CN112180022B - 一种炒蒺藜或蒺藜中蒺藜皂苷k含量的测定方法 - Google Patents

一种炒蒺藜或蒺藜中蒺藜皂苷k含量的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种炒蒺藜或蒺藜中蒺藜皂苷K含量的测定方法，包括供试品溶液制备、对照品溶液制备、检测和分析步骤，本发明首次利用超高效液相色谱仪和蒸发光散射检测(UPLC‑ELSD)检测炒蒺藜或蒺藜标准汤剂和配方颗粒中蒺藜皂苷K的含量。本发明的检测方法灵敏度高，重复性好，回收率高。本发明建立了以蒺藜皂苷K为检测指标的检测方法，对于炒蒺藜或蒺藜标准汤剂和配方颗粒的质量控制研究具有重要意义。

Description

一种炒蒺藜或蒺藜中蒺藜皂苷K含量的测定方法
技术领域
本发明属于中药有效成分检测技术领域，具体涉及一种测定炒蒺藜或蒺藜中蒺藜皂苷K的方法。
背景技术
蒺藜为蒺藜科蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果实，具有治疗心血管系统疾病、抗衰老、降血糖、降血脂、性强壮等作用。炒蒺藜或蒺藜是经炮制得到的蒺藜炮制品。皂苷类成分是蒺藜的主要活性成分，根据文献研究(杨俊英，蒺藜果呋甾皂苷的分离鉴定及含量测定研究[D]，长春中医药大学，2009)发现蒺藜水煎剂中的皂苷是降血糖的活性物质，其降糖机理与促进肝糖元的合成，保护、促进胰岛细胞分泌胰岛素有关，而蒺藜所含的甾体皂苷分为螺甾皂苷和呋甾皂苷两大类。螺甾烷型极性小，易结晶；呋甾烷型水溶性较大，不易结晶，而蒺藜皂苷K属于呋甾皂苷。
目前对蒺藜的质量控制研究中，对总皂苷的测定研究较多，多采用测定总皂苷的紫外分光光度法，但该方法专属性有限，结果准确度不高，另外，还有采用蒸发光检测法测定蒺藜中单个甾体皂苷成分或皂苷元的研究有少许报道，如解生旭等用蒸发光检测法测定蒺藜中蒺藜皂苷D的含量(解生旭等，RP-HPLC蒸发光检测法测定蒺藜中蒺藜皂苷D的含量[J]，中成药，2009，31(03):434-436；王桂玲等，HPLC-蒸发光散射检测法测定蒺藜中蒺藜皂苷A[J]，中草药，2005，36(09):1406-1407)以及专利文献1(CN101953868A)。以往涉及蒺藜的检测以分单体为主，以质谱、核磁、红外等确认构型，以发现新化合物为主要目标，缺少应用层面简单快捷准确有效的分析研究。由于蒺藜皂苷有多种构型，每个构型的活性研究目前还不够透彻，目前研究人员主要关注的是醇提和小极性溶剂提取的小分子物质，对大分子及其水溶性成分研究关注度不够高，醇提和水提提取都会得一定量的蒺藜皂苷，但物质组成，干扰成分，大不相同，水提相对与醇提而言，得到的蒺藜提取物含有众多大分子和水溶性成分，组成更加复杂，给分析带来了难度。另外蒺藜皂苷各构型之间物理化学性质上也存在差异，不同构型的蒺藜检测方法之间可借鉴性低，不确定性大。
蒺藜配方颗粒是以单味蒺藜药材(蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果实经炮制后按标准汤剂的主要质量指标加工制成的配方颗粒)投料，经过规范提取(一般以水提为主)、浓缩、干燥和制粒而成，具有无需煎煮，易于调剂、贮存和服用方便等优点。然而现阶段由于缺少有效的质量标准和质量控制体系，导致市场上同一配方颗粒的质量不一，监管难度加大。2016年国家药典委员会发布了《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》，该技术要求提出将标准汤剂作为中药配方颗粒是否与临床汤剂基本一致的标准参照物，并指出中药材、饮片、中间体和配方颗粒的特征或指纹图谱应具有相关性。标准汤剂作为配方颗粒的基准物质，对配方颗粒的质量控制起到了标准参照的作用。
目前鲜见蒺藜药材、标准汤剂、中间体和配方颗粒指纹图谱相关性的研究。并且研究人员对蒺藜的醇提和极性溶剂提取的物质关注比较多，对以水提得到的提取物及其制剂的研究也比较少。本发明人对炒蒺藜或蒺藜标准汤剂中蒺藜提取物进行了检测，发现蒺藜皂苷D含量极低，难以定量，而蒺藜皂苷K含量较高。综合考虑，蒺藜皂苷K具有专属性，有较好水溶性，可定量性以及其所属皂苷为指标性成分，最终选择蒺藜皂苷K作为含量测定控制中指标性成分，并建立了其超高效液相-蒸发光散射检测方法，该方法准确、快速、重现性好，尤其适用于对炒蒺藜或蒺藜标准汤剂及其配方颗粒的蒺藜皂苷K含量测定。这对于蒺藜的质量控制研究具有重要意义。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供一种炒蒺藜或蒺藜中蒺藜皂苷K的测定方法，该方法准确、快速、高效、重现性好，样品前处理简便，尤其适用于炒蒺藜或蒺藜标准汤剂及其配方颗粒的蒺藜皂苷K含量测定。
用于解决问题的方案
在一个技术方案中，本发明提供了一种炒蒺藜或蒺藜中蒺藜皂苷K含量的测定方法，所述方法包括供试品溶液制备、对照品溶液制备、检测和分析步骤，
其中，所述供试品溶液的制备包括：
将炒蒺藜或蒺藜样品精密称定，然后与第一溶剂混合，称定重量，加热回流，放冷，再称定重量，可选地用第二溶剂补足减失的重量，过微孔滤膜，取续滤液，即得；
所述检测采用超高效液相色谱仪和蒸发光散射检测器进行测定。
在一个实施方式中，所述炒蒺藜或蒺藜样品选自炒蒺藜或蒺藜标准汤剂冻干粉、炒蒺藜或蒺藜配方颗粒或者炒蒺藜或蒺藜药材或饮片。
在另一个实施方式中，所述第一溶剂、所述第二溶剂分别独立地选自甲醇或甲醇的水溶液，优选地选自甲醇或80％甲醇的甲醇水溶液，进一步优选地所述第一溶剂和所述第二溶剂均为甲醇。
在另一个实施方式中，所述加热回流时间为：15-60min，所述加热回流温度为70～100℃。
在另一个实施方式中，所述炒蒺藜或蒺藜样品与所述第一溶剂的质量体积比为：1g：20-180ml。
在另一个实施方式中，所述供试品溶液的制备包括：
