CN102749348B - 一种鉴别药用植物中活性成分组的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鉴别药用植物中活性成分组的方法。该方法包括：对药用植物进行提取，得到含有活性成分组的药用植物特征提取物；对所述特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出所述各活性成分相应标准参照品的特征峰峰强度；通过定量分析手段得到所述标准参照品的绝对含量；利用所述各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品的特征峰峰强度的比值和所述绝对含量，通过偶联公式计算出各活性成分的含量及活性成分组的含量。本发明能准确地反映药用植物中含有的活性成分以及它们之间的比例及总量，达到准确地对药用植物品种鉴别和药用植物源产品质量评价的目的。
Description
技术领域
本发明属于天然药用植物的鉴别领域，具体地，涉及一种鉴别药用植物中活性成分组的方法。
背景技术
指纹图谱技术是借鉴法医学“指纹”的概念，针对天然产物中活性成分的多样化与复杂性而提出的，试图能够一一说明这些活性成分而对其深入研究、科学评价或有效控制其质量的一种重要技术。指纹图谱是利用现代信息采集技术和一定的定性、定量分析手段得到的能够显现天然产物特性的图像、图形、光谱及其数据等[周玉新,中药指纹图谱研究技术[M].北京,化学工业出版社.2002],目前国际上已公识。
指纹图谱主要包括生物指纹图谱和化学指纹图谱两大类[罗国安等,中药指纹图谱的分类和发展,中国新药杂志2002,11(1):46-51]。生物指纹图谱包括：基因组学指纹图谱、蛋白质组学指纹图谱；化学指纹图谱根据所采用的化学或物理分析手段不同，主要包括色谱法和谱学法两大类。色谱法包括：薄层色谱(thin layer chromatography,TLC)；气相色谱(gas chromatography,GC)；高效液相色谱(liquidchromatography,HPLC)；高效毛细管电泳法(capillary chromatography,HPCE)，主要特点是以分离技术为基础。谱学法包括：紫外光谱（UV）；红外光谱（IR）；近红外光谱（NIR）；X-光衍射（XRD）；质谱（MS）与核磁共振（NMR）等，主要特点是以化合物分子结构鉴定为基础。
指纹图谱出现后，虽然发展很快，但是，用单一手段完成的化学指纹图谱，面对活性成分复杂的天然产物，既要解决这些活性成分是什么，又要解决活性成分之间的比例及总量，存在着严重的局限性，因此，限制了化学指纹图谱的深度发展。IGD核磁共振碳谱指纹图谱技术，也叫反门控去偶核磁共振碳谱（IGD13C NMR）偶联（coupling）指纹图谱技术是在我们研究多年的核磁共振氢谱（1H NMR）指纹图谱技术[赵天增，等.1HNMR指纹法鉴定植物中药，中草药2000，31(11)：868-870]的基础上提出的IGD核磁共振碳谱指纹图谱偶联其他手段提供的信息而形成的一种新的非单一手段综合指纹图谱技术。
赵天增等在国内外较早提出并推广应用了天然产物核磁共振氢谱（1H NMR）指纹图谱技术，但由于不同磁场强度的仪器得到的同一样品的核磁共振氢谱的外貌差别很大，加之核磁共振氢谱谱峰之间重叠厉害，严重制约了核磁共振氢谱指纹图谱技术的发展。对于核磁共振碳谱而言，不存在上述氢谱的两个局限性，孙庆雷等[CN200510044396.0]在国内外较早提出并应用了中药常规核磁共振碳谱（13C NMR）指纹图谱技术。但由于常规碳谱谱峰强度与对应碳数目不成比例，造成常规核磁共振碳谱不具有定量性；为此，IGD（一种碳谱谱峰强度与对应碳数目成比例的技术）核磁共振碳谱指纹图谱技术应运而生，其各碳峰峰强与对应碳数目成比例。
也就是说，目前现有技术解决鉴别植物品种和评价植物源产品质量的定性和定量分析方面存在着很大的局限性，但是市场和民生迫切需要这种方法。众所周知，中药是历史悠久的药物，现代中药多为植物提取物加工而成。中药材大多受到采摘地域和采摘时间的限制，人工培育的中药材的效果大多不及天然中药材的效果。特别需要一种方法能够鉴别植物品种及其提取物中的各种活性成分，并且将其定量，然后选择出最好的提取物成分或其组合物，以便充分发挥其效果。另外，中药走出国门的障碍之一是没有组成成分及其定量标识，如果能够解决这个问题，完全有理由相信，中药可给人类带来更大的福音。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种鉴别药用植物中活性成分组的方法
为了实现上述目的，本发明提供一种鉴别药用植物中活性成分组的方法，包括以下步骤：
1）对药用植物进行提取，得到含有活性成分组的药用植物特征提取物；
2）对所述特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式（IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测）测定出所述各活性成分相应标准参照品的特征峰峰强度；
3）通过定量分析手段得到所述标准参照品的绝对含量；
4）利用所述特征峰峰强度（各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品的特征峰峰强度）的比值和所述绝对含量，计算出各活性成分的含量及该类活性成分的总含量，即活性成分组的含量。
其中，采用具有获得清晰IGD核磁共振碳谱指纹图谱的提取工艺作为所述药用植物的提取方式。
本发明所述方法，步骤1）中特征提取物的提取方法和制备方法，都是采用常规的方法先进行实验并记录实验过程（不同的提取物提取和制备方法不同），然后利用IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测方法检测得到的提取物，从图谱的清晰程度和是否具有代表性的活性成分组来确定都是哪些提取物是特征提取物，从而筛选出最佳的提取方法和制备方法。
其中，步骤2）中，根据所述特征提取物的结构特性是从IGD核磁共振碳谱指纹图谱中选择碳峰作为各活性成分特征峰。
进一步地，所述碳峰为：化学位移差别较大的活性成分组中各活性成分的碳峰。
更进一步地，所述化学位移差别较大指峰和峰之间的化学位移差别≥0.01。
其中，步骤2）中所述峰强度采用峰高法、面积积分法或重量法计算。
