CN103344738A - 九味镇心颗粒的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种九味镇心颗粒的检测方法，本发明的检测方法对九味镇心颗粒中的酸枣仁、五味子、延胡索、肉桂、天冬、远志进行了薄层色谱和人参中的草酸钙进行了显微鉴别，以及人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的HPLC含量的测定方法。本发明的检测方法具有稳定、精密度良好、方法重现性较好、回收率高；良好分离效果的特点。通过本发明的方法可以进一步全面控制九味镇心颗粒的质量，并且本发明提供的测定人参皂苷Rg1和人参皂苷Re含量的方法可以实现人参皂苷Rg1和人参皂苷Re很好的基线分离效果，并且测定结果准确，重现性好。
Description
技术领域
本发明涉及九味镇心颗粒的检测方法，具体地说，涉及九味镇心颗粒中的各种成分的鉴别方法以及人参皂苷Rg1和人参皂苷Re含量的测定方法。
背景技术
九味镇心颗粒主治养心补脾，益气安神，用于治疗广泛性焦虑症心脾两虚证，比如临床症见善思多虑不解、失眠多梦、心悸、食欲不振、神疲乏力、头晕、易出汗、善太息、面色萎黄、舌淡苔薄白、脉玄细。九味镇心颗粒气微香、味苦、细棕色的颗粒。九味镇心颗粒的主要成分包括酸枣仁、五味子、延胡索、肉桂、天冬、远志、人参。
由于成分复杂，所以在鉴别实验中容易出现相互干扰，难以准确鉴别。同时，由于在用于含量测定的液相预实验中发现九味镇心颗粒中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re保留时间比较接近，多数品牌的柱子无法分离，并且在两成分色谱峰周围有2-3个杂质干扰，因此，难以成功分离上述两种色谱峰，更不能有效测定九味镇心颗粒中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量。
发明内容
为了解决现有技术中的上述技术难题，本发明提供了一种检测九味镇心颗粒的方法，从而得以有效检测九味镇心颗粒的质量。
本发明的目的是为了提供一种检测九味镇心颗粒的方法，所述方法检测包括：
（1）对酸枣仁的鉴别方法包括：将所述九味镇心颗粒的样品研细，精密称定称取20g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100ml，密塞，称定重量，浸泡过夜，加热回流2小时，放冷，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液50ml，蒸干，残渣加水30ml使溶解，用乙醚30ml振摇提取，弃去乙醚液，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次30ml，合并正丁醇液，用氨试液（从北京化工厂购买，型号：20110102）洗涤2次，每次35ml，合并氨试液，用水饱和的正丁醇35ml振摇提取，合并正丁醇溶液，用正丁醇饱和的水30ml洗涤，弃去水液，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液1；
另取酸枣仁对照药材1g，加乙醚20ml，超声处理45分钟，滤过，弃去乙醚，药渣加甲醇30ml，加热回流3小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液1；
再取酸枣仁皂苷A对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液1；
按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液1、对照药材溶液1和对照品溶液1分别为5μl、8μl和2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为4:1:5正丁醇-甲酸-水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，晾干，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（2）对五味子的鉴别方法包括：称取所述九味镇心颗粒的样品5g，研细，加三氯甲烷40ml，置于水浴上加热回流3小时，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液2；
另取五味子对照药材1g，与所述五味子的鉴别方法中所制成的供试品溶液2同法制成对照药材溶液2；
再取五味子乙素对照品，加三氯甲烷制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液2；
按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液2、对照药材溶液2和对照品溶液2分别为4μl、4μl、4μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为15:5:1石油醚-甲酸乙酯-甲酸的上层溶液为展开剂，所述石油醚的温度为30～60℃，展开，取出，晾干，置于紫外光灯254nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（3）对延胡索的鉴别方法包括：称取所述九味镇心颗粒5g，研细，加浓氨试液1ml，三氯甲烷20ml，超声处理40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液3；
另取延胡索对照药材1g，与所述延胡索的鉴别方法中所制成的供试品溶液3同法制成对照药材溶液3；
再取延胡索乙素对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液3；
