CN109400730A - 一种枸杞多糖、其制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从枸杞子中提取的枸杞多糖LBP1B‑S‑2及其硫酸化多糖衍生物Sul‑LBP1B‑S‑2，本发明还提供了它们的制备方法和用途。经体外实验证明，Sul‑LBP1B‑S‑2可在低浓度下显著抑制血管生成，且几乎没有毒性。有望开发成为无毒高效抗血管生成类候选多糖药物。

Description

一种枸杞多糖、其制备方法及用途
技术领域
本发明涉及多糖类物质、其提取方法及其在制备药物中的用途，更具体地说，涉及一种从红色枸杞子(fruits of Lycium barbarum L.)中提取阿拉伯半乳聚糖多糖LBP1B-S-2的方法、其硫酸化衍生物的制备方法以及其硫酸化衍生物在制备抗血管生成药物方面的应用。
背景技术
多糖(polysaccharide)是一类由10个以上单糖通过糖苷键连接而成的天然大分子物质。其具有抗肿瘤、抗凝血、抗衰老、降血糖和免疫调节活性等多种功能活性。近年来多糖的化学分子修饰尤其是硫酸化修饰受到人们的广泛关注，主要因为硫酸化产物具有良好的生物活性，特别在抗病毒、抗肿瘤、抗补体等方面。
肿瘤血管生成是所有实体肿瘤的共同特征，是实体肿瘤生长和转移必须依赖的病理学基础，与肿瘤的生长、侵袭转移关系极为密切。因此抗血管生成靶向治疗已经成为肿瘤治疗的重要策略。研究发现，硫酸化多糖具有较强的抑制血管生成的活性。无细胞毒性的抗血管生成硫酸化多糖有望开发成为抗血管生成类抗肿瘤药物的候选药物，在肿瘤治疗候选药物方面具有巨大的应用前景。
枸杞为人们对商品枸杞子、植物宁夏枸杞、中华枸杞等枸杞属下物种的统称。人们日常食用和药用的枸杞子多为宁夏枸杞的果实“枸杞子”，而且宁夏枸杞是唯一载入《2010年版中国药典》的品种。宁夏枸杞主要分布在中国西北地区，多糖是枸杞子中的一种重要的活性物质，具有降血糖、抗衰老、抗肿瘤、免疫调节等作用，但硫酸化的枸杞多糖在抗血管生成方面的作用，尚无报道。所以硫酸化枸杞多糖Sul-LBP1B-S-2在抗血管生成方面具有巨大的应用前景。
发明内容
本发明采用一种简单有效的多糖提取工艺和方法，以枸杞子为原料获得了一种阿拉伯半乳聚糖的多糖，而后将其衍生化得到硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2。药理实验表明Sul-LBP1B-S-2可以剂量依赖性地抑制血管生成。细胞毒性实验表明Sul-LBP1B-S-2对正常HMEC-1细胞几乎无毒性。Sul-LBP1B-S-2有望开发成为一种抗血管生成类抗肿瘤药物。
本发明的一个目的在于提供一种枸杞多糖LBP1B-S-2，其结构式如下：
其中，n为2-91的整数。
所述多糖的重均分子量的范围为14-640kDa，优选为40-200kDa，更优选为60-100kDa。
枸杞多糖LBP1B-S-2的单糖组成包括阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和鼠李糖，阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和鼠李糖的质量比为53.55：39.37：3.95：3.13。
所述枸杞多糖LBP1B-S-2的红外特征图谱的主要伸缩振动吸收峰与图1所示的红外图特征图谱中的基本一致，优选地，在所述枸杞多糖LBP1B-S-2的红外特征图谱中，3434.18cm-1为O-H伸缩振动吸收峰，2925.19cm-1为C-H伸缩振动吸收峰，1425.39-1067.12cm-1为C-O和糖环振动信号。1736.72cm-1有吸收峰，表明该多糖含有糖醛酸。
所述枸杞多糖LBP1B-S-2，其13C NMR谱的主要信号值与图2所示的13C NMR谱基本一致，优选地，在所述枸杞多糖LBP1B-S-2的13C NMR谱中，位于δ110-δ108的端基碳信号，分别为1,5-阿拉伯糖和α-末端阿拉伯糖的C1信号；位于δ106-δ104的端基碳信号，分别为1,3,6-半乳糖、1,3-半乳糖、1,6-半乳糖及末端半乳糖的C1信号；位于δ103-δ102的端基碳信号，分别为β-末端阿拉伯糖及末端鼠李糖的C1信号；在δ17.56处为鼠李糖甲基碳的信号峰。
