CN103705534A - 一种天然活性物质构建的高分子复合药物的制备及其在抑制血管生成中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种天然活性物质构建的高分子复合药物的制备方法及其在抑制血管生成中的应用。该高分子复合药物是在肝素或其衍生物的羧基上，通过化学偶联的方法，引入天然活性小分子物质，形成高分子复合药物。形成的高分子复合药物，改善了天然活性小分子物质的溶解性，降低毒副作用，同时也改善低肝素或其衍生物大量使用后出血问题，而且增强了两者单独使用时抑制血管生成的作用。该高分子复合药物制备过程简单，操作容易，减少成本，提高效率，容易实现工业化。
Description
技术领域
本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种天然活性物质构建的高分子复合药物的制备及其在抑制血管生成中的应用。
技术背景
癌症是全球范围内威胁人类健康和生命的重大疾病之一，而且随着人口增长和人们生活方式的改变，癌症发生率呈逐年增长的趋势，癌症将成为新世纪人类急需攻克的问题。
肿瘤的传统治疗方式是在肿瘤处于初期时采用手术切除治疗，而如果肿瘤细胞已经扩散，则需采用化学药物进行治疗以及同时采用放射治疗来杀死肿瘤细胞和控制肿瘤细胞转移。这些治疗由于选择性不强，对机体的正常组织也有杀伤，降低患者的免疫力，在杀伤肿瘤的同时也带来了很大的副作用。随着药学和生命科学研究的飞速进展，恶性肿瘤细胞内的信号转导、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正逐渐被阐明。上世纪六十年代初，Folkman就提出了肿瘤血管生成理论，如果没有新血管生成，肿瘤的生长不会超过1mm3。故肿瘤的生长和转移主要依赖于肿瘤周围新血管的形成，抑制肿瘤血管生成可起到治疗肿瘤的作用。鉴于新生血管在肿瘤发生和生长中的重要作用，肿瘤血管已经成为抗肿瘤治疗的一个重要靶点。2004年，FDA委员Mark McClellan宣布，除了手术治疗、放射治疗和化学治疗之外，抗新生血管生成可以看成是肿瘤治疗的第四种方式。
天然活性物质来源广泛，毒副反应少，具有广泛的生物活性。熊果酸是一种五环三萜类化合物，在自然界植物中广泛分布。研究人员以B16F10黑色素瘤细胞诱导的C57BL／6小鼠为模型，来研究熊果酸的抗新血管生成活性。发现熊果酸能显著降低血清中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、NO和炎症因子，而金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)和白介素-2的含量显著升高，进而抑制内皮细胞的迁移和入侵，达到抑制肿瘤血管生成的作用。姜黄素是从中药姜黄中提取的一种酚性色素，具有显著的抗肿瘤活性。姜黄素能有效的抑制内皮细胞的增殖，并且呈浓度依赖性。在小鼠模型中姜黄素能显著抑制由碱性成纤维细胞生长因子(base fibroblast growth factor，bFGF)介导的眼角膜血管新生。藤黄酸是从藤黄科植物藤黄的干燥分泌物提取的主要活性成分，属于黄酮类天然活性物质。研究发现，藤黄酸的浓度分别为10nmol／L和40nmol／L时，能明显抑制内皮细胞的迁移和侵袭。藤黄酸主要通过抑制VEGF受体通路来抑制肿瘤血管的生成。大黄酸是从虎杖、何首乌、大黄等天然植物中提取分离纯化出来的蒽醌类单体，研究发现，其可以通过抑制表皮生长因子受体的络氨酸激酶磷酸化，进而抑制ERK信号通路来抑制肿瘤血管的生成。
除此之外，萜类中的雷公藤甲素、蒽醌类中的和厚朴酚、酚类中的黄芩素以及黄酮类中的大黄酸和白芦藜醇等天然活性小分子物质也可以通过抑制肿瘤血管生成的作用起到抗肿瘤作用。但是这些物质基本上都是脂溶性的，制剂制备困难，生物利用度低，这在很大程度上限制其利用开发。
肝素或其衍生物是由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成酸性粘多糖硫酸酯。为水溶性良好的天然活性高分子物质，且结构上含有大量的羟基和羧基易于进行结构修饰。研究发现，肝素及其衍生物通过抑制肝素酶的活性，减少细胞外基质中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖降解，从而减少VEGF，bFGF等血管生长因子的释放，来抑制肿瘤血管生成。还可以通过干扰VEGF与其受体结合，抑制肿瘤血管的生成。同时，肝素及其衍生物还可通过影响免疫系统，激活自然杀伤细胞，来抑制肿瘤的生长和转移。但是肝素及其衍生物在大量使用时，容易引起出血，而限制其在临床中的应用。
发明内容
本发明的目的针对上述应用问题，提供一种天然活性物质构建的高分子复合药物，该高分子复合药物既改善了天然活性小分子物质的溶解性和稳定性，也减弱了肝素或其衍生物的抗凝活性，而且增强了两者单独使用时抑制血管生成的作用。使具有抗血管生成作用的肝素或其衍生物和天然活性小分子物质的应用具有更广阔的产业化前景。
本发明的另一个目的是提供上述天然活性物质构建的高分子复合药物的制备方法。
本发明的还有一个目的是提供上述天然活性物质构建的高分子复合药物在抑制血管生成中的应用。
为了达到上述发明目的，本发明提供一种天然活性物质构建的高分子复合药物，利用肝素或其衍生物主链上含有大量的羧基，易于进行结构修饰，通过化学偶联的方法，引入天然活性小分子物质，形成高分子复合药物。该高分子复合药物具有两亲性，在极性溶剂中可以自组装形成纳米级药物，其亲水性的外壳可以避免被网状内皮系统吞噬，在血液中长时间循环并保持稳定，通过增强穿透以及滞留效应(EPR效应)和细胞内吞作用，达到被动靶向作用。