按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液3、对照药材溶液3和对照品溶液3分别为20μl、5μl、2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为25:15:3:0.25正己烷-三氯甲烷-甲醇-水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（4）对肉桂的鉴别方法包括：称取所述九味镇心颗粒15g，研细，加无水乙醇50ml，浸渍1小时，轻轻振摇。超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液4；
另取肉桂对照药材1g，加无水乙醇20ml，与所述肉桂的鉴别方法中所制成的供试品溶液4同法制成对照药材溶液4；
再取肉桂酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液4；
按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液4、对照药材溶液4和对照品溶液4分别为10μl、2μl、2μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为43:8:1石油醚-醋酸乙酯-甲酸为展开剂，所述石油醚的温度为60～90℃，展开，取出，晾干，置于紫外光灯254nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（5）对天冬的鉴别方法包括：称取所述九味镇心颗粒1g，研细，用5%盐酸的50%乙醇溶液浸泡过夜，水浴上回流水解3小时，放冷后，加5%氢氧化钠溶液中和至pH7.0，用20ml、20ml、20ml三氯甲烷分别提取3次，合并三氯甲烷液，挥干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液5；
另取天冬对照药材1g，与所述天冬的鉴别方法中所制成的供试品溶液5同法制备成对照药材溶液5；
按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5、对照药材溶液5各10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为8:3正己烷-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外光灯254nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（6）对远志的鉴别方法包括：称取所述九味镇心颗粒3g，研细，加乙醇20ml，加热回流20分钟，滤过，滤液浓缩至约10ml，放冷，加入乙醚30ml，放置使沉淀完全，倾去上清液，沉淀挥干，加10%盐酸溶液10ml，加热回流30分钟，放冷，滤过，沉淀物用甲醇5ml溶解，作为供试品溶液6；
另取远志对照药材1g，与所述远志的鉴别方法中所制成的供试品溶液6同法制备成对照药材溶液6；
按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液6和对照药材溶液6各10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为8:4:0.2:0.5三氯甲烷-丙酮-正己烷-醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（7）对人参的鉴别方法包括显微鉴别和液相鉴别，显微鉴别如下：称取所述九味镇心颗粒，置于显微镜下观察；草酸钙簇晶20-68um，梭角尖锐。
此外，本发明对所述人参中的人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量测定方法包括：
（1）制备对照品溶液：取人参皂苷Rg1和人参皂苷Re对照品，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含0.38mg和0.18mg的对照品溶液；
（2）制备供试品溶液：将所述九味镇心颗粒的样品研细，称取20g，精密陈定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100ml，浸泡过夜，密塞，称定重量，浸泡过夜，加热回流120～180分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液50ml，蒸干，残渣加水30ml使溶解，用乙醚30ml振摇提取，弃去乙醚液，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次30ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2～3次，每次35ml，合并氨试液，用正丁醇反洗合并的氨试液，用水饱和的正丁醇35ml振摇提取，合并正丁醇溶液，用正丁醇饱和的水30ml洗涤，弃去水液，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液以作为供试品溶液；
（3）按照高效液相色谱法测定，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按下列规定条件进行梯度洗脱、测定；
其中：
流动相A体积百分比与流动相B体积百分比之和为100%；
填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；
流速为1.0ml/min；
流动相A为乙腈，
流动相B为0.4体积%磷酸；
液相色谱仪的波长为203nm；
柱温为40℃；