取炒蒺藜或蒺藜标准汤剂冻干粉，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇或甲醇水溶液，密塞，称定重量，加热回流，放冷，再称定重量，用甲醇或甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过微孔滤膜，取续滤液，即得；
或者,
取炒蒺藜或蒺藜配方颗粒适量，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇或甲醇水溶液，密塞，称定重量，加热回流，放冷，再称定重量，用甲醇或甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过微孔滤膜，取续滤液，即得；
或者，
取炒蒺藜或蒺藜药材或饮片适量，打粉，过筛，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇或甲醇水溶液，密塞，称定重量，加热回流，放冷，再称定重量，用甲醇或甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过微孔滤膜，取续滤液，即得。
在另一个实施方式中，所述对照品溶液制备包括，取蒺藜皂苷K对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含蒺藜皂苷K 0.1mg的溶液，摇匀，即得。
在另一个实施方式中，所述超高效液相色谱仪色谱的条件为：色谱柱：C18柱，优选色谱柱包括Eclipse Plus C18(Agilent Corporation，2.1×100mm，1.8μm)，Zobax EcipsePlus C18(2.1×100mm，1.8μm)、Thermo Acclaim RLSC polar advantage(100×2.1mm，2.2μm)；流动相为：体积比为50-65:35-50的甲醇和水等度洗脱，优选地所述流动相为：体积比为58:42的甲醇和水等度洗脱；流速为0.25～0.35ml/min，柱温为30～40℃。
在另一个实施方式中，所述蒸发光散射检测器的条件为：气体流速：1.8L/min～2.2L/min；漂移管温度为：85～95℃。
在另一个实施方式中，所述分析是以外标两点法进行的定量分析，以已知浓度的对照品溶液色谱峰面积的LN值比对其相应进样量的LN值进行回归分析，得到标准曲线，对供试品溶液进行测定，测得检出供试品溶液中蒺藜皂苷K色谱峰面积，代入标准曲线，求得炒蒺藜或蒺藜中蒺藜皂苷K的含量。
在另一个技术方案中，本发明提供了蒺藜皂苷K在作为蒺藜或蒺藜药材、标准汤剂或配方颗粒质量控制的检测指标的用途。
发明的效果
本发明发现蒺藜皂苷K可以作为炒蒺藜或蒺藜药材、标准汤剂或配方颗粒质量控制的检测指标，本发明首次利用超高效液相色谱仪和蒸发光散射检测(UPLC-ELSD)检测炒蒺藜或蒺藜标准汤剂和颗粒中蒺藜皂苷K的含量，本发明质量指标控制更加明确，供试品处理简单快捷，检验周期短，本发明的检测方法灵敏度高，重复性好，回收率高。本发明建立了以蒺藜皂苷K为检测指标的检测方法，对于炒蒺藜或蒺藜标准汤剂和颗粒的质量控制研究具有重要意义。
附图说明
图1蒺藜皂苷K对照品的线性关系图
图2炒蒺藜标准汤剂专属性图
图3炒蒺藜标准汤剂延迟性图
图4蒺藜皂苷K对照品的线性关系图
图5炒蒺藜配方颗粒专属性图
图6炒蒺藜配方颗粒延迟性图
具体实施方式
为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有定义，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。
本发明提供了一种炒蒺藜或蒺藜中蒺藜皂苷K含量的测定方法，在一个实施方式中，所述炒蒺藜或蒺藜选自炒蒺藜或蒺藜标准汤剂、炒蒺藜或蒺藜配方颗粒或者炒蒺藜或蒺藜药材或饮片。本发明进一步提供了一种炒蒺藜或蒺藜标准汤剂或配方颗粒中蒺藜皂苷K含量的测定方法。
炒蒺藜或蒺藜标准汤剂是指经过标准化工艺(根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》)制备而成的单味蒺藜水煎剂。以往，学术界更加关注醇提和小极性溶剂提取的小分子物质，对大分子及其水溶性成分研究关注度不够高。本发明对蒺藜水提得到的提取物进行了研究，并对炒蒺藜或蒺藜标准汤剂的水提得到的提取物进行含量检测，发现蒺藜皂苷D含量极低，难以定量，蒺藜皂苷K含量较高。蒺藜皂苷K(Terrestrosin K,cas:193605-07-1)是一种从蒺藜中提取的呋甾皂苷。由于蒺藜皂苷K具有专属性，有较好水溶性，可定量性以及其所属皂苷为活性成分，因此本发明人选择蒺藜皂苷K作为炒蒺藜或蒺藜标准汤剂或配方颗粒含量测定控制中指标性成分。
本发明提供的测定方法包括供试品溶液制备、对照品溶液制备、检测和分析步骤，
其中，所述供试品溶液的制备包括：
将炒蒺藜或蒺藜样品精密称定，然后与第一溶剂混合，称定重量，加热回流，放冷，再称定重量，可选地用第二溶剂补足减失的重量，过微孔滤膜，取续滤液，即得。
在本发明中供试品溶液的制备过程由于涉及蒺藜皂苷K的提取，因此各步骤对于检测结果的影响相对较大。采用本发明所述的加热回流的提取方式有利于蒺藜皂苷K的提取，相对于其他的提取方式，如超声或震荡，加热回流处理获得的蒺藜皂苷K含量高，提取更充分。进一步地，本发明加热回流的70～100℃，加热回流时间为：15-60min，更进一步地，加热回流时间为30-60min，综合考虑检验周期和提取充分等因素，更优选加热回流时间为30min。本发明的供试品处理相对简单快捷。如果在供试品溶液的制备过程中增加常规的萃取或者过柱等除杂工艺，会导致有效成分损失较多，方法可操作性变差，样品含测结果平行性差。
