CN103822888B - 赶黄草的质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了赶黄草的质量检测方法。通过同时检测赶黄草中的总黄酮和槲皮素的含量，达到有效的控制赶黄草的质量。本发明通过同时检测赶黄草中的总黄酮和槲皮素，有效控制赶黄草药材及提取物的质量，检测方法专属性强，分离度高，稳定，易于实验室以及工业大生产中产品的质量控制。

Description

赶黄草的质量检测方法

技术领域

本发明涉及赶黄草的质量检测方法。

背景技术

赶黄草为虎耳草科赶黄草属植物赶黄草PenthorumchinensePursh的干燥地上部分，收载于1993年版《湖南省中药材标准》。主含黄酮类、挥发油等成分。其中已确定没食子酸和槲皮素为已知具有抗乙肝病毒和保肝作用的成分，是赶黄草的有效成分。据现有文献资料，仅见对其化学成分的研究报道，以及含该药材的中成药肝苏颗粒用于治疗肝炎及抗肝纤维化等临床报道。但多年来未见《湖南省中药材标准》修正赶黄草项，并且该标准中主要以槲皮素的含量为标准，难以对赶黄草药材及其制剂进行全面评价和有效的质量控制。

申请号：201210490728.8，发明名称：扯根菜提取物的制备方法，其中公开了总黄酮的含量测定方法，采用紫外分光光度法在350nm吸光度下测定总黄酮含量。郭亚健，范丽，张珍兰，等.关于比色法测定总黄酮方法的探讨[J].药物分析杂志，2002，22(2):97；马陶陶，张群林，李俊，等.三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨[J].时珍国医国药，2008，19(1):54。

发明内容

本发明的技术方案是提供了赶黄草的质量检测方法。

本发明提供了赶黄草的质量检测方法，它包括检测赶黄草中的总黄酮和槲皮素；

其中，总黄酮的含量检测方法是采用UV法测定赶黄草中的总黄酮的含量，它包括如下步骤：

a、溶液的制备

芦丁对照品溶液的制备精确称取芦丁10.6mg于10mL烧杯中，以50%乙醇溶解，定容于100mL容量瓶中，浓度为0.106mg·mL^-1；

供试品溶液的制备精密称取赶黄草细粉约0.1g于50mL具塞锥形瓶中，100∶1的比例分别于5个锥形瓶中各加入70%乙醇溶液10mL，摇匀，密封，避光处静置1h，于超声波清洗器中超声提取1h，摇匀，静置冷却，取续滤液；

b、测定方法及测定波长的选择

取芦丁对照品溶液和供试品溶液各0.2mL于5mL容量瓶，加水至刻度，摇匀，加0.1mol·mL^-1三氯化铝溶液1mL，加水定容至10mL，摇匀静置30min，用紫外分光光度计扫描，测定波长为417nm；

槲皮素的检测方法包括薄层色谱检测法和高效液相色谱法；

其中，薄层色谱检测方法包括如下步骤：

a、供试品溶液制备：取赶黄草细粉，加入50%-70%的乙醇超声提取，滤过，滤液蒸干，残渣加水溶解，用石油醚萃取，弃去石油醚，水液加稀盐酸，置100℃水浴锅中水解，取出，迅速冷却，用乙酸乙酯振摇提取，合并乙酸乙酯液，用水洗涤，弃去水洗液，乙酸乙酯液蒸干，残渣加乙酸乙酯溶解，过滤，作为供试品溶液；

b、对照品溶液制备：取槲皮素对照品加乙酸乙酯溶解制成每1mL含0.5mg的对照品溶液；

c、分别取a步骤的供试品和对照品溶液，点样于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸（10∶8∶3）为展开剂，预饱和10min，上行展开，取出，晾干，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的亮黄色的斑点；再喷以1％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

所述的HPLC法测定赶黄草槲皮素的含量：

色谱条件：色谱柱：DikmaKromasilC₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-0.1％磷酸(52∶48)；检测波长：366nm；柱温：40℃；流速：1.0mL·min^-1；进样量：10μL。

