CN113466355A - 一种青风藤高效液相特征图谱方法的构建 - Google Patents

一种青风藤高效液相特征图谱方法的构建 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种可适用于整体控制青风藤药材、饮片、标准汤剂、提取液、配方颗粒及青风藤其他制剂质量的高效液相特征图谱检测方法。本发明采用高效液相色谱建立了青风藤药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱，并确定了6个特征峰，其中2号峰为青藤碱峰。本发明所建立的HPLC特征图谱检测方法色谱条件梯度简单，峰形好，分离度好，专属性好，精密度高，稳定性、耐用性好，有利于评价青风藤制剂生产全过程相关工艺的科学性、合理性，可用于指导青风藤制剂生产过程工艺参数优化，指导生产制备过程投料、规范生产操作，更能整体控制青风藤药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒及其他青风藤制剂的内在质量，实现全过程质量控制，确保青风藤的临床用药的安全、有效、稳定。

Description

一种青风藤高效液相特征图谱方法的构建
技术领域
本申请涉及一种青风藤药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒和其它青风藤制剂的特征图谱的HPLC检测方法，属于中药检测、鉴别领域。
背景技术
中药特征图谱分析技术是在中药成分研究基础上建立起来的一种综合的、可量化的色谱鉴定手段，可用于整体表征中药的化学成分。它不但可用于整体全面的控制中药及其制剂的质量，而且还是生产标准化（GMP）的准绳，指导中药炮制、提取、制剂等生产过程。
青风藤为防己科植物青藤Sinomenium acutum（Thunb.）Rehd. et Wils.和毛青藤Sinomenium acutum（Thunb.）Rehd. et Wils.var.cinereum Rehd. et Wils.的干燥藤茎。秋末冬初采割，扎把或切长段，晒干。具有祛风湿，通经络，利小便的作用，用于风湿痹痛，关节肿胀，麻痹瘙痒。
青风藤的应用迄今为止已有一千多年的历史，特别是近年来，随着风湿、类风湿病发病率的不断上升，对青风藤的研究逐渐受到重视。综述文献表明，对青风藤的化学成分研究主要集中在青藤碱上。目前，《中国药典》2020年版一部项下收载了采用高效液相色谱法测定青藤碱的含量，尚未建立特征图谱检查方法及标准，无法较全面的评价青风藤的药材质量。鉴于中药特征图谱在中药质量评价方面的优势及对生产过程的指导作用，本研究拟建立统一的青风藤药材、饮片、标准汤剂、提取液、浓缩液、喷干粉、配方颗粒特征图谱测定方法，可用于指导青风藤制剂生产制备过程投料、规范生产操作，评价青风藤制剂生产全过程相关工艺的科学性、合理性，优化青风藤生产过程工艺参数，更能整体控制青风藤药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒及其他青风藤制剂的内在质量，实现全过程质量控制，确保青风藤的临床用药的安全、有效、稳定。
发明内容
本发明提供了一种适用于青风藤药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒及其他青风藤制剂的HPLC特征图谱检测方法，该方法仅仅使用2个色谱梯度，色谱峰峰形好，分离度好，专属性好，精密度高，稳定性、耐用性好，易于实验室间转移，可用于评价青风藤制剂生产全过程工艺的合理性，优化生产过程工艺参数，更能整体控制青风藤药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒及其他青风藤制剂的内在质量，实现全过程质量控制，确保青风藤的临床用药的安全、有效、稳定。
本发明的青风藤制剂全过程、整体的HPLC指纹图谱的检测方法，包括如下操作步骤：
1）参照物溶液的制备：取对照品，溶解，即得对照品参照物溶液，取对照药材，提取，即得对照药材参照物溶液；
2）供试品溶液的制备：取青风藤药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒，经提取，取续滤液，即得；
3）将青风藤药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒、参照物溶液采用高效液相色谱仪分析，得到青风藤药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱。
其中步骤1）的参照物溶液包括对照药材参照物溶液和青藤碱对照品参照物溶液。
其中步骤2）所述提取溶剂是指甲醇、水、甲醇-水溶液中任一一种，加入溶剂量为50-100倍。
进一步的所述提取方法如下：
取青风藤药材粉末适量，研细，取约0.3g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇溶液25ml，超声提取30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得青风藤药材供试品溶液。
取青风藤饮片粉末适量，研细，取约0.3g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇溶液25 ml，超声提取30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得青风藤饮片供试品溶液。