在一个实施方式中，加热回流放冷后如果称定重量减少，则需用第二溶剂补足减失的重量。根据蒺藜皂苷K的溶解性可以选择合适的提取溶剂即第一溶剂和复溶溶剂即第二溶剂，相对于水而言，甲醇或甲醇水溶液提取蒺藜皂苷K的含量更高，进一步地，所述第一溶剂和所述第二溶剂均为甲醇。在一个实施方式中采取甲醇提取-甲醇复溶的方法，相对于水提取-甲醇复溶、正丁醇提取-甲醇复溶等方式获得的蒺藜皂苷K的含量高。进一步地，炒蒺藜或蒺藜样品与第一溶剂的质量体积比为：1g：20-180ml，即可以实现提取充分且满足检测的浓度要求，更进一步地，炒蒺藜或蒺藜样品与第一溶剂的质量体积比为：1g：70-180ml，在本发明一个具体实施方式中，0.3g炒蒺藜或蒺藜样品对应的提取溶剂甲醇的体积为25ml。在另一个实施方式中，在供试品溶液的制备过程中如减少称样量和第一溶剂的用量，可实现直接进行提取，无需蒸干复溶，也就是说供试品溶液的制备包括：将炒蒺藜或蒺藜样品精密称定，然后与第一溶剂混合，称定重量，加热回流，放冷，过微孔滤膜，取续滤液，即得。
在一个实施方式中，对于炒蒺藜或蒺藜标准汤剂样品，所述供试品溶液的制备包括：取炒蒺藜或蒺藜标准汤剂冻干粉，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇，密塞，称定重量，加热回流，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过微孔滤膜优选过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。进一步地，炒蒺藜或蒺藜标准汤剂与甲醇的质量体积比为：1g：70-90ml。
在另一个实施方式中，对于炒蒺藜或蒺藜配方颗粒样品，所述供试品溶液的制备包括：取炒蒺藜或蒺藜配方颗粒适量，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇水溶液，密塞，称定重量，加热回流，放冷，再称定重量，用甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过微孔滤膜优选过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。进一步地，炒蒺藜或蒺藜配方颗粒与甲醇水溶液的质量体积比为：1g：40-60ml。在一个具体实施方式中，所述甲醇水溶液为甲醇含量为80％的甲醇水溶液。
在另一个实施方式中，对于炒蒺藜或蒺藜药材或饮片样品，所述供试品溶液的制备包括：取炒蒺藜或蒺藜药材或饮片适量，打粉过筛(比如过三号筛)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇，密塞，称定重量，加热回流，放冷，再称定重量，用甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过微孔滤膜优选过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。进一步地，炒蒺藜或蒺藜药材或饮片与甲醇的质量体积比为：1g：20-40ml。
在本发明的一个实施方式中，超高效液相色谱仪(UPLC)色谱柱为C18柱，即以十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，优选色谱柱包括Eclipse Plus C18(AgilentCorporation，规格为2.1×100mm，1.8μm)，Zobax Ecipse Plus C18(规格为2.1×100mm，1.8μm)、Thermo Acclaim RLSC polar advantage(规格为2.1×100mm，2.2μm)，本发明人发现上述三种色谱柱的分离效果较好，保留时间适中，色谱柱对样品的测定结果影响较小，基于耐用性考量，优选地，采用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱进行炒蒺藜或蒺藜标准汤剂冻干粉或配方颗粒的含量测定。UPLC与HPLC相比，分析周期短，分离度更高，本发明人发现在对蒺藜皂苷K的检测中UPLC检测周期是HPLC的三分之一左右，大大提高了研究检测的精度和效率，另外UPLC还可分离出HPLC包峰的两个成分。在一个具体实施方式中，本发明可采用Waters-ACQUIYT-UPLC-H-Class的超高效液相色谱系统。
在一个实施方式中，流动相为：体积比为50-65:35-50的甲醇和水等度洗脱，优选地，所述流动相为：体积比为58:42的甲醇和水等度洗脱。相较于梯度洗脱，等度洗脱适用性更好，重现性更佳，总体方法周期较短。等度洗脱采用恒比例流动性进行洗脱，可采用控制比例阀或者配成单通道流动相进行测定，使得方法不仅适用于UPLC，还可转移到HPLC上适用，不仅适用于常规液相，还可适用于硬件配备欠缺的单通道低配置液相色谱仪，大大排除了不同仪器，比例阀误差等干扰，保证了方法的耐用性，由于等度洗脱恒定比例，不用梯度洗脱再平衡，大大缩减了分析周期。从色谱峰分离效果考虑，本发明优选的流速为0.25～0.35ml/min，柱温为30～40℃，更进一步地，考虑到分析所需时间，流速优选为0.30ml/min，柱温优选为35℃。
为了实现色谱峰分离效果好且同时不影响含量测定的结果，优选地，在本发明的一个实施方式中，本发明所用的蒸发光散射检测器(奥泰蒸发光检测器6000型号)的条件为：气体流速：1.8L/min～2.2L/min；漂移管温度为：85～95℃，如果气体流速或漂移管温度不在此范围，会导致基线噪音增大，信噪比变高，影响最终结果的测定。
在另一个实施方式中，本发明的对照品溶液制备包括，取蒺藜皂苷K对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含蒺藜皂苷K 0.08-0.15mg的溶液，摇匀，即得。进一步优选地，每1ml甲醇含蒺藜皂苷K 0.1mg。
在另一个实施方式中，本发明的分析步骤是以外标两点法进行的定量分析，以已知浓度的对照品溶液色谱峰面积的LN值比对其相应进样量的LN值进行回归分析，得到标准曲线，对供试品溶液进行测定，测得检出供试品溶液中蒺藜皂苷K色谱峰面积，代入标准曲线，求得炒蒺藜或蒺藜中蒺藜皂苷K的含量。
采用本发明的方法，线性结果好，精密度高，准确度高，重复性好。