其中，所述的槲皮素的检测方法中薄层色谱检测方法a步骤中乙醇浓度为70%。

其中，槲皮素的检测方法中槲皮素标准品Rf=0.47。

其中，所述的HPLC法测定赶黄草槲皮素的含量中，对照品溶液的制备方法为：精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的槲皮素对照品4.23mg置100mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得浓度为42.3μg·mL^-1的槲皮素对照品溶液；供试品溶液的制备：精密称取赶黄草粗粉0.5g，加入10mL甲醇，超声提取1h，过滤，取5mL加24%盐酸水解1.5h，蒸干，甲醇定容于5mL容量瓶，作为供试品溶液。

本发明通过同时检测赶黄草中的总黄酮和槲皮素的含量，达到有效的控制赶黄草的质量。本发明通过同时检测赶黄草中的总黄酮和槲皮素，有效控制赶黄草药材及提取物的质量，检测方法专属性强，分离度高，稳定，易于实验室以及工业大生产中产品的质量控制。

附图说明

图1赶黄草提取液和芦丁对照品溶液扫描图谱A芦丁对照品溶液B赶黄草提取液

图2芦丁标准吸收曲线

图3槲皮素薄层色谱非荧光斑点（其中，1、2、3槲皮素提取液4槲皮素对照品）

图4槲皮素薄层色谱荧光斑点（其中，1、2、3槲皮素提取液4槲皮素对照品）

图5槲皮素对照品溶液HPLC色谱图

图6赶黄草供试品溶液HPLC色谱图

图7槲皮素对照品标准曲线图

图8槲皮素紫外吸收图（A槲皮素对照品溶液B赶黄草提取液）

具体实施方式

实施例1UV法测定赶黄草中的总黄酮的含量

1溶液的制备

芦丁对照品溶液的制备精确称取芦丁10.6mg于10mL烧杯中，以50%乙醇溶解，定容于100mL容量瓶中，浓度为0.106mg·mL^-1。

供试品溶液的制备精密称取细粉约0.1g于50mL具塞锥形瓶中，100∶1的比例分别于5个锥形瓶中各加入70%乙醇溶液10mL，摇匀，密封，避光处静置1h，于超声波清洗器中超声提取1h，摇匀，静置冷却，取续滤液。

2测定方法及测定波长的选择

取芦丁对照品溶液和供试品溶液各0.2mL于5mL容量瓶，加水至刻度，摇匀，加0.1mol·mL^-1三氯化铝溶液1mL，加水定容至10mL，摇匀静置30min，用紫外分光光度计扫描，对照品溶液和供试品溶液均在417nm处有最大吸收（图1），故以417nm作为其测定波长。

3标准曲线的绘制

分别取芦丁对照品溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mL，按2.1.2项下方法测定，在波长417nm处测定吸光度A，测得结果（表1）。

表1总黄酮线性试验测定结果

以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标，绘制标准曲线（图2），得吸光度A与芦丁浓度C的回归方程式：A=26.456C+0.0032，r=0.9999。

4精密度试验

取同一对供试品溶液，按2.1.3项下方法在417nm测定吸光度A，计算得RSD为0.47%，（表2）。试验结果表明仪器精密度良好。

表2总黄酮精密度试验结果

5重复性试验

取本品细粉5份，每份0.1g，精密称定，照2.1.1项下方法制备供试品溶液，在波长417nm处测定吸光度A，并采用标准曲线计算总黄酮的含量，得其RSD为1.52%，（表3），试验结果表明本法重复性良好。

表3总黄酮重复性试验结果

6稳定性试验

分别取对照品溶液和供试品溶液，按2.1.2项下方法测定吸光度，每10min测量一次，结果见表4。试验结果表明供试品溶液在60min内稳定。

表4总黄酮稳定性试验结果

7回收率试验

精密称取已知含量(0.9907％)的本品9份，每份0.05g，分成3组，分别精密添加浓度为0.1252mg·mL^-1的槲皮素对照品溶液3，4，5mL，照2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.1.2项下方法测定，计算回收率，结果（表5）。

表5总黄酮回收率试验结果

试验结果表明本法具有良好的回收率。

8黄酮含量的测定

分别取本品供试品溶液，按2.1.2项下方法测定，并用标准曲线计算其含量，结果（表6）。

表6赶黄草黄酮含量测定结果(n＝3)