取青风藤标准汤剂冻干粉样品适量，研细，取约0.3g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得青风藤标准汤剂冻干粉供试品溶液。
取青风藤水溶液提取液冻干粉样品适量，研细，取约0.3 g，置具塞锥形瓶中，加入50 %甲醇25 ml，超声处理30 min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得水溶液提取液冻干粉供试品溶液。
取青风藤配方颗粒样品适量，研细，取约0.3g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25ml，超声处理30 min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得青风藤配方颗粒供试品溶液。
其中，HPLC的色谱条件为：以30%四氢呋喃甲醇为流动相A，0.1%磷酸水为流动相B，进行梯度洗脱，流速为0.8~1.2ml/min，柱温为25~35℃，检测波长为312~332nm，进样量为3~12μl。
进一步地，所述流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为320nm，梯度洗脱条件为：0~8min，流动相A的体积分数变化为5%~5%，流动相B的体积分数变化为95%~95%；8-50min，流动相A的体积分数变化为5%~55%，流动相B的体积分数变化为95%~45%。
其中，所用色谱柱为Atlantis T3色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；
进一步地，青风藤药材、饮片、标准汤剂冻干粉、提取液冻干粉、配方颗粒的特征图谱的特征在于：
1）供试品色谱中应呈现6个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的6个特征峰保留时间相对应，其中1个峰应与青藤碱对照品参照物峰的保留时间相对应。
2）与青藤碱参照物峰相对应的峰为S峰，计算峰1、3、4、5、6与S峰的相对保留时间，依次应为：0.558，1.573，1.729，1.790，3.603，且其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内。
本申请的有益效果包括但不限于：
1．本申请首次建立了一种青风藤药材、饮片、标准汤剂、提取液冻干粉、配方颗粒的HPLC特征图谱，可同时对6种有效成分进行鉴别。
2．本发明构建的HPLC特征图谱充分反应样品的特征峰信息，且色谱条件梯度简单，色谱峰峰形好，分离度好、方法稳定、精密度高、专属性、重现性、耐用性好。
3．本发明为青风藤药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒及青风藤其他制剂的质量控制提供一种快速、全面的检测手段。
4．本发明可用于评价青风藤制剂生产全过程相关工艺的科学性，优化生产工艺参数，指导生产过程，并可以实现青风藤制剂全过程质量控制。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为梯度洗脱条件；
图2为表1青风藤配方颗粒特征图谱特征峰相对保留时间；
图3为表2青风藤标准汤剂特征图谱特征峰相对保留时间；
图4为表3 青风藤药材特征图谱特征峰相对保留时间；
图5为表4 青风藤饮片特征图谱特征峰相对保留时间；
图6为青风藤药材特征图谱，峰2：青藤碱；
图7为青风藤饮片特征图谱，峰2：青藤碱；
图8为青风藤标准汤剂特征图谱，峰2：青藤碱；
图9为青风藤配方颗粒特征图谱，峰2：青藤碱。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
仪器与耗材：
Waters e2695高效液相色谱仪，Agilent高效液相色谱仪，CP225D电子天平（赛多利斯科技仪器（北京）有限公司），KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；
试剂：
甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司），四氢呋喃（色谱纯，美国天地有限公司），甲醇（分析级，国药集团化学试剂有限公司），屈臣氏饮用水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。
试药：
青风藤对照药材（中国食品药品检定研究院，121572-201202）；
青藤碱对照品（中国食品药品检定研究院，110885-201703）；
青风藤配方颗粒（山东宏济堂制药集团股份有限公司，批号：2008001、2008002、2008003）。
青风藤药材（批号：QFT-1、QFT-2、QFT-3、QFT-4、QFT-5、QFT-6、QFT-7、QFT-8、QFT-9、QFT-10、QFT-11、QFT-12、QFT-13、QFT-14、QFT-15）。
青风藤饮片（批号：YQFT-1、YQFT-2、YQFT-3、YQFT-4、YQFT-5、YQFT-6、YQFT-7、YQFT-8、YQFT-9、YQFT-10、YQFT-11、YQFT-12、YQFT-13、YQFT-14、YQFT-15）。