实施例
以下将结合具体的实施例来进一步阐述本发明中的技术方案。应当理解的是，下列实施例仅用于解释和说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。
实施例1：炒蒺藜标准汤剂中蒺藜皂苷K的测定
(一)仪器与试药
Waters-ACQUIYT-UPLC-H-Class，超高效液相色谱系统；waters-Quaternary-Solvent-Manager-四元泵；Sample-manager-FTN自动进样器；Waters-UPLC-PDA检测器；Empower-3色谱工作站；KQ-250E超声清洗机(昆山超声仪器有限公司)；电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；控温水浴锅(南通华泰实验仪器有限公司)；HY-4振荡器(金坛市科兴仪器厂)；蒸发光检测器(奥泰6000)；纯水系统(Sartorius公司)；TGL-16C型离心机(上海安亭科学仪器厂)；甲醇(色谱纯，Thermo Fisher公司)；水为超纯水；其它试剂均为分析纯。
本发明色谱条件：色谱柱：Eclipse Plus C18(Agilent Corporation，2.1×100mm，1.8μm)；流动相为：V(甲醇)∶V(水)＝58：42等度洗脱；流速为0.30mL/min，柱温为35℃。蒸发光散射检测器条件为：气体流速：2.0L/min；漂移管温度为：90℃。
炒蒺藜标准汤剂冻干粉为江阴天江药业有限公司依据《医疗机构中药煎药室管理规范》国中医药发(2009)3号文，自己制备。制备过程包括将药材经过炮制，加水浸泡，水煎煮1～2次，过滤得到药液，低温浓缩后冷冻干燥即得。
(二)对照品来源及制备
蒺藜皂苷K(编号：112023-201601)购于中国食品药品检定研究研究院，供含量测定用，含量以90.6计，使用前无须处理。取蒺藜皂苷K对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含蒺藜皂苷K 118.87μg的溶液，摇匀，即得。
(三)供试品溶液的制备
(1)供试品制备方法筛选
方法1：取炒蒺藜标准汤剂冻干粉约0.5g，精密加入100mL水溶液，加热回流60min，放冷，过滤，用少量水洗涤残渣，合并过滤液，蒸干，用甲醇溶解，转移至25mL容量瓶，定容至刻度线，摇匀，过微孔滤膜，取续滤液，即得。
方法2：取炒蒺藜标准汤剂冻干粉约0.5g，精密加入100mL甲醇溶液，加热回流60min，放冷，过滤，用少量甲醇洗涤残渣，合并过滤液，蒸干，残潼加甲醇适量使溶解，转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
方法3：取炒蒺藜标准汤剂冻干粉约0.5g，精密加入100mL正丁醇溶液，加热回流60min，放冷，过滤，用少量甲醇洗涤残渣，合并过滤液，蒸干，用甲醇溶解，转移至25mL容量瓶，定容至刻度线，摇匀，过微孔滤膜，取续滤液，即得。
方法4：取炒蒺藜标准汤剂冻干粉约0.5g，精密加入100mL水溶液，加热回流60min，放冷，过滤，用少量甲醇洗涤残渣，合并过滤液，蒸干，用50mL蒸馏水复溶，用水饱和正丁醇提取三次，每次50ml，合并正丁醇液，蒸干，残潼加甲醇适量使溶解，转移至25ml量瓶中，加甲醇定容至刻度线，摇匀，过微孔滤膜，取续滤液，即得。
方法5：取炒蒺藜标准汤剂冻干粉约0.5g，精密加入100mL甲醇溶液，加热回流60min，放冷，用水饱和正丁醇提取三次，每次100ml，合并正丁醇液，蒸干，残潼加甲醇适量使溶解，转移至25ml量瓶中，加甲醇定容至刻度线，摇匀，过微孔滤膜，取续滤液，即得。
方法6：取炒蒺藜标准汤剂冻干粉约0.5g，精密加入100mL水溶液，加热回流60min，放冷，过D101大孔树脂，用水除杂至无色，用100mL80％甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残潼加甲醇适量使溶解，转移至25ml量瓶中，加甲醇定容至刻度线，摇匀，过微孔滤膜，取续滤液，即得。
方法7：取炒蒺藜标准汤剂冻干粉约0.5g，精密加入100mL甲醇溶液，加热回流60min，放冷，过滤，用少量甲醇洗涤残渣，合并过滤液，蒸干，用50mL蒸馏水复溶，过D101大孔树脂，用水除杂至无色，用100mL80％甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残潼加甲醇适量使溶解，转移至25ml量瓶中，加甲醇定容至刻度线，摇匀，过微孔滤膜，取续滤液，即得。
采用前述色谱条件测定蒺藜皂苷K的含量。方法1-7相应的蒺藜皂苷K含量测定结果参见表1。
表1不同制备方法对蒺藜皂苷K含量测定的影响
Figure BDA0002117107410000061
通过表1可以发现，甲醇提取-甲醇复溶的方法测得的蒺藜皂苷K含量最高，而操作步骤的增多会使得成分损失较多，样品含测结果平行性差，方法可操作性变差。综合考虑，本发明选择甲醇提取-甲醇复溶的方式。
(2)不同提取溶剂的考察
考察方法：取炒蒺藜标准汤剂冻干粉约0.3g，平行5份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水、30％甲醇、60％甲醇、80％甲醇和甲醇各25ml，密塞，称定重量，分别进行超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用与提取溶剂相同的溶剂补足减失的重量，摇匀，过0.22μm的微孔滤膜，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液2.0μl，注入液相色谱仪，按前述色谱条件，得蒺藜皂苷K含量，结果见表2。
表2不同提取溶剂对蒺藜皂苷K含量测定的影响
Figure BDA0002117107410000071
