CN102507466B - 一种改进的考马斯亮蓝测定蛋白质的光度法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种改进的考马斯亮蓝测定蛋白质的光度法。为了克服经典的考马斯亮蓝法测定蛋白质稳定性差和灵敏度低的缺点，本发明提供了一种基于微乳液增稳增敏的考马斯亮蓝测定蛋白质方法，采用微乳液，有效地增强体系的稳定性和提高反应体系的灵敏度。本发明所述的测定方法，是一种简便、快速的定量测定蛋白质的方法。

Description

一种改进的考马斯亮蓝测定蛋白质的光度法

技术领域

本发明涉及一种改进的考马斯亮蓝测定蛋白质的光度法，具体涉及基于一种改进的微乳液增稳增敏的考马斯亮蓝测定微量蛋白质的光度法，属于生物分析与食品安全领域。

背景技术

蛋白质是生物最重要的基本组成成分之一，它与营养、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、新陈代谢、物质运转、遗传息息相关，因此蛋白质的定量检测在生命科学、临床医学、化学研究和食品安全等领域占有十分重要的地位。

近年来，蛋白质分析方法研究的日益深入引起了科学工作者的兴趣和广泛关注。蛋白质常用的定量测定方法包括：凯式定氮法、考马斯亮蓝法(Bradford 法)、双缩脲法、Folin-酚法(Lowry 法)、紫外吸收法等。凯氏定氮法具有通用性强，测定费用低，仪器简单且比较准确等优点，但同时也具有灵敏度较低等缺点。在凯氏定氮法中，由于是通过测定氮元素来换算蛋白质的含量，该方法无法区分所测定的氮元素是否来自蛋白质，以致造成一些蛋白质含量过高的假象。双缩脲法的优点是较快速，干扰物质少，主要的缺点是灵敏度差，因此双缩脲法常用于需要快速、但并不需要十分精确的蛋白质测定。Lowry法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时较长，且Lowry反应的显色随时间不断加深，因此须精确控制反应时间。紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回收；缺点是测定蛋白质含量的准确度较差，专一性差，若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合的反应十分迅速，这一方法具有灵敏度高、干扰物质少、测定快速、简便等优点，不受酚类、游离氨基酸和缓冲剂、配位剂的影响，适合大量样品的测定，是一种常用的方法，但是体系的吸光度在10 min 后逐渐下降，因稳定性差而造成测定误差。

CN1401988公布了一种测定蛋白质的方法，是基于染料结合原理在近红外波长区测定微量蛋白质。该法采用花菁染料，在酸性缓冲溶液中使其与蛋白质相互作用，于900nm以上的近红外波长区测定体系的吸光度变化，本法灵敏度高。

本发明在原有考马斯亮蓝法的基础上，加入微量的微乳液，进一步提高了该体系测定蛋白质的灵敏度，并显著增强了体系的稳定性，从而易于蛋白质含量的快速准确测定。

发明内容

本发明的目的是为了克服经典的考马斯亮蓝法测定蛋白质的稳定性较差的缺点，提供了一种改进的考马斯亮蓝测定蛋白质的光度法，具体涉及基于一种改进的微乳液增稳增敏的考马斯亮蓝测定微量蛋白质的光度法，其特征包括以下步骤：

   (1) 在考马斯亮蓝法基础上加入一种增稳增敏剂，所述增稳增敏剂为自配的微乳液；

   (2) 优化测定步骤，从而提高测定体系的稳定性和灵敏度。

本发明所述的考马斯亮蓝选用考马斯亮蓝G-250，其分子式为：C₄₇H₄₈N₃O₇S₂Na；

本发明所述的微乳液选自下列之一：OP-10微乳液、Triton X-100微乳液、Tween-20微乳液、Tween-80微乳液。

本发明所述的微乳液所含成分的质量比为x : 正丁醇 : 正庚烷 : 水= (1 ~ 10) : (1 ~ 5) : (0.2 ~ 2) : (83 ~ 97.8)， x代表OP-10微乳液、Triton X-100微乳液、Triton X-10微乳液、Tween-20 微乳液或Tween-80微乳液，优化的增稳增敏剂是OP-10微乳液。

本发明所述的优化测定步骤包括以下方面：

   (1) 依次加入考马斯亮蓝G-250溶液(10.0 μg?mL^-1)、OP-10微乳液，然后依次加入浓度递增的蛋白质溶液，水定容摇匀，静置一段时间；

   (2) 采用分光光度计在580 ~ 610 nm处对试剂空白测定吸光度A，绘制工作曲线。

本发明所述的优化的考马斯亮蓝G-250染色液的用量为0.10 ~ 4.00 mL，优化的OP-10微乳液的用量为1.00 ~ 10.00 μL，优化的染色液、增稳增敏剂与蛋白质混合后的稳定时间为10 ~ 240 min。

