CN113248630A - 一种岩藻多糖组合物、其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种岩藻多糖组合物、其制备方法及其用途。本发明的岩藻多糖组合物能剂量依赖性地抑制肝星状细胞的激活、在1.0mg/ml的浓度下也能抑制肾小管上皮细胞的激活，从而成为广谱的抗肝纤维化、肾纤维化的潜在的糖类药物。

Description

一种岩藻多糖组合物、其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及了一种多糖，更具体而言，涉及一种从海蕴(Nemacystus decipiens)中提取得到的硫酸化的岩藻多糖组合物、其制备方法及其在制备预防和/或治疗纤维化疾病的药物或保健品中的用途。
背景技术
海蕴是一种被广泛食用的褐藻，在我国沿海和日本均有分布。海蕴含有丰富的蛋白质、多糖、脂类、维生素，此外，还有大量的微量元素，如碘、钙、磷等。褐藻中主要的多糖是海藻淀粉、褐藻胶和岩藻多糖。岩藻多糖具有众多的生物活性，如抗炎、免疫调节、抗补体活性、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗凝和抗病毒等活性。前期实验数据发现硫酸化的多糖具有良好的活性，且海蕴的岩藻多糖相关文献报道不多。
慢性病毒性和代谢性疾病引起的肝纤维化，虽然每年由于肝硬化的发展导致超过一百万的死亡，但迄今为止尚未批准有效的抗纤维化疗法。肝星状细胞的转分化(或“激活”)是分泌基质蛋白的成肌纤维细胞的主要细胞来源，而成纤维细胞是肝纤维化的主要驱动力。
肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)几乎是所有各种肾脏疾病进展到终末期肾衰竭(end-stage renal distase,ESRD)的共同途径。肾小球疾病慢性进展过程中，肾间质内表达α-SMA的肌纤维母细胞明显增多，并且是肾间质纤维化过程中细胞外基质沉积的最主要来源，其数量是判断预后的重要指标。近年来认为，在病理条件下，肾小管上皮细胞可转分化为肌成纤维细胞从而直接参与间质纤维化过程。
发明内容
发明目的
本发明利用一种简单有效的多糖提取工艺和方法，以海蕴为原料获得了一种硫酸化的岩藻多糖NDH0，药理实验表明NDH0可以抑制肝星状细胞和肾小管上皮细胞的激活。因此NDH0有望开发成为一种广谱的抗纤维的糖类药物。
本发明的一个目的在于提供一种岩藻多糖组合物。
本发明的另一目的是提供所述岩藻多糖组合物的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种包含所述岩藻多糖组合物的药物组合物。
本发明的另一目的是提供所述岩藻多糖组合物的在制备预防和/或治疗肝、肾纤维化的广谱药物或保健品中的用途。
技术方案
根据本发明的一个实施方式，其提供了一种岩藻多糖组合物，其特征在于，在该组合物中的多糖的分子量为150～200kDa，其单糖组成为岩藻糖：葡萄糖醛酸＝70～80％:10～20％，以及余量的葡萄糖、甘露糖、木糖。
根据本发明的一个实施方式，其提供了一种岩藻多糖组合物的制备方法，该方法包括以下步骤：
a.多糖提取：将海蕴干燥，加入乙醇室温浸泡48-96小时，重复1-2次，干燥得脱脂干燥样品，在70-90℃条件下用水提取6-10次，合并上清液，用流动水透析24-72小时，用乙醇沉淀，收集沉淀物并以无水乙醇和丙酮洗涤，真空干燥得粗多糖NDH；
b.多糖纯化：取步骤a中的粗多糖NDH，用QFF(Q Sepharose Fast Flow)阴离子交换柱进行分离，以蒸馏水作为A相和4M NaCl溶液作为B相进行线性洗脱，得到所述岩藻多糖组合物。
