CN103301472A - 生物体病灶部位特异性释药的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物及其药物组合物的制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物体病灶部位特异性释药的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物及其药物组合物的制备和应用。这类偶联物是在多糖骨架上通过含二硫键的连接臂引入疏水性抗肿瘤药物，使多糖-抗肿瘤药物偶联物具有两亲性质，在水中可自组装为纳米胶束，该纳米胶束可另外负载抗肿瘤药物，亦可作为偶联物前药胶束直接使用。其主要特征在于：1)纳米胶束到达病灶部位后，其二硫键连接臂可被病灶细胞内高浓度还原性物质特异性降解，导致胶束解聚和药物快速释放，提高疗效；2)通过化学偶联及物理包裹抗肿瘤药物，达到共同治疗效果。该多糖偶联物及其药物组合物可用于注射、口服或外用途径给药，能显著提高抗肿瘤活性，为抗肿瘤药物的开发提供了新思路。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂领域，涉及一种生物体病灶部位特异性释药的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物作为药物载体，本发明还涉及该偶联物载体的制备方法和应用。
背景技术
癌症是威胁人类健康的重大疾病之一。世界卫生组织2013年2月1日发表的调查报告显示，2008年全球死于癌症的人数达760万，每年约有1300万新增癌症患者，而且呈逐年上升的趋势。
抗肿瘤药物治疗癌症是目前临床治疗的主要方法之一，但由于现有的抗肿瘤药物多为水难溶性小分子化合物，口服吸收较差，生物利用度较低，而且在体内代谢较快，维持有效血药浓度时间较短，为了提高疗效往往需要增大剂量或增加给药次数，加之其对正常红细胞和癌细胞缺乏选择性，由此带来更大的毒副作用，因此开发长效、缓释和靶向性抗肿瘤药物制剂是当今研究的重点。
将抗肿瘤药物制备成脂质体、微囊(球)等给药系统增强靶向性，提高疗效、缓和毒性，已成为肿瘤靶向给药的有效途径，但脂质体作为药物载体，仍存在包封率低、靶向分布不理想、贮存中稳定性欠佳等缺点；微囊(球)粒径较大，无法透过粘膜或经体循环直接把药物输送到靶组织，不适合注射用药；且脂质体、微囊(球)在治疗某些实体瘤(如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等)方面效果不甚理想。高分子-抗肿瘤药物偶联物应运而生，即将化疗药物和水溶性大分子通过共价键偶联形成高分子前体药物。其突出优势在于：①对实体瘤具有倾向性沉积作用，即EPR效应；②被动靶向和缓控释作用；③避免被肾脏快速清除，延长药物血浆半衰期；④通过特定的酶或pH条件水解释放抗肿瘤药物，降低其对正常组织的毒副作用，提高生物利用度；⑤增加疏水药物可溶性等。然而，可用作高分子-抗肿瘤药物偶联物的材料必须满足：具有合适的反应基团；良好的生物相容性和生物可降解性；无毒性和免疫原性；对于肿瘤具有一定的靶向性，在达到靶部位前保持药物的活性等。大多数合成高分子均存在着或多或少的溶血、热原反应及渗透性等方面缺陷；生物大分子中各种水溶性蛋白质则易被蛋白酶水解，在体内降解速度较快。因此，天然存在的多糖就显现出其独特的优势。
多糖是所有生命有机体的重要组分，在控制细胞分裂、调节细胞生长以及维持生命有机体正常代谢等方面有重要作用，且来源广泛、价廉易得。作为药用高分子材料有很多优点：①具有优良的生物相容性和可降解性，能够在生物体中酶解成易被活体吸收、无毒副作用的小分子物质；②多糖主链结构含有大量活性基团，如氨基、羧基、羟基和醛基等，易于化学修饰(如酰化、硫酸酯化、接枝与交联等)而改善其理化性质；③一些多糖材料具有其他特 殊优良的特性，如低分子量透明质酸具有广谱肿瘤靶向性，可作为抗肿瘤药物载体，通过与众多肿瘤细胞表面高度表达的透明质酸受体CD44结合，将抗肿瘤药物转移至肿瘤细胞间质中。故以多糖作为高分子-抗肿瘤药物偶联物的水溶性部分受到越来越多的重视。现已有部分多糖-抗肿瘤药物偶联物处于研究阶段，但这些偶联物仍存在明显的缺点：合成条件较为苛刻；连接药物与高分子的架桥基团多为酰胺键或酯键，这两种化学键的体内稳定性较高，使得疏水性抗肿瘤药物的脱落非常缓慢，由此导致了药物到达药效部位后不能及时释放，导致缓释后药量不足以达到抗癌作用，不利于疗效的发挥；单独以高分子前药形式治疗肿瘤，作用机制单一，治疗效果未达到最佳等。
针对以上问题，本专利以天然多糖为骨架，在多糖的羧基或经过衍生化的羧基、氨基或经衍生化形成的氨基、羟基或经衍生化形成的羟基上，通过生物体病灶部位特异性释药的二硫键连接臂连接疏水性抗肿瘤药物或其衍生物，使其具有两亲性质，在水介质中可自组装为纳米胶束，增溶药物。新型生物体病灶特异性释药的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物作为药物载体具有以下特征：①多糖-抗肿瘤药物偶联物具有两亲性质，在水溶液中自组装形成纳米胶束，避免了大量有机溶剂、表面活性剂、交联剂或加热条件的使用；②在疏水性抗肿瘤药物的疏水作用力下，物理包裹更多此种抗肿瘤药物或其他难溶性抗肿瘤药物，显著提高载药量，延长药物稳定性；③多糖与疏水基团间的连接臂含有二硫键，此二硫键在体循环和细胞外的内环境较稳定，但可被病灶细胞内高浓度的还原性物质谷胱甘肽降解，在病灶部位特异性地快速释放药物，避免了化学结合于载体之上的抗肿瘤药物和包裹在胶束中的抗肿瘤药物未能释放、未作用于药效部位即被清除的缺点，可显著提高生物利用度和药效。