CN102464725B

CN102464725B - 一种天麻多糖及其降解产物,其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102464725B
Application number: CN 201010548119
Authority: CN
Inventors: 丁侃; 陈霞; 曹殿秀
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2010-11-17
Filing date: 2010-11-17
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2030-11-17
Also published as: CN102464725A

Abstract

本发明公开了一种从天麻原药材中提取的天麻多糖WGE和其降解产物WGE-AD-I和WGE-AD-O，及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的用途。该天麻多糖的结构式如下，其中x和y为整数且x+y＝16；n为整数，其平均分子量为1000kD(平均分子量范围为800-1200kD)，其比旋度为[α]¹⁹ _D+382°(c0.05，H₂O)。所述天麻多糖部分酸水解的降解产物多糖WGE-AD-I的结构重复单元与WGE一样，但平均分子量为10kD(平均分子量范围8～12kD)。另一降解产物WGE-AD-O为寡葡聚糖的混合物(分子量范围320～3,000Dalton)。该天麻多糖及其降解产物经体外实验证明能显著抑制胰腺癌细胞和黑色素瘤细胞的生长，而且对正常细胞几乎没毒性，因而有望开发为抗肿瘤药物。

Description

一种天麻多糖及其降解产物,其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种从天麻根茎中提取的天麻多糖及其降解产物，以及天麻多糖降解产物的制备方法，本发明还涉及天麻多糖降解物在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

胰腺癌与黑色素瘤为临床常见肿瘤，死亡率高。尤其是胰腺癌，患者从肿瘤发现至死亡时间平均只有3-6个月。

胰腺癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，是恶性肿瘤中最常见的，多发生于胰头部。胰腺癌被称为癌症中的王中之王，因其手术成功率低，病情恶变快，患者疼痛剧烈，大多都以短期治疗缓解症状，延长生命为主，然后再考虑如何治愈。一般认为胰腺癌对于放疗和化疗均不甚敏感，多数药物的近期有效率低于10％。相比之下较为有效的药物有5-氟脲嘧啶(5-Fu)、丝裂霉素(MMC)、链脲霉素(STZ)、阿霉素(ADM)/表阿霉素(E-ADM)、异环磷酰胺(IFO)、吉西他滨(GEM)以及雷替曲塞(Raltitrexed，Tomudex)等。对于转移性或局部晚期合并广泛腹膜播散的胰脏癌，化疗扮演了重要的角色。但是因为这些药物或者化疗都会对病人的身心带来巨大的副作用，目前正在寻在更好的候选药物。

黑色素瘤是一种恶性程度相当高的恶性肿瘤，又称恶性黑瘤，是死亡率最高的一种皮肤癌。大多原发于皮肤，也可起源于眼、鼻腔等处，早期可发生转移，转移部位多见肺、脑。治疗黑色素瘤的药物主要有亚硝脲类药物与氮烯咪胺(DTIC)。但是这些药物的毒性给患者带来了巨大的痛苦，因此，如果能研发出有抗肿瘤活性又对正常细胞毒性较小的药物，无疑是肿瘤治疗的一个重大突破。

天麻(Gastrodia elata BL.)是一味常用而比较名贵的中药。之前有本发明人的相关研究已经报道(Hong Qiu；Wei Tang；Xiankun Tong；Kan Ding；Jianping Zuo.Carbohydr.Res.2007，342，2230-2236.)从天麻中分离得到的一个均一多糖，它的硫酸化衍生物可以通过抑制血管生成进而抑制肿瘤生长。

在本发明中发明人基于以往的研究从天麻中分离得到一个天麻均一多糖(编号：WGE)，该多糖与上述已报道结构有一定的相似性，但分子量相差巨大，是一种新的多糖化合物。在8mg/ml剂量下能有效抑制胰腺癌细胞和黑色素瘤细胞的生长，其抑制率分别为45％和32％。它的降解产物(编号：WGE-AD-I和WGE-AD-O)有更好的活性，其中WGE-AD-I是WGE酸降解产物的透析袋内成分，WGE-AD-O是WGE酸降解产物的透析袋外成分。特别是WGE-AD-O，在1mg/ml剂量下表现出比原多糖WGE在8mg/ml剂量更强的活性，它对胰腺癌细胞和黑色素瘤细胞的抑制率分别为42％和50％。在2mg/ml的浓度下，对胰腺癌的抑制率为87％。同时，原多糖与其降解产物对正常肝细胞几乎都没有毒性，因而有望开发为抗肿瘤药物。

