CN102495167A - 枸杞多糖提取物中枸杞多糖的检测方法 - Google Patents
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Abstract
枸杞多糖提取物中枸杞多糖的检测方法,其步骤为:⑴制备6种单糖的对照品溶液;⑵将对照品溶液制备成可供气相色谱分析的试样,检测对照品溶液,得出对照品色谱图和标准曲线;⑶制备供试品;⑷在与对照品相同的色谱条件下对供试品进行检测,得出供试品色谱图;⑸将供试品检测出的色谱图与对照品色谱图进行比对,计算出每种单糖含量;⑹根据单糖含量配制6种单糖混合标准溶液,绘制标准曲线;⑺供试品用紫外分光光度计测定吸光值,计算枸杞多糖含量;本方法通过测定枸杞多糖的单糖组成,可以鉴别枸杞多糖的真伪;采用单糖混合标准溶液制作标准曲线,相对于以葡萄糖为标准溶液制作标准曲线,克服了各种单糖显色程度不一致导致的误差,结果更客观准确。
Description
㈠技术领域:本发明涉及一种检测方法,具体是枸杞多糖提取物中枸杞多糖的检测方法。
㈡背景技术:枸杞多糖是一种由酸性杂多糖与多肽或蛋白质构成的复合多糖,具有抗菌、抗肿瘤、抗衰老的功效,同时也是枸杞子降血糖、降血压、降脂、抗炎等的活性物质。
枸杞多糖具有分子量大、结构组成极为复杂的特点,主要由半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、甘露糖等单糖复合组成。
2010版中华人民共和国药典用硫酸苯酚显色,紫外分光光度法测定吸光值,以葡萄糖标准溶液制作标准曲线,测定枸杞多糖结果,结果以葡萄糖计。该法为枸杞子中药材质量鉴别项下检测方法,对于判断枸杞子质量优劣具有适宜性。
但是,枸杞多糖提取物涉及到提取、纯化、浓缩与干燥等工艺过程,从外观上无法象枸杞子一样判断其真实来源。因此,简单地采用上述药典中方法检测枸杞多糖提取物中枸杞多糖的含量,不具备科学性,不能识别掺假形象,如掺兑葡萄糖、麦芽糊精等。前期我们通过市场上的枸杞多糖提取物样品进行了检测,充分证明了这一点。
采用硫酸苯酚法显色,枸杞多糖中6种单糖在紫外分光光度计下吸光值差别较大,因此用葡萄糖作为标准绘制标准曲线来计算枸杞多糖含量是欠科学的,严格地讲应该用枸杞多糖纯品来制作标准曲线,但是制备枸杞多糖纯品非常复杂,且性质不稳定,不能长期贮存,所以通过分析单糖组成,采用本法检测枸杞多糖含量更具有简便性、科学性。
㈢发明内容:本发明的目的就是针对现有检测方法中所存在的问题而提出的一种枸杞多糖提取物中枸杞多糖的检测方法,本方法是对现有方法的改良,也是对现有方法的完善。本方法是将枸杞多糖提取物进行水解、衍生转化为可供气相色谱分析的样品,检测其单糖组成,根据单糖组成配制标准溶液,用硫酸苯酚进行显色反应,用紫外分光光度计测定吸光值,从而计算出枸杞多糖含量;通过对本方法进行方法学考察,检测结果具有良好的重复性与准确性,回收率大于80%,RSD值小于10%;灵敏度高,适宜于枸杞多糖提取物中枸杞多糖的定性、定量分析。
本检测方法包括两大部分,第一部分为单糖组成分析,步骤包括a~e;第二部分为在第一部分基础上,根据单糖组成,配制标准曲线,用硫酸苯酚法进行显色,在紫外分光光度计下测定吸光值,测定枸杞多糖含量,步骤包括f~i。
具体检测步骤如下:
a.气相色谱法对照品溶液的制备
内标溶液:精密称取赤藓醇约2mg,用吡啶溶解定容到10ml,混匀备用;
混合单糖贮备液:精密称取葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖各约10mg,用吡啶溶解定容到10ml,混匀备用。
