CN102879516A

CN102879516A - 补阳还五汤的鉴别和含量测定方法

Info

Publication number: CN102879516A
Application number: CN2012103616618A
Authority: CN
Inventors: 陆兔林; 毛春芹; 蔡宝昌; 殷放宙; 李林; 严国俊; 季德; 张星
Original assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Current assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Priority date: 2012-09-25
Filing date: 2012-09-25
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2032-09-25
Also published as: CN102879516B

Abstract

本发明公开了补阳还五汤的质量控制方法，该方法提供了鉴别方法和高效液相色谱法测定药物中芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、槲皮素成分的含量方法，提高后的质量标准能更好地控制药品的质量，本发明的质量控制方法，具有较强的专属性和良好的重现性，真正体现体现药品安全有效、质量可控。

Description

补阳还五汤的鉴别和含量测定方法

技术领域

本发明涉及中药制剂质量控制领域，具体涉及一种补阳还五汤的鉴别和含量测定方法。

背景技术

补阳还五汤出自《医林改错》下卷,由清代名医王清任所创制，由生黄芪、当归、赤芍、川芎、桃仁、地龙、红花组成，具有补气活血、化瘀通络之功效，主要用于治疗半身不遂，遗尿不禁等气虚血瘀证，是临床治疗老年中风症常用经验方剂。但是目前有关补阳还五汤的质量标准、有效成分等深入研究很少，有限的研究报道也只是一鳞半爪。而对于同时测定补阳还五汤中多种成分的报道尚未见到。无论从继承和发扬祖国医药的观点，还是从当前人民用药的需要，均有必要对补阳还五汤药用标准、化学成分及作用机理深人研究和探讨，以便开发利用。

中药长期以来，质量难以有效控制，有效控制中药产品的质量是一个重大的课题，现有技术中采用的方法不完整，少数针对性不强，使用这些方法难以达到真正控制质量的目的。补阳还五汤由于缺少系统的质量控制方法，难以控制补阳还五汤的质量，以致正常的临床用药及疗效无法保证，利用已知的一些技术难以对补阳还五汤提供好的质量控制方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种补阳还五汤的鉴别和含量测定方法，为了达到这个目地，采用如下技术方案：

一种补阳还五汤的鉴别和含量测定方法，所述补阳还五汤是由如下原料及方法制备，取黄芪120g，当归6g，赤芍5g，川芎3g、红花3g、桃仁3g、地龙3g，于砂锅中加相当于饮片10倍量的水，浸泡30min，煎煮30min，煎煮2次，两层纱布过滤，合并滤液，浓缩，定容至300mL，制备成补阳还五汤，包括以下鉴别方法和同时测定芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、槲皮素的含量测定方法：

A.黄芪的TLC鉴别取上述补阳还五汤10mL，用水饱和的正丁醇振摇提取，每次20mL，提取3次，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤，每次20mL，洗涤2次，弃去氨试液，取正丁醇提取液，水浴蒸干，残渣加蒸馏水3～5mL使之溶解，通过内径为1.5cm，长度为12cm的D101大孔树脂柱，加蒸馏水50mL洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30mL洗脱，弃去洗脱液，再用70%乙醇80mL洗脱，收集洗脱液，水浴蒸干，用甲醇定容至5mL容量瓶，作为补阳还五汤供试品溶液；另精密称取黄芪对照药材4g，粉碎，按上述补阳还五汤供试品溶液的制备方法，自用水饱和的正丁醇振摇提取开始，制成黄芪对照药材溶液，再按补阳还五汤制备方法制备缺黄芪的补阳还五汤阴性样品，取缺黄芪的补阳还五汤阴性样品溶液20mL，同样方法制成缺黄芪的阴性对照溶液，分别吸取上述溶液各10μL，点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为30∶10∶1的二氯甲烷-甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%硫酸乙醇溶液，于105℃加热显色，至斑点清晰，结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰；

B.当归薄层色谱鉴别取上述补阳还五汤25ml，加热蒸干，加入乙醚10mL，加热回流提取30min，放冷滤过，滤液水浴蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液，另精密称取当归对照药材0.5g，粉碎，按上述补阳还五汤供试品溶液的制备方法，自用水饱和的正丁醇振摇提取开始，制成当归对照药材溶液，再按补阳还五汤制备方法制备缺当归的补阳还五汤阴性样品，取缺当归的补阳还五汤阴性样品溶液25mL，同样方法制成缺当归的阴性对照溶液，分别吸取上述三种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为4∶1的正己烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，置于波长为365nm的紫外光灯下检视，结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰；