本发明对经典的考马斯亮蓝法进行了改进，在考马斯亮蓝G-250溶液中加入微乳液改变了其本身的疏水作用，反应体系变为绿色，吸收峰位于634 nm处，其吸收强度有所增强；加入蛋白质后，吸收峰从634 nm蓝移至595 nm，反应体系呈现蓝色，吸光度的变化与蛋白质的浓度呈正比，从而达到定量测定蛋白质的目的。在考马斯亮蓝G-250溶液中加入适量微乳液，然后再与蛋白质混合，以提高测定体系的稳定性和灵敏度。

以OP-10微乳液为例说明增稳增敏剂的加入对体系的影响，数据见表1和表2。

表1 体系的稳定性试验

表2 体系的稳定性试验

从表1和表2可以看出，加入微乳液的体系在10 min后吸光度值就达到了最大，并且该体系的吸光度值在10 ~ 240 min内没有发生明显改变，24 h后测定体系的吸光度值降低的程度较小，体系的稳定性明显增强；而未加入微乳液的体系稳定性较差，10 min后吸光度就逐渐降低。在其他条件相同的情况下，加入微乳液的体系的吸光度值比未加入微乳液的体系的吸光度值明显增强。例如10 min时，未加入OP-10微乳液的体系的吸光度值为0.019，加入微量OP-10微乳液体系的吸光度值为0.224，摩尔吸光系数增大12倍，灵敏度显著增强。

具体实施方式

以下给出优化实验操作条件下实施例。

实施例1（青霉素钠盐中蛋白质的测定）

样品预处理：准确称取0.4800 g某医药公司生产的注射用青霉素钠于烧杯中，加适量水溶解，溶解完全后转移至50 mL容量瓶中，用水定容摇匀。

按照质量比 OP-10 : 正丁醇 : 正庚烷 : 水= 2 : 3 : 1 : 90，配制OP-10微乳液，在10 mL 容量瓶中依次加入2.00 mL考马斯亮蓝G-250溶液(10.0 μg?mL^-1)、4.00 μL OP-10微乳液、1.00 mL样品溶液，水定容并摇匀，静置25 min，在595 nm 处，以试剂空白为参比测定体系的吸光度。测定结果如表3所示。

表 3  青霉素钠盐中蛋白质的分析结果

 

实施例2（青霉素G钾工业盐中蛋白质的测定）

样品的处理：准确称取0.9600 g某公司生产的青霉素G钾工业盐于烧杯中，加适量水溶解，溶解完全后转移至100 mL容量瓶中，加水定容并摇匀。

按照质量比 OP-10 : 正丁醇 : 正庚烷 : 水= 1 : 4 : 1 : 92，配制OP-10微乳液，在10 mL 容量瓶中依次加入2.00 mL 考马斯亮蓝G-250溶液(10.0 μg?mL^-1)、4.00 μL OP-10微乳液、1.00 mL 样品溶液，定容摇匀，静置15 min，在595 nm 处对试剂空白测定吸光度。测定结果如表4所示。

表 4 青霉素G钾工业盐样品中蛋白质的分析结果

 

实施例3 （奶粉样品中蛋白质的测定）

样品的处理：准确称取市售奶粉0.0313 g于玻璃研钵中，将样品溶液定容到100 mL容量瓶，用水定容并摇匀。

按照质量比 OP-10 : 正丁醇 : 正庚烷 : 水= 2 : 3 : 1 : 89，配制OP-10微乳液，在10 mL 容量瓶中依次加入2.00 mL考马斯亮蓝G-250溶液(10.0 μg?mL^-1)、4.00 μL OP-10微乳液、2.50 mL样品溶液，定容摇匀，静置20 min，在595 nm处对试剂空白测定吸光度。测定结果表5所示。

表 5 奶粉样品中蛋白质的分析结果

由以上3个实施例的测定结果可看出，相对标准偏差均小于5%，说明该方法精密度较高；回收试验表明，测得的回收率均在98% ~ 102%范围内，说明该方法用于上述样品中蛋白质的测定，结果准确可靠。

Claims (3)

1.一种改进的考马斯亮蓝测定蛋白质的光度法，其特征是在考马斯亮蓝法的基础上加入一种增稳增敏剂，所述增稳增敏剂为OP-10微乳液，测定体系的稳定时间为10 ~ 240 min；所述OP-10微乳液所含成分的质量比为OP-10 : 正丁醇 : 正庚烷 : 水选自下列之一： 2 : 3 : 1 : 90， 1 : 4 : 1 : 92， 2 : 3 : 1 : 89。

2.根据权利要求1所述的一种改进的考马斯亮蓝测定蛋白质的光度法，其特征是依次加入考马斯亮蓝G-250溶液、OP-10微乳液、浓度递增的蛋白质溶液，水定容摇匀，静置一段时间，采用分光光度计在580~610 nm处对试剂空白测定吸光度A，绘制工作曲线。

3.根据权利要求2所述的一种改进的考马斯亮蓝测定蛋白质的光度法，其特征是所述考马斯亮蓝G-250溶液：浓度为10.0 μg?mL^-1，用量为2 mL；所述OP-10微乳液的用量为1.00 ~ 10.00 μL。