通过含二硫键的连接臂引入疏水基团所形成的生物体病灶部位特异性释药两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物尚未见任何文献和专利报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤活性并生物可降解的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物。该偶联物在水介质中可自组装形成纳米胶束，避免化学交联剂、大量有机溶剂、加热条件的使用，制备工艺简单；可通过疏水抗肿瘤药物所形成的疏水内核物理包裹更多的此种抗肿瘤药物或其他难溶性抗肿瘤药物，显著提高抗肿瘤药物的溶解性、载药量；此外，可通过化学偶联与物理包裹疏水性抗肿瘤药物，共同达到治疗癌症的效果。该两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物具有抗肿瘤活性强、载药量高、稳定性好、药效提高、毒副作用降低的特征。
本发明的另一个目的是提供上述载体的制备方法。
本发明还有一个目的是提供上述载体在制药中的应用。
为达到上述目的，本发明提供了一种生物体病灶部位特异性释药的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物载体，其结构如下列化学式所示：
其中：GLY为多糖分子链，n+m为连接臂所含亚烷基个数，D为疏水性抗肿瘤药物基团，R为多糖分子上疏水基团取代的个数。
所述的生物体病灶部位特异性释药的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物，其中所选用的多糖包括透明质酸、未分级肝素、低分子量肝素、脱硫酸化肝素、软骨素、多硫酸化软骨素、海藻酸、葡聚糖、真菌多糖、壳聚糖及其含有羧基、氨基或羟基的衍生物。
所述的生物体病灶部位特异性释药的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物，其中连接臂含有病灶部位特异性降解的二硫键，且两端反应基团为氨基或羧基或一端反应基团为氨基另一端反应基团为羧基，连接臂所含亚烷基个数为2～16的整数。
所述的生物体病灶部位特异性释药的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物，其中疏水性抗肿瘤药物包括紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、喜树碱、羟基喜树碱、全反式维甲酸、9-顺式维甲酸、甲氨蝶呤、氨基蝶呤、齐墩果酸、熊果酸、藤黄酸、新藤黄酸、甘草酸、甘草次酸、长春碱、长春新碱。
所述的生物体病灶部位特异性释药的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物，其中多糖分子上疏水抗肿瘤药物基团取代的个数为2～600的整数。
所述的生物体病灶部位特异性释药的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物，其中多糖分子与连接臂通过酰胺键或酯键相连，连接臂另一端与疏水性抗肿瘤药物通过酰胺键或酯键相连。
所述的生物体病灶部位特异性释药的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物的制备方法包括下列步骤：
(1)将含有羧基(氨基、羟基)的多糖或含有羧基(氨基、羟基)的多糖衍生物溶于反应溶剂中，采用含有二硫键且两端同为氨基(两端同为羧基、一端氨基一端羧基)的连接臂，以EDC和NHS或EDC和HOBt或EDC和DMAP为活化剂进行缩合反应，多糖与连接臂的一端发生酯化或酰胺化反应得到多糖中间体；将含有羧基(氨基、羟基)的疏水性抗肿瘤药物或含有羧基(氨基、羟基)的疏水性抗肿瘤药物衍生物溶于反应溶剂中，以DCC和NHS或EDC和NHS或EDC和HOBt或EDC和DMAP或DCC和DMAP为活化剂，疏水性抗肿瘤药物基团的羧基(氨基、羟基)进一步和多糖中间体连接臂上另一端羧基(氨基、羟基)缩合反应，即得具有生物体病灶部位特异性释药功能的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物载体。
(2)将含有羧基(氨基、羟基)的疏水性抗肿瘤药物或含有羧基(氨基、羟基)的抗肿瘤药物衍生物溶于反应溶剂中，采用含有二硫键且两端同为氨基(两端同为羧基、一端氨基一端羧基)的连接臂，以DCC和NHS或EDC和NHS或EDC和HOBt或EDC和DMAP或DCC和DMAP为活化剂进行缩合反应，疏水性抗肿瘤药物基团与连接臂的一端发生酯化或 酰胺化反应得到抗肿瘤药物中间体；将含有羧基(氨基、羟基)的多糖或含有羧基(氨基、羟基)的多糖衍生物溶于反应溶剂中，以DCC和NHS或EDC和NHS或EDC和HOBt或EDC和DMAP或DCC和DMAP为活化剂，多糖的羧基(氨基、羟基)进一步和抗肿瘤药物中间体连接臂上另一端羧基(氨基、羟基)缩合反应，即得具有生物体病灶部位特异性释药功能的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物载体。
所述的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物制备方法，其中反应溶剂为水、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、吡啶、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、丙酮、二甲基亚砜、甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮或其中任意两种溶剂的混合溶剂。