b.对照品溶液的检测
①色谱条件
气相色谱仪:Agilent 6890N
色谱柱:DB-1701毛细管色谱柱,30m×0.32mm×0.25μm
进样口条件:载气为氮气,纯度大于99.999%;温度250℃;分流模式,分流比20:1
柱温箱条件:初温190℃,保持5min,以8℃/min升到260℃
柱参数:恒流模式,流速1.5ml/min
检测器条件:氢火焰检测器,温度260℃,H2流量30ml/min,Air流量350ml/min,尾吹气氮气流量25ml/min
理论塔板数以赤藓醇计不低于5000。
②检测方法
在混合单糖贮备液中加入赤藓醇内标溶液0.1ml,混匀,加入10mg 盐酸羟胺,充分振荡溶解,于90℃水浴反应 30min,取出,冷却到室温,加入1ml无水醋酸酐,于90℃水浴酰化反应 30 min,取出冷却后真空浓缩蒸干,残渣加入1ml氯仿溶解,进行气相色谱分析,自动进样器进样,进样量1ul,得出对照品色谱图。
c.供试品的制备
称取 10 mg枸杞多糖提取物样品于安瓿瓶中,加入2 ml2 mol/L的三氟乙酸,封管后置于120℃干燥箱中水解,2h后取出冷却,离心后取上清液,真空浓缩至干,得枸杞多糖水解产物,置于干燥箱中备用。
在上述备用的枸杞多糖水解产物中,加入10mg 盐酸羟胺及1ml无水吡啶,加入内标溶液0.1ml;充分振荡溶解,于90℃水浴反应30min,取出,冷却到室温,加入1ml无水醋酸酐,于90℃水浴酰化反应30min,取出冷却后真空浓缩蒸干,残渣加入1ml氯仿溶解,得供试品溶液。
d.供试品的检测
取上述待测供试品溶液1ml,置自动进样器样品瓶中,在与对照品溶液检测相同的色谱条件下自动进样分析,得出供试品图谱。
e.检测结果分析
将供试品检测出的色谱图与对照品色谱图进行比对,对色谱峰进行确认、定性;以赤藓醇对应的谱峰作为内标,并根据相应峰面积用内标法计算出各单糖的含量。
f.硫酸苯酚法对照品溶液的制备
根据步骤f中检测出的枸杞多糖中单糖组成及含量,按组成比例分别精确称取6种单糖标准物质共约12mg至100ml容量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀得每毫升含糖0.12mg的糖对照品溶液。
g.标准曲线的制作
精密吸取溶液0.1ml,0.2ml,0.4ml,0.6ml,0.8ml,1ml,分别置于10ml具塞比色管中,加水补至2ml,加入5%苯酚溶液1ml,摇匀,迅速加入浓硫酸5ml,摇匀,置沸水浴中煮沸15min,取出冷却至室温,以相应试剂为空白,490nm波长处测定吸光度,以吸光度A为纵坐标,糖对照品溶液不同的稀释浓度C为横坐标,绘制糖对照品标准曲线C=kA+b。
h.供试品溶液的制备
称取枸杞多糖提取物样品约0.25g,于150ml具塞锥形瓶中,精密加入蒸馏水20ml,超声溶解,取1ml溶液于50ml离心管中,加入无水乙醇19ml使溶液含醇量为95%,涡旋混匀,于离心机中,以9600转/分,离心15分钟,弃去上清液,残渣加水溶解,定容至100ml,作为供试品溶液备用。
i.供试品的检测
精密吸取供试品溶液1ml,加水至2ml,照g步骤中标准曲线的制备项下的方法,自“加入5%苯酚溶液1ml”起,依上述方法测定吸光度A1,从糖对照品标准曲线上读出吸光度A1所对应的供试品溶液中糖的
其中C:按标准曲线C=kA+b计算出的浓度,g/L;M:取样量,g。
