇的总重量得到第二总重量，并用甲醇补足第二总重量中减失的重量使其与第一总重量相等，摇匀，过滤得到第三滤液，取所述第三滤液25ml，蒸干得到第一残渣。所述第一残渣用体积份数比10%的硫酸1ml溶解，用水稀释并定容至10ml后，过滤得到第四滤液即所需的供试品溶液；

测定法分别精密吸取第二对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

与现有技术相比，本发明使用塞北紫堇中主要的有效成分原阿片碱作为对照，更为科学，在供试品的制备中首先采用加热回流利用高温环境去除叶绿素，进一步的采用硫酸溶液溶解的方式再一次除去干扰杂质，进而避免了大量的叶绿素对测定产生的干扰；更为科学的是，本发明使用生物碱与溴甲酚绿和磷酸盐缓冲液发生特征反应，并采用二氯甲烷萃取特征反应的产物进行测定，由于二氯甲烷只对特征反应中生成的产物进行萃取，避免了非生物碱类成分的干扰，进一步增加了结果的准确性及科学性。

实验例1：塞北紫堇中总生物碱的含量测定实验

1.仪器、试剂和供试样品

仪器：电子天平：岛津AUW220D型；滴定管（北京玻璃仪器厂，25ml）；岛津UV-2450型紫外分光光度仪。

对照品：原阿片碱对照品（中国药品生物制品检定所），批号：0853-200201。

样品：塞北紫堇（青海金诃藏药药业股份有限公司提供），批号分别为：110801、110802、110803。

2.总生物碱含量测定

对照品溶液的配置精密称取干燥至恒重的原阿片碱5mg，体积份数1%的硫酸溶液1ml使溶解，用水定容至100ml，摇匀，即得。

标准溶液的制备精密吸取对照品溶液0、1、2、3、4、5ml，分别置分液漏斗中，各加0.1%（质量体积比，即100ml溶液中溴甲酚绿含量为0.1g）溴甲酚绿试液2ml、磷酸盐缓冲液2ml，用水补足溶液至10ml。加二氯甲烷10ml，振摇2min，静置，分出有机层于410nm波长处测定吸收度，绘制吸收度与标准溶液中原阿片碱浓度的标准曲线。

样品溶液的制备取本品药材细粉约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，称定药材与甲醇的总重量，加热回流1小时，过滤得到第一滤液，取所述第一滤液25ml，蒸干得残渣。所述残渣用体积份数10%的硫酸溶液1ml溶解，用水稀释并定容至5ml后，过滤得到第二滤液，即所需的样品溶液备测。

精密吸取样品溶液1ml置分液漏斗中，按绘制标准曲线时测定标准溶液吸收度的方法测定样品溶液的吸收度，并由标准曲线求算含量。

磷酸盐缓冲液的配置磷酸二氢钠38g与磷酸氢二钠5.04g，加水定容至1000ml，摇匀，即得。

3.重现性试验

取110801批号塞北紫堇药材样品6份，按总生物碱含量测定方法测定，计算总生物碱含量及其相对标准偏差。结果表明：该方法重复性良好。结果见表1。

表1总生物碱含量测定重现性试验结果

4.回收率试验

精密称取已知总生物碱含量的同一批塞北紫堇药材样品6份（批号：110801），分别精密加入原阿片碱对照品，按总生物碱含量测定方法测定，计算回收率及其相对标准偏差。结果表明：该测定方法测定结果准确。结果见表2。

