CN109134694B - 一种金钗石斛多糖的硫酸化衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种金钗石斛多糖的硫酸化衍生物及其制备方法和用途，所述金钗石斛多糖如以下结构式所示。体内外的实验研究表明，所述金钗石斛多糖的硫酸化衍生物具有抗血管生成的药物活性。

Description

一种金钗石斛多糖的硫酸化衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种金钗石斛多糖的硫酸化衍生物及其制备方法和用途。

背景技术

肿瘤是引起人类死亡的主要疾病之一，对其至今仍缺乏专一性强、疗效好、毒副作用小的治疗药物。通过抑制新生血管生成来抗肿瘤是治疗肿瘤的新思路。因此寻找到高活性且低副作用的抗血管生成的多糖类产品迫在眉捷。

发明内容

本发明的一个目的是寻找一种具有抗血管生成作用且毒副作用低的多糖类药物。

本发明一方面提供一种金钗石斛多糖的硫酸化衍生物，其中，所述金钗石斛多糖具有以下结构：

所述金钗石斛多糖的重均分子量(Mw)范围为5×10³-5×10⁴Da，数均分子量(Mn)范围为1×10²-1×10⁴Da，分子量分布(PDI＝Mw/Mn)为5-50；

所述硫酸化衍生物的硫酸化位点为金钗石斛多糖的主链上1,4-α-Glcp的2位和6位。

所述硫酸化衍生物的硫酸化度可以为1.31-1.51。

本发明还提供一种如上所述的金钗石斛多糖的硫酸化衍生物的制备方法，所述方法包括：使所述金钗石斛多糖与三氧化硫-吡啶复合物发生酯化反应。

在一个实施方式中，在上述金钗石斛多糖的硫酸化衍生物的制备方法中，所述反应在约50-70℃进行2小时以上，优选3-5小时。

在一个实施方式中，在上述金钗石斛多糖的硫酸化衍生物的制备方法中，所述金钗石斛多糖与所述三氧化硫-吡啶复合物的重量比为1：2-1：4。

在一个实施方式中，在上述金钗石斛多糖的硫酸化衍生物的制备方法中，所述反应在溶剂中进行，所述溶剂可以为二甲基甲酰胺(DMF)等。

另一方面，本发明提供具有以下结构的金钗石斛多糖：

在上式中，所述金钗石斛多糖的重均分子量范围为5×10³-5×10⁴Da，数均分子量(Mn)范围为1×10²-1×10⁴Da，分子量分布(PDI＝Mw/Mn)为5-50。

另一方面，本发明提供上述金钗石斛多糖的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)制备粗多糖：金钗石斛干燥茎经脱脂后，用沸水提取，提取液浓缩，乙醇沉淀，洗涤后得到金钗石斛的水提粗多糖；以及

2)纯化步骤：将所述水提粗多糖用阴离子交换柱进行纯化，得到所述金钗石斛多糖。

在步骤1)中，优选用约95％乙醇脱脂5天以上，优选5-9天，例如1周。沸水提取时优选金钗石斛干燥茎与水的重量比为1:4～1:12，更优选为1:6～1:10；提取时间可以为2小时以上，例如2-8小时；提取可以进行1次以上，例如2-5次。优选在提取液浓缩后进行透析，透析内液浓缩，离心去沉淀，上清液加入4倍体积约95％乙醇沉降，沉淀物用无水乙醇和丙酮交替洗涤，烘干得金钗石斛水提粗多糖。

在步骤2)中，优选以蒸馏水、0.1mol/l NaCl和0.2mol/l NaCl进行梯度洗脱，收集0.1mol/l NaCl洗脱液，然后经浓缩、透析和冷冻干燥金钗石斛多糖。

