CN101684163A - 一种天麻多糖硫酸化衍生物及其制备方法和抗肿瘤用途 - Google Patents

一种天麻多糖硫酸化衍生物及其制备方法和抗肿瘤用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从天麻中提取的天麻多糖的硫酸化衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的用途，其中该天麻多糖的结构式如图，其中x和y为整数且x+y＝16，n为整数，其峰尖分子量为2.8×105，在其0.5mg/mL水溶液中的比旋度为+95°；该天麻多糖的硫酸化衍生物是天麻多糖主要在6位羟基上的硫酸化衍生物，其峰尖分子量为6.5×104，在其0.5mg/mL水溶液中的比旋度为+150.0°。经体内外实验证明该天麻多糖的硫酸化衍生物通过抑制Id1的表达而抑制血管生成，进而抑制肿瘤的生长，具有明显抗肿瘤作用，而且对内皮细胞几乎没有毒性，因此有望开发为抗肿瘤的药物。

Description

一种天麻多糖硫酸化衍生物及其制备方法和抗肿瘤用途
技术领域
本发明涉一种从天麻中提取的天麻多糖的硫酸化衍生物及其制备方法和用于制备抗肿瘤药物的用途。
背景技术
Id1是转录因子bHLH家族中DNA结合抑制蛋白中的一员，定位于核内，是血管生成必须的促进因子之一。它在多数肿瘤中表达升高，而在正常组织中的表达偏低，是一很好的抗肿瘤靶标。这使得针对Id1开发低毒、高效、强特异性的抑制剂成为抗肿瘤药物研发的一个热点，目前已报道一特异性靶向内皮细胞的反义核苷酸Id1-PCAO和一能抑制侵袭性乳腺癌细胞中Id1表达的小分子大麻二醇(cannabidiol)。因为反义核苷酸作为药物在技术上仍有诸多障碍，大麻二醇为大麻素类似物，因而它们都不是很好的候选药物。
天麻(Gatrodia elata BL.)是一著名的传统中药，目前未见其中多糖和多糖衍生物的正式报道。本发明人从天麻中分离得到天麻多糖，通过硫酸化衍生得到的其硫酸化衍生物(WSS25)，WSS25能够在25μg/ml剂量下几乎完全抑制Id1mRNA水平和蛋白质水平的表达，而抑制血管生成，进而抑制肿瘤的生长，但是对内皮细胞几乎没有细胞毒性，因而是低毒高效的Id1抑制剂。
发明内容
因此，本发明的一个目的在于提供一种从天麻中提取的天麻多糖的硫酸化衍生物，其中该天麻多糖的结构式如下：
α-D-Glcp-(1[→4)-α-D-Glcp-(1]x
                        ↓
                         6
-{[→4)-α-D-Glcp-(1]y→4-α-D-Glcp-(1→}n-
其中x和y为整数且x+y＝16，
n为整数，其峰尖分子量为2.8×105，在其0.5mg/mL水溶液中的比旋度为+95°；
该天麻多糖的硫酸化衍生物是天麻多糖主要在6位羟基上的硫酸化衍生物，其峰尖分子量为6.5×104，在其0.5mg/mL水溶液中的比旋度为+150.0°。
本发明的另一目的为提供一种天麻多糖的硫酸化衍生物的制备方法，该方法的具体步骤如下：
1)水提粗多糖(WGE)的制备：干燥的天麻饮片，经乙醇脱脂、干燥后，用热水反复提取2～5次，合并提取液；所得提取液浓缩后用三氯乙酸脱蛋白，离心分离，所得上清液经中和、透析、浓缩，得到一浓缩液；加入2～5倍于浓缩液体积的乙醇，离心分离得沉淀，该沉淀经真空干燥，得水提粗多糖WGE；
2)天麻多糖(WGESC1A)的制备：向上述步骤1)得到的水提粗多糖WGE加入适量水溶解并离心，上清液用二乙基氨乙基纤维素[DEAE-纤维素(Cl-型)]为载体进行柱层析分离，分别以水、0.1～0.4mol/L NaCl溶液剃度洗脱，其中0.1mol/L NaCl洗脱液经浓缩、透析以及冷冻干燥得到白色絮状固体天麻多糖WGESC1A；
3)天麻多糖硫酸化衍生物(WSS25)的制备：经分子筛处理的吡啶冰浴冷却后，将氯磺酸逐滴加入到吡啶中制成酯化试剂；经分子筛处理的甲酰胺中溶解天麻多糖，该溶液冰浴冷却下，然后往该溶液中逐滴加入上述制备的酯化试剂；反应完毕，反应液调pH值至7.8，然后浓缩，所得浓缩液对饱和的NaHCO3溶液透析后，换成对水透析；透析袋内液冷冻干燥得天麻多糖的硫酸化衍生物WSS25。