本发明的另一目的是提供所述枸杞多糖LBP1B-S-2的制备方法，包括以下步骤：
a.多糖提取：干燥的枸杞果实，粉碎、酶-水联提、灭酶，离心，将所得滤液浓缩，透析，浓缩，离心，醇沉，离心，洗涤，真空干燥，得酶-水联提枸杞粗多糖；
优选地，所述步骤a包括：干燥的枸杞果实经粉碎机粉碎，加入15-30倍重量的去离子水，于55-60℃下，再分别加入枸杞重量的3％纤维素酶、枸杞重量的1％淀粉酶及枸杞重量的0.5％木瓜蛋白酶提取1h，后将温度升至100℃使酶失活，离心，滤液浓缩，透析，再浓缩，加入五倍于浓缩液体积的95％(质量分数)乙醇，离心得沉淀，沉淀经无水乙醇与丙酮交替洗涤各三次，经干燥得酶-水联提枸杞粗多糖；
b.多糖纯化：取酶-水联提枸杞粗多糖，水溶解，离心，上清液经DEAE SepharoseTMFast Flow阴离交换柱进行初步分级纯化，依次以水、0.05M、0.1M及0.2M氯化钠洗脱，收集0.1M氯化钠洗脱组分，得枸杞多糖LBP1B，再将LBP1B溶于0.2M氯化钠(平衡液)中，离心，上清液经Sephacryl HR S-300凝胶色谱柱分离，收集洗脱组分，浓缩，透析，冷冻干燥，得所述枸杞多糖LBP1B-S-2；
优选地，所述步骤b包括：取酶-水联提枸杞粗多糖，加入10倍重量的水中溶解，离心，上清液经DEAE SepharoseTM Fast Flow阴离交换柱分离，依次以去离子水、0.05M、0.1M及0.2M氯化钠洗脱，硫酸-苯酚检测，收集合并0.1M氯化钠洗脱组分，浓缩，透析，冷冻干燥，得初步纯化的多糖LBP1B；再将LBP1B溶于0.01倍重量的0.2M氯化钠(平衡液)中，离心，上清液经Sephacryl HR S-300凝胶色谱柱分离，硫酸-苯酚检测，以0.2MNaCl洗脱并控制流速3-6mL/15min。硫酸-苯酚法检测，在490nm波长下绘制洗脱曲线，从洗脱曲线得1-2个吸收峰，收集合并第一个吸收峰(即收集从30到60管，洗脱速度为3-6ml/15min的洗脱液)，经HPGPC检测，重均分子量在14-640kDa且为单一对称的吸收峰即为组分LBP1B-S-2，浓缩，透析，冷冻干燥，得所述枸杞多糖LBP1B-S-2。
多糖结构鉴定：所述枸杞多糖LBP1B-S-2通过对其单糖组成、甲基化、红外数据、部分酸水解及核磁等进行综合解析，确定其结构。
本发明的另一目的是提供一种硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2，其由所述枸杞多糖LBP1B-S-2硫酸化得到，具体可以由氯磺酸-吡啶法酯化得到，步骤如下：
氯磺酸和吡啶(1:3/v:v)制备硫酸化试剂，枸杞多糖LBP1B-S-2与硫酸化试剂于60℃反应，反应结束后经NaOH中和，饱和NaHCO3透析、去离子水透析、冷冻，干燥后得到硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2。
更具体而言，在室温下，将氯磺酸逐滴加入到吡啶中制备硫酸化试剂；枸杞多糖LBP1B-S-2溶解于干燥的甲酰胺中，并加入硫酸化试剂于60℃反应。反应结束后用5M的氢氧化钠溶液于冰浴中中和，再用饱和碳酸氢钠透析24h，去离子水透析3天。透析内液冷冻干燥后得到淡黄色硫酸化产物，即硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2。图3为硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2的13C NMR图谱，对比原糖图谱，Sul-LBP1B-S-2硫酸化的位点主要为末端阿拉伯糖的C-5和C-3，1,5-α-阿拉伯糖的C-2位或者C-3位且无选择性。
本发明的又一目的是提供所述硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2在制备抗血管生成药物中的用途。
本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的内容。
附图说明：
图1为枸杞多糖LBP1B-S-2的特征红外光谱图；
图2为枸杞多糖LBP1B-S-2的特征13C NMR图谱；