通过表2可知甲醇提取蒺藜皂苷K含量最高，因此优选的提取和复溶溶剂为甲醇。水和30％的甲醇的提取效率较低，峰面积过低无法计算。
(3)不同提取方法的考察
考察方法：取炒蒺藜标准汤剂冻干粉约0.3g，平行3份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)、加热回流(90℃)、振摇提取30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.22μm的微孔滤膜，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液2.0μl，注入液相色谱仪，按前述色谱条件测定，得蒺藜皂苷K含量，结果见表3。
表3不同提取方法对蒺藜皂苷K含量测定的影响
Figure BDA0002117107410000072
Figure BDA0002117107410000081
通过表3可知加热回流提取蒺藜皂苷K含量最高，说明提取更充分，为保证提取完全，因此确定提取方式加热回流。
(4)不同提取溶剂量的考察
考察方法：取炒蒺藜标准汤剂冻干粉约0.3g，平行三份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml、50ml、100ml，密塞，分别加热回流30min，加热温度为90℃，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.22μm的微孔滤膜，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试品溶液2.0μl，注入液相色谱仪，按前述色谱条件测定，得蒺藜皂苷K含量，结果见下表4。
表4不同提取溶剂量对蒺藜皂苷K含量测定的影响
Figure BDA0002117107410000082
由表4可知，提取溶剂为25ml和50ml时，含量相近，说明已经提取充分，溶剂量为100ml时，由于浓度过低，不易检测，综合实际情况，优选的溶剂量为25ml。
(5)不同提取时间的考察
考察方法：取炒蒺藜标准汤剂冻干粉约0.3g，平行4份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，分别加热回流(90℃)15min、30min、45min、60min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.22μm的微孔滤膜，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试品溶液2.0μl，注入液相色谱仪，按前述色谱条件测定，得蒺藜皂苷K含量，结果见表5。
表5不同提取时间对蒺藜皂苷K含量测定的影响
Figure BDA0002117107410000083
Figure BDA0002117107410000091
由表5可知，加热回流时间对含量检测的影响不大，加热回流15min已经提取充分，综合考虑检验周期和提取充分等因素，确认提取时间为30min。
最终确定供试品制备方法(下文计为“方法A”)为：取炒蒺藜标准汤剂冻干粉约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，取续滤液，即得。
(四)方法学验证
(1)线性
分别精密吸取蒺藜皂苷K对照品溶液(118.87μg/ml)，0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以峰面积积分值LN值为纵坐标，蒺藜皂苷K进样量(μg)LN值为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程：Y＝1.7443X+16.5087，R＝0.9999，结果见表6，图谱见图1。
表6蒺藜皂苷K对照品峰面积积分值与进样量关系
Figure BDA0002117107410000092
(2)精密度试验
1)仪器精密度试验
精密吸样品溶液2μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，连续进样6次，记录其峰面积测量值，计算相对标准偏差，结果见下表。
表7仪器精密度试验
Figure BDA0002117107410000101
结果：仪器精密度良好(RSD％＝2.69％)。
2)重复性试验
平行取6份炒蒺藜标准汤剂冻干粉约0.3g，精密称定，分别按前述方法A制成样品供试液，分别进样2.0μl，测定蒺藜皂苷K峰面积值，计算其含量及RSD，结果见表8。
表8炒蒺藜标准汤剂样品的重复性试验
Figure BDA0002117107410000102
结果：重复性试验(RSD％＝1.93％)良好。
3)中间精密度
取炒蒺藜标准汤剂冻干粉2份(每份约0.3g)，分别由两个实验员按前述方法A制成样品供试液，分别于不同时间在同一台仪器上分别进样2.0μl，测定蒺藜皂苷K的峰面积值，计算蒺藜皂苷K含量，计算其RSD，结果见表9。
表9中间精密度试验
Figure BDA0002117107410000103
Figure BDA0002117107410000111
结果：中间精密度(RSD％＝1.65％)良好。
(3)准确度试验
取已知含量的炒蒺藜标准汤剂冻干粉样品0.15g(含量为0.38％，江阴天江药业有限公司制)，共6份，精密称定，分别加入适量蒺藜皂苷K对照品，按前述方法A制成加样回收供试品溶液，按前述色谱条件，分别进样2.0μl，以式(1)计算回收率，RSD，结果见下表。
回收率(％)＝(测得量(mg)-样品中含量(mg))/加入对照品量(mg)×100％
式(1)
表10蒺藜皂苷K准确度试验
Figure BDA0002117107410000112
结果准确度符合要求，说明方法可行。
(4)专属性试验
将空白溶剂甲醇、蒺藜皂苷K对照品溶液、供试品溶液进样，记录图谱，结果见图2，由图2可以看出，空白溶剂甲醇不干扰蒺藜皂苷K的测定，说明本发明定量分析方法的选择性良好。