青风藤标准汤剂（批号：BQFT-1、BQFT-2、BQFT-3、BQFT-4、BQFT-5、BQFT-6、BQFT-7、BQFT-8、BQFT-9、BQFT-10、BQFT-11、BQFT-12、BQFT-13、BQFT-14、BQFT-15）。
实施例1 本发明检测方法用于青风藤标准汤剂高效液相特征图谱的检测
1.参照物溶液的制备：取青风藤对照药材粉末适量，研细，取约0.3g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇溶液25 ml，超声提取30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得青风藤对照药材参照物溶液。另取青藤碱适量，精密称定，加50%甲醇制成100 µg/ml的青藤碱溶液作为对照品参照物溶液。
2.供试品溶液的制备：取青风藤标准汤剂冻干粉样品适量，研细，取约0.3 g，置具塞锥形瓶中，加入50 %甲醇25 ml，超声处理30 min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以30%四氢呋喃甲醇为流动相A，以0.1%磷酸水为流动相B，按图1中的规定进行梯度洗脱，柱温为30℃，检测波长320nm，流速为1.0ml/min。理论板数按青藤碱峰计算应不低于1500。
4.检测：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.结果：供试品特征图谱中呈现6个特征峰，并与对照药材参照物色谱中的6个特征峰保留时间相对应，其中1个峰应与对照品参照物峰的保留时间相对应。与青藤碱参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，表明该方法可以准确高效的控制青风藤标准汤剂中的特征成分。
实施例2 本发明检测方法用于青风藤标准汤剂高效液相特征图谱的检测
1.参照物溶液的制备：取青风藤对照药材粉末适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇溶液25 ml，加热回流提取30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得青风藤对照药材参照物溶液。另取青藤碱适量，精密称定，加50%甲醇制成50 µg/ml的溶液作为对照品参照物溶液。
2.供试品溶液的制备：取青风藤标准汤剂冻干粉样品适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入30 %甲醇25 ml，加热回流提取30 min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以30%四氢呋喃甲醇为流动相A，以0.1%磷酸水为流动相B，按图1中的规定进行梯度洗脱，柱温为28℃，检测波长312nm，流速为0.9ml/min。理论板数按青藤碱峰计算应不低于1500。
4.检测：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各3μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.结果：供试品特征图谱中呈现6个特征峰，并与对照药材参照物色谱中的6个特征峰保留时间相对应，其中1个峰应与对照品参照物峰的保留时间相对应。与青藤碱参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，表明该方法可以准确高效的控制青风藤标准汤剂中的特征成分。
实施例3 本发明检测方法用于青风藤配方颗粒高效液相特征图谱的检测
1.参照物溶液的制备：取青风藤对照药材粉末适量，研细，取约0.3g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇溶液25 ml，超声提取30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得青风藤对照药材参照物溶液。另取青藤碱适量，精密称定，加甲醇制成10 µg/ml的青藤碱溶液作为对照品参照物溶液。
2.供试品溶液的制备：取青风藤配方颗粒样品适量，研细，取约0.3 g，置具塞锥形瓶中，加入50 %甲醇25 ml，超声处理30 min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以30%四氢呋喃甲醇为流动相A，以0.1%磷酸水为流动相B，按图1中的规定进行梯度洗脱，柱温为30℃，检测波长320nm，流速为1.0ml/min。理论板数按青藤碱峰计算应不低于1500。
4.检测：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.结果：供试品特征图谱中呈现6个特征峰，并与对照药材参照物色谱中的6个特征峰保留时间相对应，其中1个峰应与对照品参照物峰的保留时间相对应。与青藤碱参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，表明该方法可以准确高效的控制青风藤配方颗粒中的特征成分。
实施例4 本发明检测方法用于青风藤配方颗粒高效液相特征图谱的检测
1.参照物溶液的制备：取青风藤对照药材0.3g，加入50%甲醇溶液25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取青藤碱对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1mL含青藤碱100μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