理论板数按人参皂苷Rg1、Re峰计算均应不低于5000。
优选地，所述高效液相色谱法测定中的色谱柱为SUPELCOC
或Phenomenex Gemini。
本发明的检测方法具有稳定、精密度良好、方法重现性较好、回收率高；良好分离效果的特点。并且，经过发明人的创造性劳动，在众多的色谱柱品牌和规格的基础上，采用特定的色谱柱SUPELCOC
和Phenomenex Gemini，实现了人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的基线分离，获得了令人满意的分离效果；而且在两成分色谱峰周围没有杂质干扰。由此，成功解决了现有技术中多数品牌的柱子无法分离上述两种保留时间非常接近的成分，更难以有效测定九味镇心颗粒人参含量的技术难题。
因此，通过本发明的方法可以进一步全面控制九味镇心颗粒的质量，并且本发明提供的测定人参皂苷Rg1和人参皂苷Re含量的方法可以实现人参皂苷Rg1和人参皂苷Re很好的基线分离效果，并且测定结果准确，重现性好。
附图说明：
图1-1、图1-2、图1-3、图1-4、图1-5、图1-6表示本发明的人参皂苷Re和人参皂苷Rg1能达到基线分离的色谱图；
图2表示本发明的空白溶液在人参皂苷Rg1和人参皂苷Re对照品相同保留时间处未显色谱峰的色谱图；
图3-1、图3-2表示本发明的人参皂苷Rg1在0.3160μg～12.6407μg范围内线性关系和人参皂苷Re在0.1498μg～5.9904μg范围内线性关系示意图；
图4-1、图4-2、图4-3、图4-4、图4-5表示本发明的色谱柱SUPELCOC Discovery C185μ4.6×250mm Cat:504971Col:115575-02的色谱图；
图5-1、图5-2、图5-3、图5-4、图5-5表示本发明的色谱柱Phenomenex Gemini5μ110A C184.6×250mm P/NO00G-4435-E02的色谱图；
具体实施方式
为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例。需要指出的是，这些实施例完全是例证性的。给出这些实施例的目的是为了充分明示本发明的意义和内容，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1：鉴别九味镇心颗粒中的酸枣仁
取九味镇心颗粒的样品研细，称取20g，加入甲醇100ml，密塞，称定重量，浸泡过夜，加热回流2小时，放冷，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液50ml，蒸干，残渣加水30ml使溶解，用乙醚30ml振摇提取，弃去乙醚液，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次30ml，合并正丁醇液，用氨试液（从北京化工厂购买，型号：20110102）洗涤2次，每次35ml，合并氨试液，用水饱和的正丁醇35ml振摇提取，合并正丁醇溶液，用正丁醇饱和的水30ml洗涤，弃去水液，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。另取酸枣仁对照药材1g，加乙醚20ml，超声处理45分钟，滤过，弃去乙醚，药渣加甲醇30ml，加热回流3小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。再取酸枣仁皂苷A对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液分别为5μl、8μl和2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为4:1:5正丁醇-甲酸-水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，晾干，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点，阴性无干扰。
实施例2：鉴别九味镇心颗粒中的五味子
称取所述九味镇心颗粒的样品5g，研细，加三氯甲烷40ml，置于水浴上加热回流3小时，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液。另取五味子对照药材1g，与所述五味子的鉴别方法中所制成的供试品溶液2同法制成对照药材溶液。再取五味子乙素对照品，加三氯甲烷制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液分别为4μl、4μl、4μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为15:5:1石油醚-甲酸乙酯-甲酸的上层溶液为展开剂，所述石油醚的温度为30～60℃，展开，取出，晾干，置于紫外光灯254nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点。
实施例3：鉴别九味镇心颗粒中的延胡索
称取所述九味镇心颗粒5g，研细，加浓氨试液1ml，三氯甲烷20ml，超声处理40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取延胡索对照药材1g，与所述延胡索的鉴别方法中所制成的供试品溶液3同法制成对照药材溶液。再取延胡索乙素对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液分别为20μl、5μl、2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为25:15:3:0.25正己烷-三氯甲烷-甲醇-水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点。