其中，步骤3）中所述定量分析手段为：高效液相（HPLC）、气相色谱（GC）、薄层色谱法（TLC）或称量法。
其中，步骤2）和步骤3）中所述标准参照品为内标物或外标物。
其中，步骤3）中所述标准参照品的绝对含量是指：用定量分析手段测定的标准参照品的质量百分含量。
其中，步骤4）中，计算各活性成分的含量的偶联公式为：
其中：
W标为步骤3）用定量分析手段测定的某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；
M标为所述某一活性成分对应的标准参照品的分子量；
h标为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；
W测为某一活性成分的质量百分含量；
M测为某一活性成分的分子量；
h测为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的某一活性成分的特征峰峰强度；该类活性成分的总含量就是同类的各活性成分的W测相加之和，即活性成分组的含量。
上述公式的推导过程为：
本发明方法所述活性成分组，既可以是单味药用植物中的活性成分组，也可是药用植物衍生品中的活性成分组。
其中，所述药用植物衍生品包括：中药药用植物提取物或天然药物中的活性成分组。
本发明所述的药用植物，既包括用于防病、治病的植物，又包括用作营养剂、某些嗜好品、调味品、色素添加剂，及农药和兽医用药的植物资源；包括植物的各个部位，如根、茎、叶、花和果实等。
本发明所述方法，采用具有获得清晰IGD核磁共振碳谱指纹图谱的提取工艺作为所述药用植物的提取方式优势为：以是否能得到获得清晰IGD核磁共振碳谱指纹图谱为依据，选择的提取方式可得到含量相对固定的特征提取物。一般而言，天然药用植物的常规提取方法都能耳熟能详，但是最佳工艺参数的确定并非易事。工艺参数不同，提取物成分不同，其效果可能有天壤之别。选择不同工艺参数，将得到的提取物进行图谱检测，以清晰图谱和具有代表性的活性成分组为目标，从而得到本方法的特征提取物。虽然常规提取工艺为普通技术人员所熟知，但却从未有人将得到清晰图谱和具有代表性的活性成分组为标准来选择工艺参数。利用此方法，会使最终对于提取物的鉴别效果更好。
本发明中提到的特征提取物实际上就是药用植物中的一种活性成分组，药用植物可以看成是多个活性成分的组合体。由于药用植物中活性成分的复杂性和多样性，如果分离提取程序不当，势必会造成提取两种结果：IGD核磁共振碳谱指纹图谱严重重叠和复杂，难以解析；再加之IGD核磁共振碳谱灵敏度较低，使得具有特征的代表性活性成分组在IGD核磁共振碳谱图谱中难以突显出来。因此，需要选择适当的提取分离程序才能得到药用植物中一种活性成分组，具有特征性和代表性，这种活性成分组就叫特征提取物。由于特征提取物只是一个活性成分组，使得活性成分富集和简化，上面提到的两个难点迎刃而解。药用植物中的不同活性成分组可选择不同的分离提取程序而得到，因此，选择适当的提取分离程序是得到特征提取物的关键，也是本发明的关键。
本发明各活性成分的含量及该类活性成分的总含量的计算，是通过偶联公式将IGD核磁共振碳谱和分析定量手段偶联。和现有技术相比，本发明采用IGD13C NMR偶联指纹图谱具有下面几个特点：
①稳定性（重复性）：IGD13C NMR得到的化学位移数据为小数点后第二位，分辩性好，重复性好；HPLC、GC的非色谱条件（如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等）改变等，得到的保留时间数据变化很大，意味着整体色谱图形的变异，重复性不好。
②整体性（全面性）：IGD13C NMR指纹图谱中包含样品中的每一个活性成分碳的相应谱峰；HPLC、GC、UV、IR、MS不存在这种关系。
③可靠性（单一性）：IGD13C NMR谱峰与样品中不同活性成分及其不同基团上的碳是严格的一一对应关系；HPLC、GC、UV、IR、MS不存在这种关系。
④可行性（易辨性）：IGD13C NMR指纹图谱规律性很强，一般情况下，可归属图谱中的每一个碳峰；HPLC、GC需要对照品；IR不易解析；UV信息量少；MS则有离子化程度和基质干扰等问题。
本发明中提到的标准参照品是用以定量分析的参照品，它可以是特征提取物活性成分组中的某一活性成分，叫做内标，也可以是另外添加的任意一个化合物，叫做外标。IGD核磁共振碳谱指纹图谱只能表明特征提取物中有哪些活性成分，以及这些活性成分之间的定量比例，而这些活性成分的绝对含量必须通过标准参照品和其他分析定量手段，再通过偶联公式而得到。
本发明针对药用植物中活性成分的多样性、复杂性及其他单一手段完成的指纹图谱的局限性，创造性地利用核磁共振碳谱技术在分子结构分析方面的优势以及与核磁共振氢谱、紫外、红外、质谱、高效液相等现有技术相比所具有的特点，构建IGD核磁共振碳谱指纹图谱技术，能够十分准确地反映药用植物中含有哪些活性成分以及它们之间的比例及总量，达到准确地对药用植物品种的鉴别和药用植物源产品质量的评价的目的。
附图说明
图1-1-1为实施例1中河南嵩县箭叶淫羊藿药材提取方法1沉淀部分IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图1-1-2为实施例1中河南嵩县箭叶淫羊藿药材提取方法2沉淀部分IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图1-1-3为实施例1中河南嵩县箭叶淫羊藿药材提取方法2树脂部分IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图1-2-1-a为实施例1中吉林丹东朝鲜淫羊藿药材IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图1-2-1-b为实施例1中吉林丹东朝鲜淫羊藿药材IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图1-2-2-a为实施例1中辽宁本溪朝鲜淫羊藿药材IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图1-2-2-b为实施例1中辽宁本溪朝鲜淫羊藿药材IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