发明内容

因此，本发明的一个目的在于提供一种从天麻中提取的天麻多糖，该天麻多糖的结构式如下：

其中x和y为整数且x+y＝16；

n为正整数，其数值范围可以由分子量计算得出；

分子量范围在800-1,200kD，其平均分子量为1,000kD；

其比旋度为[α]¹⁹ _D+382°(c 0.05，H₂O)，其中测试条件为19℃，浓度为0.05g/100ml，水为溶剂)。

本发明的另一目的为提供一种提取天麻多糖的方法，该方法的具体步骤如下：

(1)取天麻原药材，用95％乙醇脱脂，脱脂后室温自然干燥。干燥后的天麻原药材用沸水提取4至6次，每次4h到6h，天麻原药材与每次加水量的比例为1kg药材加水8至10L，硫酸-苯酚法检测提取液的糖含量，直至糖反应不明显；

(2)将每次的提取液合并，最终浓缩至5-15L，扎透析袋(截留分子量约为3000)，对流动水透析三天。透析袋内液浓缩至5-10L，加入5-10L 30％(W/V)三氯乙酸溶液，使其终浓度为15％(W/V)，脱蛋白，之后用10％NaOH中和至pH为7.0至8.0，对流动水透析(透析袋截留分子量约为3kD)三天去蛋白。内液浓缩至5L，离心去沉淀，上清液加入3至4倍95％乙醇沉淀，静置，沉淀离心，用95％乙醇洗涤数次后烘干，得到天麻水提粗多糖GE。

(3)取步骤(2)中的水提粗多糖GE，适量水溶解，离心除去不溶物，上清液通过二乙基氨乙基纤维素[DEAE-纤维素(Cl^-型)]柱进行分离。逐步以蒸馏水、0.1mol/L NaCl洗脱，硫酸-苯酚法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收取合并洗脱液，其中0.1mol/L NaCl洗脱液经浓缩至30-40ml，装透析袋(截留分子量为3kD)，对蒸馏水透析(2L×4)，透析袋内液冷冻干燥后得到白色絮状固体，为天麻多糖WGE。

本发明的另一目的为提供一种由天麻多糖制备天麻降解多糖的方法，该方法的具体步骤如下：

天麻多糖WGE经三氟乙酸降解，反应液除去三氟乙酸后，对蒸馏水透析，透析袋内液浓缩后冻干得次级天麻多糖WGE-AD-I，透析外液浓缩后得天麻混合寡糖WGE-AD-O。WGE-AD-I为均一多糖，结构重复单元与WGE一样，但其平均分子量为10kD(分子量范围为8kD-12kD)，为不同多糖化合物。WGE-AD-O是寡糖混合物，其中包括葡萄糖单糖，以及2-19个单糖组成的葡聚糖。

更具体而言，取1.0g天麻多糖WGE置于干燥的500ml圆底烧瓶中，加入300ml1.0mol/L三氟乙酸，密塞，100℃保温0.5至3h。反应液经减压蒸馏除去三氟乙酸后，对蒸馏水透析(2L×3)48h，透析袋内、外液分别浓缩后冻干。内液冻干后得到次级天麻多糖WGE-AD-I。合并两次透析外液冻干产物得天麻混合寡糖WGE-AD-O。

在上述提取过程中，天麻原药材购于云南中药生产基地；WGE-AD-O降解产物的制备过程中，所使用的水优选为蒸馏水或去离子水；透析所用膜为普通级实验用透析膜。

本发明的又一目的是提供所述天麻多糖及其降解产物在制备抗肿瘤药物中的用途。经体外实验证明，天麻多糖具有明显抑制胰腺癌细胞与黑色素瘤细胞的生长的作用。天麻多糖的降解产物，在更少剂量时即能起到该作用，因而有望作为抑制肿瘤细胞生长的药物。