实施例2本发明紫外分光光度法测定总黄酮显色方法的选择

黄酮类化合物(Flavonoids)是以C₆-C₃–C₆结构为基本母核的色原烷或色原酮的衍生物，以其广泛的药理作用倍受青睐。而中药材中总黄酮的含量测定成为近年来研究黄酮化合物所关注的焦点。中药总黄酮的含量测定采用的比色法是被《中国药典》所采用的最常见的总黄酮测定方法，其中又以NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH比色法常用。这种方法以NaNO₂-Al(NO₃)₃为显色剂，在碱性条件下，利用其与黄酮物质生成红色铝螯合物为特征，以芦丁为对照，在510nm处测定吸光度，从而得到待测物质总黄酮的含量。郭亚建等曾对这种方法的专属性进行了讨论，发现具有邻二酚羟基的非黄酮类物质在芦丁显色的最大波长处(510nm左右)也有较强吸收而黄酮类成分黄芩素、山柰酚在此波长处没有吸收^[18]，

从而说明采用NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH比色法，以芦丁作为对照，不能排除非黄酮类物质的干扰，这种方法测定中药总黄酮含量的专属性不强。

在马陶陶等的研究中^[19]，具有典型结构的常见的黄酮类苷和苷元：金丝桃苷，芦丁，异鼠李素，山柰酚，AlCl₃显色前在421nm处无吸收，显色后均在芦丁的最大吸收峰421nm左右有较大的吸收。在现今的实验条件下，对于大多数黄酮类中药材而言，多含有黄酮苷，常见的苷在此波长处有较强吸收而非黄酮类物质在此处无吸收。因此以芦丁作为对照，AlCl₃比色法可以成为测定中药总黄酮含量的理想方法。

因此本研究采用芦丁作为对照品，采用AlCl₃比色法做为紫外测定赶黄草黄酮含量的方法。

仪器与试剂

1仪器

电热恒温干燥箱(DHG-9077A，上海精宏实验设备有限公司)；超声波清洗器(AS3120A，天津奥特赛恩思仪器有限公司)；电子天平(FA1104N，上海民桥精密仪器有限公司)；恒温水浴锅(余姚电讯仪器实业公司)；中药材粉碎机(浙江武义县屹立工具有限公司)；紫外灯(上海顾村电光仪器厂ZF-I型三用紫外分析仪)；戴安高效液相色谱仪(P680A四元低压梯度泵，PDA-100二极管阵列检测器，TCC-100柱温箱，Chromeleon色谱工作站)；双光束紫外-可见分光光度计(UV-2100，北京瑞利分析仪器公司)；药典4号筛(新乡市同心机械有限责任公司)。

2试剂和对照品

芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号080-9303)；槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所，批号0081-9304)；没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号0831-9501)；甲醇为色谱纯，其余试剂(无水乙醇、甲酸乙酯、甲酸、甲苯、三氯化铁、三氯化铝、甲烷、95%乙醇、盐酸、磷酸、三乙胺等)均为分析纯；水为重蒸馏水；硅胶G板(100×100mm，青岛海洋化厂工分厂)，临用前活化。

3实验材料

赶黄草商品药材由四川省泸州市古蔺肝苏药业有限公司赶黄草培养（种植）基地提供及泸州医学院生药教研室于古蔺、合江产地采集，均由生药教研室税丕先副教授鉴定为PenthorumchinensePursh。

取赶黄草，在电热恒温干燥箱中60℃干燥3h，粉碎并过4号筛，得赶黄草细粉，密封备用。

实施例3槲皮素的薄层色谱鉴别

取赶黄草细粉2.0g，加70％乙醇50mL，超声提取40min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL溶解，用石油醚提取两次，每次20mL，弃去石油醚，水液加稀盐酸20mL，置100℃水浴锅中水解1h，取出，迅速冷却，用乙酸乙酯振摇提取两次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，用水30mL洗涤，弃去水洗液，乙酸乙酯液蒸干，残渣加乙酸乙酯10mL溶解，过滤，作为供试品溶液^[13]。另取槲皮素对照品加乙酸乙酯溶解制成每1mL含0.5mg的对照品溶液。分别取上述供试品和对照品溶液各10μL，点样于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸（10∶8∶3）为展开剂，预饱和10min，上行展开，取出，晾干，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的亮黄色的斑点（图3）。喷以1％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点（图4）。