图1-2-3-a为实施例1中河南嵩县箭叶淫羊藿药材IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图1-2-3-b为实施例1中河南嵩县箭叶淫羊藿药材IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图2-1-1-a为实施例2中提取物A外标法（外标双香豆素）IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图2-1-1-b为实施例2中提取物A外标法（外标双香豆素）IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图2-1-2-a为实施例2中提取物B称量法（外标双香豆素）IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图2-1-2-b为实施例2中提取物B称量法（外标双香豆素）IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图2-1-3-a为实施例2中提取物C称量法（外标双香豆素）IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图2-1-3-b为实施例2中提取物C称量法（外标双香豆素）IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图2-2-1-a为实施例2中提取物B称量法（外标对苯二酚）IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图2-2-1-b为实施例2中提取物B称量法（外标对苯二酚）IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图2-2-2-a为实施例2中提取物D称量法（外标对苯二酚）IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图2-2-2-b为实施例2中提取物D称量法（外标对苯二酚）IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图3-1-1为实施例3中河南市售冬凌草1提取方法1浓缩膏的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图3-1-2为实施例3中河南市售冬凌草1提取方法2沉淀部分IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图3-1-3为实施例3中河南市售冬凌草1提取方法2树脂部分（70%）IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图3-1-4为实施例3中河南市售冬凌草1提取方法2树脂部分（80%）IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图3-1-5为实施例3中河南市售冬凌草1提取方法2树脂部分（90%）IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图3-2-1-a为实施例3中河南市售冬凌草2药材IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图3-2-1-b为实施例3中河南市售冬凌草2药材IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图3-2-2-a为实施例3中河南市售冬凌草3药材IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图3-2-2-b为实施例3中河南市售冬凌草3药材IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图3-2-3-a为实施例3中河南济源冬凌草药材IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图3-2-3-b为实施例3中河南济源冬凌草药材IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图4-1-a为实施例4中薄荷素油产品A IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图4-1-b为实施例4中薄荷素油产品A薄荷醇类IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图4-1-c为实施例4中薄荷素油产品A薄荷酮类IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图4-2-a为实施例4中薄荷素油产品B IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图4-2-b为实施例4中薄荷素油产品B薄荷醇类IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图4-2-c为实施例4中薄荷素油产品B薄荷酮类IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图4-3-a为实施例4中薄荷素油产品C IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图4-3-b为实施例4中薄荷素油产品C IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步地详细描述，但本发明的保护范围并不局限于此。
本发明的方法适合所有类别的药用植物。IGD核磁共振碳谱指纹图谱的研究
步骤1）：特征提取物的获得
选择最佳提取分离方法程序，可获取一种或几种具有代表性的活性成分组提取物，这种提取物称之为特征提取物（The CharacteristicExtracts,CE）。这种特征提取物应具有原药用植物中的一些代表性活性成分组，对于同种同地同采摘期的药用植物，是具体的、特征的和含量相对固定的。例如，大量的研究证明，丹参的活性成分组应是丹参酮和丹酚酸两大类化学成分，研究丹参指纹图谱时，其特征提取物中的代表性活性成分组应是丹参酮类和丹酚酸类。因此，特征提取物的获得是指纹图谱研究最关键的一步，其成功与否，是指纹图谱研究的重点和难点。
