CN106124639A

CN106124639A - 杜仲药材的多成分含量测定方法

Info

Publication number: CN106124639A
Application number: CN201610195762.0A
Authority: CN
Inventors: 黄勇; 王爱民; 李勇军; 王永林; 郑林; 孙佳; 陆苑; 廖尚高; 杨畅
Original assignee: Guizhou Medical University
Current assignee: Guizhou Medical University
Priority date: 2016-03-31
Filing date: 2016-03-31
Publication date: 2016-11-16

Abstract

本发明公开了一种杜仲药材的多成分含量测定方法，用于同时测定杜仲药材中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷的含量，它采用UPLC法，以Waters BET C₁₈（2.1×150 mm，1.7 µm）为色谱柱，0.1%甲酸乙腈溶液‑0.1%甲酸水溶液进行梯度洗脱，检测波长为205 nm，流速0.25 mL/min，柱温45℃。按照本发明的方法，杜仲中的六种有效成分能得到较好的分离，方法的加样回收率为96.92%～101.01%，RSD﹤3%。该方法可为杜仲的质量控制研究提供依据。

Description

杜仲药材的多成分含量测定方法

技术领域

本发明属于中药检测技术领域，尤其是涉及杜仲药材的多成分含量测定方法。

背景技术

杜仲为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥树皮，又名思仙、思仲、木棉，为我国名贵滋补药材。杜仲作为中药在我国已有2000多年的药用历史，具有补肝肾、强筋骨、降血压、抗肿瘤、安胎等诸多功效，《神农本草经》将其列为上品。

目前已知杜仲的主要化学成分有木质素类、环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类等几十种化合物，研究表明其中部分活性成分桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷、绿原酸、京尼平苷酸、京尼平苷具有抗肿瘤、降血压、抗菌、抗血栓等药理作用。《中国药典》2010版中收录用高效液相法测定松脂醇二葡萄糖苷单一成分，但并未给出杜仲中其它成分含量的测定方法，现行质量标准含量测定指标单一，难以全面的评价杜仲药材的内在质量。

发明内容

本发明的目的是以UPLC作为分析手段建立多指标定量分析方法，在同一色谱条件下同时对杜仲药材中的桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷6个有效成分进行含量测定，从而较为全面的覆盖药材中所含的木质素类、环烯醚萜类及酚酸类成分，克服药材质量控制的片面性，进一步提高了杜仲药材的质量控制研究、为杜仲药材的开发应用提供实验依据。

本发明的技术方案如下：

本发明的杜仲药材的多成分含量测定方法，用于测定杜仲药材中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷的含量，采用UPLC法，以Waters BET C₁₈（2.1×150 mm，1.7 µm）为色谱柱，0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液进行梯度洗脱，检测波长为205 nm，流速0.25 mL/min，柱温45 ℃。

用甲醇作为杜仲药材的提取溶剂，提取回流次数为2次。

具体的，包括如下步骤：

步骤1：制备对照品溶液和供试品溶液；

对照品溶液的制备方法是：分别精密称取桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷对照品适量至6个5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。获得桃叶珊瑚苷（1.169 mg/mL）、京尼平苷酸（1.205 mg/mL）、绿原酸（1.253 mg/mL）、京尼平苷（1.000 mg/mL）、松脂醇二葡萄糖苷（1.190 mg/mL）、松脂醇单葡萄糖苷（1.100 mg/mL）的储备液。分别精密量取上述6种对照品储备液置同一个10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液（0.2221、0.1808、0.0376、0.1000、0.0595、0.0088 mg/mL），于4 ℃保存备用。

供试品溶液的制备方法是：精密称取粉碎的杜仲药材2 g，精密加入20 mL甲醇回流提取2次，每次1.5 h，冷却，过滤，浓缩并用甲醇定容至25 mL容量瓶，用0.22 µm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，即得。

步骤2：分别取混合对照品溶液和供试品溶液，用UPLC-PDA测定，得色谱图，6种化合物与其他物质峰分离完全；其中色谱条件为：流动相为0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液，色谱柱Waters BET C18（2.1×150 mm，1.7 µm），检测波长205 nm，流速0.25 mL/min，柱温45 ℃，进样量1 µL。