(5)延迟性试验
按照方法A制备供试品溶液，按前述色谱条件，进样2.0μl，进样分析周期延迟到20min，观察目标峰出峰后后续峰有无干扰。结果参见图3。
由图3可知，延长进样时间至20min，无杂质峰干扰测定。
(6)耐用性试验
1)稳定性试验
取炒蒺藜标准汤剂冻干粉样品1份(约0.3g)，按前述方法A制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12h进样2.0μl，测定峰面积值，计算其RSD，结果见表11。
表11稳定性试验测定结果
Figure BDA0002117107410000121
结果：样品供试液在12小时内稳定性良好。
2)不同流速考察
取炒蒺藜标准汤剂冻干粉样品1份(约0.3g)(批号：DG 1705510，江阴天江药业有限公司制)，按前述方法A制备供试品溶液，考察0.25ml/min、0.30ml/min、0.35ml/min三个流速，其余条件同(一)仪器与试药。结果表明三种流速下色谱峰分离效果均较好。流速为0.30ml/min时分析所需时间适中，本发明选择流速为0.30ml/min。结果见表12。
表12不同流速考察
Figure BDA0002117107410000122
结果：流速在每分钟0.25ml～0.35ml波动，色谱峰分离效果均较好。
3)柱温考察
取炒蒺藜标准汤剂冻干粉样品1份(约0.3g)(批号：DG 1705510，江阴天江药业有限公司制)，按前述方法A制备供试品溶液，考察30℃、35℃、40℃三个柱温，其余条件同(一)仪器与试药。结果表明三种柱温下色谱峰分离效果均较好。柱温为35℃时分析所需时间适中，本实验选择柱温为35℃。结果见下表13。
表13不同柱温的考察
Figure BDA0002117107410000123
结果：柱温在30℃～40℃波动，色谱峰分离效果均较好。
4)色谱柱考察
取炒蒺藜标准汤剂冻干粉样品1份(约0.3g)，按前述方法A制备供试品溶液，分别采用Agilent Ecipse Plus C18(2.1×100mm，1.8μm)、Zobax Ecipse Plus C18(2.1×100mm，1.8μm)、Thermo Acclaim RLSC polar advantage(100×2.1mm，2.2μm)三种色谱柱，对炒蒺藜标准汤剂冻干粉样品进行分析，其余条件同(一)仪器与试药。分析结果显示，三种色谱柱的分离均较好，保留时间适中，说明色谱柱对样品的测定结果影响较小。此方法具有普遍适应性。考虑到实验的耐用性，本发明优选采用Agilent Ecipse Plus C18(2.1×100mm，1.8μm)色谱柱进行炒蒺藜标准汤剂冻干粉含量测定。结果见表14。
表14不同色谱柱的比较
Figure BDA0002117107410000131
结果：三种不同型号色谱柱的分离效果均较好，保留时间适中，说明色谱柱对样品的测定结果影响较小。
5)漂移管温度考察
取炒蒺藜标准汤剂冻干粉样品1份(约0.3g)，按前述方法A制备供试品溶液考察蒸发光散射检测器漂移管温度85℃、90℃、95℃三个温度，其余条件同(一)仪器与试药，结果表明三种温度下色谱峰分离效果均较好。结果见表15。
表15不同漂移管温度的考察
Figure BDA0002117107410000132
结果：漂移管温度85℃～95℃波动，色谱峰分离效果均较好，不影响含量测定结果。
6)检测器气体流速考察
取炒蒺藜标准汤剂冻干粉样品1份(约0.3g)，按前述方法A制备供试品溶液，考察蒸发光散射检测器气体流速1.8L/min、2.0L/min、2.2L/min三个气体流速，其余条件同(一)仪器与试药，结果表明三种温度下色谱峰分离效果均较好。结果见表16。
表16不同气体流速的考察
Figure BDA0002117107410000133
结果：气体流速在1.8～2.2℃波动，色谱峰分离效果均较好，不影响含量测定结果。
(五)不同批次的炒蒺藜标准汤剂冻干粉含量测定
取不同批次的炒蒺藜标准汤剂冻干粉样品1份(约0.3g)，按前述方法A制备供试品溶液，按前述色谱条件，进样2.0μl，测定得到表17，由此可证明该方法可以实际应用于炒蒺藜标准汤剂的测定，该方法具有可操作性。
表17不同批次的炒蒺藜标准汤剂冻干粉含量测定
Figure BDA0002117107410000134
Figure BDA0002117107410000141
实施例2：炒蒺藜配方颗粒中蒺藜皂苷K的测定
(一)仪器与试剂和(二)对照品来源及配置均同实施例1。
(三)供试品溶液的制备(下文计为“方法B”)
取炒蒺藜配方颗粒(江阴天江药业有限公司自制，具体是将药材经过炮制，加水浸泡，水煎煮1～2次，过滤得到药液，低温浓缩成浸膏，干燥，加辅料制粒，分装即得)，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇浓度为80％的甲醇水溶液25ml，密塞，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用甲醇浓度为80％的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过微孔滤膜，取续滤液，即得。
(四)方法学验证
(1)线性
分别精密吸取蒺藜皂苷K对照品溶液(118.87μg/ml)，0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以峰面积积分值LN值为纵坐标，蒺藜皂苷K进样量(μg)LN值为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程：Y＝1.7263X+16.3144，R＝0.9997，结果见表18，图谱见图4。
表18蒺藜皂苷K对照品峰面积积分值与进样量关系
Figure BDA0002117107410000142