所述的天然活性物质构建的高分子复合药物，其中天然活性小分子物质，选自萜类物质熊果酸、雷公藤甲素，或酚类物质姜黄素、和厚朴酚，或黄酮类物质藤黄酸、黄芩素，或蒽醌类物质大黄酸、白藜芦醇。
所述的天然活性物质构建的高分子复合药物，其中天然高分子物质肝素或其衍生物，选自肝素、低分子量肝素、N-O-去硫酸化肝素或N-去硫酸化肝素。
所述的天然活性物质构建的高分子复合药物的制备方法，根据天然活性小分子物质的结构不同，包括下列两个方法：
a.天然活性小分子物质的结构中含有羧基的
将天然活性小分子物质溶于适当有机溶剂，以二环己基碳二亚胺(DDC)、羟基琥珀酰亚胺(NHS)为活化剂，采用二胺类为连接臂，通过酰胺反应，得到游离一端氨基的活性中间体；将肝素或其衍生物溶于反应溶剂中，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)为活化剂，通过酰胺反应将天然活性小分子物质接枝到肝素或其衍生物的主链上。
b.天然活性小分子物质的结构中不含有羧基的
将肝素或其衍生物溶于反应溶剂中，以4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)为脱水剂，先将肝素或其衍生物主链上的羧基活化后，再将天然活性小分子物质溶于适当有机溶剂后加入，通过酯化反应，将天然活性小分子物质接枝到肝素或其衍生物的主链上。
所述的制备方法a和b，其中适当有机溶剂选自四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、或四氢呋喃与N，N-二甲基甲酰胺、或四氢呋喃与二甲基亚砜的混合物。
所述的制备方法a，其中二胺类连接臂选自对苯二胺、胱胺或碳原子数为2～12的亚烷基二胺。
所述的制备方法a和b，其中反应溶剂选甲酰胺、或甲酰胺与四氢呋喃、或甲酰胺与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂。
所述的天然活性物质构建的高分子复合药物，用药学上可接受溶剂溶解后，经超声或高压均质处理，制成溶液型制剂或冻干制备成冻干制剂，也可以将该溶液吸附在固体辅料表面制备成固体制剂。
所述的天然活性物质构建的高分子复合药物胶束纳米粒的制备方法如下：天然活性物质构建的高分子复合药物与水按重量比3～50∶1000的比例溶解，经超声或高压均质处理，制备成粒径为10～1000nm的复合药物胶束纳米粒。
所述的天然活性物质构建的高分子复合药物及胶束纳米粒的具体制备方法如下：
一、天然活性物质构建的高分子复合药物的制备
a.天然活性小分子物质的结构中含有羧基的，具体制备步骤如下：
(1)将天然活性小分子物质溶于适当有机溶剂，以二环己基碳二亚胺(DDC)、羟基琥珀酰亚胺(NHS)为活化剂，控制反应条件至反应完全，抽滤除去沉淀物二环己基脲(DCU)，滤液用适当溶剂沉淀，抽滤得沉淀物，真空干燥，得天然活性小分子物质的活性中间酯；
(2)将天然活性小分子物质的中间酯与二胺类连接臂按适当比例溶于N，N-二甲基甲酰胺中，将二胺类连接臂缓慢滴加到天然活性小分子物质的活性中间酯的溶液中，控制反应至完全，用适当溶剂沉淀，沉淀物分别进行酸洗，水洗，抽滤得沉淀物，真空干燥，得羧基氨化的天然活性小分子物质。
合成路线通式如下：
(R1-COOH为熊果酸、藤黄酸或大黄酸；H2N-R2-NH2为对苯二胺、胱胺、或碳原子数2～12的亚烷基二胺)
步骤(1)中所述的适当有机溶剂为四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、或者四氢呋喃与N，N-二甲基甲酰胺、或四氢呋喃与二甲基亚砜的混合物。
步骤(1)中所述的控制反应条件，为惰性气体保护下，冰浴反应0.2～2h，升至室温，反应6～72h。
步骤(1)中所述的滤液的适当沉淀溶剂为正己烷。
步骤(2)所述的二胺类连接臂选自对苯二胺、胱胺或碳原子数为2～12的亚烷基二胺。
步骤(2)中所述的天然活性小分子物质中间酯与二胺类的适当摩尔比例为5∶1～80∶1。
步骤(2)中所述的控制反应，为反应滴速控制在每滴间隔2～30秒；反应温度优选为0～40℃；二胺类滴加完之后，再反应3～12h。
步骤(2)中所述的适当沉淀溶剂为饱和氯化钠。
步骤(2)中所述的酸洗，水洗，分别为0.1～1mol／L稀HCl，超纯水或蒸馏水。
(3)将肝素或其衍生物溶于适当反应溶剂，在惰性气体保护下，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺为活化剂，加入氨化后的天然活性小分子物质，控制反应至完全，用适当溶剂沉淀，过滤得沉淀物，复溶，超声，透析，冷冻干燥，即得到天然活性物质构建的高分子复合药物。根据天然活性物质对光的耐受性，选择是否避光反应。
合成路线通式如下：
(R3-COOH为肝素、低分子量肝素、N-去硫酸化肝素或N-O-去硫酸化肝素)
步骤(3)中所述的适当反应溶剂为甲酰胺、或甲酰胺与四氢呋喃、或甲酰胺与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂；所述的控制反应为先加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺活化剂反应0.2～2h后，再加入氨化后的天然活性小分子物质，室温反应6～72h；所述的适当沉淀溶剂为冰丙酮、冰乙醚、冰乙醇或冰乙酸乙酯；所述的超声为探头超声10～60min；所述的透析时间为0.5～3d。