附图说明

图1为根据本发明的WGE的¹³C NMR谱图；

图2为根据本发明的WGE的GC图。

具体实施方式

下面结合具体实施例详细描述本发明，但本发明并不仅仅局限于这些具体实施例。

实施例1从天麻中提取天麻多糖

取天麻原药材5.0Kg，用20L 95％乙醇脱脂一周，脱脂后室温自然干燥。干燥后的天麻原药材4.7Kg用沸水提取，每次加水40L，每次4h，硫酸-苯酚法检测提取液的糖含量，直至糖反应不明显。将每次的提取液合并，浓缩至5-15L，对流动水透析三天(透析袋截留分子量约为3kD)，以除去小分子化合物。透析袋内液浓缩至500-1000mL，加入500-1000mL 30％(W/V)三氯乙酸溶液，使其终浓度为15％(W/V)，脱蛋白，之后用10％NaOH中和至pH 7.0-8.0，对流动水透析三天(透析袋截留分子量约为3kD)，去蛋白。内液浓缩至小体积(5L)，离心去沉淀，上清液加入3-4倍95％乙醇沉淀，静置12h，沉淀离心，用95％乙醇洗涤两次后80℃烘干，得到天麻水提粗多糖GE 260g。

取6g水提粗多糖GE，适量水溶解，离心除去不溶物，上清液通过二乙基氨乙基纤维素[DEAE-纤维素(Cl^-型)]柱进行分离。逐步以蒸馏水、0.1mol/LNaCl洗脱，硫酸-苯酚法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收取合并洗脱液，其中0.1mol/L NaCl洗脱液经浓缩、对蒸馏水透析，透析袋内液冷冻干燥后得到白色絮状固体，为天麻多糖WGE(1.2g)。

物化性质测定：按照多糖的常规方法，以分子量已知的右旋糖酐T-700，T-580，T-110，T-80，T-40，T-11为标准，使用Agilent HPGPC(Ultrahydragel^TM500串联Ultrahydragel^TM2000柱)测定WGE平均分子量为1,000kD(平均分子量范围为800-l,200kD)。使用旋光仪Perkin-Elmer 241M测得WGE比旋度为[α]¹⁹ _D+382°(c 0.05，H₂O)。

糖组成分析：取3mg WGE样品，110℃下封管用三氟乙酸(TFA)水解2小时，水解产物冷却后于40℃减压浓缩蒸干，重复操作4-5次，以除尽TFA。然后加3ml去离子水溶解样品，加入20～30mg硼氢化钠，室温下还原3小时(间歇震荡)，然后用25％乙酸中和多余的硼氢化钠，至溶液不再产生气泡，pH应在4～5之间，加甲醇多次，减压蒸干，100℃加热15分钟，除去残留的水分，加3ml醋酐，密塞，100℃反应1小时，冷却，加甲苯4～5次(每次2～3ml)共蒸除去多余醋酐，直至完全干燥。所得的乙酰化产物用8ml氯仿萃取，经等体积蒸馏水洗涤4次，氯仿层用无水硫酸钠干燥，浓缩至0.1ml后用岛津GC-14B气相色谱仪分析。结果(图2)显示，对照标准样品，只有葡萄糖的峰，所以该多糖为葡聚糖。

化学结构测定：

1)核磁共振分析：室温下，取30mg WGE，用1ml重水溶解后，用核磁共振仪BruckerAM-400获得其¹³C NMR谱图(参见图1)。

2)甲基化分析：取5mg WGE样品于25ml圆底烧瓶中，加入3ml干燥二甲基亚砜(DMSO)，放入搅拌子后，连接三通(气球里充满N₂)，使装有样品的烧瓶中充满N₂，密塞，超声波仪中超声10min后，再于室温中搅拌10min，快速加入20～30mg预先干燥的NaOH粉末，超声10min，于室温搅拌30min，冰浴下缓慢滴入1ml CH₃I，用铝箔纸包住反应瓶，使其避光反应1h。反应完毕，加入2ml蒸馏水，减压除去过量CH₃I，以氯仿-水系统萃取，水洗三次，氯仿层以适量无水Na₂SO₄室温干燥2h，干燥完毕，减压蒸干，再如上法重复两次(如需过夜样品置于装有P₂O₅的真空干燥器中干燥)。甲基化产物溶于3ml 2mol/L的三氟乙酸，于110℃保温3h，反应完毕，以甲醇多次减压蒸干，产物溶于3ml 0.3％NaOH(w/v)，加入40mg左右NaBH₄，于40℃下水浴反应1.5h，反应完毕以醋酸中和，加入甲醇多次减压蒸干，100℃干燥10min，加入3ml乙酸酐，100℃下反应1.5h，加入甲苯多次减压蒸干，用氯仿-水系统萃取四次，氯仿层加入适量无水Na₂SO₄于室温干燥20min，减压浓缩至约0.1ml后进行GC-MS分析。结果(表1)显示WGE中末端葡萄糖、(1→4)连接的葡萄糖和1、4、6连接的葡萄糖的摩尔比为1∶16∶1，是一α(1→4)连接的葡聚糖，6位上带有少量α(1→4)连接的寡聚葡萄糖。