优选地，在步骤a中，将海蕴干燥，加入95％乙醇室温浸泡72小时，重复1次，干燥得脱脂干燥样品，在80℃条件下用水提取8次，合并上清液，用流动水透析48小时，95％用乙醇沉淀，收集沉淀物并以无水乙醇和丙酮洗涤，真空干燥得粗多糖NDH。
根据本发明的另一个实施方式，其提供了一种药物组合物，其包含上述岩藻多糖组合物和药学上可接受的辅料。
根据本发明的另一个实施方式，其提供了所述岩藻多糖组合物在制备预防和/或治疗肝、肾纤维化的广谱药物或保健品中的用途。
有益效果
本发明的岩藻多糖组合物能剂量依赖性地抑制肝星状细胞的激活、在1.0mg/ml的浓度下也能抑制肾小管上皮细胞的激活，从而成为广谱的抗肝纤维化、肾纤维化的潜在的糖类药物。
附图说明：
图1为岩藻多糖组合物NDH0的分子量检测图；
图2为岩藻多糖组合物NDH0的PMP衍生化糖组成分析图；
图3为岩藻多糖组合物NDH0抑制LX-2细胞中α-SMA和Collagen I的蛋白水平表达量的免疫印迹图；
图4为岩藻多糖组合物NDH0抑制HK--2细胞中α-SMA和Collagen I的蛋白水平表达量的免疫印迹图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，以下实施方式只以举例的方式描述本发明。很明显，本领域普通技术人员可在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和修改。需要了解的是，本发明意欲涵盖在所附权利要求中包括的变通和修改。
实施例1：岩藻多糖组合物NDH0的制备
a.多糖提取：
称取新鲜的海蕴2.5kg，日晒风干获得0.389kg干燥海藻。加入2L 95％乙醇室温浸泡三天，重复一次。通风吹干，获得0.362kg干燥样品。使用恒温电磁炉控温80℃提取海蕴粗多糖，每次加水10L，电动搅拌器旋转搅拌8小时。用硫酸-苯酚法检测提取液中的糖含量，至无显色变化为止，共计提取8次。上清合并，以流动水透析两天，加入95％乙醇至乙醇浓度为80％，沉淀24小时，12000r/min离心收集沉淀，弃上清。三倍体积无水乙醇和丙酮洗涤一次，40℃真空干燥，获得粗多糖NDH28.26 g，得率7.8％。
b.多糖分离与纯化：
取上述制备的海蕴粗多糖用QFF(Q Sepharose Fast Flow)阴离子交换柱(50cm×5cm)进行分离，以蒸馏水(A相)和4M NaCl溶液(B相)进行线性洗脱，得NDH0多糖1.15g，得率0.32％。
c.多糖分子量检测：
用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定NDH0多糖相对分子质量。多糖样品配成2mg/ml溶液，以0.1M NaNO3为流动相，流速0.5mL/min，柱温25℃，进样体积20μL。通过Agilent配套色谱工作站GPC软件计算多糖相对分子量为170kDa，其结果如图1所示。
d.多糖单糖组成分析：
利用PMP柱前衍生化进行单糖组成分析。制备单糖标准品，称取各单糖标准品1mg，以去离子水为溶剂配成1mg/mL溶液。水解多糖，称取4mg多糖样品置于鸡心瓶中，加入1mL去离子水溶解，加入1mL 4M的三氟乙酸，封口置于110℃高温烘箱水解4小时，冷却至室温。加入甲醇去除多余三氟乙酸。200μL去离子水复溶。取50μL多糖水解液或等体积混合单糖标准品水溶液于无酶ep管中，加入等体积0.6mol/L的NaOH溶液，充分混匀，加入100μL 0.5mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液，涡旋震荡充分混匀。70℃水浴加热100分钟，冷却至室温。加入100μL 0.3mol/L的HCL去除NaOH。加入700μL去离子水和1mL三氯甲烷充分震荡，静置2小时。吸取上层液体900μL，再加入900μL三氯甲烷萃取。重复一次。使用0.22μm滤器过滤，放入HPLC中分析检测。其单糖组成为岩藻糖：葡萄糖醛酸＝75％：15％，以及少量的葡萄糖、甘露糖、木糖，其结果如图2所示。