更具体而言，在步骤1)中，取天麻干燥饮片，用95wt％乙醇脱脂1周，脱脂后室温自然干燥；干燥后，用100℃水反复浸渍天麻饮片数次，至提取液用硫酸-苯酚检测无明显反应，将每次的提取液合并后加热浓缩；所得浓缩液冷却后以15％(W/V)三氯乙酸溶液脱蛋白，离心分离，所得上清液用1mol/L NaOH中和至pH7.0，然后对流动水透析72h，内液浓缩至小体积，在搅拌下加入三倍体积的95wt％乙醇，静置过夜，倾去上清液，离心分离，所得沉淀依次用2倍体积的无水乙醇、丙酮洗涤以脱去水分，离心分离，所得沉淀置40℃下真空干燥，得水提粗多糖WGE。
在步骤2)中，取水提粗多糖WGE，用适量水溶解，离心除去不溶物，上清液通过二乙基氨乙基纤维素[DEAE-纤维素(Cl-型)]柱进行分离。逐步以水、0.1mol/L NaCl、0.2mol/L NaCl和0.4mol/L NaCl洗脱，用硫酸-苯酚法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收取合并洗脱液，其中0.1mol/L NaCl的洗脱液经浓缩，对蒸馏水透析，所得透析袋内液冷冻干燥得天麻多糖WGESC1A。
在所述步骤3)中，经
Figure A20081020040700071
分子筛处理的吡啶冰浴冷却后，以氯磺酸/吡啶V/V＝2∶1的氯磺酸逐滴加入到吡啶中制成酯化试剂；每8mL
Figure A20081020040700082
分子筛处理的甲酰胺中溶解158.9mg的天麻多糖，该溶液冰浴至0℃，然后往溶液中逐滴加入2mL新鲜制备的酯化试剂；加毕，25℃水浴反应4h；反应完毕，反应液用5mol/L NaOH调pH值至7.8，然后＜30℃减压浓缩至小体积；浓缩液对2L饱和的NaHCO3溶液透析24h后，换成对2L去离子水透析，每次24h，共三次；透析袋内液冷冻干燥得天麻多糖的硫酸化衍生物。图2为WSS25的13C NMR谱图，由图2可知硫酸化主要发生在6位。
在上述提取过程中，天麻饮片购自上海市徐汇中药饮片有限公司；水可以采用蒸馏水或去离子水；透析所用膜为本领域常规使用的透析膜。
本发明的又一目的是提供所述天麻多糖的硫酸化衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途，经体内外实验证明天麻多糖的硫酸化衍生物通过抑制Id1的表达而抑制血管生成，进而抑制肿瘤的生长，具有明显抗肿瘤作用，因此有望开发为抗肿瘤的药物。
附图说明
图1为WGESC1A的13C NMR谱图；
图2为WSS25的13C NMR谱图；
图3显示WSS25对Id1-luc/HEK293细胞中荧光素酶表达的影响；
图4显示WSS25在不同浓度下对HMEC-1在基质胶上管腔形成的抑制作用；
图5显示WSS25不同浓度和不同处理时间对HMEC-1细胞生长的影响；
图6显示WSS25对肝癌细胞Bel7402在裸小鼠中移植瘤生长的抑制作用；
图7显示WSS25对肝癌细胞SMMC7721在裸小鼠中移植瘤生长的抑制作用。
具体实施方式
实施例1从天麻中提取天麻多糖
取天麻干燥饮片1000g，用5L 95wt％乙醇脱脂1周，脱脂后室温自然干燥。干燥后的天麻饮片975g用沸水提取，每次加水30L，每次4h，硫酸-苯酚法检测提取液的糖含量，直至糖反应不明显。将每次的提取液合并，浓缩至小体积，以15％(W/V)三氯乙酸溶液脱蛋白，离心分离，所得上清液用1mol/L NaOH中和至pH7.0，然后对流动水透析72h，内液浓缩至小体积，在搅拌下加入三倍体积的95wt％乙醇，静置过夜，倾去上清液，离心分离，所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤以脱去水分，离心分离，沉淀置40℃下真空干燥，得水提粗多糖WGE195g。
取5g水提粗多糖WGE，适量水溶解，离心除去不溶物，上清液通过二乙基氨乙基纤维素[DEAE-纤维素(Cl-型)]柱进行分离。逐步以蒸馏水、0.1mol/L NaCl、0.2mol/L NaCl和0.4mol/L NaCl洗脱，硫酸-苯酚法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收取合并洗脱液，其中0.1mol/L NaCl洗脱液经浓缩、对蒸馏水透析，和所得透析袋内液冷冻干燥得WGESC1A(2.0g)。