步骤2）：IGD核磁共振碳谱指纹图谱的测定
将特征提取物作为待测样品进行IGD核磁共振碳谱图谱测定。主要检测样品的全图谱和各段放大图谱，要求图谱清晰，便于比较。得到的IGD核磁共振碳谱指纹图，用以定性鉴定。
步骤3）：特征提取物中标准参照品的绝对含量的测定
通过一定的分析定量手段（高效液相、气相色谱、薄层色谱法和称量法等）得到待测样品中标准参照品（可以是某一活性成分作为内标，也可以是外加参照品作为外标）的含量。
步骤4）：IGD核磁共振碳谱指纹图谱的解析
解析分为核磁共振碳谱碳峰的归属指认和活性成分组中各活性成分含量及总量的计算。
由于碳谱指纹图谱是特征提取物各种活性成分的混合谱，许多化学位移相近的碳峰，其相对大小仅靠文献数据难以确定，所以解析难度很大。为此，需要对其活性成分进行重新的分离提取，在相同条件下进行碳谱测定，然后进行归属指认，即可得到准确可靠的结论。该步骤是指纹图谱研究工作量最大的一步，也是其另一个重点和难点。因此本发明也可以用来鉴别和分析未知物。
各活性成分含量及总量的计算可根据IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测和标准参照品绝对含量的结果及IGD核磁共振碳谱指纹图谱公式进行计算，其关键在于选择活性成分组中各活性成分的碳峰指定特征峰。虽然碳谱的化学位移δ值范围非常宽（300-600），且碳峰都是一根根棒峰，重叠性较小，但是，IGD核磁共振碳谱指纹图谱是多个活性成分的混合谱，不可避免会引起一根根棒峰的拥挤，甚至重叠。为了使计算结果准确，选择化学位移差别较大的活性成分组中各活性成分碳峰指定特征峰是必要的。
根据药用植物不同活性成分的特点需要选择不同的活性成分碳峰指定特征峰。选择原则如下：①同类化合物的指定特征峰最好为各个化合物位置相同的碳碳峰；②每个化合物的指定特征峰与其他碳峰之间化学位移差别较大；③各个化合物的指定特征峰之间化学位移差别较大；④影响各个化合物的指定特征峰本身的化学位移效应差别较大。例如，淫羊藿的主要活性成分是4'位甲氧基-8-异戊烯基黄酮醇苷化合物，选择C-3碳峰作为该类活性成分碳峰指定特征峰：其原因为C-3碳峰之间化学位移差别较大，且不与其他碳化学位移重叠；3-OH无苷化时，C-3化学位移δC 136.0左右；因3-OH的苷化，C-3信号向高场移动0.6-2.0，化学位移δC 135.0左右。冬凌草的主要活性成分是对映贝壳杉烷型二萜化合物，选择C-17双键碳碳峰作为该类活性成分碳峰指定特征峰：其原因为C-17为双键碳，与其他碳化学位移差别较大，易识别；且不同二萜化合物C-17碳峰之间化学位移也有一定差别。薄荷素油的主要活性成分是单萜类醇、酮、醚等挥发性成分。选择C-1碳峰作为该类活性成分碳峰指定特征峰：其原因为C-1为连氧碳,与其他碳化学位移差别较大，易识别；且不同单萜化合物C-1碳峰之间化学位移也有一定差别。
仪器、试剂与材料
核磁共振波谱仪：Bruker DPX 400型。
质谱仪：Waters Micromass Q-Tof MicroTM型。
高效液相色谱仪：Agilent 1200型。
气相色谱仪：福立9710型。
2000mL蒸馏烧瓶、5000mL蒸馏烧瓶、球型冷凝管、2000mL分液漏斗。
DE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。
DEF-6020型真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。
淫羊藿：分别采摘自吉林丹东、辽宁本溪和河南嵩县。
冬凌草：收购自河南不同药材公司。
薄荷素油：购自不同厂家。
淫羊藿苷、冬凌草甲素和薄荷脑：化学对照品，购自中国生物药品检定所。
甲醇：色谱纯（天津市四友精细化学品有限公司）及分析纯（天津市化学试剂一厂）。
实施例1：淫羊藿药材IGD核磁共振碳谱指纹图谱
本实施例中活性成分所对应的中文名为：
Epimedoside C：淫羊藿新苷C；Acuminatin：淫羊藿苷；
Epimedokoreanoside I：朝藿苷I；Desmethylanhydroicaritin：去甲基脱水-淫羊藿素；
Caohuoside A：朝藿苷A；Caohuoside E：朝藿苷E；
Icariin：淫羊藿苷；Icariside II：淫羊藿次苷II；
Icaritin-3-rhamnoside：淫羊藿素-3-鼠李糖基黄酮；
3′″-carbonyl-2″-β-L-quinovosyl icariin：3′″-羰基-2″-β-L-奎诺糖基淫羊藿苷；
3′″-carbonyl-2″-β-L-quinovosyl icariside II：3′″-羰基-2″-β-L-奎诺糖基淫羊藿次苷Ⅱ；
Epimedin A：朝藿定A；Epimedin B：朝藿定B；Epimedin C：
朝藿定C；Epimedin K：朝藿定K；
Sagittatoside A：箭藿苷A；Sagittatoside B：箭藿苷B。
（1）药材特征提取物制备
1）最佳提取分离程序的选择（以河南嵩县箭叶淫羊藿为例）
①提取方法1
称取粉碎后的河南嵩县箭叶淫羊藿叶子，用其重量10倍（mL/g）体积的0.1%v NaOH的乙醇水溶液回流提取3次，每次1h；提取液过滤、合并后减压浓缩至淫羊藿重量1~2倍(mL/g)体积，用稀HCl调PH=2，静置12h，过滤，得沉淀，干燥后备用。河南嵩县箭叶淫羊藿药材提取方法1沉淀部分的IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图1-1-1。
②提取方法2
称取粉碎后的河南嵩县箭叶淫羊藿叶子，用其重量10倍（mL/g）体积的70%v的乙醇水溶液回流提取2次，每次2h；提取液过滤、合并后减压浓缩至淫羊藿重量4~4.5倍(mL/g)体积，用20%v的乙醇水溶液稀释至浓缩液体积的2.5倍，静置后离心，沉淀，干燥后备用。河南嵩县箭叶淫羊藿药材提取方法2沉淀部分IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图1-1-2。上清液上Diaion HP20树脂柱，以20%v、70%v和95%v乙醇水溶液梯度洗脱，收集70%v乙醇水溶液洗脱液，减压浓缩至膏状，干燥后粉碎。河南嵩县箭叶淫羊藿药材提取方法2树脂部分IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图1-1-3。