b.天然活性小分子物质的结构中不含羧基的，具体制备步骤如下：
(I)将肝素或其衍生物溶于适当反应溶剂，在惰性气体保护下，以4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)为脱水剂，将肝素或其衍生物主链上的羧基活化；
(II)天然活性小分子物质用适当有机溶剂溶解后，缓慢滴加到肝素或其衍生物溶液中，控制反应至完全，用适当溶剂沉淀，过滤得沉淀物，复溶，超声，透析，冷冻干燥，即得到天然活性物质构建的高分子复合药物。根据天然活性小分子物质对光的耐受性，选择是否避光反应。
(R3-COOH为肝素、低分子量肝素、N-去硫酸化肝素或N-O-去硫酸化肝素；R4-OH为雷公藤甲素、黄芩素、和厚朴酚、姜黄素或白芦藜醇)
步骤(I)中所述的适当反应溶剂为甲酰胺、或者甲酰胺与四氢呋喃、或者甲酰胺与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂；所述的肝素或其衍生物、催化剂、脱水剂三者的摩尔比为1∶0.2～0.5∶3～20。
步骤(II)中所述的溶解天然活性小分子物质的适当有机溶剂为四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、或四氢呋喃与N，N-二甲基甲酰胺、或四氢呋喃与二甲基亚砜的混合物；所述的控制反应为按上述摩尔比加入催化剂和活化剂，反应0.2～2h后，加入天然活性小分子物质，控制反应滴速为每滴间隔2～30秒，滴加完后再室温反应6～72h；所述的适当沉淀溶剂为冰丙酮、冰丙酮、冰乙醚、冰乙醇或冰乙酸乙酯；所述的超声为探头超声10～60min；所述的透析时间为0.5～3d。
二、天然活性物质构建的高分子复合药物胶束纳米粒的制备
按每1ml水中溶解3～50mg的天然活性物质构建的高分子复合药物的比例，将制得的天然活性物质构建的高分子复合药物溶于水或其他极性溶剂中，经超声或高压均质处理，制备成粒径为10～1000nm的复合药物胶束纳米粒。
本发明相对于现有技术具有如下效益：
(1)本发明根据天然活性小分子物质结构的特征，利用简单的酰胺反应和酯化反应，将天然活性小分子物质接枝到肝素或其衍生物的主链上，制备过程简单，操作容易，减少成本，提高效率，容易实现工业化。
(2)本发明将疏水性的天然活性小分子物质接枝到亲水性的肝素或其衍生物的主链上，形成两亲性高分子复合药物，不仅改善天然活性小分子物质的溶解性，增加其生物利用度，降低毒副作用，同时也改善低肝素或其衍生物大量使用后出血问题。
(3)本发明提供的天然活性物质构建的高分子复合药物，其中天然活性小分子物质与肝素或其衍生物两者都具有抑制血管生成的作用，故形成的高分子复合药物，可以减小给药剂量以及给药次数，提高患者的耐受性。
(4)本发明提供的天然活性物质构建的高分子复合药物可用于胃肠道途径或非胃肠道途径给药，具有高度安全性，粒径可控制在10～1000nm。
附图说明
图1：熊果酸-乙二胺-低分子量肝素复合药物对HUVEC小管形成的影响。
图2：姜黄素-N-去硫酸化肝素复合药物对HUVEC小管形成的影响。
图3：雷公藤甲素-肝素复合药物对HUVEC小管形成的影响。
图4：藤黄酸-胱胺-N-O-去硫酸化肝素复合药物对HUVEC小管形成的影响。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但下述实施例并不限制本专利的权利范围。
实施例1：熊果酸-乙二胺-低分子量肝素复合药物的合成
称取熊果酸(UA)适量置于茄形瓶中，加入20mL四氢呋喃，UA的摩尔浓度为0.05mmol／mL，冰浴，在惰性气体保护的条件下，依次加入二环己基碳二亚胺(DCC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)，UA、DCC、NHS的摩尔比依次为1∶1.2∶1.2。冰浴反应30min，移至室温反应24h。真空抽滤除去沉淀物二环己基脲(DCU)，得滤液。滤液用3倍量的正己烷沉淀12h，过滤，真空干燥，得琥珀酰亚胺基UA。称取琥珀酰亚胺基UA0.23g，用15mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，缓慢滴加到1mL乙二胺中，30min滴完。再反应6h，饱和食盐水沉淀，过滤，得白色沉淀物UA-NH2，依次进行酸洗，水洗，真空干燥，4℃保存。称取40mg低分子量肝素(LMWH)用5mL甲酰胺溶解，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，两者摩尔比为1∶4。惰性气体保护的条件下，将EDC加入LMWH溶液中，活化30min后，将UA-NH2的DMF溶液(与LMWH摩尔比为8∶1)加入到LMWH的溶液中。室温反应，TLC监控反应至完全后，加入过量体积的冰乙醇沉淀产物，抽滤，得产物。产物用超纯水复溶，冰浴，探头超声30min，在蒸馏水中透析1d(MWCO=3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得产物熊果酸-乙二胺-低分子量肝素复合药物。
实施例2：藤黄酸-胱胺-N-O-去硫酸化肝素复合药物的合成