C.赤芍的TLC鉴别取上述补阳还五汤30mL，加热蒸干，加入70%甲醇20mL，超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液。另精密称取赤芍对照药材0.5g，粉碎，按上述补阳还五汤供试品溶液的制备方法，自用水饱和的正丁醇振摇提取开始，制成赤芍对照药材溶液，再按补阳还五汤制备方法制备缺赤芍的补阳还五汤阴性样品，取缺赤芍的补阳还五汤阴性样品溶液20mL，同样方法制成缺赤芍的阴性对照溶液，吸取上述3种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为8∶1∶4的二氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，于105℃加热显色，至斑点显色清晰，结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色的斑点，阴性对照无干扰；

D.川芎的薄层色谱鉴别取上述补阳还五汤100mL，加热蒸干，加乙醚20mL，回流提取30min，滤过，蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml，使溶解，作为供试品溶液。另精密称取川芎药材1g，粉碎，按上述补阳还五汤供试品溶液的制备方法，自用水饱和的正丁醇振摇提取开始，制成川芎对照药材溶液，再按补阳还五汤制备方法制备缺川芎的补阳还五汤阴性样品，取缺川芎的补阳还五汤阴性样品溶液100mL，同样方法制备成缺川芎的阴性对照溶液，分别吸取上述三种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为9∶1的石油醚-乙酸乙酯为展开剂，石油醚温度为60～90℃，展开，取出，晾干，置波长为365nm的紫外光灯下检视，结果，供试品溶液色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰；

所述同时测定补阳还五汤中芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、槲皮素的含量的方法：

色谱条件色谱柱：直径和长度为250mm×4.6mm，5μm的Hypersil ODS2，流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱，梯度洗脱顺序为0分钟时，乙腈与0.1%磷酸水溶液的体积比为8:92，,15分钟时，乙腈与0.1%磷酸水溶液的体积比为10:90，25分钟时，乙腈与0.1%磷酸水溶液的体积比为15:85，35分钟时，乙腈与0.1%磷酸水溶液的体积比为18:82，45分钟时，乙腈与0.1%磷酸水溶液的体积比为24:76，64分钟时，乙腈与0.1%磷酸水溶液的体积比为36:64，73分钟时，乙腈与0.1%磷酸水溶液的体积比为45:55，80分钟时，乙腈与0.1%磷酸水溶液的体积比为66:34，流速：1mL·min-1，检测波长：260nm，柱温：30℃，进样量10μL，采样时间：80min，

对照品溶液的制备:分别精密称取芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、槲皮素对照品适量，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成单个组分对照品母液，使每1mL分别含芍药苷1.954mg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷1.728mg、槲皮素1.956mg，备用,

分别精密量取单个组分对照品溶液，加甲醇配成每1mL分别含芍药苷0.1954mg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.1728mg、槲皮素0.1956mg的混合对照品液,

精密称取补阳还五汤20mL，水浴蒸干，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，取出，放冷至室温，再称定重量，加甲醇补足损失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液，过0.45μm的微孔滤膜，

含量测定：精密吸取对照品及供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

按照补阳还五汤中芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、槲皮素含量计，不少于设定值为合格，

上述补阳还五汤的含量测定方法，补阳还五汤成品中芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、槲皮素含量计，设定值为芍药苷每毫升不得少于0.025mg；毛蕊异黄酮葡萄糖苷每毫升不得少于0.10mg；槲皮素每毫升不得少于0.05mg。

本发明对补阳还五汤提出了质量控制方法，该方法提供了鉴别和高效液相色谱法同时测定汤剂中芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖葡萄糖苷、槲皮素成分的含量，此法较单一成分含量测定更加有效精确、简单易行，而且提高后的质量标准能更好地控制汤剂的质量，本发明的质量控制方法，具有较强的专属性和良好的重现性，真正体现汤剂安全有效、质量可控，特别是采用高效液相色谱法同时测定该方剂中多种成分的含量，解决了补阳还五汤质量控制的难题，减少了质检工作强度，本发明针对补阳还五汤提供了一种实用的质量控制方法。

附图说明

图1为三种对照品混合后溶液高效液相色谱图，图中1为芍药苷，2为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，3为槲皮素；

图2为补阳还五汤溶液高效液相色谱图，图中1为芍药苷，2为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，3为槲皮素。

具体实施方式

结合具体实施方式，对本发明进一步说明如下：

1、鉴别方法为：

1.1饮片、仪器与试剂

饮片来源：补阳还五汤处方饮片购自江苏海昌中药饮片有限公司，经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定，均为正品，饮片情况见表1-1