物化性质测定：按照多糖的常规方法，以分子量已知的右旋糖酐T-700，T-580，T-110，T-80，T-40，T-11为标准，Waters HPGPC测定WGESC1A峰尖分子量为2.8×105，使用旋光仪Perkin-Elmer 241M测得其在浓度为0.5mg/mL水溶液中比旋度为+95°。
糖组成分析：取2mgWGESC1A样品，110℃下封管用三氟乙酸(TFA)水解1.8小时，水解产物经乙酰化后用岛津GC-14B气相色谱仪分析。结果显示，该多糖为葡聚糖。
化学结构测定：按照多糖的常规方法，室温下，取40mgWGESC1A经氢交换后用核磁共振仪Brucker AM-400获得其13C NMR谱图(参见图1)。取8mgWGESC1A按照Needs方法进行甲基化分析，结果显示WGESC1A中末端葡萄糖、(1→4)连接的葡萄糖和1、4、6连接的葡萄糖的摩尔比为1∶16∶1，是一α(1→4)连接的葡聚糖，6位上带有少量α(1→4)连接的寡聚葡萄糖。
实施例2天麻多糖硫酸化衍生物的制备
经
Figure A20081020040700101
分子筛处理的吡啶冰浴冷却后，以氯磺酸/吡啶V/V＝2∶1的氯磺酸逐滴加入到吡啶中制成酯化试剂。每8mL
Figure A20081020040700102
分子筛处理的甲酰胺中溶解158.9mg的WGESC1A，该溶液冰浴至0℃，然后往溶液中逐滴加入2mL新鲜制备的酯化试剂。加毕，25℃水浴反应4h。反应完毕，反应液用5mol/L NaOH调pH值至7.8，然后＜30℃减压浓缩至小体积。浓缩液对2L饱和的NaHCO3溶液透析24h后，换成对2L去离子水透析，每次24h，共三次。透析袋内液冷冻干燥得WGESC1A的硫酸化衍生物WSS25。图2为WSS25的13C NMR谱图，由图2可知硫酸化主要发生在6位。
物化性质测定：按照多糖的常规方法，以分子量已知的右旋糖酐T-700，T-580，T-110，T-80，T-40，T-11为标准，Waters HPGPC测定WSS25峰尖分子量为6.5×104，使用旋光仪Perkin-Elmer 241M测得其在浓度为0.5mg/ml水溶液中比旋度为+150.0°。
试验性实施例
1、Id1表达抑制剂的筛选
将装载Id1启动子区的pGL4.14[luc2/Hygro]转入人胚肾细胞HEK293(来源于美国典型培养物保存中心)，经潮霉素筛选得稳定细胞株Id1-luc/HEK293，该细胞株用于Id1表达抑制剂的筛选，用含10％胎牛血清(杭州四季青产品)的DMEM培养基于37度5％CO2的培养箱培养。筛选时将90μL Id1-luc/HEK293细胞加入96孔板，每孔2500个细胞，24小时后10μL 250μg/mL和1000μg/mL的WSS25加入，每个浓度设三个复孔，等体积的生理盐水作为对照，继续培养18小时后用luminometer(NOVOstar BMG LABTECH.Pty.Ltd)测定荧光素酶(luciferase)活性，抑制率＝[(对照组荧光素酶相对活性-加药组荧光素酶相对活性)/对照组荧光素酶相对活性]×100％。25μg/mL和100μg/mL的WSS25的抑制率分别为39.25％和46.24％，如图3所示。
2、WSS25对人微血管内皮细胞HMEC-1管腔形成的影响
在96孔板内加入基质胶(Matrigel，BD Biosciences)，每孔50μL，37度放置30分钟后，分别加入10μL WSS25和90μL含3×104个HMEC-1细胞的培养基，使WSS25终浓度分别为6.25、25和50μg/mL，每个浓度设三个复孔。培养基为含有2mM谷氨酰胺、10ng/mL EGF(上海PrimeGene生物科技公司产品)、15％FBS(杭州四季青产品)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的MCDB131(Invitrogen产品)培养基。于37度5％CO2的培养箱培养10h后，显微镜(Olympus IX 51)下拍照，放大倍数为200，在25μg/mL的浓度下WSS25基本抑制了在基质胶上的HMEC-1细胞管腔的形成，而在低浓度时亦有微弱的抑制作用，如图4所示。
3、WSS25对内皮细胞的细胞毒性