表1WGE的全甲基化后的气质联用(GC-MS)图谱分析结果

在糖化学领域中，即使重复单元一样，但由于分子量不一样，其空间结构会不同，而这种空间结构的变化可以带来活性的显著变化。在本申请背景技术部分提及的本发明人之前发表的文献中所提到的天麻多糖的硫酸化衍生物分子量在降解前为280kD，而本申请的多糖为非硫酸多糖，分子量在降解前是大约1800-1200kD，相差巨大。而原多糖降解后的多糖分子量分别只有大约10kD和320-3000道尔顿。分子量减小后成药性会更好，吸收也容易一些。以下的药理学实施例中也证明了本发明的天麻多糖及其降解产物对正常细胞的毒副作用也大大降低。

实施例2天麻多糖降解产物的制备

取1.0g天麻多糖置于干燥的500ml圆底烧瓶中，加入30ml1.0mol/L三氟乙酸，密塞，100℃保温1h。反应液经减压蒸馏除去三氟乙酸后，对蒸馏水透析(2L×3)48h，透析袋内、外液分别浓缩后冻干。内液冻干后得到次级天麻多糖WGE-AD-I(531mg)。合并两次透析外液冻干产物，得到天麻混合寡糖WGE-AD-O(343mg)。

物化性质测定：按照多糖的常规方法，以分子量已知的右旋糖酐T-700，T-580，T-110，T-80，T-40，T-11为标准，Agilent HPGPC(TSK-gel 300PW_XL)测定WGE-AD-I的平均分子量约为10kD，WGE-AD-O平均分子量约为3kD。使用旋光仪Perkin-Elmer 241M测得WGE-AD-I比旋度为[α]¹⁹ _D+78°(c 0.05，H₂O)，WGE-AD-O比旋度为[α]¹⁹ _D+142°(c 0.05，H₂O)。

药理学实施例

1、WGE、WGE-AD-I、WGE-AD-O抗胰腺癌细胞活性

在96孔板内加入含有人体胰腺癌细胞株panc-1的培养基悬浮液100μL，细胞浓度为0.5×10⁴个。37℃5％CO₂培养箱孵育24小时。吸出培养液，分别加入含有WGE、WGE-AD-I、WGE-AD-O的培养基溶液100μL，使其终浓度分别为8mg/ml，8mg/ml，1mg/ml。培养基为含有2ml谷氨酰胺、10％胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司产品)、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的MCDB131培养基(Invitrogen公司产品)。37℃5％CO₂培养箱培养72小时后，MTT检测抑制率。结果显示WGE、WGE-AD-I、WGE-AD-O在其对应的浓度下对胰腺癌细胞的抑制率分别为45％，80％，42％。对于WGE-AD-O，使用浓度梯度为0.25，0.5，1.0，2.0mg/ml对应的胰腺癌细胞的抑制率分别为15％，19％，42％和87％。

2、WGE、WGE-AD-I、WGE-AD-O抗黑色素瘤细胞活性

在96孔板内加入含有人体黑色素瘤细胞株B₁₆F₁₀的培养基悬浮液100μL，细胞浓度为0.3×10⁴个。37℃5％CO₂培养箱孵育24小时。吸出培养液，分别加入含有WGE、WGE-AD-I、WGE-AD-O的培养基溶液100μL，使其终浓度分别为8mg/ml，8mg/ml，1mg/ml。培养基为含有2ml谷氨酰胺、10％胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司产品)、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的MCDB131培养基(Invitrogen产品)。37℃5％CO₂培养箱培养72小时后，MTT检测抑制率。结果显示WGE、WGE-AD-I、WGE-AD-O在其对应的浓度下对黑色素瘤细胞的抑制率分别为32％，27％，50％。

3、WGE、WGE-AD-O对正常肝细胞LO2的细胞毒性

在96孔板内加入含有LO2的培养基悬浮液100μL，细胞浓度为0.5×10⁴个。37℃5％CO₂培养箱孵育24小时。吸出培养液，分别加入含有WGE、WGE-AD-O的培养基溶液100μL，使其终浓度都为1mg/ml。培养基为含有2ml谷氨酰胺、10％胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司产品)、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的MCDB131培养基(Invitrogen产品)。37℃5％CO₂培养箱培养72小时后，MTT检测抑制率。结果显示WGE、WGE-AD-O在1mg/ml浓度下对LO2的抑制率分别为-8％，7％。