表1-1饮片一般情况

硅胶G、H薄层板（青岛海洋化工厂）；

FA1104型万分之一电子分析天平（上海天平仪器厂）；

紫外分析仪WD-9403C型（北京市六一仪器厂）；

水浴锅（巩义市英峪予华仪器厂）；

黄芪对照药材（批号120974-200407），购自中国药品生物制品检定所；

当归对照药材（批号120955-200305），购自中国药品生物制品检定所；

赤芍对照药材（批号121093-200405），购自中国药品生物制品检定所；

川芎对照药材（批号110736-200427），购自中国药品生物制品检定所；

芍药苷对照品（批号110736-201035），购自中国药品生物制品检定所；

槲皮素对照品(批号10081-9905)，购自中国药品生物制品检定所;

毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(批号110796-201017)，购自上海源叶生物科技有限公司。

正丁醇为分析纯（上海实意化学试剂有限公司，批号：20080227）；

乙酸乙酯为分析纯（国药集团化学试剂有限公司，批号：T20090406）；

氨水为分析纯（南京化学试剂有限公司，批号：080920759）；

冰醋酸为分析纯（国药集团化学试剂有限公司，批号：T20090305）；

浓硫酸为分析纯（上海久亿化学试剂有限公司，批号：091022）；

乙醇为分析纯（南京化学试剂有限公司，批号：09081310871）；

乙醚为分析纯（上海中试化工总公司，批号：20100415）；

正己烷为分析纯（上海试四赫维化工有限公司，批号：0904102）；

二氯甲烷为分析纯（上海凌峰化学试剂有限公司，批号：042101）；

水为双重蒸馏水。

供试样品溶液的制备：取补阳还五汤药材饮片（黄芪120g，当归6g，赤芍5g，川芎、红花、桃仁、地龙各3g）于砂锅中加相当于饮片10倍量的水，浸泡30min，煎煮30min，煎煮2次，两层纱布过滤，合并滤液，浓缩，定容至300mL，作为供试品溶液。

1.2实验方法

D.川芎的薄层色谱鉴别取上述补阳还五汤100mL，加热蒸干，加乙醚20mL，回流提取30min，滤过，蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml，使溶解，作为供试品溶液。另精密称取川芎药材1g，粉碎，按上述补阳还五汤供试品溶液的制备方法，自用水饱和的正丁醇振摇提取开始，制成川芎对照药材溶液，再按补阳还五汤制备方法制备缺川芎的补阳还五汤阴性样品，取缺川芎的补阳还五汤阴性样品溶液100mL，同样方法制备成缺川芎的阴性对照溶液，分别吸取上述三种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为9∶1的石油醚-乙酸乙酯为展开剂，石油醚温度为60～90℃，展开，取出，晾干，置波长为365nm的紫外光灯下检视，结果，供试品溶液色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰。

2.含量测定：

2.1饮片、仪器与试剂

饮片来源：补阳还五汤处方饮片购自江苏海昌中药饮片有限公司，经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定，均为正品，饮片情况见表2-1

表2-1样品一般情况

Agilent1100型高效液相色谱仪（包括在线脱气机、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器），Mettler Toledo AG285十万分之一天平，医用超声清洗器（KQ-500E型，昆山超声仪器有限公司）；

色谱甲醇（美国Tedia公司生产），水为双重蒸馏水；分析甲醇（南京化学试剂有限公司，批号：09020310079），分析磷酸（广东光华化学厂有限公司，批号：20071101），芍药苷对照品（批号110736-201035）、槲皮素对照品(批号10081-9905)，均购自中国药品生物制品检定所，毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(批号110796-201017)，购自上海源叶生物科技有限公司。

2.2方法与结果

2.2.1测定波长的选择

补阳还五汤成分复杂，其主要有效成分的紫外吸收差异很大，通过HPLC在210nm、230nm、260nm、300nm、360nm波长下检测，结果表明在260nm处有被测各种成分均能出峰，在260nm以上芍药苷被测灵敏度大大降低，在低波长处基线不稳，为了使各组分在同一波长下都能有较好吸收，达到吸收强、干扰小的目的，故选择260nm。

2.2.2色谱条件

色谱柱：直径和长度为250mm×4.6mm，5μm的Hypersil ODS2，流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱，梯度洗脱顺序见表2-2，流速：1mL·min-1，检测波长：260nm，柱温：30℃，进样量10μL，采样时间：80min。

表2-2梯度洗脱顺序

2.2.3对照品溶液的制备

分别精密称取芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、槲皮素对照品适量，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成单个组分对照品母液，使每1mL分别含芍药苷1.954mg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷1.728mg、槲皮素1.956mg，备用。

分别精密量取单个组分对照品溶液，加甲醇配成每1mL分别含芍药苷0.1954mg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.1728mg、槲皮素0.1956mg的混合对照品液。

2.2.4供试样品溶液的制备

精密称取补阳还五汤20mL，水浴蒸干，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，取出，放冷至室温，再称定重量，加甲醇补足损失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液，过0.45μm的微孔滤膜。

