CN1207553C - 总黄酮含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种测定柚或与柚总黄酮成份相同的物质中总黄酮含量的方法，(1)先将干燥后的柚子或其提取物溶解，配制成待测液，然后用标准纯度99.9%以上柚皮苷作对照品，配制成梯度的标准溶液，在283nm波长下，分别测定该标准溶液的吸光值，根据吸光值与浓度之间的对应关系建立标准曲线；(2)将待测液在283nm波长下测吸光值，根据所得吸光值，由标准曲线查得该待测液浓度，该浓度值即为待测液总黄酮含量，然后根据稀释倍数换算出柚子或其提取物总黄酮含量。本发明具有检测结果准确、针对性强；操作简便；稳定性好，易于控制；重复性好。本发明正被申请人使用在原料质量控制，如柚子中总黄酮含量；半成品质量控制，如柚提取物中总黄酮含量；以及成品质量控制，如出厂产品抽样检测总黄酮含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定物质含量的方法，特别是一种测定柚或与柚总黄酮成份相同的物质中总黄酮含量的方法。
背景技术
黄酮是自然界中广泛存在的一大类物质，很多植物所含黄酮并不以单一成份存在，而以几种结构相近或相似的黄酮共同存在，如柚，其所含黄酮主要为柚皮苷，还含有少量橙皮甙、野漆树苷等其它黄酮。测定总黄酮含量的方法很多，而具体针对柚中总黄酮含量的测定方法至今未见报道。现有测定总黄酮含量的方法中多以芦丁为标准对照品，以甲醇为溶剂，在360nm检测波长下，测定其吸光值，其吸光值与浓度之间存在线性关系，制作标准曲线，根据该标准曲线，从待测溶液的吸光值即可得出待测溶液的浓度，根据该浓度值可换算出待测物总黄酮含量。但由于以芦丁为标准对照品，其检测波长为360nm，而360nm处，柚皮苷的吸光值很小，由柚皮苷的紫外扫描图形可知，柚皮苷的紫外最大吸收峰为283±1nm，在360nm处，柚皮苷的吸光值已接近波谷，因此采用该方法测定柚中总黄酮含量，其测定结果严重偏小。另外，还有一种常用于检测总黄酮含量的方法，那就是将待测样品溶解于甲醇，在碱性条件下加入AlCl3溶液，让黄酮中的
结构与Al3+络合，然后以待测样品的标准品为对照，根据紫外分光光度法的基本原理，以紫外区最大吸收峰处的波长为检测波长，制作标准曲线。以相同方法对待测物进行预处理，测定待测液吸光值，由标准曲线可求得待测液浓度，最后换算出待测物总黄酮含量，该方法虽然应用广泛，但用于测定柚子中总黄酮含量时却很难控制，因为在检测过程中，其吸光值在不断变小，根据time-coursre试验，该方法用于检测柚子或其提取物中总黄酮含量时，稳定性较差，无法用于柚或其提取物中总黄酮含量测定。
发明内容
发明的目的就是提供一种准确、便捷测定柚或与柚总黄酮成份相同的物质中总黄酮含量的方法。
本发明可由以下方式来实现：(1)先将干燥后的柚子或其提取物溶解，配制成待测液，然后用标准纯度99.9％以上柚皮苷作对照品，配制成梯度的标准溶液，在283nm波长下，分别测定该标准溶液的吸光值，根据吸光值与浓度之间的对应关系建立标准曲线；(2)将待测液在283nm波长下测吸光值，根据所得吸光值，由标准曲线查得该待测液浓度，该浓度值即为待测液总黄酮含量，然后根据稀释倍数换算出柚子或其提取物总黄酮含量。溶解柚子和提取物以及配制柚皮苷标准溶液所用的溶剂为甲醇或无水乙醇。
本发明具有以下优点：
1、检测结果准确、针对性强。
本发明专门针对柚或其提取物中总黄酮含量的测定，283±1nm波长处的吸收，为
结构在紫外的最大吸收处，而柚中所含黄酮均具有该结构，因此283nm处的吸光值，为多种黄酮的总吸光值，测定结果比较准确。以柚粉(批号为2002-04-09)为例，利用HPLC法(中华人民共和国药典一部<2000版>化橘红项下提供)检测柚皮苷含量为10％，以芦丁为对照品，360nm为检测波长，测得其总黄酮含量为1％左右，以柚皮苷为对照品，Al3+络合法测得总黄酮含量为7％，本发明测得总黄酮含量为11％，测定结果见表1。可见本发明较之同类测定方法具有更高原可信度。另外，经加样回收试验表明，该方法加样回收率可达99％，测定结果可靠。
表1：批号为2002-04-09柚中黄酮含量测定比较
| 方 法 | 对照品 | 检测波长(nm) | 柚皮苷含量(％) | 总黄酮含量(％) |
| HPLC | 柚皮苷 | 283 | 10 | - |
| 芦丁对照法 | 芦丁 | 360 | - | 1 |
| Al3+络合法 | 柚皮苷 | 351 | - | 7 |
| 本发明 | 柚皮苷 | 283 | - | 11 |
2、操作简便
使用本发明步骤少，不需加碱及络合试剂，待测样品预处理后，即可利用紫外分光光度计进行检测，操作方便。
3、稳定性好，易于控制
本发明经time-coursre试验表明，其吸光值48小时内无变化，见图2、图3。而采用Al3+络合法测定柚及其提取物时，稳定性极差，其吸光值在24小时内不断变小。
4、重复性好
本发明对于同一样品，每次检测结果相对偏差不超过0.5％，见表2。