含有2mM谷氨酰胺、10ng/mL EGF(上海PrimeGene生物科技公司产品)、15％FBS(杭州四季青产品)、100U/mL青霉素和100μg/ml链霉素的MCDB131(Invitrogen产品)培养基培养的生长状态良好的人微血管内皮细胞HMEC-1细胞90μL种入96孔板，每孔加入5000个细胞，于37度5％CO2的培养箱中培养24h后分别加入10μL WSS25，使终浓度分别为10、50、100、500和1000μg/mL，每个浓度设三个复孔，继续于37度5％CO2的培养箱内培养，24h，48h，72h后加入20μL 5mg/mL MTT(Sigma产品)，37度反应4h后加入100μL裂解液(10％SDS-5％异丁醇-0.1M HCl)37度裂解12～16h，570度下测定吸光值(A570)，计算抑制率，抑制率＝[(对照A570-加药组A570)/对照A570]×100％。结果表明WSS25在剂量1mg/mL时仅有微弱的细胞毒作用，而在剂量100μg/mL时对细胞几乎没有影响，如图5所示。
4、WSS25对裸鼠移植瘤生长的抑制作用
4.1受试药物的准备：
本发明中制备的受试药物WSS25为一硫酸化的葡聚糖，易溶于水，实验过程中以生理盐水为溶媒配制成相应浓度溶液，溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后给药。
4.2WSS25对裸小鼠中移植瘤生长的抑制作用实验
4.2.1WSS25对肝癌细胞Bel7402在裸小鼠中移植瘤生长的抑制作用实验
5-6周龄购自上海斯莱克实验动物有限责任公司的雄性BALB/cA裸小鼠右前肢皮下注射400μL含4×106个肝癌细胞Bel7402(来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)的细胞悬液，游标卡尺测量，待肿瘤体积长至100mm3左右后随机分成阴性对照组和100mg/kgWSS25给药组，每组裸鼠5只，开始给药。给药组中每只小鼠给予10mg/mL生理盐水配制的WSS25 0.1mL/10g，给药前新鲜配置，对照组中每只小鼠给予相应体积生理盐水。从尾静脉给药(给药前用生理盐水新鲜配置)，每两天一次，持续给药10次，每次给药前称鼠重。给药后，每3天以游标卡尺测量一次瘤体积，瘤体积V＝0.52×a×b2，其中a为移植瘤最长距离，b为移植瘤最短距离。第21天处死，以游标卡尺测得对照组平均瘤体积为822.97mm3，给药组平均瘤体积为272.195mm3，计算抑制率＝[(对照组瘤体积-给药组瘤体积)/对照组瘤体积]×100％，抑制率为66.9％，如图6所示。
4.2.2WSS25对肝癌细胞SMMC7721在裸小鼠中移植瘤生长的抑制作用
Balb/c品系裸小鼠，雄性，12只，体重23±1g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。将1×107个人肝癌SMMC-7721肿瘤细胞(来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)注射入裸小鼠的腋下，传3代后取瘤块，切成1.5mm3大小瘤块，种植于试验裸小鼠的腋下，游标卡尺测量，待肿瘤生长至100mm3左右，将动物随机分组开始给药。12只接种SMMC-7721肿瘤细胞的裸小鼠随机分成2组，1)阴性对照组6只，2)WSS25 100mg/kg组6只。阴性对照组隔天尾静脉注射生理盐水0.1mL/10g，WSS25 100mg/kg组(给药前新鲜配置于生理盐水中)隔天尾静脉注射10mg/mL的WSS25 0.1mL/10g。每3天称重并以游标卡尺测定肿瘤体积，给药10次后停药，阴性对照组和WSS25100mg/kg组裸小鼠体重在实验治疗前后均无显著变化，各组均无一动物死亡，于第23天处死小鼠，称体重，以游标卡尺测定瘤块体积，计算相对肿瘤体积(RTV)、相对肿瘤增值率(T/C)。肿瘤体积V＝a×b2/2，其中a为移植瘤最长距离，b为移植瘤最短距离。相对肿瘤体积(RTV)的计算遵循：RTV＝Vt/V0，Vt为给定时间的肿瘤体积，V0为分笼给药时测量所得肿瘤体积。以相对肿瘤增值率T/C(％)作为抗肿瘤活性评价指标，T/C(％)＝给药组平均相对肿瘤体积/对照组平均相对肿瘤体积×100％。若T/C％≤60％，统计学检测有显著性差异，视为具有明显的体内抗肿瘤作用。与相应天数的阴性对照组比较，WSS25 100mg/kg组裸小鼠移植瘤体积从给药后第3天开始减小。阴性对照组相对瘤体积(RTV)为3.0，WSS25 100mg/kg组的RTV值为1.68，相对肿瘤增值率(T/C)为56％，如图7所示。