2.2.5线性关系考察

分别精密吸取2.2.3项下的混合对照品溶液0.4mL、1mL、2mL、5mL至10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，分别进样分析，进样量10μL记录峰面积。以峰面积Y对进样量X（μg）进行线性回归，求得芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、槲皮素的回归方程、相关系数和线性范围，结果见表2-3。

表2-33种有效成分的线性方程、相关系数及线性范围

2.2.7精密度试验

取上述对照品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，计算芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、槲皮素的峰面积，其RSD分别为0.69%，1.09%，1.35%表明仪器精密度良好。

2.2.8稳定性试验

取批号为1的补阳还五汤供试样品1份，分别在0,2,4,8,12,20h测定样品中各组分的峰面积，测得芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、槲皮素、峰面积的RSD分别为1.34%，2.02%，0.53%，表明供试品溶液在20h内稳定。

2.2.9重复性试验

精密称取批号为1的补阳还五汤供试样品6份，按照“2.2.3”项下方法供试品溶液的制备方法制备供试品液，进样10μL，记录峰面积，并计算含量。结果样品中芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、槲皮素平均含量（n=6）分别为0.0640mg·g-1，0.2787mg·g-1，0.1237mg·g-1，RSD分别为2.5%，0.81%，0.61%，表明该方法重现性良好。

2.2.10准确度试验

精密称取批号为1的补阳还五汤样品9份，每份约10mL，精密量取，水浴蒸干，置具塞锥形瓶中，分别加入低、中、高3个质量浓度的混合对照品溶液（含芍药苷0.3498mg·mL-1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷1.3287mg·mL-1、槲皮素0.5894mg·mL-1）0.8mL、1mL、1.2mL，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率。结果芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷及槲皮素的平均回收率分别为98.75%、101.65%和97.23%，RSD分别为0.24%、1.03%和0.73%。

2.2.11样品含量测定

取3个不同批号的补阳还五汤9份（每个批号3份），按“2.2.4”项下的方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定含量，结果见表2-4。

表2-4补阳还五汤3种有效成分含量测定

Claims

1.一种补阳还五汤的鉴别和含量测定方法，所述补阳还五汤是由如下原料及方法制备，取黄芪120g，当归6g，赤芍5g，川芎3g、红花3g、桃仁3g、地龙3g，于砂锅中加相当于饮片10倍量的水，浸泡30min，煎煮30min，煎煮2次，两层纱布过滤，合并滤液，浓缩，定容至300mL，制备成补阳还五汤，其特征在于包括以下鉴别方法和同时测定芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、槲皮素的含量测定方法：

D.川芎的薄层色谱鉴别取上述补阳还五汤100mL，加热蒸干，加乙醚20mL，回流提取30min，滤过，蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml，使溶解，作为供试品溶液。另精密称取川芎药材1g，粉碎，按上述补阳还五汤供试品溶液的制备方法，自用水饱和的正丁醇振摇提取开始，制成川芎对照药材溶液，再按补阳还五汤制备方法制备缺川芎的补阳还五汤阴性样品，取缺川芎的补阳还五汤阴性样品溶液100mL，同样方法制备成缺川芎的阴性对照溶液，分别吸取上述三种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为9∶1的石油醚-乙酸乙酯为展开剂，石油醚温度为60~90℃，展开，取出，晾干，置波长为365nm的紫外光灯下检视，结果，供试品溶液色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰；

色谱条件色谱柱：直径和长度为250mm×4.6mm，5μm的HypersilODS2，流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱，梯度洗脱顺序为0分钟时，乙腈与0.1%磷酸水溶液的体积比为8:92，,15分钟时，乙腈与0.1%磷酸水溶液的体积比为10:90，25分钟时，乙腈与0.1%磷酸水溶液的体积比为15:85，35分钟时，乙腈与0.1%磷酸水溶液的体积比为18:82，45分钟时，乙腈与0.1%磷酸水溶液的体积比为24:76，64分钟时，乙腈与0.1%磷酸水溶液的体积比为36:64，73分钟时，乙腈与0.1%磷酸水溶液的体积比为45:55，80分钟时，乙腈与0.1%磷酸水溶液的体积比为66:34，流速：1mL·min-1，检测波长：260nm，柱温：30℃，进样量10μL，采样时间：80min，

按照补阳还五汤中芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、槲皮素含量计，不少于设定值为合格。

2.根据权利要求1所述补阳还五汤的鉴别和含量测定方法，其特征在于补阳还五汤成品中芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、槲皮素含量计，设定值为芍药苷每毫升不得少于0.025mg；毛蕊异黄酮葡萄糖苷每毫升不得少于0.10mg；槲皮素每毫升不得少于0.05mg。