步骤3：分别进行线性关系考察、精密度实验、重复性试验、稳定性试验和加样回收率实验。

按照本发明的方法，杜仲中的六种有效成分能得到较好的分离，方法的加样回收率为96.92%～101.01%，RSD ﹤3%。该方法简便、准确，重复性好，可用于杜仲中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷的含量测定，为杜仲的质量控制研究提供依据。

附图说明

图1是系统适用性实验UPLC图，图中，1 桃叶珊瑚苷；2 京尼平苷酸；3 绿原酸；4 京尼平苷；5 松脂醇二葡萄糖苷；6 松脂醇单葡萄糖苷）。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：

1 仪器与材料

Acquity UPLC-PDA系统（Waters公司，包含二元超高压梯度泵、自动进样器、色谱柱温箱、阵列二级管检测器、Empower工作站）；AE240十万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），DK-98-11恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司），超纯水机（四川沃特尔科技发展有限公司）。

京尼平苷酸对照品、京尼平苷对照品和桃叶珊瑚苷对照品购自四川省维克奇生物科技有限公司（批号120314、110722、110711），松脂醇二葡萄糖苷对照品购自上海顺勃生物工程有限公司（批号201206），松脂醇单葡萄糖苷对照品购自江苏弘惠医药有限公司（批号070801），绿原酸对照品购自北京世纪奥科生物技术有限公司（批号MUST-11042802），对照品纯度均大于98%。

乙腈（上海振兴化工一厂，色谱纯），甲醇（上海振兴化工一厂，分析纯），甲酸（美国TEDIA有限公司，优级纯），实验用杜仲药材由贵阳医学院药学院药用植物与生药学教研室龙庆德副教授鉴定为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥树皮，标本存于贵州省中药民族药研究开发中心。

2 方法

2.1 色谱条件

流动相为0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液，色谱柱Waters BET C18（2.1×150 mm，1.7 µm），检测波长205 nm，流速0.25 mL/min，柱温45 ℃，进样量1 µL，梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱表

时间（min）	流速（mL/min）	A（%）	B（%）
				0	0.25	4	96
1	0.25	4	96
				6	0.25	10.5	89.5
13	0.25	10.5	89.5
				31	0.25	30	70
35	0.25	95	5

2.2 对照品溶液制备

分别精密称取桃叶珊瑚苷、绿原酸、京尼平苷酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷对照品适量至6个5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。获得桃叶珊瑚苷（1.169 mg/mL）、京尼平苷酸（1.205 mg/mL）、绿原酸（1.253 mg/mL）、京尼平苷（1.000 mg/mL）、松脂醇二葡萄糖苷（1.190 mg/mL）、松脂醇单葡萄糖苷（1.100 mg/mL）的储备液。分别精密量取上述6种对照品储备液置同一个10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液（0.2221、0.1808、0.0376、0.1000、0.0595、0.0088 mg/mL），于4 ℃保存备用。

2.3 供试品溶液制备

精密称取粉碎的杜仲药材2 g，精密加入20 mL甲醇回流提取2次，每次1.5 h，冷却，过滤，浓缩并用甲醇定容至25 mL容量瓶，用0.22 µm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 系统适应性考察

分别取混合对照品溶液和供试品溶液各1 µL，在“2.1”项的色谱条件下，用UPLC-PDA测定，得色谱图，6种化合物与其他物质峰分离完全，见图1。

2.4.2 线性关系考察

精密量取“2.2”项下对照品储备液1.25 mL置10 mL容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品稀释液。分别精密吸取混合对照品稀释液1，2，4 μL和“2.2”项下对照品储备液1，2，4，8 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制工作曲线，结果见表2。

表2 回归方程和线性范围.