图3为硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2的特征13C NMR图谱；
图4为枸杞多糖LBP1B02I的特征HMBC图谱；
图5为枸杞多糖LBP1B-S-2的特征HMBC图谱；
图6为硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2在不同浓度下对人表皮血管内皮细胞HMEC-1在基质胶管腔形成抑制作用示意图；
图7为硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2在不同浓度以及不同处理时间下对HMEC-1细胞生长的折线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，以下实施方式只以举例的方式描述本发明。很明显，本领域普通技术人员可在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和修改。
高效凝胶渗透色谱采用UltrahydrogelTM 2000(25cm×0.75cm，美国Waters公司)；和UltrahydrogelTM 500(25cm×0.75cm，美国Waters公司)串联柱，以用不同分子量的T-系列标准葡聚糖(Dextran)制作标准曲线；
高效液相色谱(HPLC)采用Agilent 1260Seri高效液相系统测定(美国Agilent公司)；
红外分析采用Perkin-Elmer 599B型红外分光光度计测定(美国Perkin-Elmer公司)；
核磁共振分析采用BruckerAM-500型核磁共振仪测定(德国Brucker公司)。
实施例1：枸杞多糖LBP1B-S-2的制备
a.多糖提取：
干燥的枸杞果实1000g经粉碎机粉碎，加入20L的去离子水，于55℃下，再分别加入30g纤维素酶、10g淀粉酶及5g木瓜蛋白酶提取1h，后将温度升至100℃使酶失活，离心，滤液浓缩，对流动水透析3天。将透析内液加热浓缩至3L，离心弃去沉淀，将上清液在搅拌下加入五倍体积15L的95％乙醇，静置过夜，离心分离，所得沉淀用无水乙醇与丙酮交替洗涤各3次，离心分离，沉淀置50℃下干燥，得酶-水联提枸杞粗多糖25.8g。
b.多糖纯化：
取上述制备的酶-水联提枸杞粗多糖6g，60mL的去离子水溶解，4000r/min离心10min除去不溶物，上清液经DEAE SepharoseTM Fast Flow阴离交换柱进行分离，依次以去离子水、0.05M、0.1M及0.2M氯化钠洗脱，硫酸-苯酚检测，并绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集合并0.1M氯化钠洗脱液，浓缩，透析，冷冻干燥，得初步纯化的多糖LBP1B。取200mg LBP1B溶于2mL的0.2M氯化钠中，4000r/min离心20min，上清液经Sephacryl HR S-300凝胶色谱柱，以0.2M NaCl洗脱并控制流速3-6mL/15min。硫酸-苯酚法检测，在490nm波长下绘制洗脱曲线，从洗脱曲线得1-2个吸收峰，收集合并第一个吸收峰(即收集从30到60管，洗脱速度为3-6ml/15min的洗脱液)，经HPGPC检测，重均分子量在14-640kDa且为单一对称的吸收峰即为组分LBP1B-S-2，浓缩，透析，冷冻干燥，得所述枸杞多糖LBP1B-S-2约63mg。
c.多糖结构鉴定及解析：
①经高效凝胶渗透色谱(high performance gel permeation chromatography，HPGPC)测定枸杞多糖LBP1B-S-2相对分子质量为80kDa。将其进行单糖组成分析，即将多糖完全水解、PMP衍生、萃取后取水相送入HPLC分析。单糖组成分析结果显示，枸杞多糖LBP1B-S-2主要含有阿拉伯糖，半乳糖，痕量的鼠李糖及葡萄糖醛酸。结合红外、部分酸水解、甲基化和核磁共振分析(参见图1、图2、图4、图5)，确定枸杞多糖LBP1B-S-2为一阿拉伯半乳聚糖。
②单糖组成分析表明LBP1B-S-2主要含阿拉伯糖、半乳糖、少量的鼠李糖及葡萄糖醛酸，四者的质量比为53.55：39.37：3.95：3.13。