所述的生物体病灶部位特异性释药的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物的应用，偶联物可直接作为制剂应用；也可用于抗肿瘤药物组合物，作为其他药学活性或药理活性分子载体应用。其中药学活性或药理活性分子选自选自：紫杉烷类、喜树碱类、长春碱类、维A酸类、蒽醌类、鬼臼毒素类、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、叶酸拮抗剂、藤黄酸类抗肿瘤药的任意一项。
所述的多糖-抗肿瘤药物偶联物或抗肿瘤药物组合物，可以用作血管内注射、肌肉注射、口服或外用。其中注射给药优选注射剂、冻干粉针，口服给药优选片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、颗粒剂、口服溶液剂，外用给药优选贴剂、搽剂、洗剂、凝胶剂、涂剂、软膏剂。
所述的多糖-抗肿瘤药物偶联物制备成胶束或载药胶束方法步骤如下：两亲性多糖-抗肿瘤药物与水按重量比为1～50∶1000的比例溶解，经超声或高压均质处理，即得到多糖-抗肿瘤药物偶联物的纳米胶束；将治疗有效量的难溶或微溶于水的有机药物用药学上可接受的溶剂溶解后，与上述两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物的水溶液混合后，经超声或高压均质处理，溶液用透析法或超滤法或柱分离法除去有机溶剂和小分子，冻干制得粒径为10～1000nm的纳米载药胶束。
具体实施方案如下：
在多糖的羧基、氨基或羟基通过含二硫键的可特异性降解连接臂引入疏水性抗肿瘤药物，使其具有两亲性，在水介质中可自组装成纳米胶束。疏水的抗肿瘤药物聚集成内核，多糖分子亲水链形成高度亲水性外壳，具有提高抗肿瘤活性、稳定胶束、有效躲避单核-吞噬细胞系统的捕捉的作用。因此这类两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物是一类优良的药物载体，尤其对于难溶性抗肿瘤药物。该两亲性多糖-偶联物胶束到达病灶部位后，其二硫键连接臂可被病灶细胞内高浓度还原性物质谷胱甘肽特异性降解，疏水性抗肿瘤药物与亲水基团的快速分离导致药物的快速释放，作用于病灶部位，可显著提高病灶部位游离药物浓度、疗效和生物利用度。该偶联物亦可作为药物载体，粒径在10～1000nm可控，表面光滑，均匀度好，再分散性好，载药量和包封率高。该偶联物可用于血管内或肌肉注射、口服或外用。
生物体病灶部位特异性释药两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物的合成及药学或生理活性组合物制备方法详细说明如下：
一、生物体病灶特异性释药的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物
(一)、连接臂先同亲水性多糖连接，后连接疏水性抗肿瘤药物
1、多糖中间体的合成
(1)多糖与两端为氨基的连接臂反应
将一定量的含羧基的多糖或含羧基的多糖衍生物溶于反应溶剂中，加入过量的两端为氨基的连接臂，以EDC和NHS或EDC和HOBt为活化剂反应，反应12h～48h后使用过量的丙酮将多糖沉淀出来，抽滤并分离纯化沉淀物，得到多糖中间体。
合成路线如下式所示：
(2)多糖与两端为羧基的连接臂反应
将一定量的含氨基(羟基)的多糖或含氨基(羟基)的多糖衍生物溶于反应溶剂中，加入过量的两端为羧基的连接臂，以EDC和NHS或EDC和HOBt或EDC和DMAP为活化剂反应，反应12h～48h后使用过量的丙酮将多糖沉淀出来，抽滤并分离纯化沉淀物，得到多糖中间体。
合成路线如下式所示：
(3)多糖与一端为羧基另一端为氨基的连接臂反应
将一定量的含羧基(氨基、羟基)的多糖或含羧基(氨基、羟基)的多糖衍生物溶于反应溶剂中，加入过量的一端为羧基另一端为氨基的连接臂，以EDC和NHS或EDC和HOBt或EDC和DMAP为活化剂反应，反应12h～48h后使用过量的丙酮将多糖沉淀出来，抽滤并分离纯化沉淀物，得到多糖中间体。
合成路线如下式所示：
2、两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物的合成
(1)多糖中间体同含羧基的抗肿瘤药物反应
将一定量的含羧基的抗肿瘤药物或含羧基的抗肿瘤药物衍生物溶于反应溶剂中，加入反应后一端为氨基的多糖中间体，以EDC和NHS或EDC和HOBt为活化剂反应，反应12h～48h后使用过量的丙酮将多糖沉淀出来，抽滤并分离纯化沉淀物，即得偶联物。
合成路线如下式所示：
(2)多糖中间体同含氨基的抗肿瘤药物反应
将一定量的含氨基的抗肿瘤药物或含氨基的抗肿瘤药物衍生物溶于反应溶剂中，加入反应后一端为氨基的多糖中间体，以EDC和NHS或EDC和HOBt为活化剂反应，反应12h～48h后使用过量的丙酮将多糖沉淀出来，抽滤并分离纯化沉淀物，即得偶联物。
合成路线如下式所示：
(3)多糖中间体同含羟基的抗肿瘤药物反应
将一定量的含羟基的抗肿瘤药物或含羟基的抗肿瘤药物衍生物溶于反应溶剂中，加入反应后一端为氨基的多糖中间体，以EDC和NHS或EDC和DMAP为活化剂反应，反应12h～48h后使用过量的丙酮将多糖沉淀出来，抽滤并分离纯化沉淀物，即得偶联物。
合成路线如下式所示：
(二)、连接臂先同疏水性抗肿瘤药物连接，后连接亲水性多糖
1、抗肿瘤药物中间体的合成
(1)抗肿瘤药物与两端为氨基的连接臂反应
将一定量的含羧基的抗肿瘤药物或含羧基的抗肿瘤药物衍生物溶于反应溶剂中，加入过量的两端为氨基的连接臂，以EDC和NHS或EDC和HOBt或DCC和NHS或EDC和DMAP或DCC和DMAP为活化剂反应，监控反应至完全，分离纯化产物，得到多糖中间体。
合成路线如下式所示：
(2)抗肿瘤药物与两端为羧基的连接臂反应