③最佳提取分离程序的确定
河南嵩县箭叶淫羊藿药材提取方法1沉淀部分IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，主要显示淫羊藿苷的特征信号：157.6(C-2),134.9(C-3),178.5(C-4),159.3(C-5),98.3(C-6),160.7(C-7),108.5(C-8),153.2(C-9),105.8(C-10),122.5(C-1′),130.8(C-2′,6′),114.3(C-3′,5′),161.6(C-4′),21.6(C-11),122.4(C-12),131.3(C-13),25.7(C-14),18.1(C-15),55.7(OCH3),102.2(C-1″),70.3(C-2″),70.5(C-3″),71.3(C-4″),70.9(C-5″),17.7(C-6″),100.8(C-1′″),73.6(C-2′″),76.8(C-3′″),69.9(C-4′″),77.4(C-5′″),60.8(C-6′″)。其他4'位甲氧基-8-异戊烯基黄酮醇苷化合物的特征信号未见显示。
河南嵩县箭叶淫羊藿药材提取方法2沉淀部分IGD核磁共振碳谱指纹图谱未见淫羊藿苷等4'位甲氧基-8-异戊烯基黄酮醇苷化合物的特征信号，HPLC检测，该沉淀中淫羊藿苷质量百分含量仅为0.1%，进一步证明了上述结果。
河南嵩县箭叶淫羊藿药材提取方法2树脂部分IGD核磁共振碳谱指纹图谱显示多种4'位甲氧基-8-异戊烯基黄酮醇苷化合物的特征信号，且比例均可清楚的显示。HPLC检测，该样品中淫羊藿苷质量百分含量为3%，与其余样品相比有显著提升，证明了上述结果。因此，将提取方法2得到的树脂部分的程序确定为特征提取物最佳提取分离程序，该部分作为特征提取物用以IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测。
2）优选后的特征提取物制备方法
称取粉碎后的淫羊藿叶子，用其重量10倍（mL/g）体积的70%v的乙醇水溶液回流提取2次，每次2h；提取液过滤、合并后减压浓缩至淫羊藿重量4~4.5倍(mL/g)体积，用20%v的乙醇水溶液稀释至浓缩液体积的2.5倍，静置后离心，上Diaion HP20树脂柱，以20%v、70%v和95%v乙醇水溶液梯度洗脱，收集70%v乙醇水溶液洗脱液，减压浓缩至膏状，干燥后粉碎，得淫羊藿黄酮醇苷特征提取物（CE）。
（2）特征提取物IGD核磁共振碳谱测试
取淫羊藿黄酮醇苷特征提取物80mg，溶于0.5mL DMSO-d6中，作IGD核磁共振碳谱图谱，即得到IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
1）鉴别
特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，应清楚地显示4'位甲氧基-8-异戊烯基黄酮醇苷化合物的特征信号：δC 55.8左右为C-4'位甲氧基碳信号；
δC 25.8,18.2左右分别为异戊烯基上14和15位甲基碳信号，21.8左右为异戊烯基上的亚甲基碳信号，122.5,131.5左右分别为异戊烯基上12和13位双键碳信号；δC 159.4,98.5,160.9或162.0,108.7,153.1,105.9左右分别为A环5,6,7,8,9和10位苯环碳信号，122.4,130.9×2,114.5×2左右，161.7-162.0分别为B环1′，2'和6',3'和5',4'位苯环碳信号，178.3-178.6为黄酮醇类化合物C-4羰基信号，157.1-157.7,134.2-136.1为黄酮醇类化合物C-2、C-3信号。
2）特征峰选择
淫羊藿的主要活性成分是4'位甲氧基-8-异戊烯基黄酮醇苷化合物，基本骨架为式1。经过大量研究，选择C-3碳峰作为该类活性成分碳峰指定特征峰，其原因为C-3碳峰之间化学位移差别较大，且不与其他碳化学位移重叠：3-OH无苷化时，C-3化学位移δC 136.0左右。因3-OH的苷化，C-3信号向高场移动0.6-2.0，化学位移δC 135.0左右。
3）不同品种不同产地主要淫羊藿黄酮醇苷活性成分特征峰相对比例测定结果如下：
①吉林丹东朝鲜淫羊藿
IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图1-2-1-a，以及特征峰局部拉宽放大图见1-2-1-b。
②辽宁本溪朝鲜淫羊藿
IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图1-2-2-a，以及特征峰局部拉宽放大图见1-2-2-b。
③河南嵩县箭叶淫羊藿
IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图1-2-3-a，以及特征峰局部拉宽放大图见1-2-3-b。
（4）采用HPLC测定不同品种不同产地淫羊藿药材中主要活性成分标准参照品淫羊藿苷(icariin)的含量
分析条件：
流动相：乙腈：水=30：70；色谱柱：C18（250*4.6mm，5um）
检测波长：270nm 流速1ml/min
样品处理方法：
药材的前处理方法依照2010版药典中方法（每个样品平行处理三份）：取淫羊藿药材粉末（过三号筛）约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇20ml，称定重量，超声处理1h，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
不同品种不同产地药材淫羊藿苷含量测定结果：
（5）不同品种不同产地药材淫羊藿黄酮醇苷含量测定结果
根据上述淫羊藿IGD核磁共振碳谱指纹图谱所测淫羊藿药材中各主要活性成分峰强度比例和HPLC所测标准参照品淫羊藿苷质量百分含量，通过偶联公式计算结果如下：
从上表可看出，吉林丹东产朝鲜淫羊藿中淫羊藿苷和8-异戊烯基黄酮醇苷化合物总量较高，是8-异戊烯基黄酮醇苷类化合物的较好原料。