结果表明：蒺藜皂苷K进样量在0.04755～0.17830μg范围内，进样量与峰面积值呈良好的线性关系。
(2)精密度试验
1)仪器精密度试验
精密吸样品溶液2μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，连续进样6次，记录其峰面积测量值，计算相对标准偏差，结果见表19。
表19仪器精密度试验
Figure BDA0002117107410000151
结果：仪器精密度良好(RSD％＝2.67％)。
2)重复性试验
平行取6份炒蒺藜配方颗粒约0.5g(批号：KL 18041029，江阴天江药业有限公司制)，精密称定，分别按前述方法B制成样品供试液，分别进样2.0μl，测定蒺藜皂苷K峰面积值，计算其含量及RSD，结果见下表。
表20炒蒺藜配方颗粒样品的重复性试验
Figure BDA0002117107410000152
结果：重复性试验(RSD％＝1.98％)良好。
3)中间精密度
平行取3份炒蒺藜配方颗粒约0.5g(批号：KL 18041029，江阴天江药业有限公司制)，分别由两个实验员按前述方法B制成样品供试液，分别于不同时间在同一台仪器上分别进样2.0μl，测定蒺藜皂苷K的峰面积值，计算蒺藜皂苷K含量，计算其RSD，结果见表21。
表21中间精密度试验
Figure BDA0002117107410000161
结果：中间精密度(RSD％＝2.58％)良好。
4)准确度试验
取已知含量的炒蒺藜配方颗粒(批号：KL 18041029，江阴天江药业有限公司制，含量：0.38％)0.15g，共6份，精密称定，分别加入适量蒺藜皂苷K对照品，参考方法B制成加样回收供试品溶液，按前述色谱条件，分别进样2.0μl，以前述式(1)计算回收率，RSD，结果见下表22。
表22蒺藜皂苷K准确度试验
Figure BDA0002117107410000162
结果：蒺藜皂苷K回收率在90％～108％之间，RSD％小于3.0％，准确度试验良好。
(4)专属性试验
计算0.5g颗粒中所含的辅料量，精密称取计算量的辅料按前述方法B制成阴性样品溶液，以排除辅料对目标峰的干扰，保证方法的专属性。分别吸取阴性样品溶液，对照品溶液和颗粒供试品溶液，按前述色谱条件分别进样，以对照品出峰位置，阴性溶液无峰及附近无干扰峰为依据，判断方法测定指标的专属性。结果参见图5。
由图5可知，辅料对蒺藜皂苷K的测定没有干扰，具有很好的专属性。
(5)延迟性试验
按照方法B制备供试品溶液，按前述色谱条件，进样2.0μl，进样分析周期延迟到20min，观察目标峰出峰后后续峰有无干扰。结果参见图6。
由图6可知，延长进样时间至20min，无杂质峰干扰测定。
(6)耐用性试验
1)稳定性试验
取炒蒺藜配方颗粒1份(批号：KL 18041029，江阴天江药业有限公司制)，按方法B制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12h进样2.0μl，测定峰面积值，计算其RSD，结果见表23。
表23稳定性试验测定结果
Figure BDA0002117107410000171
结果：样品供试液在12小时内稳定性良好。
2)不同流速考察
取炒蒺藜配方颗粒1份(批号：KL 18041029，江阴天江药业有限公司制)，按方法B制备供试品溶液，考察0.25ml/min、0.30ml/min、0.35ml/min三个流速，其余条件不变。结果表明三种流速下色谱峰分离效果均较好。流速为0.30ml/min时分析所需时间适中，本发明优选流速为0.30ml/min。结果见表24。
表24不同流速考察
Figure BDA0002117107410000172
结果：流速在每分钟0.25ml～0.35ml波动，色谱峰分离效果均较好。
3)柱温考察
取炒蒺藜配方颗粒1份(批号：KL 18041029，江阴天江药业有限公司制)，按方法B制备供试品溶液，考察30℃、35℃、40℃三个温度，结果表明三种柱温下色谱峰分离效果均较好。柱温为35℃时分析所需时间适中，本发明优选柱温为30℃。结果见表25。
表25不同柱温的考察
Figure BDA0002117107410000173
Figure BDA0002117107410000181
结果：柱温30℃～40℃波动，色谱峰分离效果均较好。
4)色谱柱考察
取炒蒺藜配方颗粒1份(批号：KL 18041029，江阴天江药业有限公司制)，按方法B制备供试品溶液，分别采用Agilent Ecipse Plus C18(2.1×100mm，1.8μm)、Zobax EcipsePlus C18(2.1×100mm，1.8μm)、Thermo Acclaim RLSC polar advantage(100×2.1mm，2.2μm)、三种色谱柱，对炒蒺藜或蒺藜颗粒颗粒样品进行分析。分析结果显示，三种色谱柱的分离均较好，保留时间适中，说明色谱柱对样品的测定结果影响较小。此方法具有普遍适应性。考虑到实验的耐用性，本发明优选采用Agilent Ecipse Plus C18(2.1×100mm，1.8μm)色谱柱进行炒蒺藜配方颗粒含量测定。结果见下表、下图。
表26不同色谱柱的比较
Figure BDA0002117107410000182
结果：三种不同型号色谱柱的分离效果均较好，保留时间适中，说明色谱柱对样品的测定结果影响较小。
5)漂移管温度考察
取炒蒺藜配方颗粒1份(批号：KL 18041029，江阴天江药业有限公司制)，按方法B制备供试品溶液，考察蒸发光散射检测器漂移管温度85℃、90℃、95℃三个温度，结果表明三种温度下色谱峰分离效果均较好。结果见表27。
表27不同漂移管温度的考察
Figure BDA0002117107410000183
结果：漂移管温度85℃～95℃波动，色谱峰分离效果均较好，不影响含量测定结果。
6)检测器气体流速考察
取炒蒺藜配方颗粒1份(批号：KL 18041029，江阴天江药业有限公司制)按方法B制备供试品溶液，考察蒸发光散射检测器气体流速1.8L/min、2.0L/min、2.2L/min三个气体流速，结果表明三种温度下色谱峰分离效果均较好。结果见表28。