将一定量的含氨基(羟基)的抗肿瘤药物或含氨基(羟基)的抗肿瘤药物衍生物溶于反应溶剂中，加入过量的两端为羧基的连接臂，以EDC和NHS或EDC和HOBt或DCC和NHS或EDC和DMAP或DCC和DMAP为活化剂反应，监控反应至完全，分离纯化产物，得到多糖中间体。
合成路线如下式所示：
(3)抗肿瘤药物与一端为羧基另一端为氨基的连接臂反应
将一定量的含羧基(氨基、羟基)的抗肿瘤药物或含羧基(氨基、羟基)的抗肿瘤药物衍生物溶于反应溶剂中，加入过量的一端为羧基另一端为氨基的连接臂，以EDC和NHS或EDC和HOBt或DCC和NHS或EDC和DMAP或DCC和DMAP为活化剂反应，监控反应至完全，分离纯化产物，得到多糖中间体。
合成路线如下式所示：
2、两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物的合成
(1)抗肿瘤药物中间体同含羧基的多糖反应
将一定量的含羧基的多糖或含羧基的多糖衍生物溶于反应溶剂中，加入反应后一端为氨基的抗肿瘤药物中间体，以EDC和NHS或EDC和HOBt为活化剂反应，反应12h～48h后使用过量的丙酮将多糖沉淀出来，抽滤并分离纯化沉淀物，即得偶联物。
合成路线如下式所示：
(2)抗肿瘤药物中间体同含氨基的多糖反应
将一定量的含氨基的多糖或含氨基的多糖衍生物溶于反应溶剂中，加入反应后一端为羧基的抗肿瘤药物中间体，以EDC和NHS或EDC和HOBt为活化剂反应，反应12h～48h后使用过量的丙酮将多糖沉淀出来，抽滤并分离纯化沉淀物，即得偶联物。
合成路线如下式所示：
(3)抗肿瘤药物中间体同含羟基的多糖反应
将一定量的含羟基的多糖或含羟基的多糖衍生物溶于反应溶剂中，加入反应后一端为羧基的抗肿瘤药物中间体，以EDC和NHS或DCC和NHS或EDC和DMAP或DCC和DMAP为活化剂反应，反应12h～48h后使用过量的丙酮将多糖沉淀出来，抽滤并分离纯化沉淀物，即得偶联物。
合成路线如下式所示：
二、两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物纳米胶束的制备方法
按每1mL水中溶解2～30mg的两亲性多糖衍生物的比例，将制得的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物溶于水中，经超声或高压均质处理，制备成粒径为10～1000nm的多糖-抗肿瘤药物偶联物胶束。
三、以两亲性多糖-抗肿瘤药物胶束作为载体，制备包载难溶性抗肿瘤药物的药物组合物
多糖-抗肿瘤药物偶联物溶于水，浓度0.1％～5％(w/w)，将难溶性抗肿瘤药物如紫杉醇用适当有机溶剂溶解，加至偶联物的胶束溶液中，经超声或高压均质处理，通过透析或减压蒸馏的方法除去有机溶剂，制得粒径为10～1000nm的纳米胶束。所谓适当溶剂，指药学上使用的能溶解该药物的溶剂。
四、采用多糖-抗肿瘤药物偶联物胶束作为载体制备药物组合物，可对抗肿瘤药物有效负载。可使用该两亲性多糖衍生物作为载体的药物有：紫杉醇、多烯紫杉醇、替尼泊苷、羟基喜树碱、喜树碱、长春碱、长春新碱、长春酰胺、依托泊苷、阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、丝裂霉素、水飞蓟素、甲氨蝶呤、藤黄酸、新藤黄酸、全反式维甲酸、9-顺式维甲酸等，但并不局限于这些所列药物。
本发明的有益效果：
一、本发明以二硫键的连接臂在多糖的氨基或羧基或羟基上引入疏水性抗肿瘤药物基团，此二硫键在体循环和细胞外的内环境中稳定性较高，但易被病灶细胞内高浓度的还原性物质谷胱甘肽降解，可在病灶细胞内特异性地快速释放药物，避免了药物未能释放、未能发挥药效即被清除的缺点，可显著提高生物利用度和疗效。
二、本发明提供的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物具有良好的生物病灶部位特异性释药行为，还具有临界胶束浓度低、可主动靶向肿瘤的优势。
三、本发明提供的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物，可在水中自发形成纳米胶束，对难溶性抗肿瘤药物具有良好的物理包裹负载，例如，对紫杉醇的物理负载高达33.2％(w/w)，对阿霉素的物理负载高达19.7％(w/w)，对羟基喜树碱的物理负载高达28.8％(w/w)，对甲氨蝶呤的物理负载高达18.2％(w/w)，对多烯紫杉醇的物理负载高达21.3％(w/w)，对藤黄酸的物理负载高达26.0％(w/w)。
四、本发明提供的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物可用于注射、口服、外用或粘膜给药。本两亲性偶联物具有高度安全性，粒径可控制在10～1000nm。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但下述实施例并不限制本专利的权利范围。
实施例1：透明质酸-胱胺-紫杉醇偶联物的制备
0.1mmol透明质酸、1mmol胱胺、0.2mmol EDC和0.2mmol NHS溶于甲酰胺中，反应24h后使用过量的丙酮沉淀，抽滤。加水复溶沉淀，并用蒸馏水透析3d(MWCO＝3500)，冷冻干燥即得到游离一端氨基的透明质酸中间体。
将0.4mmol紫杉醇溶于吡啶中，加入0.4mmol丁二酸酐，室温搅拌反应4h。旋转蒸发除去吡啶，真空干燥。加入适量双蒸水，搅拌30min，过滤收集沉淀，将沉淀溶于适量丙酮，缓慢加入双蒸水，收集结晶，真空干燥，得到含有羧基的2’-琥珀酰紫杉醇衍生物。
将0.025mmol2’-琥珀酰紫杉醇、0.1mmol透明质酸中间体、0.025mmol EDC和0.025mmol NHS溶于甲酰胺，反应24h后使用过量的丙酮沉淀，抽滤。加水复溶沉淀，并用蒸馏水透析3d(MWCO＝3500)，冷冻干燥即得透明质酸-胱胺-紫杉醇偶联物载体。