（6）结论
综上所述，淫羊藿的IGD核磁共振碳谱指纹图谱和数据能准确地反映淫羊藿特征性化学成分的存在、结构以及成分比例，可作为淫羊藿基源鉴定的依据。
实施例2：淫羊藿提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱(外标法)
（1）药材特征提取物制备
选择不同厂家淫羊藿提取物产品作为特征提取物。
（2）特征提取物IGD核磁共振碳谱测试
方法1：取淫羊藿提取物50mg+双香豆素（Dicoumarolum）(外标，纯度99.8%，分子式C19H12O6，分子量：336.31)5mg，溶于0.5mLDMSO-d6中，作IGD核磁共振碳谱图谱，即得到IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
方法2：取淫羊藿提取物55mg+对苯二酚(外标，纯度99.8%，分子式C6H6O2；分子量110.11)3mg，溶于0.5mL DMSO-d6中，作IGD核磁共振碳谱图谱，即得到IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
1）鉴别
淫羊藿提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，应清楚地显示4'位甲氧基-8-异戊烯基黄酮醇苷化合物的特征信号。
外标双香豆素(δC 163.8,162.5,151.9,131.8,124.0,123.5,117.1,116.1,102.4,19.5)或对苯二酚(δC 149.9,115.9)也应有清晰的显示。
2）特征峰选择
淫羊藿提取物产品特征峰同实施例1。外标双香豆素选择δ163.7左右C-2碳峰作为该化合物碳峰指定特征峰，其原因为C-2碳峰与淫羊藿提取物产品碳峰之间化学位移差别较大，且不与其他碳化学位移重叠；外标对苯二酚选择δ149.7左右低场碳峰作为该化合物碳峰指定特征峰，原因同上。
3）不同厂家淫羊藿提取物主要淫羊藿黄酮醇苷活性成分及其相对特征峰比例测定结果如下：
①提取物A（外标双香豆素）
IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图2-1-1-a，特征峰局部拉宽放大图见2-1-1-b。
②提取物B（外标双香豆素）
IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图2-1-2-a，特征峰局部拉宽放大图见2-1-2-b。
③提取物C（外标双香豆素）
IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图2-1-3-a，特征峰局部拉宽放大图见2-1-3-b。
④提取物B（外标对苯二酚）
IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图2-2-1-a，特征峰局部拉宽放大图见2-2-1-b。
⑤提取物D（外标对苯二酚）
IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图2-2-2-a，特征峰局部拉宽放大图见2-2-2-b。
（4）结论
综上所述，说明IGD核磁共振碳谱指纹图谱技术标准参照品除了采用内标外，也可以采用外标。本实施例中，淫羊藿提取物B分别采用两种外标，结果相似。
实施例3：冬凌草药材IGD核磁共振碳谱指纹图谱
（1）冬凌草药材特征提取物制备
1）最佳提取分离程序的选择（以河南市售冬凌草1为例）
①提取方法1
称取粉碎后的冬凌草地上部分，用其重量8倍（mL/g）体积的95%v的乙醇水溶液回流提取2次，每次2h；提取液过滤、合并后减压浓缩至药材重量0.7倍(mL/g)体积，直接加入活性碳吸附，抽滤后，蒸干备用。河南市售冬凌草1提取方法1IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图3-1-1。
②提取方法2
称取粉碎后的冬凌草地上部分，用其重量8倍(mL/g)体积的95%v的乙醇水溶液回流提取2次，每次2h；提取液过滤、合并后减压浓缩至药材重量1.5-1.7倍(mL/g)体积，加入1v倍水溶液，静置12小时后离心，沉淀，干燥后备用。河南市售冬凌草1沉淀部分IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图3-1-2。上清液上Diaion HP20树脂柱，以水、20%v、70%v乙醇水溶液梯度洗脱，收集70%v乙醇水溶液洗脱液，减压浓缩至膏状，干燥后粉碎，得冬凌草二萜特征提取物（CE）。河南市售冬凌草1树脂部分（70%）IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图3-1-3。上清液上Diaion HP20树脂柱，以水、20%v、80%v乙醇水溶液梯度洗脱，收集80%v乙醇水溶液洗脱液，减压浓缩至膏状，干燥后粉碎，得冬凌草二萜特征提取物（CE）。河南市售冬凌草1树脂部分（80%）IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图3-1-4。上清液上DiaionHP20树脂柱，以水、20%v、90%v乙醇水溶液梯度洗脱，收集90%v乙醇水溶液洗脱液，减压浓缩至膏状，干燥后粉碎，得冬凌草二萜特征提取物（CE）。河南市售冬凌草1树脂部分（90%）IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图3-1-5。
③最佳提取分离程序的确定
河南市售冬凌草1提取方法1浓缩膏IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，主要显示齐墩果酸、熊果酸等三萜化合物的特征信号。冬凌草甲素（Oridonin）、冬凌草乙素（Ponicidin）等二萜化合物的特征信号未见显示。
河南市售冬凌草1提取方法2沉淀部分IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，主要显示齐墩果酸、熊果酸等三萜化合物的特征信号。冬凌草甲素（Oridonin）、冬凌草乙素（Ponicidin）等二萜化合物的特征信号未见显示。