③红外图谱(图1)，3434.18cm-1为O-H伸缩振动吸收峰，2925.19cm-1为C-H伸缩振动吸收峰，1425.39-1067.12cm-1为C-O和糖环振动信号。1736.72cm-1有吸收峰，表明该多糖含有糖醛酸。
④多糖的部分酸水解
取LBP1B-S-2 200mg溶解于20mL的0.2M三氟乙酸中，密封后于100℃水解1h。反应完毕后，用甲醇反复减压蒸干，后用去离子水透析4次，每次1L(透析袋的截留分子量为3500Da)，透析内外液浓缩、冷冻干燥得到部分酸水解产物LBP1B02I(透析内液)和LBP1B02IO(透析外液)。
⑤NMR分析
取多糖LBP1B02I(35mg)和LBP1B-S-2(50mg)，分别加D2O 0.4mL溶解，加2.5μL丙酮为内标(δH＝2.29ppm，δC＝31.5ppm)，于Bruker AVANCE III500M核磁共振仪上，25℃分别测定一维和二维核磁共振图谱(NMR)，根据图4的HMBC谱(异核多碳相关谱)和图5的HMBC谱(异核多碳相关谱)对LBP1B-S-2进行结构确证，结果如图4、图5所示。
13C NMR谱中(图2)，位于δ110-δ108的端基碳信号，分别为1,5-阿拉伯糖和α-末端阿拉伯糖的C1信号；位于δ106-δ104的端基碳信号，分别为1,3,6-半乳糖、1,3-半乳糖、1,6-半乳糖及末端半乳糖的C1信号；位于δ103-δ102的端基碳信号，分别为β-末端阿拉伯糖及末端鼠李糖的C1信号；在δ17.56处为鼠李糖甲基碳的信号峰。从上述结果可以发现LBP1B-S-2为一阿拉伯半乳聚糖。
在LBP1B02I的HMBC图谱中(图4)，可以确定糖苷键之间的连接顺序。相关峰A(δ104.96/3.92)代表1,3-β-半乳糖的C-1和1,3-β-半乳糖的H-3相关，相关峰B(δ83.20/4.74)代表1,3-β-半乳糖的C-3和1,3-β-半乳糖的H-1相关，相关峰C(δ104.96/4.11)代表1,3-β-半乳糖的C-1和1,6-β-半乳糖的H-6相关，相关峰D(δ104.62/4.11)代表1,6-β-半乳糖的C-1和1,6-β-半乳糖的H-6相关,相关峰E(δ70.75/4.52)代表1,6-β-半乳糖的C-6和1,6-β-半乳糖的H-1相关，相关峰F(δ104.62/3.92)代表1,6-β-半乳糖的C-1和1,3-β-半乳糖的H-3相关，相关峰G(δ105.31/3.92)代表1,3,6-β-半乳糖的C-1和1,3-β-半乳糖的H-3相关,相关峰H(δ83.20/4.69)代表1,3-β-半乳糖的C-3和1,3,6-β-半乳糖的H-1相关,相关峰I(δ4.70/83.20)代表1,4-β-葡萄糖醛酸的H-1相和1,3,6-β-半乳糖的C-3关，相关峰J(δ76.87/4.52)代表1,4-β-葡萄糖醛酸的C-4和1,6-β-半乳糖的H-1相关，相关峰K(δ3.83/104.62)代表1,4-β-葡萄糖醛酸的H-4和1,6-β-半乳糖的C-1相关，相关峰L(δ103.96/3.98)代表β-末端半乳糖的C-1和1,6-β-半乳糖的H-6相关，相关峰M(δ70.75/4.59)代表1,6-β-半乳糖的C-6和β-末端半乳糖的H-1相关。
在LBP1B-S-2的HMBC图谱中(图5)，可以确定糖苷键之间的连接顺序。相关峰N(δ108.68/3.86)代表α-末端阿拉伯糖的C-1和1,5-α-阿拉伯糖的H-5相关,相关峰O(δ67.95/5.15(5.18))代表1,5-α-阿拉伯糖的C-5和α-末端阿拉伯糖的H-1相关，相关峰P(δ67.95/5.15)代表1,5-α-阿拉伯糖的C-5和β-末端阿拉伯糖的H-1相关，相关峰Q(δ83.20/5.31)代表1,3,6-β-半乳糖的C-3和1,5-α-阿拉伯糖的H-1相关，相关峰R(δ70.75/4.81)代表1,3,6-β-半乳糖的C-6和β-末端鼠李糖相关。
综上所述，该多糖是以半乳糖残基为主链，其它糖残基为支链直接或者间接连接在主链糖残基的C-3或C-6位。
以上结果表明枸杞多糖LBP1B-S-2的结构为：
其中，n为2-91的整数。
实施例2.硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2抗血管生成实验