表2回收率实验结果

5.三批药材总生物碱含量测定

为进一步验证本方法的准确性，取藏药材塞北紫堇三批，按总生物碱含量测定项下方法测定，计算塞北紫堇中总生物碱含量。结果见表3。

表3总生物碱含量测定结果

实验例2：塞北紫堇中原阿片碱的含量测定实验

1.仪器、试药和供试样品

仪器：高效液相色谱仪：日立L-2100泵，日立L-2400紫外检测器；

电子天平：岛津AUW220D型。

对照品：原阿片碱对照品（中国药品生物制品检定所），批号：0853-200201。

样品：塞北紫堇（青海金诃藏药药业股份有限公司提供），批号分别为：110801、110802、110803。

2.检测波长选择

取原阿片碱混合对照品溶液，于190-400nm波长范围内进行扫描，根据紫外吸收图谱，选定289nm为检测波长。

3.流动相选择

分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-体积份数比0.2%磷酸加三乙胺的缓冲溶液（PH值为3.5）、乙腈-体积份数比0.2%冰醋酸加体积份数比0.5%三乙胺的缓冲溶液（PH值为6.0）等不同体积份数比为流动相时供试品溶液中原阿片碱的分离效果，研究发现，选用乙腈-体积份数比0.2%冰醋酸加体积份数比0.5%三乙胺的缓冲溶液（PH值为6.0）为流动相进行梯度洗脱时，能够得到较好的分离效果。

4.系统适用性试验

在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，供试品色谱中原阿片碱与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5。

5.对照品溶液制备

取原阿片碱对照品5mg，加体积分数比1%硫酸使溶解，用水定容至100ml，即得；

6.供试品溶液制备

分别考察了超声、回流、振摇三种提取方法的提取效果，甲醇、乙醇、氯仿三种提取溶剂的提取效果；还分别考察了0.5小时、1小时、1.5小时三种提取时间的提取效果。以每克药品中原阿片碱的含量为指标确定提取方法、提取溶剂、提取时间。结果见表4、5、6。

表4提取方法考察试验结果

提取溶剂	超声	回流	振摇
				原阿片碱含量(mg/g)	0.5652	0.7526	0.3235

表5提取溶剂考察试验结果

提取溶剂	甲醇	乙醇	氯仿
				原阿片碱含量(mg/g)	0.7532	0.6295	0.6874

表6提取时间考察试验结果

提取时间	0.5小时	1小时	1.5小时
				原阿片碱含量(mg/g)	0.7083	0.7525	0.7526

结果表明，采用回流提取比较充分，提取溶剂优选甲醇，提取时间选用1小时，能够保证原阿片碱提取完全。具体方法如下：

取本品药材细粉约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液25ml，蒸干。残渣用硫酸（1→10）1ml溶解，用水稀释并定容至10ml后，过滤，取续滤液，备测。

7.线性关系的考察

精密量取原阿片碱对照品贮备液溶液（原阿片碱含量为104.5μg/ml）1ml、3ml、5ml、8ml、10ml，分别置10ml容量瓶中，水稀释至刻度，摇匀，各精密进样10μl，以峰面积（A）对对照品浓度（C）进行线性回归，得原阿片碱回归方程：A=4449.5C+361.43，相关系数：R=0.9997。结果表明：原阿片碱在10.45μg/ml～104.50μg/ml范围内，原阿片碱色谱峰的峰面积（A）与对照品浓度（C）线性关系良好。结果见表7和附图1。

表7原阿片碱线性关系考察结果

序号	对照品浓度C(μg/ml)	峰面积A(μV·s)
			1	10.45	45686
2	31.35	141285
			3	52.25	230479
4	83.60	378523
			5	104.50	461257

8.精密度试验

精密吸取原阿片碱对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，各连续测定6次，记录峰面积并计算相对标准偏差。结果表明，仪器精密度良好。结果见表8。

表8原阿片碱精密度试验结果

9.稳定性试验

供试品溶液制备完成后，精密吸取10μl，分别在0、4、8、12、24小时注入液相色谱仪，记录峰面积并计算峰面积的相对标准偏差。结果表明：供试品溶液中原阿片碱在24小时内测定结果稳定。结果见表9。

表9原阿片碱稳定性试验结果

10.重复性试验

取同一批塞北紫堇药材（批号：110801）6份，按照供试品的制备方法制备供试品溶液，精密吸取10μl，注入液相色谱仪进行测定，计算样品中原阿片碱的含量及其相对标准偏差。结果表明：分析方法重复性良好。结果见表10。

表10原阿片碱重复性试验结果

11.回收率试验

精密称取已知原阿片碱含量的同一批塞北紫堇药材6份（批号：110801），原阿片碱对照品，测定其含量，计算回收率及其相对标准偏差。结果表明：该测定方法测定结果准确。结果见表11。