河南市售冬凌草1提取方法2树脂（70%）部分IGD核磁共振碳谱指纹图谱显示中，主要显示齐墩果酸、熊果酸等三萜化合物的特征信号。冬凌草甲素（Oridonin）的特征信号有显示，但信号较弱，且其他二萜化合物的特征信号未见显示。
河南市售冬凌草1提取方法2树脂（80%）部分IGD核磁共振碳谱指纹图谱显示中，主要显示齐墩果酸、熊果酸等三萜化合物的特征信号。冬凌草甲素（Oridonin）的特征信号有较强显示，但其他二萜化合物的特征信号信号较弱。
河南市售冬凌草1提取方法2树脂（90%）部分IGD核磁共振碳谱指纹图谱显示中，主要显示冬凌草甲素（Oridonin）、冬凌草乙素（Ponicidin）、冬凌草素D（Rubescensin D）以及其他多种二萜化合物的特征信号，且比例均可清楚的显示。因此，将该提取方法确定为特征提取物最佳提取分离程序，该部分作为特征提取物用以IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测。
2）特征提取物制备方法
称取粉碎后的冬凌草地上部分，用其重量8倍（mL/g）体积的95%v的乙醇水溶液回流提取2次，每次2h；提取液过滤、合并后减压浓缩至药材重量1.1~1.2倍(mL/g)体积，加入1v倍水溶液，静置12小时后离心，上Diaion HP20树脂柱，以水、20%v、80~90%v乙醇水溶液梯度洗脱，收集80~90%v乙醇水溶液洗脱液，减压浓缩至膏状，干燥后粉碎，得冬凌草二萜特征提取物（CE）。
（2）特征提取物IGD核磁共振碳谱测试
取冬凌草二萜特征提取物200mg，溶于0.5mLC5D5N中，作IGD核磁共振碳谱图谱，即得到IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
1）鉴别
特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，应清楚地显示冬凌草甲素（Oridonin）、冬凌草乙素（Ponicidin）、冬凌草素D（Rubescensin D）等二萜化合物的特征信号。
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| oridonin | 74.6 | 30.4 | 39.2 | 33.9 | 60.5 | 73.4 | 98.2 | 62.8 | 54.1 | 41.6 |
| ponicidin | 71.9 | 72.7 | 39.8 | 33.5 | 63.0 | 72.7 | 96.2 | 58.0 | 45.7 | 47.5 |
| Rubescensin D | 72.9 | 30.8 | 39.0 | 33.4 | 63.3 | 210.6 | 90.1 | 59.9 | 58.7 | 48.8 |
| 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | |
| oridonin | 20.2 | 30.8 | 43.8 | 73.0 | 209.0 | 153.1 | 119.0 | 33.2 | 22.1 | 63.8 |
| ponicidin | 19.7 | 26.6 | 40.9 | 69.6 | 203.0 | 150.1 | 117.8 | 30.6 | 22.9 | 97.1 |
| Rubescensin D | 22.8 | 32.4 | 43.4 | 73.8 | 204.6 | 152.8 | 116.9 | 34.0 | 23.0 | 82.3 |
2）特征峰选择
冬凌草的主要活性成分是对映贝壳杉烷型二萜化合物。经过大量研究，选择C-17双键碳碳峰作为该类活性成分碳峰指定特征峰，其原因为C-17为双键碳，与其他碳化学位移差别较大，易识别；且不同二萜化合物C-17碳峰之间化学位移也有一定差别。
3）不同来源冬凌草主要二萜活性成分特征峰相对比例测定结果如下：
①河南市售冬凌草2
IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图3-2-1-a，特征峰局部拉宽放大图见3-2-1-b。
②河南市售冬凌草3
IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图3-2-2-a，特征峰局部拉宽放大图见3-2-2-b。
③河南济源冬凌草
IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图3-2-3-a，特征峰局部拉宽放大图见3-2-3-b。
（4）采用HPLC测定不同来源冬凌草药材中主要活性成分标准参照品冬凌草甲素（Oridonin）的质量百分含量。
分析条件：
流动相：甲醇：水=55：45 色谱柱：C18（250*4.6mm，5um）
检测波长：239nm 流速0.8ml/min
样品处理方法：
药材的前处理方法依照2010版药典中方法（每个样品平行处理三份）：取冬凌草药材粉末（过三号筛）约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀20ml，称定重量，超声处理1h，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
不同来源冬凌草药材冬凌草甲素含量测定结果：
（5）不同来源冬凌草主要二萜含量测定结果
根据上述冬凌草IGD核磁共振碳谱指纹图谱所测冬凌草药材中各主要活性成分峰强度比例和HPLC所测标准参照品冬凌草甲素质量百分含量，通过偶联公式计算结果如下：
从上表可看出，河南市售冬凌草2、河南济源冬凌草中冬凌草甲素（Oridonin）、冬凌草乙素（Ponicidin）、冬凌草素D（Rubescensin D）等对映贝壳杉烷型二萜化合物及总量较高，是对映贝壳杉烷型二萜化合物的较好原料。
（6）结论
综上所述，冬凌草的IGD核磁共振碳谱指纹图谱和数据能准确地反映冬凌草特征性化学成分的存在、结构以及成分比例，可作为冬凌草基源鉴定的依据。
实施例4：薄荷素油IGD核磁共振碳谱指纹图谱
（1）产品特征提取物制备
选择不同厂家薄荷素油产品直接作为特征提取物。
（2）特征提取物IGD核磁共振碳谱测试
取薄荷素油100mg，溶于0.5mLCDCl3中，作IGD核磁共振碳谱图谱，即得到IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