表28不同气体流速的考察
Figure BDA0002117107410000184
结果：气体流速在1.8～2.2℃波动，色谱峰分离效果均较好，不影响含量测定结果。
(五)不同批次炒蒺藜配方颗粒含量测定
取三批炒蒺藜配方颗粒样品，研细，取约0.5g，精密称定，按方法B制备供试品溶液，测定蒺藜皂苷K的含量。
表29不同批次炒蒺藜配方颗粒含量测定
Figure BDA0002117107410000185
Figure BDA0002117107410000191
由表29表明，不同批次的炒蒺藜配方颗粒的蒺藜皂苷K的含量测定结果相近，证明该方法可以实际应用于炒蒺藜配方颗粒的测定，该方法具有可操作性。
实施例3：不同批次蒺藜药材和炒蒺藜饮片含量测定
(一)仪器与试剂同实施例1。
(二)对照品对照品来源及制备
蒺藜皂苷K(编号：112023-201601)购于中国食品药品检定研究研究院，供含量测定用，含量以90.6计，使用前无须处理。取蒺藜皂苷K对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含蒺藜皂苷K 100μg的溶液，摇匀，即得。
(三)供试品溶液的制备(下文计为“方法C”)
取本品(蒺藜药材，江阴天江药业有限公司制)约1g，打粉，过3号筛，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.22μm滤膜，取续滤液，即得。
分别精密吸取对照品溶液0.5μl、2.0μl和供试品溶液2μl，注入液相色谱仪，测定不同批次的蒺藜药材，所得结果见表30。由此可见，本方法可以实际应用于蒺藜药材的测定，该方法具有可操作性。
表30不同批次蒺藜药材含量测定
Figure BDA0002117107410000192

Claims (10)

1.一种炒蒺藜或蒺藜中蒺藜皂苷K含量的测定方法，其特征在于，所述方法包括供试品溶液制备、对照品溶液制备、检测和分析步骤，
其中，所述供试品溶液的制备包括：
将炒蒺藜或蒺藜样品精密称定，然后与第一溶剂混合，称定重量，加热回流，放冷，再称定重量，可选地用第二溶剂补足减失的重量，之后过微孔滤膜，取续滤液，即得；
所述检测采用超高效液相色谱仪和蒸发光散射检测器进行测定；
所述炒蒺藜或蒺藜样品选自炒蒺藜或蒺藜标准汤剂冻干粉、炒蒺藜或蒺藜配方颗粒或者炒蒺藜或蒺藜药材或饮片；
所述第一溶剂、所述第二溶剂分别独立地选自甲醇或60%~80%甲醇的水溶液；
所述加热回流时间为：15-60min，所述加热回流温度为70~100℃；
所述超高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂的色谱柱；流动相为：体积比为50-58:42-50的甲醇和水等度洗脱；流速为0.25~0.35 ml/min，柱温为30~40℃。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述炒蒺藜或蒺藜样品选自炒蒺藜或蒺藜标准汤剂冻干粉、炒蒺藜或蒺藜配方颗粒。
3.根据权利要求1或2任一项所述的测定方法，其特征在于，所述第一溶剂、所述第二溶剂分别独立地选自甲醇或80%甲醇的甲醇水溶液。
4.根据权利要求1或2任一项所述的测定方法，其特征在于，所述第一溶剂和所述第二溶剂均为甲醇。
5.根据权利要求1或2所述的测定方法，所述炒蒺藜或蒺藜样品与所述第一溶剂的质量体积比为：1g：20-180ml。
6.根据权利要求1或2所述的测定方法，所述供试品溶液的制备包括：
取炒蒺藜或蒺藜标准汤剂冻干粉，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇或甲醇水溶液，密塞，称定重量，加热回流，放冷，再称定重量，用甲醇或甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过微孔滤膜，取续滤液，即得；
或者,
取炒蒺藜或蒺藜配方颗粒适量，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇或甲醇水溶液，密塞，称定重量，加热回流，放冷，再称定重量，用甲醇或甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过微孔滤膜，取续滤液，即得；
或者，
取炒蒺藜或蒺藜药材或饮片适量，打粉，过筛，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇或甲醇水溶液，密塞，称定重量，加热回流，放冷，再称定重量，用甲醇或甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过微孔滤膜，取续滤液，即得。
7.根据权利要求1或2所述的测定方法，所述对照品溶液制备包括，取蒺藜皂苷K对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含蒺藜皂苷K 0.08-0.15mg的溶液，摇匀，即得。
8.根据权利要求1或2所述的测定方法，所述流动相为：体积比为58:42的甲醇和水等度洗脱。
9.根据权利要求1或2所述的测定方法，所述蒸发光散射检测器的条件为：气体流速：1.8L/min~2.2L/min；漂移管温度为：85~95℃。
10.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，所述分析是以外标两点法进行的定量分析，以已知浓度的对照品溶液色谱峰面积的LN值比对其相应进样量的LN值进行回归分析，得到标准曲线，对供试品溶液进行测定，测得检出供试品溶液中蒺藜皂苷K色谱峰面积，代入标准曲线，求得炒蒺藜或蒺藜中蒺藜皂苷K的含量。
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