2.供试品溶液的制备：取青风藤配方颗粒适量，研细，取约1g，置具塞锥形瓶中，加入水溶液60mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以30%四氢呋喃甲醇为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按图1中的规定进行梯度洗脱，检测波长330nm，流速为1.1ml/min，柱温为32℃。
4.检测：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.结果：供试品特征图谱中呈现6个特征峰，并与对照药材参照物色谱中的6个特征峰保留时间相对应，其中1个峰应与对照品参照物峰的保留时间相对应。与青藤碱参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，表明该方法可以准确高效的控制青风藤配方颗粒中的特征成分。
实施例5 本发明检测方法用于青风藤药材高效液相特征图谱的检测
1.参照物溶液的制备：取青风藤对照药材0.3g，加入50%甲醇溶液25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取青藤碱对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1mL含青藤碱50μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
2.供试品溶液的制备：取青风藤药材粉末适量，研细，取约1g，置具塞锥形瓶中，加入30%甲醇溶液50mL，回流提取30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以30%四氢呋喃甲醇为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按图1中的规定进行梯度洗脱；检测波长320nm；流速为1.0ml/min；柱温为31℃。
4.检测：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各8μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.结果：供试品特征图谱中呈现6个特征峰，并与对照药材参照物色谱中的6个特征峰保留时间相对应，其中1个峰应与对照品参照物峰的保留时间相对应。与青藤碱参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，表明该方法可以准确高效的控制青风藤药材中的特征成分。
实施例6 本发明检测方法用于青风藤饮片高效液相特征图谱的检测
1.参照物溶液的制备：取青风藤对照药材0.5g，加入50%甲醇溶液25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取青藤碱对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1mL含青藤碱20μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
2.供试品溶液的制备：取青风藤饮片粉末适量，研细，取约0.3g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得青风藤饮片供试品溶液。
3.色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以30%四氢呋喃甲醇为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按图1中的规定进行梯度洗脱；检测波长320nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃。
4.检测：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.结果：供试品特征图谱中呈现6个特征峰，并与对照药材参照物色谱中的6个特征峰保留时间相对应，其中1个峰应与对照品参照物峰的保留时间相对应。与青藤碱参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，表明该方法可以准确高效的控制青风藤饮片中的特征成分。
实施例7 本发明检测方法用于青风藤配方颗粒生产全过程质量控制
所述青风藤配方颗粒生产过程为：青风藤药材炮制成饮片，取青风藤饮片5000g，加水煎煮，滤过，滤液浓缩成清膏，加入辅料适量，喷雾干燥，再加入辅料适量，混匀，制粒，制成1000g，即得。
所述中药特征图谱检测方法包括以下步骤：
1.参照物溶液的制备：取青风藤对照药材0.3g，加入50%甲醇溶液25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取青藤碱对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1mL含青藤碱50μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
2.供试品溶液的制备：