1）鉴别
薄荷素油的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，应清楚地显示薄荷脑、薄荷酮、桉油精等化合物的特征信号：
| 活性成分 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| (-)薄荷脑 | 71.3 | 49.9 | 23.0 | 34.4 | 31.5 | 44.8 | 25.6 | 15.8 | 20.9 | 22.1 |
| (+)薄荷醇 | 67.4 | 49.6 | 25.8 | 34.4 | 31.3 | 40.3 | 26.2 | 17.8 | 19.5 | 19.8 |
| (-)薄荷酮 | 212.8 | 55.8 | 27.8 | 26.8 | 35.4 | 50.7 | 25.9 | 18.5 | 21.0 | 22.3 |
| (+)薄荷酮 | 215.2 | 57.1 | 27.3 | 29.6 | 34.0 | 48.1 | 26.8 | 19.8 | 20.9 | 21.1 |
| 桉油精 | 69.5 | 33.1 | 28.9 | 31.7 | 73.3 | 31.7 | 28.9 | 23.0 | 23.0 | 27.6 |
2）特征峰选择
薄荷素油的主要活性成分是单萜类醇、酮、醚等挥发性成分。经过大量研究，选择C-1碳峰作为该类活性成分碳峰指定特征峰，其原因为C-1为连氧碳，与其他碳化学位移差别较大，易识别；且不同单萜化合物C-1碳峰之间化学位移也有一定差别。
3）不同厂家薄荷素油产品中主要活性成分特征峰相对比例测定结果如下：
①产品A
IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图4-1-a，特征峰局部拉宽放大图见4-1-b（薄荷醇类）与4-1-c（薄荷酮类）。
②产品B
IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图4-2-a，特征峰局部拉宽放大图见4-2-b（薄荷醇类）与4-2-c（薄荷酮类）。
③产品C
IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图4-3-a，特征峰局部拉宽放大图见4-3-b。
（4）采用GC测定不同厂家薄荷素油产品中标准参照品薄荷脑含量
分析条件：
仪器：福立9710；色谱柱：FFAP 0.32mm*32m
柱温：程升；进样口：250℃；检测器：250℃
载气：2mL/min；空气：300mL/min；氢气：30mL/min；进样量：2
不同厂家薄荷素油产品中薄荷脑含量测定结果：
| 样品 | A | B | C |
| 薄荷脑质量百分含量(%) | 52.0 | 65.2 | 10.3 |
（5）不同厂家薄荷素油产品主要活性成分含量测定结果：
根据上述薄荷素油IGD核磁共振碳谱指纹图谱所测薄荷素油产品中各主要活性成分峰强度比例和GC所测标准参照品薄荷脑含量，通过偶联公式计算结果如下：
从上表可看出，薄荷素油产品A、B中薄荷脑、薄荷酮、桉油精等单萜类醇、酮、醚等挥发性成分及总量较高，是单萜类醇、酮、醚等挥发性成分的较好原料。
（6）结论
综上所述，薄荷素油的IGD核磁共振碳谱指纹图谱和数据能准确地反映薄荷素油产品特征性化学成分的存在、结构以及成分比例,可作为薄荷素油产品鉴定的依据。
Claims (8)
1.一种鉴别药用植物中活性成分组的方法，包括以下步骤：
1）对药用植物进行提取，得到含有活性成分组的药用植物特征提取物；
2）对所述特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出所述各活性成分相应标准参照品的特征峰峰强度；
3）通过定量分析手段得到所述标准参照品的绝对含量；
4）利用所述各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品的特征峰峰强度的比值和所述绝对含量，计算出各活性成分的含量及活性成分组的含量；
采用具有获得清晰IGD核磁共振碳谱指纹图谱的提取工艺作为所述药用植物的提取方式；
步骤2）中，根据所述特征提取物的结构特性是从IGD核磁共振碳谱指纹图谱中选择碳峰作为各活性成分特征峰。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碳峰为：化学位移差别较大的活性成分组中各活性成分的碳峰。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述峰强度采用峰高法、面积积分法或重量法计算。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3）中所述定量分析手段为：高效液相、气相色谱、薄层色谱法或称量法。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2）和步骤3）中所述标准参照品为内标物或外标物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中所述标准参照品的绝对含量是指：用定量分析手段测定的标准参照品的质量百分含量。
7.根据权利要求1、2或6所述的方法，其特征在于，步骤4）中，计算各活性成分的含量的偶联公式为：
W标为步骤3）用定量分析手段测定的某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；
M标为所述某一活性成分对应的标准参照品的分子量；
h标为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；
W测为某一活性成分的质量百分含量；
M测为某一活性成分的分子量；
h测为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的某一活性成分的特征峰峰强度。
8.根据权利要求1、2或6所述的方法，其特征在于，所述活性成分组为：单味药用植物中的活性成分组或药用植物衍生品中的活性成分组。
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