通过上述药理学实施例可以了解，本发明的天麻多糖及其降解产物对胰腺癌细胞和黑色素瘤细胞均具有显著的抑制效果，同时保持对人体的正常细胞极小的毒性。因此有望开发为抗肿瘤，特别是针对胰腺癌和黑色素瘤的药物。

本领域技术人员可以理解上述实施例仅是说明性的，并不对本发明构成任何限制，任何不偏离本发明的实质的修改和改变均落入本发明的保护范围内。

Claims

1.从天麻根茎中提取的天麻多糖WGE，其中该天麻多糖的结构式如下：

其中x和y为整数且x+y=16；

n为正整数；

分子量范围在800-1,200kD，其平均分子量为1,000kD；

其比旋度为[α]¹⁹ _D+382°，其中测试条件为19℃，浓度为0.05g/100ml的水溶液。

2.一种如权利要求1所述的天麻多糖的降解产物WGE-AD-I，其特征在于，所述降解产物WGE-AD-I按照以下方式获得：

将权利要求1中所述天麻多糖WGE置于干燥烧瓶中，加入1.0mol/L三氟乙酸，密塞，100℃保温0.5至3h，反应液经减压蒸馏除去三氟乙酸后，对蒸馏水透析，透析袋内液浓缩后冻干，得到天麻多糖降解产物WGE-AD-I；

该天麻多糖降解产物WGE-AD-I的结构重复单元与权利要求1中所述天麻多糖WGE一样，其分子量范围为8kD-12kD，平均分子量为10kD；其比旋度为[α]¹⁹D+78°，其中测试条件为19℃，浓度为0.05g/100ml的水溶液。

3.一种如权利要求1所述的天麻多糖的降解产物WGE-AD-O，其特征在于：所述降解产物WGE-AD-O按照以下方式获得：

将权利要求1中所述天麻多糖WGE置于干燥烧瓶中，加入1.0mol/L三氟乙酸，密塞，100℃保温0.5至3h，反应液经减压蒸馏除去三氟乙酸后，对蒸馏水透析，透析袋外液浓缩后冻干，得到天麻多糖降解产物WGE-AD-O；

该天麻多糖降解产物WGE-AD-O为寡糖混合物，其中包括葡萄糖单糖，以及2-19个单糖组成的葡聚糖；其平均分子量为3kD；其比旋度为[α]¹⁹ _D+142°，其中测试条件为19℃，浓度为0.05g/100ml的水溶液。

4.一种从天麻根茎中提取权利要求1所述的天麻多糖的方法，该方法包括以下步骤：

（1）取天麻原药材，用95%乙醇脱脂，脱脂后室温自然干燥，干燥后的天麻原药材用沸水提取4至6次，每次4h到6h，天麻原药材与每次加水量的比例为1kg药材加水8至10L，硫酸-苯酚法检测提取液的糖含量，直至糖反应不明显；

（2）将每次的提取液合并，最终浓缩至5-15L，扎透析袋，以截留分子量为3000，对流动水透析三天，透析袋内液浓缩至5-10L，加入5-10L30%W/V三氯乙酸溶液，使其终浓度为15%W/V，脱蛋白，之后用10%NaOH中和至pH为7.0至8.0,对流动水透析三天去蛋白，以透析袋截留分子量为3kD，内液浓缩至5L，离心去沉淀，上清液加入3至4倍95%乙醇沉淀，静置，沉淀离心，用95%乙醇洗涤数次后烘干，得到天麻水提粗多糖GE；

（3）取步骤(2)中的水提粗多糖GE，适量水溶解，离心除去不溶物，上清液通过Cl^-型二乙基氨乙基纤维素柱进行分离，逐步以蒸馏水、0.1mol/LNaCl洗脱，硫酸-苯酚法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收取合并洗脱液，其中0.1mol/L NaCl洗脱液经浓缩至30-40ml，装透析袋以截留分子量为3kD，对蒸馏水透析4至6次，每次2L，透析袋内液冷冻干燥后得到白色絮状固体，为天麻多糖WGE。

5.根据权利要求1至3中任意一项所述天麻多糖或其降解产物在制备抗肿瘤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其中所述肿瘤为胰腺癌与黑色素瘤。