1、硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2的制备
在室温下，将2mL氯磺酸逐滴加入到6mL吡啶中制备硫酸化试剂，即氯磺酸和吡啶的体积比为1:3；将实施例1中制备得到的枸杞多糖LBP1B-S-2100mg溶解于5mL干燥的甲酰胺中，并加入硫酸化试剂于60℃反应，反应结束后用5M的氢氧化钠溶液于冰浴(0℃)下中和，再用饱和碳酸氢钠溶液透析(透析袋的截留分子量为3500Da)24h，去离子水透析3天。透析内液冷冻干燥后得到淡黄色产物，即硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2。
图3为硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2的13C NMR图谱。
2、硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2抑制管腔形成实验
将培养于含有15％FBS，2mM L-谷氨酰胺，10ng/mL EGF(表皮生长因子)的MCDB131培养基中的HMEC-1细胞(人微血管内皮细胞)置于5％CO2培养箱37℃孵育，2-3天换新鲜的MCDB131完全培养基1次或传代。
将基质胶(购于美国BD公司，主要成分由层粘连蛋白，Ⅳ型胶原，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)和巢蛋白等，可模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能)50μL在冰浴下均匀涂布于96孔板中并置于37℃培养箱中固化。半个小时后，将50μL HMEC-1细胞以4×104/孔的密度接种在96孔板内并加入50μL用MCDB131完全培养基配置的不同浓度的LBP1B-S-2(调整终浓度为0.095，0.19，0.38，0.76，1.52μM)，以加等量培养基空白组作为对照。12h后采用显微镜在4×物镜下随机挑选3个视野并记录(Olympus IX51digital camera(Tokyo,Japan))。
由图6可观察到，空白组在单独孵育12h后，细胞变成长梭形并向基质中延伸生长，线形排列形成管状结构，多个管状结构相互连接形成完整三维网状结构。硫酸化多糖衍生物LBP1B-S-2对HMEC-1细胞管腔形成并无明显抑制作用，而用低浓度(0.095μM)的硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2共孵育12h后，管腔形成受到抑制，在浓度0.19μM时，HMEC-1细胞基本不形成完整的管腔，管腔形成明显受到抑制。证明硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2具有显著的抑制血管生成活性。
3.MTT实验检测硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2对正常HMEC-1细胞的细胞生长的影响
对数生长期的HMEC-1细胞(3.5×103个/孔)种入96孔板中，设三复孔，于培养箱中培养24h；吸15.625μg/ml去细胞上清液，加入终浓度分别为0.012μM、0.024μM、0.048μM、0.095μM、0.19μM、0.38μM、0.76μM l及1.52μM的Sul-LBP1B-S-2溶液，继续培养24h，48h及72h后，每孔加入5mg/ml的MTT溶液10μl(购自美国sigma公司，PBS配制，经0.22μm微孔滤膜过滤)，继续培养4h后吸去孔内的细胞培养液，每孔加入150μl DMSO(二甲基亚砜)溶解形成的紫色结晶物即甲瓚，用酶标仪在490nm下采集吸光度。细胞存活率按照以下公式进行计算：细胞存活率＝(实验组OD值－空白组OD值)/(对照组OD值－空白组OD值)×100％。结果如图7所示，不同浓度的硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2分别处理细胞24h、48h及72h后，细胞的存活率分别均超过80％，说明硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2基本无毒性。