本发明还提供一种药用组合物，其包含治疗有效量的上述金钗石斛多糖的硫酸化衍生物和任选的药学上可接受的载体。

本发明还提供一种上述金钗石斛多糖的硫酸化衍生物在制备抗血管生成药物中的用途。

最后，本发明提供一种上述金钗石斛多糖的硫酸化衍生物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。

有益效果

根据本发明的金钗石斛多糖的硫酸化衍生物的体内外药理研究结果表明，其具有显著的抗血管生成作用，有望被开发成为抗肿瘤药物。

附图说明

图1为制备实施例1中制备的金钗石斛多糖的¹³C NMR谱图。

图2为制备实施例2中制备的金钗石斛多糖的硫酸化衍生物的¹³C NMR谱图。

图3A和3B示出金钗石斛多糖及其硫酸化衍生物对人微血管内皮细胞(HMEC-1)管腔形成的影响。

图4示出金钗石斛多糖的硫酸化衍生物对HMEC-1划痕愈合的抑制作用。

图5示出金钗石斛多糖的硫酸化衍生物对体内血管生成的抑制作用。

图6示出金钗石斛多糖的硫酸化衍生物对HMEC-1的细胞毒性。

具体实施方式

下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不意图限定本发明的范围，而是向本领域的技术人员进一步阐释本发明。

制备实施例1金钗石斛多糖的制备

取金钗石斛干燥茎，用95％乙醇脱脂1周，脱脂后室温自然干燥。干燥后的金钗石斛干燥茎5kg用沸水提取，每次加水40L，每次4h，硫酸-苯酚法检测提取液的糖含量，直至糖反应不明显。将每次的提取液合并，浓缩至小体积，用流动水透析2天。透析内液浓缩至小体积，离心去沉淀，上清液在搅拌下加入4倍体积95％乙醇沉降，4℃静置过夜。运用虹吸原理将沉降后的上清液吸出，余下少量溶液和沉淀物混合液离心，将离心所得沉淀物用无水乙醇和丙酮交替洗涤3次，于45℃烘箱干燥6h，得金钗石斛水提粗多糖47.96g。

取10g水提粗多糖，适量水溶解，离心除去不溶物，上清液通过阴离子交换柱(DEAESepharose Fast Flow，供应商：GE Healthcare)进行分离。以蒸馏水、0.1mol/l NaCl和0.2mol/l NaCl进行梯度洗脱，硫酸－苯酚法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集合并洗脱液，其中0.1mol/l NaCl洗脱液经浓缩、透析和冷冻干燥得938mg的金钗石斛多糖。

制备实施例2金钗石斛多糖的硫酸化衍生物(以下简称为硫酸化多糖)的制备

称取100mg金钗石斛多糖置于具塞圆底烧瓶(25mL)中于真空干燥器中干燥过夜。将干燥后的多糖样品悬浮于5mL无水二甲基甲酰胺(DMF)中，置于60℃的油浴中，并在搅拌的条件下加入5mL 200mg的三氧化硫-吡啶复合物(SO₃-Py)(货号：26412-87-3，供应商：上海沃凯化学试剂有限公司)溶解在二甲基甲酰胺中的溶液，将具塞圆底烧瓶封口后于60℃的油浴中反应4h后，用稀氢氧化钠调节pH至中性，用去离子水透析72h，冷冻干燥后得到金钗石斛多糖的硫酸化衍生物。

产物分析和结构鉴定

采用常规方法，对以上制备实施例1和2中制备的金钗石斛多糖及其硫酸化衍生物进行分析以及结构鉴定，结果如下。

物化性质测定：HPGPC分析表明金钗石斛多糖与其硫酸化衍生物的分子量分别约为12.3×10³和56.2×10³。比旋度(c1.0，水)分别为+115.3°和+142.8°。