实施例2：壳聚糖-3，3’-二硫代二丙酸-紫杉醇偶联物的制备
0.1mmol壳聚糖溶于水和甲醇(v/v＝1∶1)的混合溶剂、加入1mmol3，3’-二硫代二丙酸、0.1mmol EDC和0.1mmol HOBt，反应8h，旋转蒸发除去甲醇，蒸馏水透析3d(MWCO＝3500)，得到游离一端羧基的壳聚糖中间体。
将0.025mmol紫杉醇和0.1mmol壳聚糖中间体、0.025mmol EDC和少量DMAP溶于水和甲醇(v/v＝1∶3)的混合溶剂，反应48h。旋转蒸发除去甲醇，蒸馏水透析3d(MWCO＝3500)，冻干即得壳聚糖-3，3’-二硫代二丙酸-紫杉醇偶联物载体。
实施例3：硫酸软骨素-胱胺-藤黄酸偶联物的制备
0.1mmol硫酸软骨素、2mmol胱胺、0.4mmol EDC和0.4mmol NHS溶于甲酰胺中，反应12h后使用过量的丙酮沉淀，抽滤。加水复溶沉淀，用蒸馏水透析3d(MWCO＝3500)，冷冻干燥即得到游离一端氨基的硫酸软骨素中间体。
0.5mmol藤黄酸、0.6mmol DCC，0.6mmol NHS溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，冰浴反应30min，然后升至室温反应48h。反应结束后，滤去沉淀，以二氯甲烷和甲醇(v/v＝1∶1)为洗脱剂进行硅胶柱柱层析纯化即得到藤黄酸-NHS活化酯。
将0.4mmol藤黄酸-NHS活化酯和0.1mmol硫酸软骨素中间体溶于甲酰胺，反应12h。反应结束后使用过量的丙酮沉淀，过滤并真空干燥即得硫酸软骨素-胱胺-藤黄酸偶联物载体。
实施例4：肝素-胱胺-甲氨蝶呤偶联物的制备
取0.1mmol甲氨蝶呤、0.12mmol DCC，0.15mmol NHS，溶解在N，N-二甲基甲酰胺中， 冰浴反应30min，然后升至室温反应24h。反应结束后，滤去沉淀，并加大量乙酸乙酯洗涤沉淀。对滤液进行萃取，合并乙酸乙酯层，旋转蒸发除去溶剂得到甲氨蝶呤活化酯。
将0.1mmol甲氨蝶呤活化酯、1mmol胱胺溶于二氯甲烷，冰浴条件下反应，薄层色谱法(TLC法)监测反应至完全后，对反应液进行萃取，合并有机层，硅胶柱层析法分离纯化所得产物，即得到游离一端为氨基的甲氨蝶呤中间体。
0.1mmol肝素、30mmol EDC溶于甲酰胺中，室温反应30min，将含30mmol甲氨蝶呤中间体的N，N-二甲基甲酰胺的溶液缓慢加入上述反应液中，室温反应24h。反应结束后，加入丙酮沉淀产物，抽滤。加水复溶沉淀，在水中透析3d(MWCO＝3500)，冷冻干燥即得肝素-胱胺-甲氨蝶呤偶联物。
实施例5：葡聚糖-3，3’-二硫代二丙酸-阿霉素偶联物的制备
0.1mmol葡聚糖分散于N，N-二甲基甲酰胺中，加入1mmol3，3’-二硫代二丙酸、0.5mmol EDC和催化量的DMAP，反应48h后使用过量的丙酮沉淀，抽滤。加水复溶沉淀，并用蒸馏水透析3d(MWCO＝3500)，冷冻干燥即得到游离一端羧基的葡聚糖中间体。
将0.1mmol葡聚糖中间体、0.1mmol阿霉素、0.1mmol EDC和0.1mmol NHS溶于N，N-二甲基甲酰胺，反应48h后使用过量的丙酮沉淀，抽滤。加水复溶沉淀，并用蒸馏水透析3d(MWCO＝3500)，冷冻干燥即得葡聚糖-3，3’-二硫代二丙酸-阿霉素偶联物载体。
实施例6：多糖-抗肿瘤药物偶联物纳米胶束的制备和表征
1、两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物中抗肿瘤药物含量测定：偶联物载药量的测定方法根据药物不同而有所变化，常用定量方法有紫外、荧光、1H-NMR、HPLC等。
2、两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物纳米胶束的制备：多糖-抗肿瘤药物偶联物30mg溶解在6mL水中于室温搅拌1h，然后冰浴下超声或高压均质后，0.45μm滤膜过滤，即得。
3、粒径：Zetasizer3000HS instrument(Malvem Instruments，Malvem，UK)在633nm，25℃，He-Ne激光测定样品粒径，结果见表1。
4、临界胶束浓度(CMC)：采用最为灵敏的荧光探针法测定CMC。以芘为荧光探针，芘是一种疏水性芳香化合物，对环境极性极敏感。当两亲性分子的浓度低于CMC时，溶液中不会形成胶束，芘溶解在极性的水中；随着两亲性分子的浓度高于CMC，胶束形成。芘相向胶束内核的疏水部分分配，从而进入非极性环境，继而在其荧光广谱中可以观察到一系列变化，如荧光强度将增加，放射光谱中振动精细结构(the vibrational fine structure ofthe emission spectra)发生变化，激光光谱中(0，0)波段红移。因此，通过以芘的发射光谱中的I1/I3比(在固定的激发波长下扫描，I1、I3分别代表发射光谱中第一和第三强峰的荧光强度)或激发光谱中I338/I333比(激发光谱中波长分别为338nm和333nm的荧光强度比)对两亲分子的浓度作图即可获得两亲性分子的表观CMC，结果见表1。
表1两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物纳米胶束的表征
实施例7：物理包载紫杉醇两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物自组装纳米胶束组合物的制备和表征
1、制备工艺
(1)探头超声法