取青风藤药材，粉碎，研细，取约1g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得青风藤药材供试品溶液。
取青风藤饮片，粉碎，研细，取约1g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得青风藤饮片供试品溶液。
取青风藤水煎煮滤液适量，冷冻干燥，冻干粉研细，取约0.3g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得青风藤提取液供试品溶液。
取青风藤清膏适量，冷冻干燥，冻干粉研细，取约0.3g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得青风藤浓缩液供试品溶液。
取青风藤喷雾干燥粉末适量，研细，取约0.3g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得青风藤喷干粉供试品溶液。
取青风藤配方颗粒样品适量，研细，取约0.3g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得青风藤配方颗粒供试品溶液。
3.色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以30%四氢呋喃甲醇为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按图1中的规定进行梯度洗脱；检测波长320nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃。
4.检测：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.结果：供试品特征图谱中呈现6个特征峰，并与对照药材参照物色谱中的6个特征峰保留时间相对应，其中1个峰应与对照品参照物峰的保留时间相对应。与青藤碱参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，表明该方法可以用于青风藤配方颗粒生产全过程质量控制。
实验例1 色谱条件与系统适用性试验
流动相选择：考察了多种不同流动相的分离效果，分别为：乙腈-水梯度洗脱，乙腈-磷酸水梯度洗脱，甲醇-水梯度洗脱，甲醇-磷酸水梯度洗脱，甲醇-0.015mol/L磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾1.58g和磷酸氢二钾0.76g，加水1000ml溶解，混匀，用氢氧化钠试液调节pH值至6.7）梯度洗脱，乙腈-磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾1.58g和磷酸氢二钾0.76g，加水1000ml溶解，混匀，用氢氧化钠试液调节pH值至6.7）梯度洗脱、 乙腈-水溶液梯度洗脱（加入适量三乙胺，并以磷酸调节PH 3.0）、甲醇-水溶液（加入适量三乙胺，并以磷酸调节PH3.0）梯度洗脱、乙腈-水（添加醋酸铵，并以氨水调PH 8.0)梯度洗脱，甲醇-水（添加醋酸铵，并以氨水调PH 8.0)梯度洗脱，甲醇-磷酸盐缓冲液（0.005mol/L磷酸氢二钠溶液，以0.005mol/L的磷酸二氢钠调节pH值至8.0，再以1%三乙胺调节pH值至9.0）梯度洗脱，乙腈-磷酸盐缓冲液（0.005mol/L磷酸氢二钠溶液，以0.005mol/L的磷酸二氢钠调节pH值至8.0，再以1%三乙胺调节pH值至9.0）梯度洗脱，四氢呋喃甲醇-水溶液梯度洗脱，四氢呋喃乙腈-水溶液梯度洗脱，四氢呋喃甲醇-磷酸水溶液梯度洗脱和四氢呋喃乙腈-磷酸水溶液梯度洗脱。结果表明，30%四氢呋喃甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱条件下色谱峰多，且峰形好，故将30%四氢呋喃甲醇-0.1%磷酸水溶液作为青风藤特征图谱测定方法的流动相。
波长选择：考察供试品在210nm、230nm、254nm、260nm、300nm、320nm、350nm、390nm等波长下的吸收光谱，并结合3D色谱图，筛选特征图谱最适宜波长，其中，320nm处色谱峰基线噪音低、响应强，且分离度良好。因此，确定检测波长为320nm。
色谱柱的选择：考察样品在SB-C18、Zorbax Extend C18、Atlantis T3、Kromasil100-5C18等多种色谱柱的分离作用，结果表明，Atlantis T3色谱柱条件下，峰形好，色谱峰多，故将Atlantis T3色谱柱作为青风藤特征图谱测定方法的色谱柱。
实验例2 供试品溶液的制备方式考察
提取方式考察：取青风藤配方颗粒适量，分别进行加热回流和超声处理，测定各标识峰峰面积，结果表明超声和回流提取所获得的特征图谱所呈现的物质信息基本相同，且各峰峰面积差异不大，考虑到超声提取方式更为简便，故选择提取方式为为超声提取。
提取溶剂考察：考察提取溶剂分别为30%甲醇、50%甲醇、80%甲醇时各标识峰的峰面积，结果表明，30%甲醇和80%甲醇提取所获得的色谱图个别峰面积较小，最终选择提取溶剂为50%甲醇。
超声时间考察：设置超声时间分别为20分钟、30分钟、40分钟，考察各标识峰峰面积，结果表明，不同超声时间所获得的特征图谱所呈现的物质信息基本相同，选择超声时间为30分钟。