化学结构鉴定：¹³C NMR、IR图谱显示金钗石斛多糖是以1,4-α-Glcp为主链的葡聚糖，在其主链葡萄糖的C-6位有分支。支链呈现以下三种不同的连接方式。第一种是在1,4-α-Glcp的C-6上连接1,6-β-Glcp，而1,6-β-Glcp的C-6与1,4-β-Manp相连，最后1,4-β-Manp的C-4位与末端-α-Glcp相连；第二种与第一种的连接方式相似，唯一的不同在于末端不是α-Glcp，而是α-Galp；第三种连接方式是在1,4-α-Glcp的C-6上连接1,3,6-β-Glcp，而在1,3,6-β-Glcp的C-3位连接1,4-α-Xylp，1,4-α-Xylp的C-4与α-Araf相连；在1,3,6-β-Glcp的C-6位同时与α-Glcp相连。因此，金钗石斛多糖包含1,4-Glcp，1,6-Glcp，末端-Glcp，末端-Galp，1,4,6-Glcp，1,4-Manp，1,4-Xylp，1,3,6-Glcp和末端-α-Araf以上述9种连接方式的单糖，它们的摩尔比为34.2:2.0:2.6:1.2:3.2:2.2:1.6:1.4:1.0，由以上信息可推知，金钗石斛多糖具有以下结构：

另外，金钗石斛多糖的硫酸化衍生物的¹³C NMR图谱显示其硫酸化位点为金钗石斛多糖主链1,4-α-Glcp的2和6位。

采用氯化钡-明胶法测定硫酸化度

试剂配制：

(1)1mol/L盐酸溶液：量取10mL浓盐酸(10M)于100mL容量瓶加入去离子水定容至刻度。

(2)氯化钡-明胶试剂：称取1.25g明胶于烧杯加入100mL去离子水，隔水加热并不断搅拌至溶解，放置室温，将倒入250mL容量瓶，用少量去离子水润洗烧杯中残余溶液并定容至刻度。取250mL此溶液，加入2.5g氯化钡，置于磁力搅拌器上搅拌至溶解，然后放置于4℃下过夜。

(3)3％三氟乙酸溶液(w/v)：称取30.0g三氟乙酸溶于500mL，将此溶液置于1000mL容量瓶中定容至刻度。

(4)标准硫酸基溶液：精密称取86.7mg无水硫酸钠溶于50mL 1mol/L盐酸溶液中搅拌至溶解，并将已经溶解的此溶液置于100mL容量瓶中加1mol/L盐酸溶液定容至刻度。

标准曲线绘制：

精确量取0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2mL置于具塞试管中，再加入1mol/L盐酸溶液至总溶液体积为0.2mL。每支试管中均加入3.8mL 3％三氟乙酸溶液和1mL氯化钡-明胶溶液，振荡均匀后室温静置20min。以空白管(加入标准溶液0mL)作参比，在吸光度为360nm条件下测定吸光度值。

样品的测定：

精密称取4.5mg样品，置于具塞试管中，加入4.5mL 1mol/L盐酸溶液，振荡使样品溶解，封管后于100℃烘箱中水解2.5h，反应结束后冷却至室温，取0.2mL进行测定，余下操作标准曲线加入3.8mL 3％三氟乙酸溶液和1mL氯化钡-明胶溶液，振荡均匀后室温静置20min。以空白管(加入标准溶液0mL)作参比，在吸光度为360nm条件下测定吸光度值。

硫酸基取代度计算如下公式所示：

DS＝M×W％/(96-80×W％)

其中W％为硫酸衍生化多糖中硫酸基的含量，M为糖残基的分子量，而金钗石斛多糖为半乳甘露葡聚糖，所以M为162。

经过测定，硫酸化多糖的硫酸化度为约1.41。

实验实施例1金钗石斛多糖和硫酸化多糖体外抑制人微血管内皮细胞管腔的形成试验

采用细胞模型-人微血管内皮细胞(HMEC-1)管腔形成实验来评价硫酸化多糖的体外抗血管生成活性。

以0μM作为对照组，观察HMEC-1细胞分别经0.1μM，0.2μM，0.4μM的制备实施例1的金钗石斛多糖(图3A)以及制备实施例2的硫酸化多糖(图3B)培养后细胞管腔的变化，具体实验操作如下：