实施例4HPLC法测定赶黄草槲皮素的含量

1色谱条件

色谱柱：DikmaKromasilC₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-0.1％磷酸(52∶48)；检测波长：366nm；柱温：40℃；流速：1.0mL·min^-1；进样量：10μL。

2溶液的制备

对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的槲皮素对照品4.23mg置100mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得浓度为42.3μg·mL^-1的槲皮素对照品溶液。

供试品溶液的制备精密称取赶黄草粗粉0.5g，加入10mL甲醇，超声提取1h，过滤，取5mL加24%盐酸水解1.5h，蒸干，甲醇定容于5mL容量瓶。作为供试品溶液。

3系统适应性试验

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果（图5，6）。从图中可见，槲皮素的保留时间约为8.5min，槲皮素峰与其前后色谱峰的分离度均大于1.5，拖尾因子为1.01，理论塔板数以槲皮素峰计为4451。

4线性关系考察

精密吸取上述槲皮素对照品溶液1，2.5，5，7.5，10，15和20μL，按上述色谱条件进行测定，测定色谱峰面积。以峰面积A对进样量C(μg)进行线性回归，得回归方程:A=72.8967C+0.0459，r=0.9999。（图7），试验结果表明，槲皮素在0.042～0.846μg范围内，峰面积与进样量有良好的线性关系。

5精密度试验

精密吸取上述槲皮素对照品溶液10μL，连续进样6次，测定槲皮素峰面积，其RSD为0.60％(n＝6)，（表7）。结果表明仪器精密度良好。

表7槲皮素精密度试验结果(n＝6)

6稳定性试验

取本品的供试品溶液，分别于制备后0，4，8，12，24，48h进样测定，测得槲皮素峰面积RSD为1.30％(n＝6)，（表8）。结果表明供试品溶液在48h内稳定。

表8槲皮素稳定性试验结果(n＝6)

7重复性试验

取同一批赶黄草样品，按2.2.2项下供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，分别进样测定，测得槲皮素峰含量RSD为0.69％(n＝6)，（表9）。

试验结果表明本法具有良好的重复性。

表9槲皮素重复性试验结果(n＝6)

8回收率试验

精密称取已知含量(0.0876％)的本品9份，每份0.25g，分成3组，每组3份，分别精密添加浓度为0.0570mg·mL^-1的槲皮素对照品溶液3，4，5mL，照2.2.2项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件测定，并计算回收率，结果（表10）。

表10槲皮素回收率试验结果(n＝9)

试验结果表明本法具有较好的回收率。

9样品中槲皮素的含量测定

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液10μL，按2.2.1项下色谱条件测定，记录槲皮素的峰面积，并用外标法计算其含量，结果（表11）。

表11赶黄草中槲皮素含量测定结果(n＝3)

实施例5本发明槲皮素的薄层鉴别方法条件选择试验

发明人曾尝试过直接提取后直接点样，结果试用正丁醇-醋酸-水(4∶1∶5)、甲苯-甲酸乙酯-甲酸(8∶5∶1)、甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶2∶1)等展开系统，斑点都严重拖尾且分离不开。后来参考文献，使用石油醚以及乙酸乙酯各提取两次^[13]，甲苯-甲酸乙酯-甲酸(10∶8∶3)展开，可见光下，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同亮黄色斑点；紫外灯下，在供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同黄绿色的荧光斑点。

槲皮素可溶于乙醇，因此在喷显色剂时应注意控制量，过多的显色剂容易产生斑点漂移现象；过少显色不明显。

实施例6槲皮素含量测定方法选择

1提取方法的选择：

试验中针对配制供试品溶液的不同提取方法(超声、回流及索氏提取)，不同提取溶剂(甲醇提取后盐酸水解、2.3%盐酸甲醇、甲醇-25%盐酸)^[20][21]，不同浓度的酸水解(10％盐酸、15％盐酸、24％盐酸)^[20]，不同溶剂体积倍数(10、20、50、100倍)，不同提取时间(30、45、60、120min)及不同水解时间(10、30、60、90、120min)分别考察。结果以20倍量甲醇超声提取1h后24%盐酸水解1.5h含量最高，杂质峰较少。