称样量的考察：分别取约0.1g、0.3g、0.5g青风藤配方颗粒，测定各标识峰峰面积，结果表明，折合成相同取样量后进行峰面积进行比较，标定峰峰面积基本相同，最终选择称样量为0.3g。
实验例3 专属性考察
取青风藤配方颗粒所使用的辅料（糊精）适量，按照供试品溶液的制备方法制备成阴性对照溶液。取青风藤配方颗粒供试品溶液、青风藤对照药材溶液、青藤碱对照品溶液、阴性对照溶液按正文方法获得其色谱图，结果表明阴性对照无干扰，方法专属性良好。
实验例4 重复性考察
取青风藤配方颗粒适量，研细，取约0.5g，精密称定，取6份，按供试品溶液的制备方法制备供试液，注入waters高效液相色谱仪测定。以第2个峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间，并计算RSD。结果显示：6个标识峰的相对保留时间RSD≤1.93%，相对峰面积的RSD≤3.23%，该方法的重复性较好。
实验例5 中间精密度考察
由另一试验人员于不同时间再次进行重复性试验，注入另一waters高效液相色谱仪进行测定。以第2个峰为参照峰，计算各标识峰相对峰面积和相对保留时间，并计算RSD。结果显示：不同仪器测定相对保留时间RSD≤1.49%，不同仪器测定相对峰面积RSD≤5.46%，表明该特征图谱的方法中间精密度良好。
实验例6 稳定性考察
分别在0、2、4、8、12、24h测定同一供试品溶液，记录各标识峰保留时间和峰面积，并计算相对保留时间、相对峰面积、RSD值。结果显示：标识峰的相对保留时间RSD≤0.76%，相对峰面积的RSD≤5.21%，供试品溶液在24小时内保持稳定。
实验例7 耐用性考察
柱温：柱温变化（30℃、31℃）对特征图谱的峰信息、峰形、分离度、标识峰相对保留时间（RSD≤3.07%）没有明显的影响。
流速：流速变化（1.0、1.1ml/min）对特征图谱的峰信息、峰形、分离度、标识峰相对保留时间（RSD≤3.54%）没有明显的影响。
色谱柱：不同Atlantis T3色谱柱对特征图谱的峰信息、峰形、分离度、标识峰相对保留时间没有明显影响（RSD≤1.54%）。
仪器：不同仪器检测（不同Waters高效液相色谱仪）对特征图谱峰信息、峰形、分离度、标识峰相对保留时间没有明显的影响（RSD≤1.76%）。
实验例8 青风藤特征图谱的建立
1.青风藤配方颗粒特征图谱的建立
取3批青风藤配方颗粒，按照拟定的方法制备供试品溶液，再按照拟定的色谱条件进行测定，记录HPLC色谱图，结果见表1。
将3批供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版），进行相似度计算，结果3批青风藤配方颗粒与对照特征图谱的相似度均在0.90以上。
根据考察结果，规定青风藤配方颗粒的特征图谱中应呈现6个共有峰，其中1个峰应与对照品参照物峰的保留时间相对应。与青藤碱参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内。
2.青风藤标准汤剂特征图谱的建立
取15批青风藤标准汤剂，按照拟定的方法本别制备供试品溶液，再按照拟定的色谱条件进行测定，记录HPLC色谱图，结果见表2。
将15批供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版），进行相似度计算，结果15批青风藤标准汤剂与对照特征图谱的相似度均在0.90以上。
根据考察结果，规定青风藤标准汤剂的特征图谱中应呈现6个共有峰，其中1个峰应与对照品参照物峰的保留时间相对应。与青藤碱参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内。
3.青风藤药材特征图谱的建立
取15批青风藤药材粉末，按照拟定的方法制备供试品溶液，再按照拟定的色谱条件进行测定，记录HPLC色谱图，结果见表3。
将15批供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版），进行相似度计算，结果15批青风藤药材与对照特征图谱的相似度均在0.90以上。
根据考察结果，规定青风藤药材的特征图谱中应呈现6个共有峰，其中1个峰应与对照品参照物峰的保留时间相对应。与青藤碱参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内。
4.青风藤饮片特征图谱的建立
取15批青风藤饮片粉末，按照拟定的方法本别制备供试品溶液，再按照拟定的色谱条件进行测定，记录HPLC色谱图，结果见表4。
将15批供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版），进行相似度计算，结果15批青风藤饮片与对照特征图谱的相似度均在0.90以上。
根据考察结果，规定青风藤饮片的特征图谱中应呈现6个共有峰，其中1个峰应与对照品参照物峰的保留时间相对应。与青藤碱参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内。
综上，本发明的青风藤药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒及其他青风藤制剂HPLC特征图谱的检测方法色谱条件梯度少，特征共有峰信息多，色谱峰峰形好，分离度好，专属性好，精密度高，稳定性、重复性、耐用性好，有利于评价青风藤制剂生产全过程相关工艺的科学性、合理性，用于优化生产工艺参数，指导生产制备过程投料、规范生产操作，更能整体控制青风藤药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒及其他青风藤制剂的内在质量，实现全过程质量控制，确保青风藤的临床用药的安全、有效、稳定，且本发明针对分离难度较大的生物碱类化合物建立特征图谱，在行业属于先进水平，对其他研究提供参考作用。