两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物18mg，溶解在3mL水中于室温搅拌1h。紫杉醇10mg溶解在乙醇(甲醇、二氯甲烷)中。然后二者溶液混合，冰浴超声30min后，用透析袋(MWCO3500)在蒸馏水中室温透析12h或减压蒸除有机溶剂，离心(3000rpm)15min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。
(2)高压均质法
两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物18mg，溶解在3mL水中于室温搅拌1h。紫杉醇10mg溶解在乙醇(甲醇、二氯甲烷)中。然后二者溶液混合，高压均质，用透析袋(MWCO3500)在蒸馏水中室温透析12h或减压蒸除有机溶剂，离心(3000rpm)15min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。
(3)溶剂挥发法
两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物18mg，溶解在3mL水中于室温搅拌1h。紫杉醇10mg溶解在氯仿中，然后两者溶液混合，继续搅拌过夜，使氯仿挥发，离心(3000rpm)15min，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。
2、两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物纳米胶束中物理负载紫杉醇含量的测定
用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行含量测定。流动相为甲醇∶水＝75∶25(v/v)，色谱柱为Lichrospher C18(150×4.6μm)，柱子粒径为5μm。流速为1.0mL/min，检测波长为227nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱温为30℃，注射样品体积为20μL。以公式(1)计算样品的物理包载药物载药量。结果见表2。
表2实施例1～5载紫杉醇的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物纳米胶束的表征
实施例8：物理包载阿霉素两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物自组装纳米胶束组合物的制备和表征
1、制备工艺
两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物18mg，溶解在3mL水中于室温搅拌1h。盐酸阿霉素10mg溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，加20倍三乙胺脱盐。然后二者溶液混合，冰浴超声30min后，用透析袋(MWCO3500)在蒸馏水中室温透析12h，离心(3000rpm)15min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。
2、两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物纳米胶束中物理负载阿霉素含量的测定
用荧光光谱法进行阿霉素的含量测定(激发波长/发射波长为488nm/570nm)。以公式(1)计算样品的物理包载药物载药量。结果见表3。
表3实施例1～5载阿霉素的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物纳米胶束的表征
实施例9：物理包载羟基喜树碱两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物自组装纳米胶束组合物的制备和表征
1、制备工艺
两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物20mg，溶解在3mL水中于室温搅拌1h。羟基喜树碱10mg溶解在N，N-二甲基甲酰胺中。然后二者溶液混合，冰浴超声30min后，用透析袋(MWCO3500)在蒸馏水中室温透析12h，离心(3000rpm)15min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。
2、两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物纳米胶束中物理负载羟基喜树碱含量的测定
用高效液相-荧光检测法进行羟基喜树碱的含量测定。流动相为枸橼酸缓冲液∶乙腈∶75nmol/mL磷酸二氢钾＝70∶23∶7(v/v)。色谱柱为Lichrospher C18(150×4.6μm)，柱子粒径为5μm。流速为1.0mL/min，荧光检测的激发波长/发射波长为360nm/530nm。柱温为30℃，注射样品体积为20μL。以公式(1)计算样品的物理包载药物载药量。结果见表4。
表4实施例1～5载羟基喜树碱的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物纳米胶束的表征
实施例10：物理包载甲氨蝶呤两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物自组装纳米胶束组合物的制备和表征
1、制备工艺
两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物20mg，溶解在3mL水中于室温搅拌1h。甲氨蝶呤20mg溶解在N，N-二甲基甲酰胺中。然后二者溶液混合，冰浴超声30min后，用透析袋(MWCO3500)在蒸馏水中室温透析12h，离心(3000rpm)15min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。