表11原阿片碱回收率试验结果

12.样品测定

取藏药材塞北紫堇三批，按上述含量测定方法对原阿片碱含量进行测定。结果见表12。

表12含量测定结果

批号	原阿片碱含量(mg/g)
		110801	0.753
110802	0.749
		110803	0.757

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1是原阿片碱含量与峰面积的线性关系图；

图2是原阿片碱对照品的高效液相色谱图；

图3是塞北紫堇药材的含量测定液相图谱。

其中，图1的横坐标是浓度C，单位：μg/ml；纵坐标是峰面积A，单位：μV·s；图2、图3的横坐标是时间，单位：Minutes；纵坐标是电压，单位：mVolts。

具体实施方式

实施例1

藏药材塞北紫堇由青海金诃藏药药业股份有限公司提供。

总生物碱的含量测定

（1）对照品溶液的配置精密称取干燥至恒重的原阿片碱5mg，加硫酸溶液（1→100）1ml使溶解，用水定容至100ml，摇匀，即得。

（2）标准溶液的制备精密吸取对照品溶液0、1、2、3、4、5ml，分别置分液漏斗中，各加0.1%（质量体积比，即100ml溶液中溴甲酚绿的含量为0.1g）溴甲酚绿试液2ml、磷酸盐缓冲液2ml，用水补足溶液至10ml。加二氯甲烷10ml，振摇2min，静置，分出有机层于410nm波长处测定吸收度，绘制标准曲线。

（3）样品溶液的制备取本品药材细粉约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，称定所述塞北紫堇药材细粉与甲醇的总重量，加热回流1小时，过滤得到第一滤液，取所述第一滤液25ml，蒸干，得到残渣，所述残渣用体积份数比10%的硫酸溶液1ml溶解，再用水稀释并定容至5ml后，过滤得到第二滤液即所需的样品溶液。

（4）测定精密吸取样品溶液1ml置分液漏斗中，按标准曲线的绘制项下的方法操作，由标准曲线求算含量。

（5）磷酸盐缓冲液的配置磷酸二氢钠38g与磷酸氢二钠5.04g，加水定容至1000ml，摇匀，即得。

本品按干燥品计算，生物碱总含量以原阿片碱（C20H19NO5）计为0.76%。

塞北紫堇中原阿片碱的含量测定

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数比0.2%冰醋酸和体积份数比0.5%三乙胺的缓冲溶液形成的pH值为6.0的第一混合溶液和乙腈形成的第二混合液为流动相，其中第一混合溶液与乙腈的体积比75:25；检测波长为289nm；理论板数按原阿片碱峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备取原阿片碱对照品5mg，加体积分数比1%硫酸使溶解，用水定容至100ml，即得；

供试品溶液的制备取本品药材细粉约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，称定所述塞北紫堇药材与甲醇的总重量得到第一总重量，加热回流1小时，放冷，再次称定所述塞北紫堇药材与甲醇的总重量得到第二总重量，并用甲醇补足第二总重量中减失的重量使其与第一总重量相等，摇匀，过滤得到第三滤液，取所述第三滤液25ml，蒸干得到第一残渣。所述第一残渣用体积份数比10%的硫酸1ml溶解，用水稀释并定容至10ml后，过滤得到第四滤液即所需的供试品溶液。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，得到对照品和供试品的高效液相色谱图（分别如图2和图3所示），测定峰面积，计算原阿片碱的含量。

本品按干燥品计算，塞北紫堇含原阿片碱（C20H19NO5）为0.69mg/g。

实施例2

藏药材塞北紫堇由青海金诃藏药药业股份有限公司提供。

总生物碱的含量测定

（1）对照品溶液的配置精密称取干燥至恒重的原阿片碱8mg，加硫酸溶液（1→100）1ml使溶解，用水定容至100ml，摇匀，即得。

（2）标准溶液的制备精密吸取对照品溶液0、1、2、3、4、5ml，分别置分液漏斗中，各加0.1%（质量体积比，即100ml溶液中溴甲酚绿的含量为0.1g）溴甲酚绿试液2ml、磷酸盐缓冲液2ml，用水补足溶液至10ml。加二氯甲烷10ml，振摇2min，静置，分出有机层于410nm波长处测定吸收度，绘制标准曲线。