实施例4：鉴别九味镇心颗粒中的肉桂
称取所述九味镇心颗粒15g，研细，加无水乙醇50ml，浸渍1小时，轻轻振摇。超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取肉桂对照药材1g，加无水乙醇20ml，与所述肉桂的鉴别方法中所制成的供试品溶液4同法制成对照药材溶液。再取肉桂酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液分别为10μl、2μl、2μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为43:8:1石油醚-醋酸乙酯-甲酸为展开剂，所述石油醚的温度为60～90℃，展开，取出，晾干，置于紫外光灯254nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点。
实施例5：鉴别九味镇心颗粒中的天冬
称取所述九味镇心颗粒1g，研细，用5%盐酸的50%乙醇溶液浸泡过夜，水浴上回流水解3小时，放冷后，加5%氢氧化钠溶液中和至pH7.0，用20ml、20ml、20ml三氯甲烷分别提取3次，合并三氯甲烷液，挥干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液。另取天冬对照药材1g，与所述天冬的鉴别方法中所制成的供试品溶液同法制备成对照药材溶液。按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为8:3正己烷-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外光灯254nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点。
实施例6：鉴别九味镇心颗粒中的远志
称取所述九味镇心颗粒3g，研细，加乙醇20ml，加热回流20分钟，滤过，滤液浓缩至约10ml，放冷，加入乙醚30ml，放置使沉淀完全，倾去上清液，沉淀挥干，加10%盐酸溶液10ml，加热回流30分钟，放冷，滤过，沉淀物用甲醇5ml溶解，作为供试品溶液。另取远志对照药材1g，与所述远志的鉴别方法中所制成的供试品溶液同法制备成对照药材溶液。按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为8:4:0.2:0.5三氯甲烷-丙酮-正己烷-醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点。
实施例7：鉴别九味镇心颗粒中的草酸钙
称取所述九味镇心颗粒，置于显微镜下观察，草酸钙簇晶直径20-68μm，棱角锐尖。
实施例8：用HPLC法测定人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量
（一）仪器、药品与试剂的选择
仪器：安捷伦1200高效液相色谱仪；
色谱柱：SUPELCOC
5μ4.6×250mm Cat:504974Col:92334-062（以下简称色谱柱1）；
对照品：人参皂苷Rg1(中国药品生物制品检定所批号110703-201027)；人参皂苷Re（中国药品生物制品检定所批号110754-200320）；
实验样品：由北京北陆药业股份有限公司提供批号为110803、111110、111203；
试剂：甲醇和乙腈均为HPLC专用，其它试剂均为分析纯，水为超纯水。
（二）实验过程
制备对照品溶液：取人参皂苷Rg1和人参皂苷Re对照品，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含0.38mg和0.18mg的对照品溶液。
制备供试品溶液：将所述九味镇心颗粒的样品研细，称取20g，精密陈定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100ml，浸泡过夜，密塞，称定重量，浸泡过夜，加热回流120分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液50ml，蒸干，残渣加水30ml使溶解，用乙醚30ml振摇提取，弃去乙醚液，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次30ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次35ml，合并氨试液，用正丁醇反洗合并的氨试液，用水饱和的正丁醇35ml振摇提取，合并正丁醇溶液，用正丁醇饱和的水30ml洗涤，弃去水液，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液以作为供试品溶液。
按照高效液相色谱法测定，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按下列规定条件进行梯度洗脱、测定；
其中：
流动相A体积百分比与流动相B体积百分比之和为100%；
填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；
流速为1.0ml/min；
流动相A为乙腈，
流动相B为0.4体积%磷酸；
液相色谱仪的波长为203nm；
柱温为40℃；
理论板数按人参皂苷Rg1、Re峰计算均应不低于5000。
本品每1g含人参以人参皂苷Rg1(C42H72O14)和人参皂苷Re(C48H82O18)的总量计，应不得少于0.25mg。在此条件下，人参皂苷Re和人参皂苷Rg1能达到基线分离（色谱图参见图1-1、图1-2、图1-3、图1-4、图1-5、图1-6）。
下述实施例9-16均采用实施例8的HPLC分析方法进行。
实施例9：空白试验