2、两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物纳米胶束中物理负载甲氨蝶呤含量的测定
用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行甲氨蝶呤的含量测定。流动相为乙腈∶0.05mol/L磷酸氢二钾缓冲液(pH4.85)＝10∶90(v/v)，色谱柱为Lichrospher C18(150×4.6μm)，柱子粒径为5μm。流速为1.0mL/min，检测波长为313nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱温为25℃，注射样品体积为20μL。以公式(1)计算样品的物理包载药物载药量。结果见表5。
表5实施例1～5载甲氨蝶呤的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物纳米胶束的表征
实施例10：物理包载多烯紫杉醇两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物自组装纳米胶束组合物的制备和表征
1、制备工艺
两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物20mg，溶解在3mL水中于室温搅拌1h。多烯紫杉醇30mg溶解在乙醇中。然后二者溶液混合，冰浴超声30min后，用透析袋(MWCO3500)在蒸馏水中室温透析12h，离心(3000rpm)15min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。
2、两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物纳米胶束中物理负载多烯紫杉醇含量的测定
用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行多烯紫杉醇的含量测定。流动相为乙腈∶水＝55∶45(v/v)，色谱柱为Lichrospher C18(150×4.6μm)，柱子粒径为5μm。流速为1.0mL/min，检测波长为230nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱温为30℃，注射样品体积为20μL。以公式(1)计算样品的物理包载药物载药量。结果见表6。
表6实施例1～5载多烯紫杉醇的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物纳米胶束的表征
实施例11：物理包载藤黄酸两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物自组装纳米胶束组合物的制备和表征
1、制备工艺
两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物18mg，溶解在3mL水中于室温搅拌1h。藤黄酸12mg溶解在乙醇中。然后二者溶液混合，冰浴超声30min后，用透析袋(MWCO3500)在蒸馏水中室温透析12h，离心(3000rpm)15min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。
2、两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物纳米胶束中物理负载藤黄酸含量的测定
用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行藤黄酸的含量测定。流动相为甲醇∶水＝94∶6(v/v)，流动性用磷酸调pH至3.5。色谱柱为Lichrospher C18(150×4.6μm)，柱子粒径为5μm。流速为1.0mL/min，检测波长为360nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱温为30℃，注射样品体积为20μL。以公式(1)计算样品的物理包载药物载药量。结果见表7。
表7实施例1～5载藤黄酸的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物纳米胶束的表征
Claims (9)
1.一种生物病灶部位特异性释药的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物，其特征在于该偶联物是在多糖骨架上通过含二硫键的可特异性降解连接臂引入疏水性抗肿瘤药物，使多糖具有两亲性质，在水介质中可自组装为纳米胶束，该纳米胶束可另外负载抗肿瘤药物，亦可直接作为偶联物前药胶束使用。该纳米胶束负载药物到达病灶部位后，其二硫键连接臂可被病灶细胞内高浓度的还原性物质谷胱甘肽特异性降解，导致胶束解聚和药物的快速释放，作用于药效部位，提高病灶部位游离药物浓度、疗效和生物利用度。该偶联物结构如下列化学式所示：
其中：GLY为多糖分子，所述多糖GLY选自透明质酸、未分级肝素、低分子量肝素、脱硫酸化肝素、软骨素、多硫酸化软骨素、海藻酸、葡聚糖、真菌多糖、壳聚糖及其含有羧基、氨基或羟基的衍生物；
n+m为连接臂所含亚烷基个数，所述亚烷基个数n+m为2～16的整数；
D为疏水性抗肿瘤药物基团，所述疏水基团为含有羧基、氨基或羟基的抗肿瘤药物或含有羧基、氨基或羟基的抗肿瘤药物衍生物，抗肿瘤药物选自紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、喜树碱、羟基喜树碱、全反式维甲酸、9-顺式维甲酸、甲氨蝶呤、氨基蝶呤、齐墩果酸、熊果酸、藤黄酸、新藤黄酸、甘草酸、甘草次酸、长春碱、长春新碱；