实施例2.岩藻多糖NDH0抑制肝星状细胞的激活
1.免疫印迹实验检测岩藻多糖NDH0对LX-2细胞中α-SMA和Collagen I在蛋白水平表达的影响
取对数生长期的LX-2细胞，以1.2×106个/孔的密度种于6孔板中，培养24h后，用0、500及1000μg/ml的岩藻多糖NDH0(实施例1制备)处理1h后，以0、10ng/ml的浓度加入TGFβ刺激。处理48h后，弃上清，用预冷的PBS漂洗细胞，western及IP细胞裂解液(购自碧云天公司)冰上裂解细胞30min，离心收集上清液。加入5×上样缓冲液后将蛋白于煮样器中变性10min，冷却后储存于-80℃。免疫印迹检测α-SMA、Collagen I的蛋白表达情况。
结果如图3所示，岩藻多糖NDH0能够以浓度依赖性地抑制α-SMA、Collagen I的表达，并且可能和影响Wnt/β-catenin和AMPK信号通路有关。
2.免疫印迹实验检测岩藻多糖NDH0对肾小管上皮细胞HK-2细胞中α-SMA和Collagen I在蛋白水平表达的影响
取对数生长期的HK-2细胞，以1.2×106个/孔的密度种于6孔板中，培养24h后，用0、500及1000μg/ml的岩藻多糖NDH0(实施例1制备)处理1h后，以0、10ng/ml的浓度加入TGFβ刺激。处理48h后，弃上清，用预冷的PBS漂洗细胞，western及IP细胞裂解液(购自碧云天公司)冰上裂解细胞30min，离心收集上清液。加入5×上样缓冲液后将蛋白于煮样器中变性10min，冷却后储存于-80℃。免疫印迹检测α-SMA、Collagen I的蛋白表达情况。
结果如图4所示，岩藻多糖NDH0能够在1000μg/ml的浓度下显著地抑制α-SMA、Collagen I的表达。
综上所述，通过实施例可知，岩藻多糖NDH0能剂量依赖性地抑制肝星状细胞的激活、在1.0mg/ml的浓度下也能抑制肾小管上皮细胞的激活，进一步的分子机制研究表明，NDH0能明显抑制纤维化相关蛋白α-SMA、Collagen I的表达，从而抑制肝星状细胞和肾小管上皮细胞的激活，从而成为广谱的抗肝纤维化、肾纤维化的潜在的糖类药物。

Claims (5)

1.一种岩藻多糖组合物，其特征在于，在该组合物中的多糖的分子量为150～200kDa，其单糖组成为岩藻糖：葡萄糖醛酸＝70～80％:10～20％，以及余量的葡萄糖、甘露糖、木糖。
2.一种制备如权利要求1所述的岩藻多糖组合物的方法，该方法包括以下步骤：
a.多糖提取：将海蕴干燥，加入乙醇室温浸泡48-96小时，重复1-2次，干燥得脱脂干燥样品，在70-90℃条件下用水提取6-10次，合并上清液，用流动水透析24-72小时，用乙醇沉淀，收集沉淀物并以无水乙醇和丙酮洗涤，真空干燥得粗多糖NDH；
b.多糖纯化：取步骤a中的粗多糖NDH，用QFF阴离子交换柱进行分离，以蒸馏水作为A相和4M NaCl溶液作为B相进行线性洗脱，得到所述岩藻多糖组合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，
在步骤a中，将海蕴干燥，加入95％乙醇室温浸泡72小时，重复1次，干燥得脱脂干燥样品，在80℃条件下用水提取8次，合并上清液，用流动水透析48小时，95％用乙醇沉淀，收集沉淀物并以无水乙醇和丙酮洗涤，真空干燥得粗多糖NDH，
步骤b与权利要求2的步骤b相同。
4.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的岩藻多糖组合物，以及药学上可接受的辅料。
5.根据权利要求1所述的岩藻多糖组合物在制备预防和/或治疗肝、肾纤维化的广谱药物或保健品中的用途。
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