按处方中药味的比例，自配不含人参的群药，按其工艺制成空白制剂，再按供试品溶液制备方法制备并测定，结果空白溶液在人参皂苷Rg1和人参皂苷Re对照品相同保留时间处未显色谱峰，故认为无干扰，色谱图见图2。本实施例说明本发明液相方法可以使得空白溶液在人参皂苷Rg1和人参皂苷Re对照品相同保留时间处未显色谱峰，故认为在两成分色谱峰处无干扰。
实施例10：线性关系考察
分别精密吸取含人参皂苷Rg1（0.3160mg/ml）及人参皂苷Re（0.1498mg/ml）的混合对照品溶液1μl、2μl、4μl、6μl、8μl、10μl，含人参皂苷Rg1（1.5801mg/ml）及人参皂苷Re（0.7490mg/ml）的混合对照品溶液4μl、5μl、8μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，以进样量为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，人参皂苷Rg1的回归方程为：y=276.05x+11.5830，相关系数r为0.99997；人参皂苷Re的回归方程为：y=288.11x+4.7019，相关系数r为0.99998。结果表明，人参皂苷Rg1在0.3160μg～12.6407μg范围内线性关系良好；人参皂苷Re在0.1498μg～5.9904μg范围内线性关系良好，结果见表6和图3-1、图3-2。本发明的液相方法说明人参皂苷Rg1在0.3160μg～12.6407μg范围内线性关系良好；人参皂苷Re在0.1498μg～5.9904μg范围内线性关系良好。
表6人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的线性关系考察
表6是附图3-1和3-2的数据形式或数据基础，说明本发明的液相方法的人参皂苷Rg1在0.3160μg～12.6407μg范围内线性关系良好；人参皂苷Re在0.1498μg～5.9904μg范围内线性关系良好。
实施例11：供试品溶液的稳定性试验
取同一批样品（批号：110803），分别于配制后0、2、4、8、12、24、32小时依法测定。结果表明，供试品溶液在32小时内基本稳定，结果见表7。
表7稳定性试验
表7说明采用本发明的方法配制的供试品溶液在32小时内使用本液相方法检测，检测结果基本稳定。
实施例12：精密度试验
取同一人参皂苷Rg1、Re混合对照品溶液，重复进样6次，结果表明，精密度良好，结果见表8。
表8精密度试验
表8说明本发明的液相方法精密度良好。
实施例13：重复性试验
按本发明实施例8的HPLC检测方法，取含量测定项下对照品，重复测定6次，求得相对标准偏差RSD为0.68%，表明方法重现性较好，结果见表9。
表9重复性试验
表9说明本发明的液相方法重现性好。
实施例14：回收率试验
采用加样回收法，精密称取已知含量的同一批样品（批号：110803，人参皂苷Rg1含量为0.2364mg/g；人参皂苷Re含量为0.1045mg/g）10g，分别精密加入人参皂苷Rg1对照品溶液（2.3285mg/ml）1ml,人参皂苷Re对照品溶液（1.0830mg/ml）1ml,挥干溶剂，再精密加入甲醇100ml，照【含量测定】项下操作，平行制备6份，依法测定，计算回收率，结果见表10、表11。
表10回收率试验（人参皂苷Rg1）
表11回收率试验（人参皂苷Re）
表10和表11说明本发明的液相方法回收率高。
实施例15：耐用性分析
在预实验中发现由于人参皂苷Rg1和人参皂苷Re保留时间比较接近，多数品牌的柱子无法分离，并且在两成分色谱峰周围有2-3个杂质干扰，因此在色谱柱品牌选择上条件极为苛刻。
取同一实验样品（批号：110803），再按本发明实施例8的HPLC检测方法中的前处理方法处理得供试品溶液，取另外两色谱柱，分别依法分离测定，结果均能获得满意的分离效果，结果见表12。
（10.1）色谱柱：SUPELCOC Discovery C185μ4.6×250mm Cat:504971Col:115575-02(以下简称色谱柱2)，色谱图参见图4-1、图4-2、图4-3、图4-4、图4-5。图4-1、图4-2、图4-3、图4-4、图4-5的结果说明采用本发明的色谱柱2能够获得满意的分离效果，并且在两成分色谱峰周围没有杂质干扰。
（10.2）色谱柱：Phenomenex Gemini5μ110A C184.6×250mmP/NO00G-4435-E02(以下简称色谱柱3)，色谱图见图5-1、图5-2、图5-3、图5-4、图5-5。图5-1、图5-2、图5-3、图5-4、图5-5的结果说明采用本发明的色谱柱3能够获得满意的分离效果，并且在两成分色谱峰周围没有杂质干扰。
表12色谱柱考察测定结果
图4和图5的结果说明采用色谱柱SUPELCOC
和Phenomenex Gemini，能够实现人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的基线分离，获得令人满意的分离效果；并且在两成分色谱峰周围没有杂质干扰，解决了现有技术中多数品牌的柱子无法分离，并且在两成分色谱峰周围有2-3个杂质干扰的技术难题。
实施例16：样品测定结果
按本发明实施例8的HPLC检测方法，测定三批样品，结果见表13。
表13样品测定结果
根据上述测定结果，本品每1g含人参以人参皂苷Rg1（C42H72O14）和人参皂苷Re(C48H82O18)的总量计，不得少于0.25mg。表13的结果说明采用本发明的液相方法能够精确测定样品含量，适用于九味镇心颗粒的人参皂苷Rg1（C42H72O14）和人参皂苷Re(C48H82O18)的含量测定。