本发明方法所作的改进是将枸杞多糖进行水解、衍生转化为可供气相色谱分析的样品,检测其单糖组成,根据单糖组成配制标准溶液,用硫酸苯酚进行显色反应,用紫外分光光度计测定吸光值,检测枸杞多糖含量。
对本方法的回收率及精密度的验证:
⑴试验样品 枸杞多糖提取物(劲牌公司自制,批号20101208)。
⑵试验方法 精密称取上述枸杞多糖样品粉末10mg,加入混合单糖贮备液,按本发明中方法处理,进样分析。分析数据如表1所示:
表1 本方法回收率验证数据
取试验样品,进行平行测定,精密度实验数据如表2所示:
表2 本方法精密度实验数据
表1、2中的数据显示, 本发明用三氟乙酸将枸杞多糖加热水解后,变成单糖,再将不具挥发性的单糖与盐酸羟胺在吡啶中加热反应生成糖肟,加入醋酸酐后加热继续反应生成具有挥发性的糖腈乙酸酯,采用中等极性毛细管色谱柱,氢火焰检测器-气相色谱法方法进行单糖组成分析,灵敏度高,可以得到峰形对称、单一无异构体、分离良好的色谱峰,适宜于定性、定量。通过进行方法学考察,检测结果具有良好的重复性与准确性,回收率大于80%,RSD值小于10%。
㈣附图说明:
图1是6种标准单糖对照品衍生物的气相色谱图;
图2是劲牌公司自制枸杞多糖提取物水解衍生物气相色谱图;
图3是市售的假冒枸杞多糖提取物水解衍生物的气相色谱图。
图中,1-赤藓醇、2-鼠李糖、3-阿拉伯糖、4-木糖、5-甘露糖、6-葡萄糖、7-半乳糖。
㈤具体实施方式:
实施例1 枸杞多糖提取物中枸杞多糖含量检测
一、对照品
本发明中的对照品葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖均由国家标准物质中心提供。
二、内标溶液的制备
精密称取由国家标准物质中心提供的赤藓醇约2mg于10ml容量瓶中,用吡啶定容至刻度,混匀备用。
三、主要实验仪器、色谱条件和试剂
1、实验仪器
气相色谱仪:Agilent 6890N
弹性石英毛细管柱: DB-1701毛细管色谱柱,中等极性键合交联柱,固定液:(14%氰丙基苯基)甲基聚硅氧烷,30m*0.32mm*0.25um nominal。
2、色谱条件
进样口条件:载气为氮气,纯度大于99.999%;温度250℃;分流模式,分流比20:1
柱温箱条件:初温190℃,保持5min,以8℃/min升到260℃
柱参数:恒流模式,流速1.5ml/min
检测器条件:氢火焰检测器,温度260℃,H2流量30ml/min,Air流量350ml/min,尾吹气氮气流量25ml/min
理论塔板数以赤藓醇计不低于5000。
3、试剂
三氟乙酸:分析纯,配制成2mol/L的水溶液备用。
盐酸羟胺:分析纯;
无水吡啶:分析纯;
无水醋酸酐:分析纯;
氯仿:分析纯;
苯酚:分析纯;取苯酚100g,加铝片0.1g,碳酸氢钠0.05g,蒸馏收集182℃馏分,吸取此馏分液5ml,置100ml容量瓶中加水至刻度,一个月内使用;
浓硫酸:分析纯
水:重蒸水。
四、对照品溶液的检测
称取葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖各约 10mg,分别加入10mg 盐酸羟胺及 1ml无水吡啶,加入赤藓醇内标溶液0.1ml,充分振荡溶解,于90℃水浴反应 30min,取出,冷却到室温,加入1 ml无水醋酸酐,于90℃水浴酰化反应 30 min,取出冷却后 真空浓缩蒸干,残渣加入1ml氯仿溶解,进行气相色谱分析,得6种标准单糖对照品衍生物的气相色谱图,见图1。
以各单糖对照品峰面积与内标的峰面积比为纵坐标,各单糖对照品浓度与内标浓度比为横坐标,绘制各单糖的标准曲线,结果见下表:
五、供试品的制备(共有两种)