称取藤黄酸(GA)适量置于茄形瓶中，加入30mL四氢呋喃，GA的摩尔浓度为0.02mmol／mL，避光、冰浴、惰性气体保护的条件下，依次加入二环己基碳二亚胺(DCC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)，GA、DCC、NHS的摩尔比依次为1∶1.5∶1.2。冰浴反应30min后，移至室温反应36h。真空抽滤除去沉淀物二环己基脲(DCU)，得滤液。滤液用3倍量的正己烷沉淀8h，过滤，真空干燥，得琥珀酰亚胺基GA。称取琥珀酰亚胺基GA0.20g，用10mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，缓慢滴加到2mL胱胺中，45min滴完。再反应8h，饱和食盐水沉淀，过滤，得黄色沉淀物GA-NH2，依次进行酸洗，水洗，真空干燥，4℃保存。称取80mg N-O-去硫酸化肝素10mL甲酰胺溶解，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，两者摩尔比1∶6。惰性气体保护的条件下，将EDC滴加入N-O-去硫酸化肝素溶液中，活化30min后，将GA-NH2的DMF溶液(与N-O-去硫酸化肝素摩尔比为12∶1)加入到N-O-去硫酸化肝素的溶液中。避光，室温反应，TLC监控反应至完全后，加入过量体积的冰丙酮沉淀产物，抽滤，得产物。产物用超纯水复溶，冰浴，探头超声20min，在蒸馏水中透析2d(MWCO=3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得产物藤黄酸-胱胺-肝素复合药物。
实施例3：大黄酸-对苯二胺-低分子量肝素复合药物的合成
称取大黄酸(Rh)适量置于茄形瓶中，加入40mL四氢呋喃，Rh的摩尔浓度为0.1mmol／mL，避光，冰浴，惰性气体保护的条件下，依次加入二环己基碳二亚胺(DCC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)，Rh、DCC、NHS的摩尔比依次为1∶1.2∶1.2。冰浴反应60min，移至室温反应24h。真空抽滤除去沉淀物二环己基脲(DCU)，得滤液。滤液用3倍量的正己烷沉淀12h，过滤，真空干燥，得琥珀酰亚胺基Rh。称取琥珀酰亚胺基Rh0.50g，用30mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，缓慢滴加到2.5mL对苯二胺中，80min滴完。再反应12h，饱和食盐水沉淀，过滤，得黄色沉淀物Rh-NH2，依次进行酸洗，水洗，真空干燥，4℃保存。称取100mg肝素用15mL甲酰胺溶解，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，两者的摩尔比为1∶4。惰性气体保护的条件下，将EDC滴加入肝素溶液中，活化30min后，将Rh-NH2的DMF溶液(与肝素摩尔比为15∶1)加入到肝素的溶液中。避光，室温反应，TLC监控反应至完全后，加入过量体积的冰乙醇沉淀产物，抽滤，得产物。产物用超纯水复溶，冰浴，探头超声30min，在蒸馏水中透析2d(MWCO=3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得产物大黄酸-对苯二胺-肝素复合药物。
实施例4：姜黄素-N-去硫酸化肝素复合药物的合成
称取N-去硫酸化肝素0.1mmol置于茄形瓶中，加入45mL甲酰胺，加热，磁力搅拌使其溶解，冷却至室温，分别加入催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.02mmol，脱水剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)1.2mmol，室温条件下活化60min后，避光，加入姜黄素1.2mmol，用50mL的N，N-二甲基甲酰胺溶解，置于恒压滴液漏斗中，控制反应滴速，2～4h滴加完毕，室温反应36h。TLC监控反应至完全后，停止反应，加入过量体积的冰乙酸乙酯沉淀产物，抽滤，得产物。产物用超纯水复溶，冰浴，探头超声15min，在蒸馏水中透析2d(MWCO=3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得产物姜黄素-N-去硫酸化肝素复合药物。
实施例5：黄芩素-N-O-去硫酸化肝素复合药物的合成
称取N-O-去硫酸化肝素0.05mmol置于茄形瓶中，加入25mL甲酰胺，加热，磁力搅拌使其溶解，冷却至室温，分别加入催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.01mmol，脱水剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)0.6mmol，室温条件下活化30min后，避光，加入黄芩素0.6mmol，用30mL的N，N-二甲基甲酰胺溶解，置于恒压滴液漏斗中，控制反应滴速，1～3h滴加完毕，室温反应24h。TLC监控反应至完全后，停止反应，加入过量体积的冰丙酮沉淀产物，抽滤，得产物。产物用超纯水复溶，冰浴，探头超声30min，在蒸馏水中透析2d(MWCO=3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得产物黄芩素-N-O-去硫酸化肝素复合药物。
实施例6：雷公藤甲素-肝素复合药物的合成