提前将96孔板放入-20℃冰箱，然后把基质胶放在4℃下化冻，待基质胶完全化冻后，以每孔50μL的量加入预冷的96孔板中，放入37℃培养箱中30min使基质胶完全凝固。然后分别向其中加入含有0、0.1、0.2和0.4μM的制备实施例1制备的金钗石斛多糖与HMEC-1细胞(3.5×10⁴)，或0、0.1、0.2和0.4μM的制备实施例2的硫酸化多糖与HMEC-1细胞(3.5×10⁴)的混合培养基，每孔加入的混合培养基量为100μL，最后放入细胞培养箱中培养14h后，结果在倒置显微镜(荧光倒置显微镜Olympus BX51日本)下拍照记录，显微镜放大倍数为40倍。

实验结果如图3A所示，未经硫酸化的金钗石斛多糖在不同的药物浓度下对管腔形成没有明显的抑制作用。

而对于硫酸化多糖(图3B)，以0μM作为对照组，HMEC-1细胞在基质胶上形成较好的管腔状结构，开始加入硫酸化多糖(0.1μM)时，形成的管腔数量并没有太大变化，但可以看出管腔结构的边缘开始变细、变模糊，并且管腔大小明显增大。当硫酸化多糖浓度增加到0.2μM时，观察到管腔结构已经被完全破坏，细胞呈簇拥状形成一个个小的细胞团，在0.4μM浓度下的表型亦是如此。

实验结果可以看出硫酸化多糖在体外对HMEC-1细胞具有良好的管腔形成抑制作用，并且随着药物浓度的提高，其抑制效果越明显，药物浓度和管腔形成的抑制效果之间存在很好的量效关系。

实验实施例2硫酸化多糖对HMEC-1细胞迁移的抑制作用

血管生成的抑制通常也伴随着内皮细胞的迁移能力的抑制，因此我们通过划痕愈合实验来探究硫酸化多糖是否对HMEC-1细胞的迁移具有抑制作用。

以0μM作为对照，观察HMEC-1细胞经0.4μM的制备实施例2的硫酸化多糖培养12小时和24小时后的划痕愈合结果，具体实验操作如下：

以每孔5×10⁵个细胞将HMEC-1细胞接种于12孔板中，待细胞在每个孔的底部贴壁长满后，用黄色枪头轻轻的划一道痕，再用磷酸缓冲溶液(PBS)小心的清洗2-3次，加入含有0.4μM制备实施例2的硫酸化多糖的培养基，对照组只加入普通培养基，放入培养箱继续培养，然后分别在12h和24h后用倒置显微镜(荧光倒置显微镜Olympus BX51日本)进行拍照记录，放大倍数为100倍，实验结果通过软件Image-Pro Plus进行分析，分别计算出迁移率与迁移抑制率。

实验结果如图4所示，在细胞被划过相同宽度的痕迹后，继续培养12小时后，可看到对照组(0μM)划痕的愈合率为36.78％，给药组(0.4μM)培养12h的划痕愈合率是20.5％，此时抑制的效果并不是特别明显。但是在培养了24小时后，两者差别显著，对照组的划痕已经几乎完全愈合，而添加硫酸化多糖的给药组的迁移率只有48.77％。由此可以得到结论，硫酸化多糖能明显抑制HMEC-1细胞的划痕愈合。

实验实施例3硫酸化多糖在体内抑制新生血管生成

为了验证硫酸化多糖是否在体内对血管形成也有抑制作用，选用鸡胚绒毛尿囊膜(chicken choriaollantoic membrance，CAM)实验模型(一种常用的研究血管生成与抗血管生成效果的体内实验模型)探讨硫酸化多糖在体内的抗血管生成作用。

以0μg/egg的制备实施例2的硫酸化多糖作为对照组，分别观察50μg/蛋(μg/egg)，100μg/egg，150μg/egg的硫酸化多糖的体内抗血管生成作用，具体实验操作如下：

采购6日龄受精白鸡蛋50个，首先，用温水配制浓度0.1％新洁尔灭溶液，然后将无菌纱布放入浸湿，用其擦拭鸡蛋表面，同时将擦干净的鸡蛋放在照卵灯上观察，找到气室和胚胎的位置并标记好，如果发现有死胚或者未受精鸡胚，将其剔除，最后把鸡蛋气室向上放入蛋托，并在37℃培养箱中培养过夜。