劲牌公司自制枸杞多糖提取物粉末:样品编号1208001
市售假冒枸杞多糖提取物粉末: 样品编号1208002
分别精密称取样品1208001和样品1208002各10mg于样品瓶中,加入 2 mol/L的三氟乙酸2 ml,密封后置于120℃干燥箱中水解,2h后取出冷却,离心后取上清液,真空浓缩至干,加入 10mg 盐酸羟胺及1ml无水吡啶,加入内标溶液0.1ml,充分振荡溶解,于90℃水浴反应30min,取出,冷却到室温,加入 1 ml无水醋酸酐,于90℃水浴酰化反应30 min,取出冷却后真空浓缩蒸干,残渣加入1ml氯仿溶解,得供试品溶液。
六、供试品的检测
取上述两份待测供试品溶液,自动进样器上进行色谱分析,得供试品图谱,分别见图2和图3。
七、检测结果分析
将供试品检测出的色谱图与对照品色谱图用保留时间对比法进行比对,并确认相应特征峰,以赤藓醇为内标,用峰面积计算各单糖含量。结果见表3:
表3 两种供试品中气相色谱法单糖含量
从检测结果中单糖的组成,可准确的鉴别枸杞多糖提取物的真伪,本发明为枸杞多糖提取物的真伪鉴别提供了一个有效的方法。
八、显色法检测
根据表3中1208001样品中6种单糖气相色谱法测定的百分含量结果,分别依次精密称取6种单糖标准品1.08mg、4.80mg、0.84mg、0.54mg、1.68mg、3.06mg到100ml容量瓶中,使总含糖量为12mg/100ml,用水定容至刻度配制成混合对照品溶液,标为糖对照品溶液1。
准确称取葡萄糖标准品10mg于100ml容量瓶中,用水定容至刻度,标为糖对照品溶液2。
分别精密吸取糖对照品溶液1和2,0.1ml,0.2ml,0.4ml,0.6ml,0.8ml,1ml,置于10 ml具塞比色管中,加水补至2ml,加入5%苯酚溶液1ml,摇匀,迅速加入浓硫酸5ml,摇匀,置沸水浴中煮沸15min,取出冷却至室温,490nm波长处测定吸光度,以吸光度A为纵坐标,糖对照品浓度C为横坐标,绘制标准曲线。
糖对照品溶液1标准曲线L1为 A=0.03379C+0.00614,
糖对照品溶液2标准曲线L2为 A=0.05282C+0.01205。
分别称取样品1208001和1208002各约0.25g,于150ml具塞锥形瓶中,精密加入蒸馏水20ml,超声溶解,准确吸取1ml溶液于50ml离心管中,加入无水乙醇19ml使溶液含醇量为95%,涡旋混匀,于离心机中,以9600转/分,离心15min,弃去上清液,残渣加水溶解,定容至100ml,作为供试品溶液备用。
分别精密吸取供试品溶液各1ml,加水至2.0ml,加入5%苯酚溶液1ml,摇匀,迅速加入浓硫酸5ml,摇匀,置沸水浴中煮沸15 min,取出冷却至室温,490nm波长处测定吸光度A,从糖对照品溶液1标准曲线L1为A=0.03379C+0.00614和糖对照品溶液2标准曲线L2为A=0.05282C+0.01205上分别读出供试品1208001和1208001溶液中含糖的浓度,单位为g/l,再依据公式X%= *100%计算出枸杞多糖含量X%,具体结果见表4:
表4 供试品中枸杞多糖的含量
C为按标准曲线C=kA+b计算出的浓度,g/L;M为取样量,g。
Claims (1)
1.枸杞多糖提取物中枸杞多糖的检测方法,其特征在于包括下述步骤:
a.气相色谱法对照品溶液的制备
内标溶液:精密称取赤藓醇约2mg,用吡啶溶解定容到10ml,混匀备用;
混合单糖贮备液:精密称取葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖各约10mg,用吡啶溶解定容到10ml,混匀备用;