称取肝素0.02mmol置于茄形瓶中，加入25mL甲酰胺，加热，磁力搅拌使其溶解，冷却至室温，分别加入催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.01mmol，脱水剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)0.3mmol，室温条件下活化2h后，加入雷公藤甲素0.3mmol，用20mL的二甲基亚砜溶解，置于恒压滴液漏斗中，控制反应滴速，1～3h滴加完毕，室温反应48h。TLC监控反应至完全后，停止反应后，加入过量体积的冰乙醇沉淀产物，抽滤，得产物。产物用超纯水复溶，冰浴，探头超声45min，在蒸馏水中透析3d(MWCO=3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得产物雷公藤甲素-肝素复合药物。
实施例7：和厚朴酚-N-去硫酸化肝素复合药物的合成
称取N-去硫酸化肝素0.1mmol置于茄形瓶中，加入45mL甲酰胺，加热，磁力搅拌使其溶解，冷却至室温，分别加入催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.02mmol，脱水剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)1.2mmol，室温条件下活化60min后，加入和厚朴酚1.2mmol，用50mL的二甲基亚砜溶解，置于恒压滴液漏斗中，控制反应滴速，2～4h滴加完毕，室温反应36h。TLC监控反应至完全后，停止反应，加入过量体积的冰乙醚沉淀产物，抽滤，得产物。产物用超纯水复溶，冰浴，探头超声30min，在蒸馏水中透析2d(MWCO=3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得产物和厚朴酚N-去硫酸化肝素复合药物。
实施例8：白芦藜醇-低分子量肝素复合药物的合成
称取低分子量肝素0.02mmol置于茄形瓶中，加入25mL甲酰胺，加热，磁力搅拌使其溶解，冷却至室温，分别加入催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.01mmol，脱水剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)0.4mmol，室温条件下活化2h后，加入白芦藜醇0.4mmol，用20mL的N，N-二甲基甲酰胺溶解，置于恒压滴液漏斗中，控制反应滴速，1～3h滴加完毕，室温反应48h。TLC监控反应至完全后，停止反应，加入过量体积的冰乙醇沉淀产物，抽滤，得产物。产物用超纯水复溶，冰浴，探头超声30min，在蒸馏水中透析3d(MWCO=3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得产物白芦藜醇-低分子量肝素复合药物。
实施例9：天然活性物质构建的高分子复合药物胶束纳米粒的制备及粒径和临界胶束浓度(CMC)的测定
1、天然活性物质构建的高分子复合药物胶束纳米粒的制备：根据天然活性小分子物质的性质，考虑是否需要避光的条件下，取天然活性物质构建的高分子复合药物18mg溶解在3ml水中，于室温搅拌30min，然后冰浴下超声或高压均质后，0.8μm滤膜过滤，即得。
2、粒径：将1制备得到天然活性物质构建的高分子复合药物胶束纳米粒，取1ml用水稀释到3ml，用粒径测定仪(Malvem Instruments，Malvern，UK)进行测定，结果见表1。由表可知，制备得到的天然活性物质构建的高分子复合药物，胶束粒径达到纳米级，且粒径分布小。
3、临界胶束浓度(CMC)：芘是一种介质微极性荧光探针，属于稠环芳烃类。室温条件下，当芘的浓度低于10-5mol／L时，其荧光光谱对外界极性的变化非常敏感。当两亲性聚合物分子的浓度低于CMC时，溶液中不会形成纳米级的胶束，微量的芘溶解在极性的水中；当两亲性聚合物分子的浓度高于CMC时，纳米粒形成，芘向纳米粒内核的疏水部分分配，而进入非极性环境，表现为荧光光谱的一系列变化，如荧光强度的增加，发射光谱中振动精细结构(the vibrational fine structure of the emission spectra)的变化，激发光谱中(0，0)波段红移，从333nm移至338nm。因此，通过芘的激发光谱中I338／I333比值对两亲性物质的对数浓度作图，曲线拐点处的浓度即为聚合物的CMC。结果见表1。由表可知，由疏水性的天然活性小分子物质与低分子量肝素构建成的高分子复合药物，与小分子表面活性剂相比，临界胶束浓度很低，使其在生理条件下具有很好的稳定性，同时纳米级的粒径，可以使其逃脱网状内皮系统和肾脏的排空机制，延长血浆半衰期。
表1天然活性物质构建的高分子复合药物胶束纳米粒的表征
实施例10：天然活性物质构建的高分子复合药物的溶解度考察
天然活性物质构建的高分子复合药物的溶解度考察方法：分别称取天然活性小分子物质1mg溶解在10mL水中，以及天然活性物质构建的高分子复合药物1g溶解在1mL水中，室温下每隔5min振荡30s，观察30min内是否能完全溶解。结果见表2。由表2可知，将天然活性小分子物质接到肝素或其衍生物主链上后，能显著改善天然活性小分子物质溶解性。
表2天然活性物质构建的高分子复合药物溶解度
注：几乎不溶：-；溶解：++；易溶：+++。
实施例11：天然活性物质构建的高分子复合药物抗凝活性的检测