（3）样品溶液的制备取本品药材细粉约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，称定所述塞北紫堇药材细粉与甲醇的总重量，加热回流1小时，过滤得到第一滤液，取所述第一滤液25ml，蒸干，得到残渣，所述残渣用体积份数比10%的硫酸溶液1ml溶解，再用水稀释并定容至5ml后，过滤得到第二滤液即所需的样品溶液。

（4）测定精密吸取样品溶液1ml置分液漏斗中，按标准曲线的绘制项下的方法操作，由标准曲线求算含量。

（5）磷酸盐缓冲液的配置磷酸二氢钠38g与磷酸氢二钠5.04g，加水定容至1000ml，摇匀，即得。

本品按干燥品计算，生物碱总含量以原阿片碱（C20H19NO5）计为0.76%。

塞北紫堇中原阿片碱的含量测定

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数比0.2%冰醋酸和体积份数比0.5%三乙胺的缓冲溶液形成的pH值为6.0的第一混合溶液和乙腈形成的第二混合液为流动相，其中第一混合溶液与乙腈的体积比70:30；检测波长为289nm；理论板数按原阿片碱峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备取原阿片碱对照品5mg，加体积分数比1%硫酸使溶解，用水定容至100ml，即得；

供试品溶液的制备取本品药材细粉约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，称定所述塞北紫堇药材与甲醇的总重量得到第一总重量，加热回流1小时，放冷，再次称定所述塞北紫堇药材与甲醇的总重量得到第二总重量，并用甲醇补足第二总重量中减失的重量使其与第一总重量相等，摇匀，过滤得到第三滤液，取所述第三滤液25ml，蒸干得到第一残渣。所述第一残渣用体积份数比10%的硫酸1ml溶解，用水稀释并定容至10ml后，过滤得到第四滤液即所需的供试品溶液。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算原阿片碱的含量。

本品按干燥品计算，塞北紫堇含原阿片碱（C20H19NO5）为0.69mg/g。实施例3

藏药材塞北紫堇由青海金诃藏药药业股份有限公司提供。

总生物碱的含量测定

（1）对照品溶液的配置精密称取干燥至恒重的原阿片碱6mg，加硫酸溶液（1→100）1ml使溶解，用水定容至100ml，摇匀，即得。

（2）标准溶液的制备精密吸取对照品溶液0、1、2、3、4、5ml，分别置分液漏斗中，各加0.1%（质量体积比，即100ml溶液中溴甲酚绿的含量为0.1g）溴甲酚绿试液2ml、磷酸盐缓冲液2ml，用水补足溶液至10ml。加二氯甲烷10ml，振摇2min，静置，分出有机层于410nm波长处测定吸收度，绘制标准曲线。

（3）样品溶液的制备取本品药材细粉约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，称定所述塞北紫堇药材细粉与甲醇的总重量，加热回流1小时，过滤得到第一滤液，取所述第一滤液25ml，蒸干，得到残渣，所述残渣用体积份数比10%的硫酸溶液1ml溶解，再用水稀释并定容至5ml后，过滤得到第二滤液即所需的样品溶液。

（4）测定精密吸取样品溶液1ml置分液漏斗中，按标准曲线的绘制项下的方法操作，由标准曲线求算含量。

（5）磷酸盐缓冲液的配置磷酸二氢钠38g与磷酸氢二钠5.04g，加水定容至1000ml，摇匀，即得。

本品按干燥品计算，生物碱总含量以原阿片碱（C20H19NO5）计为0.76%。

塞北紫堇中原阿片碱的含量测定

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数比0.2%冰醋酸和体积份数比0.5%三乙胺的缓冲溶液形成的pH值为6.0的第一混合溶液和乙腈形成的第二混合液为流动相，其中第一混合溶液与乙腈的体积比80:20；检测波长为289nm；理论板数按原阿片碱峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备取原阿片碱对照品5mg，加体积分数比1%硫酸使溶解，用水定容至100ml，即得；