2.4.3 精密度实验

取同一供试品溶液，连续进样6次，计算桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷峰面积的RSD分别为1.6%、2.1%、2.7%、2.8%、0.4%、1.9%，结果说明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性实验

取同一批号杜仲药材6份，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别测定。6份供试品溶液中6个成分含量结果RSD分别为2.0%、0.8%、2.3%、2.6%、0.9%、2.5%，表明重复性良好。

2.4.5 稳定性实验

分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h分别进样，测定各指标成分峰面积。桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷峰面积的RSD分别为1.7%、2.4%、1.6%、2.2%、0.9%、1.2%，表明供试品在24 h内稳定。

2.4.6 加样回收率实验

称取已知含量的杜仲药材6份，精密加入一定量6种被测成分混合对照品，室温挥干，其余按“2.3”项下方法制备加样回收供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，结果见表3。结果表明6个待测成分回收率良好。

表3 回收率试验结果（n=6）

2.6 样品测定

取收集的不同产地及采收期的杜仲药材，按“2.3”项下方法操作，并按“2.1”项下色谱条件进样分析，测定31批不同产地和8批不同采收期（龙里S32-S39分别为3、4、5、6、7、8、9、10月份采收）杜仲药材中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄苷和松脂醇单葡萄糖苷的含量，含量测定结果见表4。

表4 不同产地和采收期杜仲药材含量测定结果.

3 讨论

3.1 测定波长的选择

由于所测杜仲中的木质素类、环烯醚萜类、酚酸类成分均具有紫外吸收，所以实验选择紫外检测器；并且利用二极管阵列检测器（PDA）检测，得到各波段的三维色谱及光谱图，根据信息最大化原则及6个待测化合物的吸收波长，最终选定205 nm为检测波长，经过方法学考察，证明本方法准确可靠，重复性好。

3.2 提取方法的选择

取同批杜仲药材以甲醇回流提取、索式提取及超声提取，并以峰信息程度、药材中各共有峰的单位质量峰面积及含量测定中各指标成分含量为指标选择相对较好的提取方法。实验结果显示，回流提取能有效的、充分的将杜仲药材中的成分提取完全。2010年版《中国药典》杜仲项下松脂醇二葡萄糖苷采用甲醇提取，本实验涉及不同性质的6个化合物，因此以甲醇、50%甲醇、乙醇、60%乙醇、水作为杜仲药材的提取溶剂进行考察。实验结果发现甲醇提取效率较高。因此实验选用甲醇作为杜仲药材的提取溶剂。对回流提取的提取次数进行考察，结果表明甲醇回流提取2次后，指纹图谱中各峰的峰面积及各指标成分含量总体趋于稳定，综合考虑，提取回流次数定为2次。

3.3 结果分析

本实验采用UPLC 为分析手段，对杜仲药材中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄苷和松脂醇单葡萄糖苷进行含量测定，该方法操作简便，在此色谱条件下所测的多种成分分离度好，线性关系，精密度，稳定性，回收率均较好，可应用于杜仲质量控制研究。

从测定结果可以看出，不同产地和不同采收期杜仲药材中6个被测成分的含量波动相对较大，它们的RSD值介于37.9%~96.0%之间，为此需要多指标成分对药材质量进行控制。其中环烯醚萜类的桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、京尼平苷含量差别较大，可能是产地对其有影响，也可能是由于环烯醚萜类化合物本身化学性质不是很稳定，在加工过程中易分解，从而导致含量差别大。松脂醇二葡萄糖苷和绿原酸对于不同产地或采收期的药材时，含量差别较小，可能由于产地和采收期对其影响较小。3月份采收的杜仲皮中松脂醇二葡萄糖苷含量为0.0542%，不建议3月作为杜仲的采收期。

当然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。

Claims

1.杜仲药材的多成分含量测定方法，用于同时测定杜仲药材中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷的含量，其特征在于：采用UPLC法，以Waters BET C₁₈（2.1×150 mm，1.7 µm）为色谱柱，0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液进行梯度洗脱，检测波长为205 nm，流速0.25 mL/min，柱温45 ℃。

2.根据权利要求1所述的杜仲药材的多成分含量测定方法，其特征在于：用甲醇作为杜仲药材的提取溶剂，提取回流次数为2次。