兔耳缘静脉取血，置于含有1／10体积0.109M枸橼酸钠抗凝液(1份抗凝液+9份全血)的塑料管中，轻轻颠倒混匀，3000rpm离心15min，收集上层液(血浆)。将样品溶液0.1mL加入0.4mL枸橼酸钠血浆中，再加入37℃预温的APTT试剂0.1mL，37℃孵育5min。同时以空白血浆作为对照。然后，加入37℃预温的0.025mol／L CaCl2溶液0.1mL，启动秒表，记录血浆凝固时间，每个样品3个复管测定，取平均值。结果见表3。由表3可以看出，经天然活性小分子物质修饰后，肝素或其衍生物的抗凝活性降低，从而降低了其大量使用时出血的风险。
表3天然活性物质构建的高分子复合药物的抗凝血活性
实施例12：天然活性物质构建的高分子复合药物对HUVEC小管形成的影响
取4℃下液态Matrigel胶50μL加入96孔板，平铺后置于37℃培养箱中1h固定，将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞混悬液50μL(3×105个／ml)加入到Matrigel胶中，用内皮细胞无血清培养基将高分子复合药物配到所需浓度，加入到培养板中，每孔加入50μL，轻轻摇晃均匀后，在37℃，5％CO2条件下，培养8h，随机选取3个视野，100倍镜下重复观察拍照，计算每个视野下小管形成数目。实验样品组为(a1)低分子量肝素；(a2)N-去硫酸化肝素；(a3)肝素；(a4)N-O-去硫酸化肝素；(b1)熊果酸；(b2)姜黄素；(b3)雷公藤甲素；(b4)藤黄酸；(c1)熊果酸-乙二胺-低分子量肝素；(c2)姜黄素-N-去硫酸化肝素；(c3)雷公藤甲素-肝素；(c4)藤黄酸-胱胺-N-O-去硫酸化肝素。实验样品组药物的浓度为100μg／mL。同时设置阴性对照组只含有5％胎牛血清。加样组和对照组均设3个复孔。以与对照组相比，单位视野下小管形成相对比值作图，结果见图1，图2，图3和图4。由图可知，天然活性物质构建的高分子复合药物与阴性对照组相比能明显抑制小管的形成，与游离的天然活性小分子物质或肝素及其衍生物相比抑制小管形成的能力增强。证明本发明中的天然活性物质构建的高分子复合药物能够抑制血管生成，且与游离的天然活性小分子物质或肝素及其衍生物相比抑制小管形成的能力增强。
实施例13：Matrigel plug法检测天然活性物质构建的高分子复合药物对血管抑制作用
取4℃液态下Matrigel胶200μL按不同实验分组，分别与不同药物混合，皮下注射，分别注入7周龄雄性C57BL／6小鼠的腋下，5只小鼠为一组，10d后处死小鼠，分离出Matrigel胶小包，用低渗溶解缓冲液(每个胶小包用2mL的0.1％苄泽-35)匀浆，10000rpm离心10min，取上清液，加入0.5mL的Drabkin’s试剂，室温孵育15min，Drabkin’s溶液作为空白试剂，540nm下检测吸光度值，以阴性对照组的吸光度值为0％，阳性对照组的吸光度值为100％，按公式(1)计算相对血红蛋白含量。实验样品分别为：1)阴性对照组：纯Matrigel胶；2)阳性对照组：Matrigel胶+bFGF(碱性成纤维细胞生长因子，200ng／mL，12.5μL)；3)实验药品组：①Matrigel胶+bFGF+a1(a1为低分子量肝素，200μg／mL，100μL)；②Matrigel胶+bFGF+a2(a2为N-去硫酸化肝素，200μg／mL，100μL)；③Matrigel胶+bFGF+a3(a3为肝素，200μg／mL，100μL)；④Matrigel胶+bFGF+a4(a4为N-O-去硫酸化肝素，200μg／mL，100μL)；⑤Matrigel胶+bFGF+b1(b1熊果酸，200μg／mL，100μL)；⑥Matrigel胶+bFGF+b2(b2为姜黄素，200μg／mL，100μL)；⑦Matrigel胶+bFGF+b3(b3为雷公藤甲素，200μg／mL，100μL)；⑧Matrigel胶+bFGF+b4(b4为藤黄酸，200μg／mL，100μL)；⑨Matrigel胶+bFGF+c1(c1为熊果酸-乙二胺-低分子量肝素，200μg／mL，100μL)；⑩Matrigel胶+bFGF+c2(c2为姜黄素-N-去硫酸化肝素，200μg／mL，100μL)；
Matrigel胶+bFGF+c3(c3为雷公藤甲素-肝素，200μg／mL，100μL)；
Matrigel胶+bFGF+c4(c4为藤黄酸-胱胺-N-O-去硫酸化肝素，200μg／mL，100μL)。结果见表4。
由表4可知，天然活性物质构建的高分子复合药物与游离的天然活性小分子物质或肝素及其衍生物相比能明显降低Matrigel胶中血红蛋白的含量。说明天然活性物质构建的高分子复合药物与游离的天然活性小分子物质或肝素及其衍生物相比，体内抑制血管形成的能力增强，证明本发明中的天然活性物质构建的高分子复合药物能够增强抑制血管生成的作用。
表4体内Matrigel plug法检测天然活性物质构建的高分子复合药物对血管抑制作用
实施例14：天然活性物质构建的高分子复合药物对B16黑色素瘤生长以及血管生成的影响
将接种B16黑色素瘤细胞C57BL／6小鼠随机分组，5只／组，以5％葡萄糖作为对照组，实验样品组为：(a1)低分子量肝素；(a2)熊果酸-乙二胺-低分子量肝素；(b1)N-去硫酸化肝素；(b2)和厚朴酚-N-去硫酸化肝素。其中(a1)和(a2)试验样品组的给药剂量为25mg／kg／d(以低分子量肝素计)，(b1)和(b2)试验样品组的给药剂量为15mg／kg/d(以N-去硫酸化肝素计)。按照隔天给药的方式，以第一天给药计为第0天，按照上述剂量，分别于0，2，4，6，8天经尾静脉注射给药。停药后第2天处死解剖小鼠，剥离肿瘤，称取瘤重，根据公式(2)计算肿瘤生长抑制百分率。结果见表5。