最后有必要说明的是，以上实施例仅用于进一步详细地说明本发明的技术方案，不能理解为对本发明保护范围的限制，任何根据本发明的上述内容作出的一些非本质的调整和改进均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种枸杞多糖LBP1B-S-2，其特征在于，结构式如下：
其中，n为2-91的整数。
2.根据权利要求1所述的枸杞多糖LBP1B-S-2，其特征在于：多糖的重均分子量的范围为14-640kDa，优选为40-200kDa，更优选为60-100kDa。
3.根据权利要求1所述的枸杞多糖LBP1B-S-2，其特征在于：枸杞多糖LBP1B-S-2的单糖组成包括阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和鼠李糖，阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和鼠李糖的质量比为53.55：39.37：3.95：3.13。
4.根据权利要求1所述的枸杞多糖LBP1B-S-2，其特征在于：其红外特征图谱的主要伸缩振动吸收峰与图1所示的红外图特征图谱中的基本一致。
5.根据权利要求1所述的枸杞多糖LBP1B-S-2，其特征在于：其13C NMR谱的主要信号值与图2所示的13C NMR谱基本一致。
6.权利要求1～5中任一项所述的枸杞多糖LBP1B-S-2的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.多糖提取：干燥的枸杞果实，粉碎、酶-水联提、灭酶，离心，将所得滤液浓缩，透析，浓缩，离心，醇沉，离心，洗涤，真空干燥，得酶-水联提枸杞粗多糖；
b.多糖纯化：取酶-水联提枸杞粗多糖，水溶解，离心，上清液经DEAE SepharoseTM FastFlow阴离交换柱进行初步分级纯化，依次以水、0.05M、0.1M及0.2M氯化钠洗脱，收集0.1M氯化钠洗脱组分，得枸杞多糖LBP1B，再将LBP1B溶于0.2M氯化钠中，离心，上清液经SephacrylHR S-300凝胶色谱柱分离，收集洗脱组分，浓缩，透析，冷冻干燥，得所述枸杞多糖LBP1B-S-2。
7.根据权利要求6所述的枸杞多糖LBP1B-S-2的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.多糖提取：干燥的枸杞果实经粉碎机粉碎，加入15-30倍重量的去离子水，于55-60℃下，再分别加入枸杞重量的3％纤维素酶、枸杞重量的1％淀粉酶及枸杞重量的0.5％木瓜蛋白酶提取1h，后将温度升至100℃使酶失活，离心，滤液浓缩，透析，再浓缩，加入五倍于浓缩液体积的95％乙醇，离心得沉淀，沉淀经无水乙醇与丙酮交替洗涤各三次，经干燥得酶-水联提枸杞粗多糖；
b.多糖纯化：取酶-水联提枸杞粗多糖，水溶解，离心，上清液经DEAE SepharoseTM FastFlow阴离交换柱进行初步分级纯化，依次以水、0.05M、0.1M及0.2M氯化钠洗脱，收集0.1M氯化钠洗脱组分，得枸杞多糖LBP1B，再将LBP1B溶于0.2M氯化钠中，离心，上清液经SephacrylHR S-300凝胶色谱柱分离，收集洗脱组分，浓缩，透析，冷冻干燥，得所述枸杞多糖LBP1B-S-2。
8.一种硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2，其由权利要求1～5中任一项所述枸杞多糖LBP1B-S-2硫酸化得到。
9.权利要求8所述硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
氯磺酸和吡啶按体积比1:3/v:v制备硫酸化试剂，将枸杞多糖LBP1B-S-2与硫酸化试剂于60℃反应，反应结束后经NaOH中和，饱和NaHCO3透析、去离子水透析、冷冻，干燥后得到硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2。
10.权利要求8所述硫酸化多糖衍生物Sul-LBP1B-S-2在制备抗血管生成药物中的用途。
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