以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种青风藤药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC的特征图谱检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：
1）参照物溶液的制备：取对照品，溶解，即得对照品参照物溶液，取对照药材，提取，即得对照药材参照物溶液；
2）供试品溶液的制备：取青风藤药材、饮片、标准汤剂、提取液冻干粉、配方颗粒，经提取，取续滤液，即得；
3）将青风藤药材、饮片、标准汤剂、提取液冻干粉、配方颗粒、参照物溶液采用高效液相色谱仪分析，得到青风藤药材、饮片、标准汤剂、提取液冻干粉、配方颗粒的HPLC特征图谱。
2.根据权利要求1所述的参照物溶液，其特征在于参照物溶液包括对照药材参照物溶液和青藤碱对照品参照物溶液。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2）所述提取溶剂是指甲醇、水、甲醇-水溶液中任一一种，加入溶剂量为50-100倍。
4.根据权利要求1、3所述的检测方法，其特征在于：步骤2）所述提取方法如下：
取青风藤药材粉末适量，研细，取约0.3g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇溶液25 ml，超声处理30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得青风藤药材供试品溶液；
取青风藤饮片粉末适量，研细，取约0.3g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇溶液25 ml，超声处理30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得青风藤饮片供试品溶液；
取青风藤标准汤剂冻干粉样品适量，研细，取约0.3g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得青风藤标准汤剂供试品溶液；
取青风藤水溶液提取液冻干粉样品适量，研细，取约0.3g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25 ml，超声处理30 min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得水溶液提取液冻干粉供试品溶液；
取青风藤配方颗粒样品适量，研细，取约0.3g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25 ml，超声处理30 min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得青风藤配方颗粒供试品溶液。
5.根据权利要求1所述的青风藤药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱的检测方法，其特征在于，所述HPLC的色谱条件为：以30%四氢呋喃甲醇为流动相A，0.1%磷酸水为流动相B，进行梯度洗脱，流速为0.8~1.2ml/min，柱温为25~35℃，检测波长为312~332nm，进样量为3~12μl。
6.根据权利要求1和5所述的HPLC特征图谱的检测方法，其特征在于，所述HPLC的色谱条件为：流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为320nm。
7.根据权利要求1和5所述的青风藤药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱的检测方法，其特征在于梯度洗脱条件为：0~8min，流动相A的体积分数变化为5%~5%，流动相B的体积分数变化为95%~95%；8-50min，流动相A的体积分数变化为5%~55%，流动相B的体积分数变化为95%~45%。
8.根据权利要求1、5、6和7所述的HPLC特征图谱检测方法，其特征在于：所用色谱柱为Atlantis T3色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）。
9.根据权利要求1、5、6、7和8所述的检测方法，其特征在于：青风藤药材、饮片、标准汤剂冻干粉、提取液冻干粉、配方颗粒的特征图谱的特征在于：
1）供试品色谱中应呈现6个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的6个特征峰保留时间相对应，其中1个峰应与青藤碱对照品参照物峰的保留时间相对应；
2）与青藤碱参照物峰相对应的峰为S峰，计算峰1、3、4、5、6与S峰的相对保留时间，依次应为：0.558，1.573，1.729，1.790，3.603，且其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内。
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