由上述实施例可知，本发明的药材鉴别方法和含量测定方法，具有以下优点：（1）能够准确无干扰地鉴别九味镇心颗粒中的各种药材；（2）能够使人参皂苷Re和人参皂苷Rg1达到基线分离；（3）在人参皂苷Re和人参皂苷Rg1两成分色谱峰处无干扰；（4）人参皂苷Rg1在0.3160μg～12.6407μg范围内线性关系良好；人参皂苷Re在0.1498μg～5.9904μg范围内线性关系良好；即在九味镇心颗粒中的人参皂苷Rg1和人参皂苷Re含量范围内，采用本液相方法检测线性关系良好；（5）采用本发明的液相方法配制的供试品溶液在32小时内使用本液相方法检测，检测结果基本稳定；（6）本发明的液相方法精密度良好；（7）本发明的液相方法重现性好；（8）本发明的液相方法回收率高；（9）采用本发明的液相方法能够精确测定样品含量，适用于九味镇心颗粒的人参皂苷Rg1（C42H72O14）和人参皂苷Re(C48H82O18)的含量测定。
更重要的是，经过发明人的创造性劳动，在众多的色谱柱品牌和规格的基础上，采用特定的色谱柱SUPELCOC 
和Phenomenex Gemini，实现了人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的基线分离，获得了令人满意的分离效果；并且在两成分色谱峰周围没有杂质干扰。成功解决了现有技术中多数品牌的柱子无法分离上述两种保留时间非常接近的成分，并且在两成分色谱峰周围有2-3个杂质干扰的技术难题。
需要说明的是，上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换、或改进。本发明的保护范围以所附权利要求书为准。
Claims (3)
1.一种九味镇心颗粒的检测方法，所述九味镇心颗粒的成分包括酸枣仁、五味子、延胡索、肉桂、天冬、远志、人参，其特征在于，所述方法检测包括：
（1）对酸枣仁的鉴别方法包括：将所述九味镇心颗粒的样品研细，精密称定称取20g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100ml，密塞，称定重量，浸泡过夜，加热回流2小时，放冷，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液50ml，蒸干，残渣加水30ml使溶解，用乙醚30ml振摇提取，弃去乙醚液，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次30ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次35ml，合并氨试液，用水饱和的正丁醇35ml振摇提取，合并正丁醇溶液，用正丁醇饱和的水30ml洗涤，弃去水液，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液1；
另取酸枣仁对照药材1g，加乙醚20ml，超声处理45分钟，滤过，弃去乙醚，药渣加甲醇30ml，加热回流3小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液1；
再取酸枣仁皂苷A对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液1；
按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液1、对照药材溶液1和对照品溶液1分别为5μl、8μl和2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为4:1:5正丁醇-甲酸-水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，晾干，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（2）对五味子的鉴别方法包括：称取所述九味镇心颗粒的样品5g，研细，加三氯甲烷40ml，置于水浴上加热回流3小时，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液2；
另取五味子对照药材1g，与所述五味子的鉴别方法中所制成的供试品溶液2同法制成对照药材溶液2；
再取五味子乙素对照品，加三氯甲烷制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液2；
按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液2、对照药材溶液2和对照品溶液2分别为4μl、4μl、4μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为15:5:1石油醚-甲酸乙酯-甲酸的上层溶液为展开剂，所述石油醚的温度为30～60℃，展开，取出，晾干，置于紫外光灯254nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（3）对延胡索的鉴别方法包括：称取所述九味镇心颗粒5g，研细，加浓氨试液1ml，三氯甲烷20ml，超声处理40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液3；
另取延胡索对照药材1g，与所述延胡索的鉴别方法中所制成的供试品溶液3同法制成对照药材溶液3；
再取延胡索乙素对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液3；
按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液3、对照药材溶液3和对照品溶液3分别为20μl、5μl、2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为25:15:3:0.25正己烷-三氯甲烷-甲醇-水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（4）对肉桂的鉴别方法包括：称取所述九味镇心颗粒15g，研细，加无水乙醇50ml，浸渍1小时，轻轻振摇。超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液4；