2测定波长的选择：

采用二极管阵列检测器在190～500nm范围内分别扫描对照品、样品溶液中槲皮素峰的紫外吸收，对照品和样品中的槲皮素没食子酸分别在201.9、202.2nm和255.8、255.8nm及366.7、366.7有最大吸收，由于366nm干扰比201nm和255nm处小，故检测波长选择366nm。（图8）

3流动相的选择：

在流动相选择试验中，考察了甲醇-水-磷酸(55∶44.6∶0.4)；甲醇-0.5%磷酸-THF(35∶60∶5)；甲醇-0.1%磷酸溶液(48∶52)等的不同比例、pH值、流速及柱温。发现其分离效果均不理想，经摸索筛选采用本实验所用色谱条件为较好，样品中槲皮素与其他组分色谱峰得到较好分离。

Claims (4)

1.赶黄草的质量检测方法，其特征在于：它包括检测赶黄草中的总黄酮和槲皮素；

其中，总黄酮的含量检测方法是采用UV法测定赶黄草中的总黄酮的含量，它包括如下步骤：

a、溶液的制备：

芦丁对照品溶液的制备：精确称取芦丁10.6mg于10mL烧杯中，以50％乙醇溶解，定容于100mL容量瓶中，浓度为0.106mg·mL^-1；

供试品溶液的制备：精密称取赶黄草细粉0.1g于50mL具塞锥形瓶中，分别于5个锥形瓶中各加入70％乙醇溶液10mL，摇匀，密封，避光处静置1h，于超声波清洗器中超声提取1h，摇匀，静置冷却，取续滤液；

b、测定方法及测定波长的选择：

取芦丁对照品溶液和供试品溶液各0.2mL于5mL容量瓶，加水至刻度，摇匀，加0.1mol·mL^-1三氯化铝溶液1mL，加水定容至10mL，摇匀静置30min，用紫外分光光度计扫描，测定波长为417nm；

槲皮素的检测方法包括薄层色谱检测法和高效液相色谱法；

其中，薄层色谱检测方法包括如下步骤：

a、供试品溶液制备：取赶黄草细粉，加入50％-70％的乙醇超声提取，滤过，滤液蒸干，残渣加水溶解，用石油醚萃取，弃去石油醚，水液加稀盐酸，置100℃水浴锅中水解，取出，迅速冷却，用乙酸乙酯振摇提取，合并乙酸乙酯液，用水洗涤，弃去水洗液，乙酸乙酯液蒸干，残渣加乙酸乙酯溶解，过滤，作为供试品溶液；

b、对照品溶液制备：取槲皮素对照品加乙酸乙酯溶解制成每1mL含0.5mg槲皮素对照品的对照品溶液；

c、分别取a步骤的供试品和对照品溶液，点样于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸＝10∶8∶3为展开剂，预饱和10min，上行展开，取出，晾干，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的亮黄色的斑点；再喷以1％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

所述的高效液相色谱法测定赶黄草槲皮素的含量：

色谱条件：色谱柱：DikmaKromasilC₁₈，250mm×4.6mm，5μm；流动相：甲醇-0.1％磷酸＝52∶48；检测波长：366nm；柱温：40℃；流速：1.0mL·min^-1；进样量：10μL。

2.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：所述的槲皮素的检测方法中薄层色谱检测方法a步骤中乙醇浓度为70％。

3.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：槲皮素的检测方法中槲皮素对照品Rf＝0.47。

4.根据权利要求1所述的质量测定方法，其特征在于：所述的高效液相色谱法测定赶黄草槲皮素的含量中，对照品溶液的制备方法为：精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的槲皮素对照品4.23mg置100mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得浓度为42.3μg·mL^-1的槲皮素对照品溶液；供试品溶液的制备：精密称取赶黄草粗粉0.5g，加入10mL甲醇，超声提取1h，过滤，取5mL加24％盐酸水解1.5h，蒸干，甲醇定容于5mL容量瓶，作为供试品溶液。