将分离的肿瘤组织，用10％的甲醛固定，做成石蜡切片，用内皮细胞标记物CD31进行免疫组织化学染色，随机选取5个视野在200倍显微镜下观察，计算单位视野平均血管数。结果见表6。
由表5和表6可知，与模型组相比，天然活性物质构建的高分子复合药物对B16黑色素瘤生长及其血管生成具有明显的抑制作用，与肝素或其衍生物相比也有显著性差异，说明天然活性物质构建的高分子复合药物在相同剂量下作用强于肝素或其衍生物。
表5天然活性物质构建的高分子复合药物对B16黑色素瘤生长的影响
注：与模型组相比*P<0.05，**P<0.01；与肝素或其衍生物相比◇P<0.01。
表6天然活性物质构建的高分子复合药物对B16黑色素瘤血管生长的影响
实施例15：天然活性物质构建的高分子复合药物对A549肿瘤生长以及血管生成的影响
将接种A549荷瘤小鼠随机分组，5只／组，以5％葡萄糖作为对照组，实验样品组为：(a1)低分子量肝素；(a2)熊果酸-乙二胺-低分子量肝素；(b1)肝素；(b2)雷公藤甲素-肝素。其中(a1)和(a2)试验样品组的给药剂量为25mg／kg/d(以低分子量肝素计)，(b1)和(b2)试验样品组的给药剂量为10mg／kg/d(以肝素计)。按照隔天给药的方式，以第一天给药计为第0天，按照上述剂量，分别于0，2，4，6，8天经尾静脉注射给药。停药后第2天处死解剖小鼠，剥离肿瘤，称取瘤重，根据公式(2)计算肿瘤生长抑制百分率。结果见表7。
将分离的肿瘤组织，用10％的甲醛固定，做成石蜡切片，用内皮细胞标记物CD31进行免疫组织化学染色，随机选取5个视野在200倍显微镜下观察，计算单位视野平均血管数。结果见表8。
由表7和表8可知，与模型组相比，天然活性物质构建的高分子复合药物对A549人肺肿瘤生长及其血管生成具有明显的抑制作用，与肝素或其衍生物相比也有显著性差异，说明天然活性物质构建的高分子复合药物在相同剂量下作用强于肝素或其衍生物。
表7天然活性物质构建的高分子复合药物对A549人肺肿瘤生长的影响
注：与模型组相比*P<0.05，**P<0.01；与肝素或其衍生物相比◇P<0.01。
表8天然活性物质构建的高分子复合药物对A549人肺肿瘤血管生长的影响
实施例16：天然活性物质构建的高分子复合药物对H22肿瘤生长以及血管生成的影响
将H22荷瘤小鼠随机分组，5只／组，以5％葡萄糖作为对照组，实验样品组为：(a1)肝素；(a2)大黄酸-胱胺-肝素；(b1)N-O-去硫酸化肝素；(b2)藤黄酸-胱胺-N-O-去硫酸化肝素。其中(a1)和(a2)试验样品组的给药剂量为10mg／kg／d(以肝素计)，(b1)和(b2)试验样品组的给药剂量为15mg／kg/d(以N-O-去硫酸化肝素计)。按照隔天给药的方式，以第一天给药计为第0天，按照上述剂量，分别于0，2，4，6，8天经尾静脉注射给药。停药后第2天处死解剖小鼠，剥离肿瘤，称取瘤重，根据公式(2)计算肿瘤生长抑制百分率。结果见表9。
将分离的肿瘤组织，用10％的甲醛固定，做成石蜡切片，用内皮细胞标记物CD31进行免疫组织化学染色，随机选取5个视野在200倍显微镜下观察，计算单位视野平均血管数。结果见表10。
由表9和表10可知，与模型组相比，天然活性物质构建的高分子复合药物对H22小鼠肝肿瘤生长及其血管生成具有明显的抑制作用，与肝素或其衍生物相比也有显著性差异，说明天然活性物质构建的高分子复合药物在相同剂量下作用强于肝素或其衍生物。
表9天然活性物质构建的高分子复合药物对H22小鼠肝肿瘤生长的影响
注：与模型组相比*P<0.05，**P<0.01；与肝素或其衍生物相比◇P<0.01。
表10天然活性物质构建的高分子复合药物对H22小鼠肝肿瘤血管生长的影响
实施例17：天然活性物质构建的高分子复合药物对ACHN肿瘤生长以及血管生成的影响
将ACHN荷瘤小鼠随机分组，5只／组，以5％葡萄糖作为对照组，实验样品组为：(a1)N-去硫酸化肝素；(a2)姜黄素-N-去硫酸化肝素；(b1)N-O-去硫酸化肝素；(b2)黄芩素-N-O-去硫酸化肝素。其中(a1)和(a2)试验样品组的给药剂量为10mg／kg/d(以N-去硫酸化肝素计)，(b1)和(b2)试验样品组的给药剂量为10mg／kg／d(以N-O-去硫酸化肝素计)。按照隔天给药的方式，以第一天给药计为第0天，按照上述剂量，分别于0，2，4，6，8天经尾静脉注射给药。停药后第2天处死解剖小鼠，剥离肿瘤，称取瘤重，根据公式(2)计算肿瘤生长抑制百分率。结果见表11。
将分离的肿瘤组织，用10％的甲醛固定，做成石蜡切片，用内皮细胞标记物CD31进行免疫组织化学染色，随机选取5个视野在200倍显微镜下观察，计算单位视野平均血管数。结果见表12。
由表11和表12可知，与模型组相比，天然活性物质构建的高分子复合药物对ACHN人肾肿瘤生长及其血管生成具有明显的抑制作用，与肝素或其衍生物相比也有显著性差异，说明天然活性物质构建的高分子复合药物在相同剂量下作用强于肝素或其衍生物。
表11天然活性物质构建的高分子复合药物对ACHN人肾肿瘤生长的影响
注：与模型组相比*P<0.05，**P<0.01；与肝素或其衍生物相比◇P<0.01。
表12天然活性物质构建的高分子复合药物对ACHN人肾肿瘤血管生长的影响
Claims (7)
1.一种天然活性物质构建的高分子复合药物，其特征在于该天然活性物质构建的高分子复合药物是通过下列方法制备得到的：将具有抑制血管生成活性的天然活性小分子物质通过化学反应接枝到具有抑制血管生成活性的天然高分子物质肝素或其衍生物的主链上，形成天然活性物质构建的高分子复合药物。