供试品溶液的制备取本品药材细粉约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，称定所述塞北紫堇药材与甲醇的总重量得到第一总重量，加热回流1小时，放冷，再次称定所述塞北紫堇药材与甲醇的总重量得到第二总重量，并用甲醇补足第二总重量中减失的重量使其与第一总重量相等，摇匀，过滤得到第三滤液，取所述第三滤液25ml，蒸干得到第一残渣。所述第一残渣用体积份数比10%的硫酸1ml溶解，用水稀释并定容至10ml后，过滤得到第四滤液即所需的供试品溶液。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算原阿片碱的含量。

本品按干燥品计算，塞北紫堇含原阿片碱（C20H19NO5）为0.69mg/g。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (7)

1.一种塞北紫堇药材的检测方法，其特征在于，采用紫外分光光度法测定其总生物碱的含量，其步骤如下，

(1)第一对照品溶液的配置，称取干燥至恒重的原阿片碱5-8mg，加体积份数比1％的硫酸溶液1-3ml使溶解，用水定容至100ml，摇匀，即得；

(2)标准溶液的制备，吸取对照品溶液0、1、2、3、4、5ml，分别置分液漏斗中，各加0.1％溴甲酚绿试液2-4ml、磷酸盐缓冲液2-3ml，用水补足溶液至10ml,加二氯甲烷10ml，振摇2min，静置，分出有机层于400nm-450nm波长处测定吸收度，绘制标准曲线；

(3)样品溶液的制备，取塞北紫堇药材细粉1-5g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，称定所述塞北紫堇药材细粉与甲醇的总重量，加热回流1小时，过滤得到第一滤液，取所述第一滤液25ml，蒸干，得到残渣，所述残渣用体积份数比10％的硫酸溶液1ml溶解，再用水稀释并定容至5ml后，过滤得到第二滤液即所需的样品溶液；

(4)测定，精密吸取所述样品溶液1ml置分液漏斗中按所述步骤(2)的方法测定吸收度，并由标准曲线求算含量。

2.根据权利要求1所述的塞北紫堇药材的检测方法，其特征在于，所述紫外分光光度法测定其总生物碱的含量，包括如下步骤，

(1)第一对照品溶液的配置称取干燥至恒重的原阿片碱5mg，加体积份数比1％的硫酸溶液1ml使溶解，用水定容至100ml，摇匀，即得；

(2)标准溶液的制备吸取对照品溶液0、1、2、3、4、5ml，分别置分液漏斗中，各加0.1％溴甲酚绿试液2ml、磷酸盐缓冲液2ml，用水补足溶液至10ml,加二氯甲烷10ml，振摇2min，静置，分出有机层于400nm-450nm波长处测定吸收度，绘制标准曲线；

(3)样品溶液的制备取塞北紫堇药材细粉1-5g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，称定所述塞北紫堇药材细粉与甲醇的总重量，加热回流1小时，过滤得到第一滤液，取所述第一滤液25ml，蒸干，得到残渣，所述残渣用体积份数比10％的硫酸1ml溶解，再用水稀释并定容至5ml后，过滤得到第二滤液即所需的样品溶液；

(4)测定精密吸取所述样品溶液1ml置分液漏斗中，按所述步骤(2)的方法测定吸收度，并由标准曲线求算含量。

3.根据权利要求2所述的塞北紫堇药材的检测方法，其特征在于，所述紫外分光光度法测定其总生物碱的含量，包括如下步骤，

(1)第一对照品溶液的配置称取干燥至恒重的原阿片碱5mg，加体积份数比1％的硫酸溶液1ml使溶解，用水定容至100ml，摇匀，即得；

(2)标准溶液的制备吸取对照品溶液0、1、2、3、4、5ml，分别置分液漏斗中，各加0.1％溴甲酚绿试液2ml、磷酸盐缓冲液2ml，用水补足溶液至10ml,加二氯甲烷10ml，振摇2min，静置，分出有机层于，410nm波长处测定吸收度，绘制标准曲线；

(3)样品溶液的制备取塞北紫堇药材细粉1.5g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，称定所述塞北紫堇药材细粉与甲醇的总重量，加热回流1小时，过滤得到第一滤液，取所述第一滤液_25ml，蒸干得到残渣，所述残渣用体积份数比10％的硫酸1ml溶解，再用水稀释并定容至5ml后，过滤得到第二滤液即所需的样品溶液；