第二天正式开始实验，用酒精棉擦拭鸡蛋气室位置的蛋壳，进行消毒，用10mL注射器的针头从气室顶端的蛋壳刺入，形成一个小孔来给鸡蛋内部减压，注意不要刺入太深，以免将内部的膜戳破，如果不慎戳破，这个鸡蛋需弃去，换新的鸡蛋进行实验。鸡蛋气室朝上拿在手中，在标记的胚头下方的位置约1cm处勾画出直径1.5cm的圆形区域，用消毒后的砂轮沿勾画的印记在蛋壳上磨擦出凹痕，然后用眼科镊轻轻从凹痕处将勾画区域内的蛋壳揭开，并撕去内壳膜，这时可以看到尿囊膜凹陷下去，形成和鸡胚自身气室不一样的假气室。假气室建立完成后，将无菌的混合纤维素酯微孔滤膜片裁剪成边长0.5cm的正方形，放到尿囊膜的表面，注意挑选血管相对较少的位置放置。鸡胚随机分成4组，每组12只，4组分别在微孔滤膜片上滴加5μL含不同浓度的制备实施例2的硫酸化多糖的生理盐水，浓度分别为：0、50、100和150μg/egg，给药后用透明胶带封闭假气室，放入37℃培养箱继续孵育。

准备固定液，固定液按照1:1的比例混合甲醇和丙酮，在孵育48h后，撕开封闭的透明胶带，加入固定液500μL，等待15min，使尿囊膜上的血管凝固，再剥去假气室周围的鸡蛋壳，方便下一步裁剪尿囊膜，裁剪尿囊膜时要轻，不要破坏血管，并以微孔滤膜片为中心裁剪尿囊膜，将裁剪下来的尿囊膜平铺在载玻片上，在倒置显微镜(荧光倒置显微镜OlympusBX51日本)下拍照记录，放大倍数为40倍。

从图5可以看到，空白组，也就是当硫酸化多糖浓度为0μg/egg时，尿囊膜上的血管生长情况良好，血管如叶脉样呈放射状分布生长，主血管生长较粗壮且分支较多，当开始加入硫酸化多糖(50μg/egg)时，发现血管密度并没有太大变化，分支也没明显减少，但是可以看到血管管径明显变细，并且血管结构变得模糊且透明。随着硫酸化多糖浓度的增大至100μg/egg时，显示血管生成受到明显抑制，血管数量大量减少，当达到最高浓度150μg/egg时，不仅血管没有明显的分支出现，主血管也很大程度地变细。这些现象表明硫酸化多糖具有抑制鸡胚绒毛尿囊膜上血管生成的活性，并且随着浓度的增加，抑制效果也随之增强，具有一定的浓度依赖关系，所以硫酸化多糖在体内也具有抑制血管生成的活性。

实验实施例4硫酸化多糖对HMEC-1细胞生长的作用

上述管腔形成实验和划痕愈合实验证明了硫酸化多糖能够抑制人微血管内皮细胞形成管腔结构并可以抑制细胞迁移，但是并不能明确此效果是否是因为通过抑制HMEC-1细胞的生长而产生。对此，采用MTT实验来检测经过硫酸化多糖处理后HMEC-1细胞生长状态。

MTT实验的具体操作如下：

a.样品

制备实施例2中制备的金钗石斛多糖硫酸化衍生物。

b.试剂

MCDB131培养基、胰酶和青/链霉素均采购于美国Gibco公司；胎牛血清(FetalBovine Serum,FBS)采购于浙江四季青公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)和二甲基亚枫(Dimethyl Sulphoxide,DMSO)采购于美国Sigma公司；EGF蛋白采购于上海普欣生物公司；Growth Factor Reduced Matrigel采购于美国BD公司；7日龄受精鸡蛋采购于上海申浦家禽育种有限公司；其他试剂均采购于上海国药集团。

c.相关实验溶液的配制

磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)(500mL)：分别称取氯化钾0.1g，氯化钠4.0g，磷酸二氢钾0.12g，十二水合磷酸氢二钠1.79g，然后加入去离子水搅拌使其充分溶解，在pH计下调节溶液pH值至7.4，调节试剂为浓盐酸，接着定容到500mL，最后经过高压灭菌后放在4℃冰箱保存。