表2：批号为2002-04-09柚粉总黄酮含量四次测定结果比较表
| 检测日期 | 总黄酮含量(％) | RSD(％) |
| 2002.4.11 | 10.95 | 0.23 |
| 2002.6.24 | 10.94 | |
| 2002.7.8 | 10.98 | |
| 2003.1.6 | 11.01 |
本发明正被申请人使用在原料质量控制，如柚子中总黄酮含量；半成品质量控制，如柚提取物中总黄酮含量；以及成品质量控制，如出厂产品抽样检测总黄酮含量。
附图说明
下面结合附图，对本发明作进一步的描述。
图1为本发明柚皮苷紫外扫描图。
图2为本发明柚皮苷对照品TIME COURSE结果图，A为第1d吸光值随时间的变化。
图3为本发明柚皮苷对照品TIME COURSE结果图，B为第2d吸光值随时间的变化。
图4为本发明的标准曲线。
具体实施方式
本发明具体操作步骤如下：
1、将分析纯99.9％以上柚皮苷对照品110℃加热至恒重；
2、准确称取该对照品0.005g，溶解于分析纯甲醇，并用甲醇定容至25ml，作为母液；
3、从定容好的容量瓶中分别吸取柚皮甙母液0ml、0.5ml、1ml、2ml、4ml、8ml至25ml容量瓶中，分别定容，则得到0μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml的柚皮苷标准溶液；
4、以甲醇为空白对照，以283±1nm为检测波长分别按次序以上标准溶液的吸光值；
5、以吸光值为纵坐标，以浓度为横坐标，建立吸光值与浓度之间的对应关系，制作标准曲线；
6、将待测物110℃干燥至恒重，准确称取一定量待测物，溶解甲醇，定溶至一定体积，先进行粗测，若其吸光值在线性范围之外，则应稀释后再测，使其吸光值在标准曲线范围之内，得到的吸光值由标准曲线得出对应的浓度，再乘以稀释倍数即得待测物中总黄酮含量。
其计算公式为：
A-待测物中总黄酮含量
C-根据标准曲线，由待测物吸光值查得待测溶液浓度(μg/ml)
V-溶解及稀释待测物所用甲醇体积(ml)
m-待测物质量(μg)
实例一柚中总黄酮含量测定
1、将柚子洗净，破碎至粗粉、干燥，随机抽取一定样品。
2、将待测样品110℃干燥至恒重，准确称取1g样品置索氏抽提器中，加沸程60-90℃石油醚80ml，加热回流2-3小时，弃去石油醚，柚渣挥去石油醚。
3、加甲醇80ml，加热回流3小时至提取液无色，放冷过滤，滤液置100ml溶量瓶中，再用少量甲醇洗涤容器，洗液滤入同一容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。
4、准确吸取1ml该溶液置25ml容量瓶中，加甲醇至刻度、摇匀即为待测液。
5、将柚皮苷对照品，由中国药品生物制品检定所提供，110℃干燥至恒重，称取柚皮苷对照品0.003g，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解，并定容，摇匀，作为母液。
6、分别准确吸取对照品溶液0ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、4.0ml、8.0ml、10.0ml于25ml容量瓶中，分别定容到刻度，摇匀，则其浓度分别为0μg/ml、2.4μg/ml、4.8μg/ml、9.6μg/ml、19.2μg/ml、38.4μg/ml、48.0μg/ml。
7、于283nm波长下分别测吸光值为：0、0.082、0.165、0.326、0.657、1.313、1.637。
8、以吸光值为纵坐标，浓度为横坐标，建立标准曲线，见图4。
9、将待测液置283nm波长下测吸光值为：1.601，由标准曲线得待测液浓度为44ug/ml。
10、由计算公式
求得柚子干粉中总黄酮含量为11％。
实例二柚提取物总黄酮含量测定
1、将柚提取物110℃干燥至恒重，准确称取该样品0.005g，置25ml容量瓶中用甲醇溶解，并定容，摇匀。
2、取1ml至25ml容量瓶中，加甲醇到刻度，得待测液，若待测样品不能完全溶解，可取澄清液。
3、标准曲线制作同实例一。
4、将待测液于283nm波长下测吸光值为0.262，由标准曲线可得其浓度为7.6μg/ml，由计算公式
求得该提取物总黄酮含95％。
Claims (2)
1、一种总黄酮含量的测定方法，其特征在于：
(1)先将干燥后的柚子或其提取物溶解，配制成待测液，然后用标准纯度99.9％以上柚皮苷作对照品，配制成梯度的标准溶液，在283nm波长下，分别测定该标准溶液的吸光值，根据吸光值与浓度之间的对应关系建立标准曲线；
(2)将待测液在283nm波长下测吸光值，根据所得吸光值，由标准曲线查得该待测液浓度，该浓度值即为待测液总黄酮含量，然后根据稀释倍数换算出柚子或其提取物总黄酮含量。
2、依权利要求1所述的方法，其特征在于溶解柚子和提取物以及配制柚皮苷标准溶液所用的溶剂为甲醇或无水乙醇。
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