R为多糖分子上疏水基团取代的个数，所述疏水基团取代的个数R为2～600的整数；
多糖分子GLY与连接臂通过酰胺键或酯键相连，连接臂和疏水性抗肿瘤药物D通过酰胺键或酯键相连。
2.如权利要求书1所述的生物病灶部位特异性释药的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物，其特征在于连接臂含有病灶部位特异性降解的二硫键，且两端的反应基团为氨基或羧基或一端反应基团为氨基另一端反应基团为羧基。
3.权利要求书1所述的生物体病灶部位特异性释药的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物的制备方法，其特征在于包括下列步骤：
(1)将含有羧基(氨基、羟基)的多糖或含有羧基(氨基、羟基)的多糖衍生物溶于反应溶剂中，采用含有二硫键且两端同为氨基(两端同为羧基、一端氨基一端羧基)的连接臂，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或EDC和1-羟基苯并三唑(HOBt)或EDC和4-二甲氨基吡啶(DMAP)为活化剂进行缩合反应，多糖与连接臂的一端发生酯化或酰胺化反应得到多糖中间体；将含有羧基(氨基、羟基)的疏水性抗肿瘤药物或含有羧基(氨基、羟基)的疏水性抗肿瘤药物衍生物溶于反应溶剂中，以二环己基碳化二亚胺(DCC)和NHS或EDC和NHS或EDC和HOBt或EDC和DMAP或DCC和DMAP为活化剂，疏水性抗肿瘤药物基团的羧基(氨基、羟基)进一步和多糖中间体连接臂上另一端羧基(氨基、羟基)缩合反应，即得具有生物体病灶部位特异性释药功能的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物载体；
(2)将含有羧基(氨基、羟基)的疏水性抗肿瘤药物或含有羧基(氨基、羟基)的抗肿瘤药物衍生物溶于反应溶剂中，采用含有二硫键且两端同为氨基(两端同为羧基、一端氨基一端羧基)的连接臂，以DCC和NHS或EDC和NHS或EDC和HOBt或EDC和DMAP或DCC和DMAP为活化剂进行缩合反应，疏水性抗肿瘤药物基团与连接臂的一端发生酯化或酰胺化反应得到抗肿瘤药物中间体；将含有羧基(氨基、羟基)的多糖或含有羧基(氨基、羟基)的多糖衍生物溶于反应溶剂中，以DCC和NHS或EDC和NHS或EDC和HOBt或EDC和DMAP或DCC和DMAP为活化剂，多糖的羧基(氨基、羟基)进一步和抗肿瘤药物中间体连接臂上另一端羧基(氨基、羟基)缩合反应，即得具有生物体病灶部位特异性释药功能的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物载体。
4.权利要求3所述的生物体病灶部位特异性释药的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物的制备方法，其特征在于所述反应溶剂为水、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、吡啶、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、丙酮、二甲基亚砜、甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮或其中任意两种溶剂的混合溶剂。
5.权利要求1或3所述的生物体病灶部位特异性释药的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物，其特征在于具有两亲性，在水介质中可自发形成纳米胶束。
6.权利要求1或3所述的生物体病灶部位特异性释药的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物的应用，用于血管内注射、肌肉注射、口服或外用。
7.权利要求1或3所述的生物体病灶部位特异性释药的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物的应用，用于制备血管内注射、肌肉注射、口服或外用的药学活性或药理活性分子的载药载体。
8.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于将如权利要求1所述的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物和药学活性或药理活性分子制成载药纳米胶束，所述的药学活性或药理活性分子选自：紫杉烷类、喜树碱类、长春碱类、维A酸类、蒽醌类、鬼臼毒素类、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、叶酸拮抗剂、藤黄酸类抗肿瘤药的任意一项。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于该负载药学活性或药理活性分子的生物体病灶部位特异性释药的两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物的制备方法包括以下步骤：两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物与水按重量比为1～50∶1000的比例溶解，得到多糖-抗肿瘤药物偶联物的纳米胶束；将治疗有效量的难溶或微溶于水的有机药物用药学上可接受的溶剂溶解后，与所述两亲性多糖-抗肿瘤药物偶联物的纳米胶束混合后，经超声或高压均质处理，溶液用透析法或超滤法或柱分离法除去有机溶剂和小分子，冻干制得粒径为10～1000nm的纳米载药胶束。
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