EGF蛋白溶液：按照采购附带的说明书加入适量的灭菌水，配置成目标浓度为10ng/mL的溶液放入-80℃冰箱保存，操作过程需要在灭菌台中完成。

谷氨酰胺溶液：用MCDB131培养基配制成终浓度为2mM的溶液，经过0.22μm微孔滤膜(Millipore，USA)过滤，放在-20℃冰箱保存。

d.细胞系与细胞培养

人微血管内皮细胞HMEC-1采购于中国科学院上海生化细胞所细胞库，用含15％FBS，10ng/mL EGF，2mM L-谷氨酰胺，100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素的MCDB131培养基培养。细胞培养于5％CO₂的37℃培养箱中，实验时取用对数生长期的细胞。

将HMEC-1细胞接种在96孔板中，每孔3000-5000个细胞，在培养箱中培养过夜，使细胞充分贴壁后，加入含不同浓度(0、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6μM)制备实施例2的硫酸化多糖的培养基，放入培养箱继续孵育72小时，然后每孔加入10μL的MTT(5mg/mL)，并置于培养箱继续培养4小时。用注射器吸去每孔中的混合液体，然后加入150μL二甲亚砜(DMSO)，放到摇床上快速摇30分钟，使沉淀的紫色结晶物充分溶解。最后放入酶标仪中，检测波长调整到490nm，测得各孔的吸光值(optical density，OD)，并根据以下公式计算细胞活力：

细胞活力＝OD(给药组)/OD(对照组)×100％。

MTT的实验结果如图6所示，HMEC-1在不同浓度(0、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6μM)的制备实施例2的硫酸化多糖处理72小时后，与对照组相比较，给药组细胞生存状态并没有受到太大的影响，各组之间没有显现出显著差异。因此，可以推断硫酸化多糖抑制血管生成的机制并不是影响HMEC-1细胞的增殖。

以上实验结果表明，金钗石斛多糖的硫酸化衍生物具有显著的体内外抗血管生成作用，并且其并不是通过影响细胞的增殖来抑制血管生成。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和精神范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (11)

1.一种金钗石斛多糖的硫酸化衍生物，其中，所述金钗石斛多糖具有以下结构：

R₁＝→1)-β-Glcp-(6→1)-β-Manp-(4→1)-α-Galp

R₂＝→1)-β-Glcp-(6→1)-β-Manp-(4→1)-α-Glcp

R₃＝α-Glcp-(1→

所述金钗石斛多糖的重均分子量(Mw)范围为5×10³-5×10⁴Da，数均分子量(Mn)范围为1×10²-1×10⁴Da，分子量分布为5-50；

所述硫酸化衍生物的硫酸化位点为金钗石斛多糖的主链上1，4-α-Glcp的2位和6位。

2.根据权利要求1所述的金钗石斛多糖的硫酸化衍生物，其中，硫酸化度为1.31-1.51。

3.制备权利要求1所述的金钗石斛多糖的硫酸化衍生物的方法，所述方法包括：使所述金钗石斛多糖与三氧化硫-吡啶复合物发生酯化反应。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述反应在50-70℃下进行2小时以上。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述反应在50-70℃下进行3-5小时。

6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述金钗石斛多糖与所述三氧化硫-吡啶复合物的重量比为1：2-1：4。

7.根据权利要求3所述的方法，其中，所述反应在溶剂中进行。

8.根据权利要求3所述的方法，其中，所述反应在二甲基甲酰胺中进行。

9.一种药用组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1所述的金钗石斛多糖的硫酸化衍生物和任选的药学上可接受的载体。

10.根据权利要求1所述的金钗石斛多糖的硫酸化衍生物在制备抗血管生成药物中的用途。

11.根据权利要求1所述的金钗石斛多糖的硫酸化衍生物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。

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