另取肉桂对照药材1g，加无水乙醇20ml，与所述肉桂的鉴别方法中所制成的供试品溶液4同法制成对照药材溶液4；
再取肉桂酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液4；
按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液4、对照药材溶液4和对照品溶液4分别为10μl、2μl、2μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为43:8:1石油醚-醋酸乙酯-甲酸为展开剂，所述石油醚的温度为60～90℃，展开，取出，晾干，置于紫外光灯254nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（5）对天冬的鉴别方法包括：称取所述九味镇心颗粒1g，研细，用5%盐酸的50%乙醇溶液浸泡过夜，水浴上回流水解3小时，放冷后，加5%氢氧化钠溶液中和至pH7.0，用20ml、20ml、20ml三氯甲烷分别提取3次，合并三氯甲烷液，挥干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液5；
另取天冬对照药材1g，与所述天冬的鉴别方法中所制成的供试品溶液5同法制备成对照药材溶液5；
按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5、对照药材溶液5各10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为8:3正己烷-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外光灯254nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（6）对远志的鉴别方法包括：称取所述九味镇心颗粒3g，研细，加乙醇20ml，加热回流20分钟，滤过，滤液浓缩至约10ml，放冷，加入乙醚30ml，放置使沉淀完全，倾去上清液，沉淀挥干，加10%盐酸溶液10ml，加热回流30分钟，放冷，滤过，沉淀物用甲醇5ml溶解，作为供试品溶液6；
另取远志对照药材1g，与所述远志的鉴别方法中所制成的供试品溶液6同法制备成对照药材溶液6；
按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液6和对照药材溶液6各10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为8:4:0.2:0.5三氯甲烷-丙酮-正己烷-醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（7）对人参的鉴别方法包括显微鉴别和液相鉴别，显微鉴别如下：称取所述九味镇心颗粒，置于显微镜下观察；草酸钙簇晶20-68um，梭角尖锐。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，对所述九味镇心颗粒中的人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量测定方法包括：
（1）制备对照品溶液：取人参皂苷Rg1和人参皂苷Re对照品，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含0.38mg和0.18mg的对照品溶液；
（2）制备供试品溶液：将所述九味镇心颗粒的样品研细，称取20g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100ml，浸泡过夜，密塞，称定重量，浸泡过夜，加热回流120～180分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液50ml，蒸干，残渣加水30ml使溶解，用乙醚30ml振摇提取，弃去乙醚液，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次30ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2～3次，每次35ml，合并氨试液，用正丁醇反洗合并的氨试液，用水饱和的正丁醇35ml振摇提取，合并正丁醇溶液，用正丁醇饱和的水30ml洗涤，弃去水液，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液以作为供试品溶液；
（3）按照高效液相色谱法测定，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按下列规定条件进行梯度洗脱、测定；
其中：
流动相A体积百分比与流动相B体积百分比之和为100%；
填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；
流速为1.0ml/min；
流动相A为乙腈，
流动相B为0.4体积%磷酸；
液相色谱仪的波长为203nm；
柱温为40℃；
理论板数按人参皂苷Rg1、Re峰计算均应不低于5000。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法测定中的色谱柱为SUPELCOC或PhenomenexGemini。
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