通过以上实验可以看出，本发明中制备的天麻多糖硫酸化衍生物WSS25具有明显的抗肿瘤作用，而且对内皮细胞几乎没有毒性，因此有望被开发成抗肿瘤的药物。

Claims (4)

1、一种从天麻中提取的天麻多糖的硫酸化衍生物，其中该天麻多糖的结构式如下：
Figure A2008102004070002C1
其中x和y为整数且x+y＝16，
n为整数，其峰尖分子量为2.8×105，在其0.5mg/mL水溶液中的比旋度为+95°；
该天麻多糖的硫酸化衍生物是天麻多糖主要在6位羟基上的硫酸化衍生物，其峰尖分子量为6.5×104，在其0.5mg/mL水溶液中的比旋度为+150.0°。
2、一种制备权利要求1所述的天麻多糖的硫酸化衍生物的方法，该方法步骤如下：
1)水提粗多糖的制备：干燥的天麻饮片，经乙醇脱脂、干燥后，用热水反复提取2～5次，合并提取液；所得提取液浓缩后用三氯乙酸脱蛋白，离心分离，所得上清液经中和、透析、浓缩，得到一浓缩液；加入2-5倍于浓缩液体积的乙醇，离心分离得沉淀，该沉淀经真空干燥，得水提粗多糖；
2)天麻多糖的制备：向上述步骤1)得到的水提粗多糖加入适量水溶解并离心，上清液用二乙基氨乙基纤维素为载体进行柱层析分离，分别以水、0.1～0.4mol/L NaCl溶液剃度洗脱，其中0.1mol/L NaCl洗脱液经浓缩、透析以及冷冻干燥得到白色絮状固体天麻多糖；
3)天麻多糖硫酸化衍生物的制备：经分子筛处理的吡啶冰浴冷却后，将氯磺酸逐滴加入到吡啶中制成酯化试剂；经分子筛处理的甲酰胺中溶解天麻多糖，该溶液冰浴冷却下，然后往该溶液中逐滴加入上述制备的酯化试剂；反应完毕，反应液调pH值至7.8，然后浓缩，所得浓缩液对饱和的NaHCO3溶液透析后，换成对水透析；透析袋内液冷冻干燥得天麻多糖的硫酸化衍生物。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征是，在所述步骤1)中，取天麻干燥饮片，用95wt％乙醇脱脂1周，脱脂后室温自然干燥；干燥后，用100℃水反复浸渍天麻饮片数次，至提取液用硫酸-苯酚检测无明显反应，将每次的提取液合并后加热浓缩；所得浓缩液冷却后以15％(W/V)三氯乙酸溶液脱蛋白，离心分离，所得上清液用1mol/LNaOH中和至pH7.0，然后对流动水透析72h，内液浓缩至小体积，在搅拌下加入三倍体积的95wt％乙醇，静置过夜，倾去上清液，离心分离，所得沉淀依次用2倍体积的无水乙醇、丙酮洗涤以脱去水分，离心分离，所得沉淀置40℃下真空干燥，得水提粗多糖；
在所述步骤2)中，取水提粗多糖，用适量水溶解，离心除去不溶物，上清液通过二乙基氨乙基纤维素柱进行分离；逐步以水、0.1mol/LNaCl、0.2mol/L NaCl和0.4mol/L NaCl洗脱，用硫酸-苯酚法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收取合并洗脱液，其中0.1mol/L NaCl的洗脱液经浓缩，对蒸馏水透析，所得透析袋内液冷冻干燥得天麻多糖；
在所述步骤3)中，经4
Figure A2008102004070004C1
分子筛处理的吡啶冰浴冷却后，以氯磺酸/吡啶V/V＝2∶1的氯磺酸逐滴加入到吡啶中制成酯化试剂；每8mL 4分子筛处理的甲酰胺中溶解158.9mg的天麻多糖，该溶液冰浴至0℃，然后往溶液中逐滴加入2mL新鲜制备的酯化试剂；加毕，25℃水浴反应4h；反应完毕，反应液用5mol/L NaOH调pH值至7.8，然后＜30℃减压浓缩至小体积；浓缩液对2L饱和的NaHCO3溶液透析24h后，换成对2L去离子水透析，每次24h，共三次；透析袋内液冷冻干燥得天麻多糖的硫酸化衍生物。
4、如权利要求1所述的天麻多糖的硫酸化衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。
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