b.对照品溶液的检测
①色谱条件
气相色谱仪:Agilent 6890N
色谱柱:DB-1701毛细管色谱柱,30m×0.32mm×0.25μm
进样口条件:载气为氮气,纯度大于99.999%;温度250℃;分流模式,分流比20:1
柱温箱条件:初温190℃,保持5min,以8℃/min升到260℃
柱参数:恒流模式,流速1.5ml/min
检测器条件:氢火焰检测器,温度260℃,H2流量30ml/min,Air流量350ml/min,尾吹气氮气流量25ml/min
理论塔板数以赤藓醇计不低于5000;
②检测方法
在混合单糖贮备液中加入赤藓醇内标溶液0.1ml,混匀,加入10mg 盐酸羟胺,充分振荡溶解,于90℃水浴反应30min,取出,冷却到室温,加入1ml无水醋酸酐,于90℃水浴酰化反应30 min,取出冷却后真空浓缩蒸干,残渣加入1ml氯仿溶解,进行气相色谱分析,自动进样器进样,进样量1ul,得出对照品色谱图;
c.供试品的制备
称取 10 mg枸杞多糖提取物样品于安瓿瓶中,加入2ml2 mol/L的三氟乙酸,封管后置于120℃干燥箱中水解,2h后取出冷却,离心后取上清液,真空浓缩至干,得枸杞多糖水解产物,置于干燥箱中备用;
在上述备用的枸杞多糖水解产物中,加入10mg 盐酸羟胺及1ml无水吡啶,加入内标溶液0.1ml;充分振荡溶解,于90℃水浴反应30min,取出,冷却到室温,加入1ml无水醋酸酐,于90℃水浴酰化反应30min,取出冷却后真空浓缩蒸干,残渣加入1ml氯仿溶解,得供试品溶液;
d.供试品的检测
取上述待测供试品溶液1ml,置自动进样器样品瓶中,在与对照品溶液检测相同的色谱条件下自动进样分析,得出供试品图谱;
e.检测结果分析
将供试品检测出的色谱图与对照品色谱图进行比对,对色谱峰进行确认、定性;以赤藓醇对应的谱峰作为内标,并根据相应峰面积用内标法计算出各单糖的含量;
f.硫酸苯酚法对照品溶液的制备
根据步骤f中检测出的枸杞多糖中单糖组成及含量,按组成比例分别精确称取6种单糖标准物质共约12mg至100ml容量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀得含糖0.12mg/ml的糖对照品溶液;
g.标准曲线的制作
精密吸取溶液0.1ml,0.2ml,0.4ml,0.6ml,0.8ml,1ml,分别置10 ml具塞比色管中,加水补至2ml,加入5%苯酚溶液1ml,摇匀,迅速加入浓硫酸5ml,摇匀,置沸水浴中煮沸15分钟,取出冷却至室温,以相应试剂为空白,490nm波长处测定吸光度,以吸光度A为纵坐标,糖对照品溶液不同的稀释浓度C为横坐标,绘制糖对照品标准曲线C=kA+b;
h.供试品溶液的制备
称取枸杞多糖提取物样品约0.25g,于150ml具塞锥形瓶中,精密加入蒸馏水20ml,超声溶解,取1ml溶液于50ml离心管中,加入无水乙醇19ml使溶液含醇量为95%,涡旋混匀,于离心机中,以9600转/分,离心15分钟,弃去上清液,残渣加水溶解,定容至100ml,作为供试品溶液备用;
i.供试品的检测
精密吸取供试品溶液1ml,加水至2ml,照g步骤中标准曲线的制备项下的方法,自“加入5%苯酚溶液1ml”起,依上述方法测定吸光度A1, 从糖对照品标准曲线上读出吸光度A1所对应的供试品溶液中糖的
其中C:按标准曲线C=kA+b计算出的浓度,g/L;
M:取样量,g。
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