(4)测定精密吸取所述样品溶液1ml置分液漏斗中按所述步骤(2)的方法测定吸收度，并由标准曲线求算含量。

4.根据权利要求1-3任一所述的塞北紫堇药材的检测方法，其特征在于，

所述磷酸盐缓冲液由38g磷酸二氢钠与5.04g磷酸氢二钠，加水定容至1000ml，摇匀配制得到。

5.根据权利要求4所述的塞北紫堇药材的检测方法，其特征在于，所述方法还包括采用高效液相色谱法测定原阿片碱的含量的步骤，其包括，

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以由体积份数比0.2％冰醋酸与体积份数比0.5％三乙胺的缓冲溶液形成的pH为6.0的第一混合溶液与乙腈形成的第二混合液为流动相，其中所述第一混合溶液与乙腈的体积比为(70-80)：(20-30)，检测波长为280-290nm；理论板数按原阿片碱峰计算应不低于3000；

第二对照品溶液的制备取原阿片碱对照品5mg，加体积份数比1％硫酸使溶解，用水定容至100ml，即得；

供试品溶液的制备取所述塞北紫堇药材细粉1-5g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，称定所述塞北紫堇药材与甲醇的总重量得到第一总重量，加热回流1小时，放冷，再次称定所述塞北紫堇药材与甲醇的总重量得到第二总重量，并用甲醇补足第二总重量中减失的重量使其与第一总重量相等，摇匀，过滤得到第三滤液，取所述第三滤液25ml，蒸干得到第一残渣,所述第一残渣用体积份数比10％的硫酸1ml溶解，用水稀释并定容至10ml后，过滤得到第四滤液即所需的供试品溶液；

测定法分别精密吸取第二对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

6.根据权利要求5所述的塞北紫堇药材的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法测定原阿片碱含量的步骤，包括，

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以由体积份数比0.2％冰醋酸与体积份数比0.5％三乙胺的缓冲溶液形成的pH为6.0的第一混合溶液与乙腈形成的第二混合液为流动相，其中所述第一混合溶液与乙腈的体积比为75：25，检测波长为289nm；理论板数按原阿片碱峰计算不低于3000；

第二对照品溶液的制备取原阿片碱对照品5mg，加体积份数比1％硫酸使溶解，用水定容至100ml，即得；

供试品溶液的制备取所述塞北紫堇药材细粉2.5g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，称定所述塞北紫堇药材与甲醇的总重量得到第一总重量，加热回流1小时，放冷，再次称定所述塞北紫堇药材与甲醇的总重量得到第二总重量，并用甲醇补足第二总重量中减失的重量使其与第一总重量相等，摇匀，过滤得到第三滤液，取所述第三滤液25ml，蒸干得到第一残渣,所述第一残渣用体积份数比10％的硫酸1ml溶解，用水稀释并定容至10ml后，过滤得到第四滤液即所需的供试品溶液；

测定法分别精密吸取第二对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

7.根据权利要求5所述的塞北紫堇药材的检测方法，其征征在于，所述高效液相色谱法测定原阿片碱的含量，包括，

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以由体积份数比0.2％冰醋酸与体积份数比0.5％三乙胺的缓冲溶液形成的pH为6.0的第一混合溶液与乙腈形成的第二混合液为流动相，其中所述第一混合溶液与乙腈的体积比为75：25；检测波长为289nm；理论板数按原阿片碱峰计算不低于3000；

第二对照品溶液的制备取原阿片碱对照品5mg，加体积份数比1％硫酸使溶解，用水定容至100ml，即得；

供试品溶液的制备取所述塞北紫堇药材细粉2g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，称定所述塞北紫堇药材与甲醇的总重量得到第一总重量，加热回流1小时，放冷，再次称定所述塞北紫堇药材与甲醇的总重量得到第二总重量，并用甲醇补足第二总重量中减失的重量使其与第一总重量相等，摇匀，过滤得到第三滤液，取所述第三滤液25ml，蒸干得到第一残渣,所述第一残渣用体积份数比10％的硫酸1ml溶解，用水稀释并定容至10ml后，过滤得到第四滤液即所需的供试品溶液；

测定法分别精密吸取第二对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。