2.根据权利要求1所述的天然活性物质构建的高分子复合药物，其特征在于所述的天然活性物质为：具有抑制血管生成的天然活性小分子物质包括熊果酸、雷公藤甲素、和厚朴酚、姜黄素、藤黄酸、黄芩素、大黄酸或白藜芦醇；具有抑制血管生成的天然高分子物质肝素或其衍生物包括肝素、低分子量肝素、N-O-去硫酸化肝素或N-去硫酸化肝素。
3.根据权利要求1所述的天然活性物质构建的高分子复合药物，其特征在于所述的抑制血管生成，是指抑制肿瘤血管生成。
4.根据权利要求1所述的天然活性物质构建的高分子复合药物，其特征在于加上相应的药用辅料可制备成注射剂、冻干粉针剂、片剂、胶囊剂、散剂丸剂、颗粒剂、口服溶液剂、贴剂、搽剂、洗剂、凝胶剂、涂剂、软膏剂、喷雾剂或气雾剂。
5.根据权利要求1所述的天然活性物质构建的高分子复合药物的制备方法，其特征包括如下两个方法：
a.天然活性小分子物质的结构中含有羧基的，其制备步骤如下：
(1)将天然活性小分子物质溶于适当的有机溶剂，以二环己基碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺为活化剂，控制反应条件至反应完全，抽滤，滤液用适当溶剂沉淀，抽滤得沉淀物，真空干燥，得天然活性小分子物质的活性中间酯；
(2)将天然活性小分子物质的中间酯与二胺类连接臂按适当摩尔比溶于N，N-二甲基甲酰胺中，将二胺类缓慢滴加到天然活性小分子物质的活性中间酯的溶液中，控制反应至完全，用适当溶剂沉淀，沉淀物分别进行酸洗，水洗，抽滤得沉淀物，真空干燥，得羧基氨化的天然活性小分子物质；
(3)将肝素或其衍生物溶于适当反应溶剂，在惰性气体保护下，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺为活化剂，加入氨化后的天然活性小分子物质，控制反应至完全，用适当溶剂沉淀，过滤得沉淀物，复溶，超声，透析，冷冻干燥，即得到天然活性物质构建的高分子复合药物；
b.天然活性小分子物质的结构中不含羧基的，其制备步骤如下：
(I)将肝素或其衍生物溶于适当反应溶剂，在惰性气体保护下，以4-二甲氨基吡啶为催化剂，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺为脱水剂，将肝素或其衍生物上的羧基活化；
(II)天然活性小分子物质用适当的有机溶剂溶解后，缓慢滴加到肝素或其衍生物溶液中，控制反应至完全，用适当溶剂沉淀，过滤得沉淀物，复溶，超声，透析，冷冻干燥，即得到天然活性物质构建的高分子复合药物。
6.根据权利要求5所述的天然活性物质构建的高分子复合药物的制备方法，其中方法a的特征在于：
步骤(1)中所述的适当有机溶剂为四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、或四氢呋喃与N，N-二甲基甲酰胺、或四氢呋喃与二甲基亚砜的混合物；所述的控制反应条件为惰性气体保护下，冰浴反应0.2～2h，升至室温，反应6～72h；所述的适当的沉淀溶剂为正己烷；
步骤(2)中所述的二胺类连接臂选自对苯二胺、胱胺或碳原子数为2～12的亚烷基二胺；所述的天然活性小分子物质中间酯与二胺类的适当摩尔比为5∶1～80∶1；所述的控制反应，为反应滴速控制在每滴间隔2～30秒；反应温度为0～40℃；二胺类滴加完之后，再反应3～12h；所述的适当沉淀溶剂为饱和氯化钠；所述的酸洗为0.1～1mol／L稀HCl；水洗为超纯水或蒸馏水；
步骤(3)中所述的适当反应溶剂为甲酰胺，或甲酰胺与四氢呋喃，或甲酰胺与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂；所述的控制反应为先加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺活化剂反应0.2～2h后，再加入氨化后的天然活性小分子物质，室温反应6～72h；所述的适当沉淀溶剂为冰丙酮、冰乙醚、冰乙醇或冰乙酸乙酯；所述的透析时间为0.5～3d。
7.根据权利要求5所述的天然活性物质构建的高分子复合药物的制备方法，其中方法b的特征在于：
步骤(I)所述的适当溶剂反应为甲酰胺、或者甲酰胺与四氢呋喃、或者甲酰胺与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂；所述的肝素或其衍生物、催化剂、脱水剂三者的摩尔比为1∶0.2～0.5∶3～20；
步骤(II)所述的溶解天然活性小分子物质的有机溶剂为四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、或四氢呋喃与N，N-二甲基甲酰胺、或四氢呋喃与二甲基亚砜的混合物；所述的控制反应为按上述摩尔比加入催化剂和活化剂，反应0.2～2h后，加入天然活性小分子物质，控制反应滴速为每滴间隔2～30秒，滴加完后再室温反应6～72h；所述的适当沉淀溶剂为冰丙酮、冰乙醚、冰乙醇或冰乙酸乙酯；所述的透析时间为0.5～3d。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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Application publication date: 20140409 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |