CN116622005A - 聚合物前药化合物及其制备方法和聚合物前药胶束及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及高分子药物技术领域，具体而言，涉及聚合物前药化合物及其制备方法和聚合物前药胶束及其制备方法。聚合物前药化合物的结构式如下所示：该聚合物前药化合物实现有效的肿瘤靶向，且延长循环时间，增加药物在肿瘤细胞的累积量，实现药物对肿瘤细胞的精准靶向以及增加药物在肿瘤组织的可控释放，避免了物理包裹所形成聚合物药物在生物体内循环过程中容易泄露等问题。
Description
技术领域
本发明涉及高分子药物技术领域，具体而言，涉及聚合物前药化合物及其制备方法和聚合物前药胶束及其制备方法。
背景技术
癌症已经成为严重危害世界人民生命和健康的疾病，其发病率和死亡率都很高。化学药物治疗仍是目前应用最为广泛的治疗手段，但传统的抗肿瘤药物由于缺乏选择性，在杀伤癌细胞的同时也对正常组织细胞造成伤害，引起多重并发症，限制了抗肿瘤药物在临床上的应用与发展。目前，纳米颗粒的药物递送载体在癌症治疗中已经取得极大的进展，尤其是聚合物前药胶束。这些聚合物前药胶束可以被动的积累在肿瘤组织中，具有高的稳定性且能药延长药物在血液中的循环时间。近几年，基于纳米药物的癌症治疗的主要潜在机制是与增强通透性和保留(EPR)效应相关的非特异性被动靶向治疗。然而，越来越多的研究表明，EPR效应虽然存在于小鼠等动物中，但由于肿瘤的异质性或肿瘤脉管系统缺乏开窗，在人体中发挥的作用不那么重要。配体-受体识别的特异性主动靶向在人类癌症治疗中能显示出比被动靶向更好的疗效，但由于主动靶向是基于配体与肿瘤细胞表面受体的识别和结合，因此其靶向作用会受到受体表达的影响。然而，肿瘤细胞的受体(表面标记物)随着肿瘤的发展的而呈现动态变化。此外，配体-受体的结合是一个可饱和的过程，因为受体的再循环和合成需要时间。这些因素会影响单药和纳米药物的给药效率，从而降低药物的疗效。因此，与单配体靶向可能导致不可控和波动的给药效率相比，双配体策略能在癌症治疗中能有更好的细胞选择性和更高的细胞摄取率。同时，根据不同的配体组合，可以达到不同的效果。这是由于结合两种靶向配体可以提高特定肿瘤细胞对纳米药物的选择性和摄取，为靶向参与肿瘤发展的不同细胞提供可能性，甚至同时实现细胞和器官的特异性靶向，实现将抗癌药物精确递送到其细胞内治疗活性部位，从而提高其抗肿瘤疗效。此外，也可将靶向配体与细胞穿透肽(CPPs)结合起来，用以进一步增强特定肿瘤细胞对纳米药物的摄取。因此，开发具有环境响应型特异性双靶向前药胶束是十分必要的。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供聚合物前药化合物及其制备方法和聚合物前药胶束及其制备方法。本发明实施例提供的聚合物前药化合物实现有效的肿瘤靶向，且延长循环时间，增加药物在肿瘤细胞的累积量，实现药物对肿瘤细胞的精准靶向以及增加药物在肿瘤组织的可控释放，避免了物理包裹所形成聚合物药物在生物体内循环过程中容易泄露等问题。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种聚合物前药化合物，其结构式如下所示：
其中，A选自聚乙二醇基团或其衍生基团、同时含烯基和羰基的复合基团或复合长链基团、同时含羰基和苯基的复合基团或复合长链基团、同时含胺基和羰基的复合基团或复合长链基团、同时含羰基和醚基的复合长链基团，同时含氨基酸残基和羰基的复合基团或复合长链基团、同时喊羰基、烯基、苯基、胺基、醚基和氨基酸残基中的至少一种基团和Su的复合基团或复合长链基团以及仅含羰基和亚烷基的复合基团或复合长链基团中的任意一种；
B选自含硫基团、含硒基团、含氨基酸残基基团和含胺基的基团中的任意一种；
Y选自N、O或C；
U选自抗肿瘤化合物；
m为8-17。
第二方面，本发明提供一种前述实施方式所述的聚合物前药化合物的制备方法，包括：
将叶酸与透明质酸进行反应形成中间体1；
将抗肿瘤化合物与含有B基团的物质反应，而后与含有A基团的化合物反应形成中间体2；
所述中间体1和所述中间体2反应形成所述聚合物前药化合物。
第三方面，本发明提供一种聚合物前药胶束，其通过前述实施方式所述的聚合物前药化合物制备得到。
第四方面，本发明提供一种前述实施方式所述的聚合物前药胶束的制备方法，包括：利用前述实施方式所述的聚合物前药化合物形成所述聚合物前药胶束。
第五方面，本发明提供一种抗肿瘤药剂，其包括前述实施方式所述的聚合物前药化合物或前述实施方式所述的聚合物前药胶束。
本发明具有以下有益效果：本发明实施例的聚合物前药化合物以透明质酸为主体，以环境响应敏感键以及聚乙二醇链或者氨基酸残基链或者纯碳链为架桥透明质酸和抗肿瘤化合物，并透明质酸的另一侧连接叶酸，能弥补单一透明质酸或者叶酸修饰的聚合物前药肿瘤靶向能力以及不可控和目标给药效率的不足的问题，且通过透明质酸和叶酸靶向肿瘤细胞表面CD44或FR受体的作用和EPR效应，增加药物在肿瘤细胞的累积量，减少抗肿瘤化合物的脱靶量，达到精准高效杀伤肿瘤的细胞的效果。同时，该聚合物前药化合物形成聚合物前药胶束时，抗肿瘤化合物包裹于胶束内部，而不会表现出毒副作用，在肿瘤微环境条件下高谷胱甘肽浓度，弱酸性等条件下会主动释放抗肿瘤化合物，实现药物的可控释放和精准杀伤肿瘤细胞的作用。且该聚合物前药胶束避免了物理包裹所形成聚合物药物在生物体内循环过程中容易泄露等问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1提供的化合物8的H-NMR图谱；
图2为本发明实施例1提供的化合物9的H-NMR图谱；
图3为本发明实施例2提供的化合物15的H-NMR图谱；
图4为本发明实施例2提供的化合物15的C-NMR图谱；
图5为本发明实施例2提供的化合物16的H-NMR图谱；
图6为本发明实施例3提供的化合物20的H-NMR图谱；
图7为本发明实施例3提供的化合物20的C-NMR图谱；
图8为本发明实施例3提供的化合物21的H-NMR图谱；
图9为本发明实施例4提供的化合物25的H-NMR图谱；
图10为本发明实施例4提供的化合物25的C-NMR图谱；
图11为本发明实施例4提供的化合物26的H-NMR图谱；
图12为本发明实施例1和2提供的FA-HA-SS-PPT和FA-HA-CC-PPT前药化合物的紫外光谱；
图13为本发明实施例1和2提供的FA-HA-SS-PPT和FA-HA-CC-PPT前药化合物的红外光谱；
图14为本发明实施例1和2提供的FA-HA-SS-PPT和FA-HA-CC-PPTT前药胶束的粒径图；
图15为本发明实施例1和2提供的FA-HA-SS-PPT和FA-HA-CC-PPTT前药胶束的透射电镜图；
图16为本发明实施例1和2提供的FA-HA-SS-PPT和FA-HA-CC-PPT的前药胶束药物释放曲线；
图17为本发明实施例1和2提供的FA-HA-SS-PPT和FA-HA-CC-PPT的前药胶束的溶血性测试评估；
图18为本发明实施例1提供的FA-HA-SS-PPT前药胶束的靶向性评估；
图19为本发明实施例1提供的FA-HA-SS-PPT前药胶束的体外细胞毒性抑制率曲线；
图20为本发明实施例1提供的FA-HA-SS-PPT前药胶束的体外细胞细胞增殖抑制作用图；
图21为本发明实施例1提供的FA-HA-SS-PPT前药胶束的体外细胞凋亡作用图；
图22为本发明实施例1提供的FA-HA-SS-PPT前药胶束的体内抗肿瘤作用图；
图23为本发明实施例提供的聚合物前药胶束的制备条件筛选的粒径图；
图24为本发明实施例5提供的化合物29的H-NMR图谱；
图25为本发明对比例1提供的化合物33的H-NMR图谱；
图26为本发明对比例2提供的化合物35的H-NMR图谱；
图27为本发明实施例1提供的化合物7的H-NMR图谱；
图28为本发明实施例1提供的化合物7的C-NMR图谱。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
脂溶性抗肿瘤化合物由于其水溶性差，选择性差，生物利用度低等问题造成的严重毒副作用，限制了脂溶性抗肿瘤化合物在肿瘤治疗中的应用。
而聚合物前药(polymer prodrug,polyprodrug)，通常是指药物与聚合物载体以化学键和的方式相连而构成，或由药物自身通过聚合反应组成的大分子前药。这样的聚合物前药通常能在水溶液中自组装成纳米颗粒，并能利用EPR效应实现药物的被动靶向，同时药物与载体相连的化学键通常是肿瘤微环境刺激响应性可断裂的，例如能响应肿瘤细胞内高水平的谷胱甘肽(GSH)的二硫键，三硫键，能响应肿瘤微环境低pH的碳酸酯键，腙键等，从而实现药物在肿瘤组织主动靶向性的释放与活化。与目前常用的物理包埋所形成的聚合物胶束相比，聚合物前药通过化学响应键将不同药物和聚合物载体紧密联系成一个整体，赋予其肿瘤微环境响应性的同时也增强了药物在体内的稳定性与可控性。具备上述的优点，聚合物前药被用于解决抗肿瘤药物现存的缺陷。
透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖组成的双糖单位反复交替连接形成的天然大分子酸性黏多糖，可与肿瘤细胞表面过表达的CD44受体特异性结合，具有良好的生物相容性、生物可降解性、受体结合性，无免疫原性和毒性，同时其结构中存在多种活性基团，可进行物理或化学修饰，制备具有不同性质的衍生物，可以作为一种比较理想的药物输送载体以及肿瘤靶向配体。
叶酸(folic acid，FA)，是一种水溶性B族维生素，也被称为维生素B9或蝶酰谷氨酸，是所有活细胞特别是一些生长繁殖较为快速的细胞生存所必需的物质，在DNA复制过程中扮演着非常重要的角色。由于叶酸受体在肿瘤细胞表面过表达，叶酸可通过叶酸受体介导的细胞内吞作用靶向进入肿瘤细胞。因此，利用叶酸作为靶向配体可以将多种药物有效载荷传递到叶酸受体阳性细胞，从而增强细胞对药物的摄取。
因此，本发明实施例提供一种聚合物前药化合物，其结构式如下所示：
其中，A选自聚乙二醇基团或其衍生基团、同时含烯基和羰基的复合基团或复合长链基团、同时含羰基和苯基的复合基团或复合长链基团、同时含胺基和羰基的复合基团或复合长链基团、同时含羰基和醚基的复合长链基团，同时含氨基酸残基和羰基的复合基团或复合长链基团、同时喊羰基、烯基、苯基、胺基、醚基和氨基酸残基中的至少一种基团和Su的复合基团或复合长链基团以及仅含羰基和亚烷基的复合基团或复合长链基团中的任意一种；B选自含硫基团、含硒基团、含氨基酸残基基团和含胺基的基团中的任意一种；Y选自N、O或C；U选自抗肿瘤化合物；m为8-17，例如m为8、9、10、11、12、13、14、15、16以及17等8-17之间的任意整数。
可见，本发明实施例提供的聚合物前药化合物以透明质酸为主体，一侧连接叶酸，弥补单一透明质酸或者叶酸修饰的聚合物前药肿瘤靶向能力以及不可控和目标给药效率的不足的问题，且使得聚合物前药化合物通过透明质酸和叶酸靶向肿瘤细胞表面CD44或FR受体的作用和EPR效应，增加药物在肿瘤细胞的累积量，减少抗肿瘤化合物的脱靶量，达到精准高效杀伤肿瘤的细胞的效果。采用不同的环境响应性(pH敏感，酶敏感，谷胱甘肽敏感等)连接键为架桥可通过响应肿瘤微环境中低的pH和高浓度的谷胱甘肽而控制释放药物，从而实现了高效的药物递送和强化的抗肿瘤效果。同时该聚合物前药化合物解决脂溶性抗肿瘤药物水溶性差，毒副作用大以及单配体靶向可能导致不可控和波动的目标给药效率等问题。可见，聚合物前药具有特异双靶向、可控释放药物、良好生物相容性以及精确靶向肿瘤等特点。
同时该聚合物前药化合物在自组装形成胶束时，亲脂的抗肿瘤化合物会被包裹于胶束内部而不会表现出毒副作用，在肿瘤微环境条件下高谷胱甘肽浓度，弱酸性等条件下会主动释放抗肿瘤化合物，实现药物的可控释放和精准杀伤肿瘤细胞的作用。且此种单一前药化合物形成的胶束避免了物理包裹所形成聚合物药物在生物体内循环过程中容易泄露等问题。
进一步地，A选自-CH2-(OCH2)n-CH2-、-CO-(CH2)n-CO-、-CH＝CH-CO-、-CH＝CH-(CH2)n-CO-、-CH(OH)-Ph-CO-、-CH(OH)-Ph-(CH2)n-CO-、-CH2-Ph-(CH2)n-CO-、--CH(OCH3)-Ph-CO-、-CH(OCH3)-Ph-(CH2)n-CO-、-CO-NH-CO-、-CO-NH-(CH2)n-CO-、-CH2-CH＝CH-CO-、-CH2-CH＝CH-(CH2)n-CO-、-CO-(CH2)n-、-(CH2)n-CO-、-CO-O-(CH2)n-CO-、-SO2-Ph-CO-、-SO2-Ph-(CH2)n-CO-、-CO-O-PAB-Cit-Val-CO-(CH2)n-CO-、-CO-O-PAB-Lys-Phe-CO-(CH2)n-CO-、-CO-(CH2)n--Su-、-CH＝CH-Su-、-CH＝CH-(CH2)n-Su-、-CH(OH)-Ph-Su-、-CH(OH)-Ph-(CH2)n-Su-、-CH2-Ph-(CH2)n-Su-、-CO-NH-Su-、-CO-NH-(CH2)n-Su-、-CH2-CH＝CH-Su-、-CH2-CH＝CH-(CH2)n-Su-、-CO-(CH2)n-、-(CH2)n-Su-、-CO-O-(CH2)n-Su-、-SO2-Ph-Su-、-SO2-Ph-(CH2)n-Su-、-CO-O-PAB-Cit-Val-CO-(CH2)n-Su-、-CO-O-PAB-Lys-Phe-CO-(CH2)n-Su-中的任意一种，其中1≤n≤14；优选为1≤n≤7；例如，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、、11、12、13以及14等1-14之间的任意数值。
且A中(CH2)n还含有取代(CH2)n中一个或多个氢的直链或支链饱和烷基、不饱和烷基、芳烷基和烷基芳烷基、芳香烃、卤素、杂原子基团、杂环取代基，所述饱和烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基或庚基；所述不饱和烷基包括但不限于乙烯基、1-丙烯基、烯丙基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基，或其E、Z的异构体，乙炔基、丙炔基、2-丁炔基；芳烷基和烷基芳烷基的示例包括但不限于苄基、二苯甲基、甲苯基甲基、三苯甲基、肉桂基、苯乙基、苯乙烯基、苯基丁基、新苯基、苯炔基、苯乙炔基；所述芳香基包括但不限于苯基、二苯基、甲苯基、甲苄基、2,4,6-三甲苯基、(叔丁基)苯基、蒽基、茚基、萘基、卤代芳基、卤代芳烷基苯氧基、甲苯氧基、二甲苯基氧基、二苯基、苯胺基、甲苯氨基、甲苯磺酰基、烯丙苄基或苯基、呋喃基、吡啶基、2-吡啶基(吡啶-2-基)、吲哚-1-基、氯甲基苄基或苯基、三氟甲基苄基或苯基、羟基苄基或苯基、甲氧基苄基或苯基、乙氧基苄基或苯基、甲氧基乙氧基苄基或苯基、烯丙氧基苄基或苯基、苯氧基苄基或苯基、乙酰氧基苄基或苯基、苯甲酰氧基苄基或苯基、甲硫基苄基或苯基、苯硫基苄基或苯基、甲苯硫基苄基或苯基、甲基氨基苄基或苯基、二甲基氨基苄基或苯基、乙基氨基苄基或苯基、二乙基氨基苄基或苯基、乙酰氨基苄基或苯基、羧基苄基或苯基、甲氧羰基苄基或苯基、乙氧羰基苄基或苯基、苯氧基羰基苄基或苯基、氯代苯氧基羰基苄基或苯基、N-环己基氨基甲酰氧基苄基或苯基、烯丙氧基羰基苄基或苯基、氨甲酰基苄基或苯基、N-甲基氨甲酰基苄基或苯基、N,N-二丙基氨甲酰基苄基或苯基、N-苯氨基甲酰基苄基或苯基、硝基苄基或苯基、氰基苄基或苯基、硫代苄基或苯基、硫酸根苄基或苯基、膦酰基苄基或苯基、磷酸根苄基或苯基、和吗啉代苄基或苯基等；所述卤素包括氟、氯、溴或碘；所述杂原子包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、甲硫基、乙硫基、正丙硫基、异丙硫基、正丁硫基、异丁硫基、叔丁硫基、甲亚磺酰基、乙亚磺酰基、异丙亚磺酰基、甲磺酰基、乙磺酰基、异丙磺酰基；所述杂环包括但不限于吡啶基、喹啉基、噻吩基、呋喃基、噁唑基、四唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基或吲哚基。
B选自-S-S-S-、-S-S-、-S-、-Se-Se-、-Se-、-C＝N-NH-和-CO-O-PAB-Cit-Val-CO-(CH2)n--CO-中的任意一种。
U选自现有脂溶性抗肿瘤化合物，例如，包括但不限于鬼臼毒素、羟基喜树碱、紫杉醇、长春花碱、去甲长春花碱、甲氨蝶呤和培美曲塞中的任意一种。
本发明实施例以鬼臼毒素作为抗肿瘤化合物，但是可以理解的是，其他的抗肿瘤化合物形成的上述结构的聚合物前药化合物也在本发明实施例的保护范围内。
具体地，其选自下述结构式所示的化合物：
其中，A、B、Y和m的选择参照上述A、B和Y的选择。
进一步地，聚合物前药化合物选自下述结构式所示的化合物中的任意一种：
其中，n为1-14，优选为7-14；例如，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13以及14等1-14之间的任意数值。m为8-17，例如，8、9、10、11、12、13、14、15、16以及17等8-17之间的任意数值。
具体地，FA-HA-CC-PPT通过响应肿瘤微环境中低的pH而可控的释放药物，FA-HA-SS-PPT可通过响应肿瘤微环境中低的pH和高浓度的谷胱甘肽而控制释放药物，从而实现了高效的药物递送和强化的抗肿瘤效果。
第二方面，本发明实施例提供一种上述聚合物前药化合物的制备方法，本发明实施例从透明质酸、叶酸和抗肿瘤化合物；例如鬼臼毒素为原料出发先将叶酸和透明质酸通过化学键合的方式连接形成具有CD44/FR双靶向的FA-HA偶合物，再将抗肿瘤化合物通过肿瘤环境响应连接键修饰过后与FA-HA通过酰胺键相连得到环境响应型CD44/FR双靶向鬼臼毒素纳米前药化合物，具体包括：参照下述合成路径进行合成：
将叶酸与透明质酸进行反应形成中间体1；
将抗肿瘤化合物与含有B基团的物质反应，而后与含有A基团的化合物反应形成中间体2；
所述中间体1和所述中间体2反应形成所述聚合物前药化合物。
本发明实施例的聚合物前药化合物的制备方法中环境响应敏感键以及聚乙二醇链等链(即含A基团的化合物)先与抗肿瘤化合物结合，而后才能与透明质酸键合，若是现将环境响应敏感键以及聚乙二醇链等链(即含A基团的化合物)先与叶酸修饰的透明质酸键合，再与抗肿瘤药物结合的话，抗肿瘤药物无法接枝成功，即无法成功得到聚合物前药化合物。
例如具体可以参照下述合成路径图：
其中Y＝C或O，A＝S或C，B＝-COO-或-COO-CH2-CH2-COO-
具体地，形成中间体1的步骤包括：将叶酸、CDI和DMSO混合反应，而后与透明质酸、DMAP和酰胺类溶液混合反应24-26小时；反应后进行透析。本发明实施例提供的中间体1的制备过程中缩合剂的选择对产品的纯度影响极大，若采用DCC和EDCI作为缩合剂，叶酸的反应率低，且会有叶酸固体和副产物析出，DCC副产物不容易透析除去，而用CDI做缩合剂反应叶酸反应能达到80％左右，且无叶酸沉淀。
形成所述聚合物前药化合物的步骤包括：将所述中间体1和酰胺类溶液混合，而后与所述中间体2、DMSO、4-PPy、CDI和DMAP在40-45℃条件下反应48-52小时。该步骤中反应温度不易过高，过高的反应温度，例如60℃，叶酸与抗肿瘤化合物前药可能会有所断裂，导致抗肿瘤呼化合物的接枝率下降。
第三方面，本发明实施例提供一种聚合物前药胶束，其通过上述所述的聚合物前药化合物制备得到。该聚合物前药胶束粒径较小，均一。
第四方面，本发明实施例提供一种聚合物前药胶束的制备方法，包括：利用上述的聚合物前药化合物形成所述聚合物前药胶束。聚合物前药化合物在水溶液中自组装形成粒径较小(在100nm以内)，且均一分散的胶束(PDI在0.3以下)，进一步提高了抗肿瘤药物的水溶性和生物相容性。
具体地，将所述聚合物前药化合物和水混合，而后超声，再静置；优选地，2.5mg聚合物前药化合物对应2.2-2.5ml水，超声时间为5-6分钟。
本发明实施例中若不采用超声所得的聚合物胶束普遍粒径较大，经过超声破碎过后粒径有所变小，但随着功率的增大和时间的增加其粒径又会变大，可能是由于其中胶束的聚集以及将胶束打碎，因此，选择上述超声时间和功率，得到的聚合物前药胶束粒径适宜。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本发明提供一种聚合物前药胶束的制备方法，包括：
参照下述合成路线合成聚合物前药化合物(记为FA-HA-SS-PPT)：
具体如下：
化合物1的合成：室温条件下，取巯基乙醇(500mg,6.40mmol,1eq)与二硫二吡啶(705mg,3.20mmol,0.5eq)溶于50ml的无水甲醇中，并逐滴滴加1.5ml醋酸。溶液有无色变为黄色，室温反应8h。点板和LC-MS检测反应不在进行，旋干甲醇，用二氯甲烷溶解并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，合并有机相。有机相用无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩得到粗品，将粗品过硅胶柱纯化得到无色液体化合物1。HRMS(ESI)m/z caled for C4H10O2S2Na[M+Na]+177.0019,found 177.0013。
化合物2的合成：在氮气条件下，将叔丁二甲基氯硅烷(3.51g，23.29mmol，1.2eq)滴加入化合物1(3.00g，19.45mmol，1eq)和咪唑(2.80g，41.23mmol，2.1eq)的THF(50mL)混合溶液中，在冰浴条件搅拌4小时。然后用水淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，收集有机相，有机相用无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩得到粗品，将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物2，为无色液体。HRMS(ESI)m/z caled for C10H24O2S2SiNa[M+Na]+:291.0887found 291.0882。
化合物3的合成：在氮气条件下，将N,N'-二异丙基乙胺(DIPEA)(2.51g，19.40mmol，2eq)和化合物3(2.60g，9.70mmol，1eq)用干燥二氯甲烷(80mL)溶解于圆底烧瓶中。然后将溶解于二氯甲烷溶解的双(对硝基苯)碳酸酯(5.90g，19.40mmol，2eq)溶液缓慢滴入上述混合溶液中，并在室温下搅拌过夜。点板和LC-MS检测反应结束，用盐酸水溶液(0.2mol/L，20mL)洗涤溶液，用二氯甲烷(30mL)萃取水层三次，合并有机相，减压去除溶剂，浓缩得到粗品。将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物3，为淡黄色液体。HRMS(ESI)m/zcaled for C17H27NO6S2SiNa[M+Na]+:456.0949,found 456.0944。
化合物4的合成：在氮气条件下，将4-二甲基氨基吡啶(1.48g，12.08mmol，2eq)用二氯甲烷溶解于圆底烧瓶中，然后将化合物3(3.00g，6.03mmol，1.5eq)和鬼臼毒素(2.50g,5.78mmol,1eq)用注射器同时缓慢滴加入圆底烧瓶中，室温下搅拌过夜。点板和LC-MS检测反应结束，用盐酸水溶液(0.2mol/L，20mL×2)淬灭反应，分离出有机相。用二氯甲烷(30mL)提取水层两次，有机相用无水硫酸钠上干燥，减压去除溶剂，浓缩得到粗品。将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物4，为白色固体。HRMS(ESI)m/z caled for C33H44O11S2SiNa[M+Na]+:713.1994,found 731.1989。
化合物5的合成：将化合物4(2.96g,4.17mmol,1eq)用蒸馏出的THF(10mL)溶解于圆底烧瓶中，之后在冰浴条件下，逐滴将Et3N·3HF(3.37g,20.88mmol,5eq)加入圆底烧瓶中，室温搅拌5-6小时。点板和LC-MS检测反应结束，旋干THF后，用二氯甲烷溶解并用水洗涤，合并有机相，有机相用无水硫酸钠上干燥，减压去除溶剂，浓缩得到粗品。将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物5，为白色固体。HRMS(ESI)m/z caled for C27H30O11S2Na[M+Na]+:617.1130,found 617.1119。
化合物6的合成将HOOC-PEG8-NH2-FMOC(200mg,0.03mmol,1eq)和化合物5(200mg，0.33mmol，1.1eq)用二氯甲烷溶解于圆底烧瓶中，搅拌三分钟之后加入EDCI(115mg,0.61mmol,2eq)和DMAP(18mg,0.15mmol,0.5eq)。室温下搅拌4-5小时。点板和LC-MS检测反应结束，用二氯甲烷和食盐水萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠上干燥，减压去除溶剂，浓缩得到粗品。将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物6，为白色固体。HRMS(ESI)m/zcaled for C61H77NO22S2Na[M+Na]+:1262.4279,found 1262.4293。
化合物7的合成：将化合物6用二氯甲烷(10mL)溶解于圆底烧瓶中，之后加入10μLDBU，室温搅拌1-2小时。点板和LC-MS检测反应结束，用二氯甲烷和食盐水萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠上干燥，减压去除溶剂，浓缩得到粗品。将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物7，为无色液体。HRMS(ESI)m/z caled for C46H67NO20S2H[M+H]+:1018.3778,found 1018.3776。
化合物8的合成：将叶酸(FA)(49mg,0.112mmol,4eq)、N,N'-羰基二咪唑(CDI)用二甲基亚砜(DMSO)溶解于圆底烧瓶中，常温反应1-2小时，之后将透明质酸(HA)(200mg，0.028mmol,相当于0.486mmol-COOH基团)和DMAP用甲酰胺溶解后加入圆底烧瓶中，常温反应24-48小时，反应结束后，将所得混合物放入透析袋(3000Da)中用去离子水透析，每六小时换一次水，换三次，后过滤、冻干，获得化合物8，为淡黄色固体。
化合物9的合成：将化合物8(50mg,0.007mmol,)和CDI用甲酰胺溶解于圆底烧瓶中室温搅拌一小时，之后将化合物7、4-PPy和DMAP用DMSO溶解后加入反应瓶中，在40℃下反应48小时，反应结束后，将所得混合物放入透析袋(3000Da)中用去离子水透析，每六小时换一次水，换三次，后过滤、冻干，获得化合物9(FA-HA-SS-PPT)，为淡黄色固体。
FA-HA-SS-PPT聚合物前药胶束的制备：
取化合物9(2.5mg)溶解在纯水(2mL)中，用超声细胞破碎仪(功率为20w,处理5min,每五秒一次)，使其均匀分散，静置半小时，即得FA-HA-SS-PPT前药胶束。
实施例2
本发明提供一种聚合物前药胶束的制备方法，包括：
参照下述合成路线合成聚合物前药化合物(记为FA-HA-CC-PPT)：
具体如下：
化合物10的合成：在氮气条件下，将叔丁二甲基氯硅烷(4.59g,30.46mmol,1.2eq)滴加入1,6己二醇(3.00g,25.38mmol,1eq)和咪唑(2.80g,41.23mmol,2.1eq)的THF(50mL)混合溶液中，在冰浴条件搅拌4小时。然后用水淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，收集有机相，有机相用无水Na2SO4干燥、过滤、浓缩得到粗品，将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物10，为无色液体。HRMS(ESI)m/z caled for C12H28O2SiNa[M+Na]+:255.1759,found255.1748。
化合物11的合成：在氮气条件下，将N,N'-二异丙基乙胺(DIPEA)(1.34g,10.35mmol,2eq)和化合物10(1.20g,5.17mmol,1eq)用干燥二氯甲烷(80mL)溶解于圆底烧瓶中。然后将溶解于二氯甲烷溶解的双(对硝基苯)碳酸酯(3.15g,10.35mmol,2eq)溶液缓慢滴入上述混合溶液中，并在室温下搅拌过夜。点板和LC-MS检测反应结束，用盐酸水溶液(0.2mol/L，20mL)洗涤溶液，用二氯甲烷(30mL)萃取水层三次，合并有机相，减压去除溶剂，浓缩得到粗品。将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物11，为淡黄色液体。HRMS(ESI)m/zcaled for C19H31NO6SiNa[M+Na]+:420.1821,found 420.1808。
化合物12的合成：在氮气条件下，将4-二甲基氨基吡啶(448mg,3.66mmol,2eq)用二氯甲烷溶解于圆底烧瓶中，然后将化合物11(800mg,2.01mmol,1.1eq eq)和鬼臼毒素(760mg,1.83mmol,1eq)用注射器同时缓慢滴加入圆底烧瓶中，室温下搅拌过夜。点板和LC-MS检测反应结束，用盐酸水溶液(0.2mol/L，20mL×2)淬灭反应，分离出有机相。用二氯甲烷(30mL)提取水层两次，有机相用无水硫酸钠上干燥，减压去除溶剂，浓缩得到粗品。将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物12，为白色固体。HRMS(ESI)m/z caled for C35H48O11SiNa[M+Na]+:695.2866,found 695.2863。
化合物13的合成：将化合物12(2.96g,4.17mmol,1eq)用蒸馏出的THF(10mL)溶解于圆底烧瓶中，之后在冰浴条件下，逐滴将Et3N·3HF(3.37g,20.88mmol,5eq)加入圆底烧瓶中，室温搅拌5-6小时。点板和LC-MS检测反应结束，旋干THF后，用二氯甲烷溶解并用水洗涤，合并有机相，有机相用无水硫酸钠上干燥，减压去除溶剂，浓缩得到粗品。将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物13，为白色固体。HRMS(ESI)m/z caled for C29H34O11Na[M+Na]+:582.2001,found 581.1982。
化合物14的合成：将HOOC-PEG8-NH2-FMOC(100mg,0.15mmol,1eq)和化合物13(100mg,0.17mmol,1.1eq)用二氯甲烷溶解于圆底烧瓶中，搅拌三分钟之后加入EDCI(57mg,0.30mmol,2eq)和DMAP(10mg,0.08mmol,0.5eq)。室温下搅拌4-5小时。点板和LC-MS检测反应结束，用二氯甲烷和食盐水萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠上干燥，减压去除溶剂，浓缩得到粗品。将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物14，为白色固体。HRMS(ESI)m/zcaled for C63H81NO22Na[M+Na]+:1226.5150,found 1226.5114。
化合物15的合成：将化合物14用二氯甲烷(10mL)溶解于圆底烧瓶中，之后加入10μL DBU，室温搅拌1-2小时。点板和LC-MS检测反应结束，用二氯甲烷和食盐水萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠上干燥，减压去除溶剂，浓缩得到粗品。将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物15，为无色液体。HRMS(ESI)m/z caled for C48H71NO20H[M+Na]+:982.4649,found 982.4612。
化合物16的合成：将化合物8(50mg,0.06mmol)和CDI用甲酰胺溶解于圆底烧瓶中室温搅拌一小时，之后将化合物15、4-PPy和DMAP用DMSO溶解后加入反应瓶中，在40℃下反应48小时，反应结束后，将所得混合物放入透析袋(3000Da)中用去离子水透析，每六小时换一次水，换三次，后过滤、冻干，获得化合物16(FA-HA-CC-PPT)，为淡黄色固体。
FA-HA-CC-PPT聚合物前药胶束的制备：
取化合物16(2.5mg)溶解在纯水(2mL)中，用超声细胞破碎仪(功率为20w,处理5min,每五秒一次)，使其均匀分散，静置半小时，即得FA-HA-CC-PPT前药胶束。
实施例3
本发明提供一种聚合物前药胶束的制备方法，包括：
参照下述合成路线合成聚合物前药化合物(记为FA-HA-SSC-PPT)：
化合物17的合成：将鬼臼毒素(500mg,1.2mmol,1eq)和3,3'-二硫二丙酸(1009mg,4.8mmol,4eq)用二氯甲烷溶解于圆底烧瓶中，搅拌三分钟之后加入EDCI(920mg,4.8mmol,4eq)和DMAP(73mg,0.6mmol,0.5eq,)。室温下搅拌4-5小时。点板和LC-MS检测反应结束，用二氯甲烷和食盐水萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠上干燥，减压去除溶剂，浓缩得到粗品。将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物17，为白色固体。HRMS(ESI)m/zcaled forC30H34O12S2Na[M+H]+:593.2001,found 593.1974。
化合物18的合成：将化合物17(300mg,0.53mmol,1eq))和乙二醇(130mg,2.11mmol,4eq)用二氯甲烷溶解于圆底烧瓶中，搅拌三分钟之后加入EDCI(203mg,1.06mmol,2eq)和DMAP(33mg,0.27mmol,0.5eq)。室温下搅拌4-5小时。点板和LC-MS检测反应结束，用二氯甲烷和食盐水萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠上干燥，减压去除溶剂，浓缩得到粗品。将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物18，为白色固体。HRMS(ESI)m/zcaled for C30H34O12S2Na[M+Na]+:637.2260,found 637.2251。
化合物19的合成：将HOOC-PEG8-NH2-FMOC(100mg,0.15mmol,1eq)和化合物18(104mg,0.17mmol,1.1eq)用二氯甲烷溶解于圆底烧瓶中，搅拌三分钟之后加入EDCI(57mg,0.30mmol,2eq)和DMAP(10mg,0.08mmol,0.5eq)。室温下搅拌4-5小时。点板和LC-MS检测反应结束，用二氯甲烷和食盐水萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠上干燥，减压去除溶剂，浓缩得到粗品。将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物19，为白色固体。HRMS(ESI)m/zcaled for C30H34O12S2Na[M+Na]+:1282.5409,found 1282.5408。
化合物20的合成：将化合物19用二氯甲烷(10mL)溶解于圆底烧瓶中，之后加入10μL DBU，室温搅拌1-2小时。点板和LC-MS检测反应结束，用二氯甲烷和食盐水萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠上干燥，减压去除溶剂，浓缩得到粗品。将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物20，为无色液体。HRMS(ESI)m/z caled for C30H34O12S2H[M+H]+:1038.4912,found 1038.4907。
化合物21的合成：将化合物8(50mg,0.046mmol)和CDI用甲酰胺溶解于圆底烧瓶中室温搅拌一小时，之后将化合物20、4-PPy和DMAP用DMSO溶解后加入反应瓶中，在40℃下反应48小时，反应结束后，将所得混合物放入透析袋(3000Da)中用去离子水透析，每六小时换一次水，换三次，后过滤、冻干，获得化合物21(FA-HA-SSC-PPT)，为淡黄色固体。
FA-HA-SSC-PPT聚合物前药胶束的制备：
取化合物21(2.5mg)溶解在超纯水(2mL)中，用超声细胞破碎仪(功率为20w,处理5min,每五秒一次)，使其均匀分散，静置半小时，即得FA-HA-SSC-PPT前药胶束。
实施例4
本发明提供一种聚合物前药胶束的制备方法，包括：
参照下述合成路线合成聚合物前药化合物(记为FA-HA-CCC-PPT)：
具体如下：
化合物22的合成：将鬼臼毒素(500mg,1.2mmol,1eq)和1,8辛二酸(835mg,4.8mmol,4eq)用二氯甲烷溶解于圆底烧瓶中，搅拌三分钟之后加入EDCI(920mg,4.8mmol,4eq)和DMAP(73mg,0.6mmol,0.5eq)。室温下搅拌4-5小时。点板和LC-MS检测反应结束，用二氯甲烷和食盐水萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠上干燥，减压去除溶剂，浓缩得到粗品。将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物22，为白色固体。HRMS(ESI)m/z caled forC28H3O11S2Na[M+Na]+:629.1130,found 629.1110。
化合物23的合成：将化合物22(300mg,0.47mmol,1eq)和乙二醇(292mg,4.7mmol,10eq)用二氯甲烷溶解于圆底烧瓶中，搅拌三分钟之后加入EDCI(180mg,0.94mmol,2eq)和DMAP(29mg,0.24mmol,0.5eq)。室温下搅拌4-5小时。点板和LC-MS检测反应结束，用二氯甲烷和食盐水萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠上干燥，减压去除溶剂，浓缩得到粗品。将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物23，为白色固体。HRMS(ESI)m/z caled forC30H34O12S2Na[M+Na]+:673.1392,found 673.1390。
化合物24的合成：将HOOC-PEG8-NH2-FMOC(100mg,0.15mmol,1eq)和化合物23(108mg,0.17mmol,1.1eq)用二氯甲烷溶解于圆底烧瓶中，搅拌三分钟之后加入EDCI(58mg,0.30mmol,2eq)和DMAP(10mg,0.08mmol,0.5eq)。室温下搅拌4-5小时。点板和LC-MS检测反应结束，用二氯甲烷和食盐水萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠上干燥，减压去除溶剂，浓缩得到粗品。将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物24，为白色固体。HRMS(ESI)m/zcaled for C64H81NO23S2Na[M+Na]+:1318.4541found 1318.4502。
化合物25的合成：将化合物24用二氯甲烷(10mL)溶解于圆底烧瓶中，之后加入10μL DBU，室温搅拌1-2小时。点板和LC-MS检测反应结束，用二氯甲烷和食盐水萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠上干燥，减压去除溶剂，浓缩得到粗品。将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物25，为无色液体。HRMS(ESI)m/z caled for C30H34O12S2H[M+H]+:1074.4040,found 1074.4051。
化合物26的合成：将化合物8(50mg,0.046mmol)和CDI用甲酰胺溶解于圆底烧瓶中室温搅拌一小时，之后将化合物25、4-PPy和DMAP用DMSO溶解后加入反应瓶中，在40℃下反应48小时，反应结束后，将所得混合物放入透析袋(3000Da)中用去离子水透析，每六小时换一次水，换三次，后过滤、冻干，获得化合物26(FA-HA-CCC-PPT)，为淡黄色固体。
FA-HA-CCC-PPT聚合物前药胶束的制备：
取化合物26(2.5mg)溶解在超纯水(2mL)中，用超声细胞破碎仪(功率为20w,处理5min,每五秒一次)，使其均匀分散，静置半小时，即得FA-HA-CCC-PPT前药胶束。
实施例5
本发明提供一种聚合物前药胶束的制备方法，包括：
参照下述合成路线合成聚合物前药化合物(记为FA-HA-C-PPT)：
化合物27的合成：将鬼臼毒素(500mg,1.2mmol,1eq)和Fmoc-11-氨基十一酸(361mg,4.8mmol,1.5eq)用二氯甲烷溶解于圆底烧瓶中，搅拌三分钟之后加入EDCI(460mg,4.8mmol,2eq)和DMAP(73mg,0.6mmol,0.5eq)。室温下搅拌4-5小时。点板和LC-MS检测反应结束，用二氯甲烷和食盐水萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠上干燥，减压去除溶剂，浓缩得到粗品。将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物27，为白色固体。HRMS
(ESI)m/z caled for C48H53NO11H[M+H]+:819.3619,found 819.3621。
化合物28的合成：将化合物27用二氯甲烷(10mL)溶解于圆底烧瓶中，之后加入10μL DBU，室温搅拌1-2小时。点板和LC-MS检测反应结束，用二氯甲烷和食盐水萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠上干燥，减压去除溶剂，浓缩得到粗品。将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物28，为无色液体。HRMS(ESI)m/z caled forC33H43O9H[M+H]+:598.2971,found598.2974。
化合物29的合成：将化合物8(50mg,0.046mmol)和CDI用甲酰胺溶解于圆底烧瓶中室温搅拌一小时，之后将化合物28、4-PPy和DMAP用DMSO溶解后加入反应瓶中，在40℃下反应48小时，反应结束后，将所得混合物放入透析袋(3000Da)中用去离子水透析，每六小时换一次水，换三次，后过滤、冻干，获得化合物29
(FA-HA-C-PPT)，为淡黄色固体。
具体合成条件类似实施例1，本实施例不再详述。
表征
对实施例1-6和对比例1-2中的化合物以及胶束进行表征，表征结果参见图1-图11以及图24-28。
根据化合物8的核磁氢谱图(图1)可知，在化学位移7.81-7.99归属于叶酸的碟啶环上的氢，6.76-6.66和7.30归属于叶酸上苯环的氢，说明叶酸已经成功接在了HA的链上，化合物8核磁表征是将实施例1中的制得化合物8固体(10mg)溶解在氘代水(0.6mL)中进行核磁氢谱表征。
根据实施例1的FA-HA-SS-PPT(图2)和实施例2的FA-HA-CC-PPT(图5)的核磁氢谱，在化学位移2.8处的信号峰属于聚乙二醇(-OCH2-)亚甲基的信号峰，表明聚乙二醇链接到HA上。化学位移5.8-7.25归属于PPT苯环上的氢信号峰，证明在获得的FA-HA-SS-PPT中存在PPT，同时7.9-8.1归属于叶酸上碟啶环上的氢，得出叶酸成功引入HA链上。同理，对于FA-HA-CC-PPT，除了出现化学位移5.8～7.25的PPT苯环上的氢的信号峰，2.8处的信号峰属于聚乙二醇(-OCH2-)亚甲基的信号峰，在7.9-8.1也有属于叶酸上碟啶环上的氢，获得的FA-HA-CC-PPT也在HA链上成功引入了PPT和叶酸。FA-HA-SS-PPT和FA-HA-CC-PPT的核磁表征是分别将实施例1中制得的FA-HA-SS-PPT或实施例2制得的FA-HA-CC-PPT前药化合物(10mg)溶在氘代水(0.6mL)中进行核磁氢谱表征。
FA-HA-SS-PPT和FA-HA-CC-PPT前药化合物的紫外表征
将实施例1制得的FA-HA-SS-PPT或实施例2制得的FA-HA-CC-PPT前药化合物与透明质酸，鬼臼毒素分别用超纯水溶解后，在200-700nm范围内扫描并将进行紫外表征，见图12，两种聚合物前药均在在278-281nm处有最高的紫外吸收，同时PPT在285-290处有最大的吸收，两个吸收相近，有一点差距可能是因为连接在HA上的PPT是经过修饰的，表明PPT已经成功接在HA链上。
FA-HA-SS-PPT和FA-HA-CC-PPT前药化合物的红外表征
将实施例1制得的FA-HA-SS-PPT或实施例2制得的FA-HA-CC-PPT前药化合物(1-2mg)与溴化钾固体粉末(100-200mg)混合研磨均匀、压片，在4000–500cm-1范围内扫描并进行红外表征，见图13。FA-HA-SS-PPT红外光谱与HA红外光谱比较在1700cm-1处出现新的酯键的特征峰，在1650cm-1，1600cm-1处出现酰胺键的特征峰，1260cm-1，960cm-1，650cm-1处出现鬼臼毒素与叶酸的苯环特征峰，2900cm-1，2845cm-1峰为PEG的C-H特征峰，FA-HA-CC-PPT红外光谱与HA红外光谱比较在1700cm-1处出现新的酯键的特征峰，在1650cm-1,1420cm-1处出现酰胺键的特征峰，1150cm-1，960cm-1处出现苯环特征峰，2900cm-1，2845cm-1峰为PEG的C-H特征峰，表明叶酸与鬼臼毒素已经成功接在HA上，在1300～1250cm-1处出现酯键(-CO-O-)的特征信号峰，1650cm-1及1560cm-1处为酰胺键的特征信号峰(-NH-CO-)，920～720出现苯环特征信号峰，表明合成目标产物。
FA-HA-SS-PPT前药胶束和FA-HA-CC-PPT前药胶束的粒径表征
将实施例1制得的FA-HA-SS-PPT或实施例2制得的FA-HA-CC-PPT前药用超纯水配为浓度为1mg/mL的稀溶液得到聚合物前药胶束，采用动态光散色法测定两种前药胶束的粒径分布以及电位，见图14，其中FA-HA-SS-PPT前药胶束，粒径大约在69.66nm左右，PDI为0.252，Zeta电位为-18.7mV，FA-HA-CC-PPT聚合物前药胶束，粒径大约在89.18nm,PDI为0.192，Zeta电位为-15.3mV，这是由于透明质酸分子上有大量的羧基基团，在中性溶液中这些基团容易解离成-COO-基团，该基团使复合体带有微量负电，纳米微球具有较好的稳定性，在缓冲溶液中能长时间降解。该粒径可以自由通过组织毛细血管(毛细血管的直径一般为6-8μm)。同时，对比两种聚合物前药胶束可以发现，带有二硫键的聚合物前药胶束形成的聚合物胶束更小，分布更均匀。
HA-NH-CO-PPT和HA-S-S-PPT前药胶束的形貌表征
将实施例1制得的FA-HA-SS-PPT和实施例2制得的FA-HA-CC-PPT前药胶束，用透射电镜表征形貌及粒径，见图15，FA-HA-SS-PPT和FA-HA-CC-PPT前药胶束基本呈球形或者椭球形，且分布均匀。
合成工艺优化：
(1)合成化合物8的条件筛选：
方案一：将叶酸(FA)(49mg,0.112mmol,4eq)、EDCI(21.392mg,0.112mmol,4eq)用二甲基亚砜(DMSO)溶解于圆底烧瓶中，常温反应1小时，之后将透明质酸(HA)(200mg，0.028mmol,相当于0.486mmol-COOH基团)和DMAP(6.28mg,0.056mmol,2eq)用甲酰胺溶解后加入圆底烧瓶中，常温反应12小时，反应结束后，将所得混合物放入透析袋(3000Da)中用去离子水透析，每六小时换一次水，换三次，后过滤、冻干，获得化合物8，为淡黄色固体，通过核磁谱图预估叶酸反应率为35％，反应过程有较多叶酸固体析出。
方案二：将叶酸(FA)(49mg,0.112mmol,4eq)、DCC(25mg,0.112mmol,4eq)用二甲基亚砜(DMSO)溶解于圆底烧瓶中，常温反应1小时，之后将透明质酸(HA)(200mg，0.028mmol,相当于0.486mmol-COOH基团)和三乙胺(7.78uL,0.056mmol,2eq)用甲酰胺溶解后加入圆底烧瓶中，常温反应12小时，反应结束后，将所得混合物放入透析袋(3000Da)中用去离子水透析，每六小时换一次水，换三次，后过滤、冻干，获得化合物8，为淡黄色固体，通过核磁谱图预估叶酸反应率为45％，反应过程中只有少量叶酸固体析出，但有较多的白色固体产生，为DCC的脲类副产物。
方案三：将叶酸(FA)(49mg,0.112mmol,4eq)、CDI(18mg,0.112mmol,4eq)用二甲基亚砜(DMSO)溶解于圆底烧瓶中，常温反应1小时，之后将透明质酸(HA)(200mg，0.028mmol,相当于0.486mmol-COOH基团)和DMAP(6.28mg,0.056mmol,2eq)用甲酰胺溶解后加入圆底烧瓶中，常温反应12小时，反应结束后，将所得混合物放入透析袋(3000Da)中用去离子水透析，每六小时换一次水，换三次，后过滤、冻干，获得化合物8，为淡黄色固体，通过核磁谱图预估叶酸反应率50％，无叶酸固体析出。
方案四：将为叶酸(FA)(49mg,0.112mmol,4eq)、CDI(18mg,0.112mmol,4eq)用二甲基亚砜(DMSO)溶解于圆底烧瓶中，常温反应1小时，之后将透明质酸(HA)(200mg，0.028mmol,相当于0.486mmol-COOH基团)和DMAP(6.28mg,0.056mmol,2eq)用甲酰胺溶解后加入圆底烧瓶中，常温反应24小时，反应结束后，将所得混合物放入透析袋(3000Da)中用去离子水透析，每六小时换一次水，换三次，后过滤、冻干，获得化合物8，为淡黄色固体，通过核磁谱图预估叶酸反应率80％，无叶酸固体析出。
方案五：将叶酸(FA)(49mg,0.112mmol,4eq)、CDI(18mg,0.112mmol,4eq)用二甲基亚砜(DMSO)溶解于圆底烧瓶中，常温反应1小时，之后将透明质酸(HA)(200mg，0.028mmol,相当于0.486mmol-COOH基团)和DMAP(6.28mg,0.056mmol,2eq)用甲酰胺溶解后加入圆底烧瓶中，常温反应36小时，反应结束后，将所得混合物放入透析袋(3000Da)中用去离子水透析，每六小时换一次水，换三次，后过滤、冻干，获得化合物8，为淡黄色固体通过核磁谱图预估叶酸反应率85％，无叶酸固体析出。
比较上述五种方案后发现：常用的DCC、EDCI的酯缩合试剂叶酸只能反应40％左右，且会有叶酸固体和副产物析出，DCC副产物不容易透析除去，而用CDI做缩合剂反应叶酸反应能达到80％左右，且无叶酸沉淀。在时间选择上叶酸反应量随时间的增加而增加，但24h和36h叶酸反应量基本相同，所以最优反应条件选择用CDI做缩合剂，在24h下常温反应。
(2)聚合物前药化合物的条件筛选：
方案一：将化合物8(50mg,0.007mmol,相当于0.126mmol-COOH)和CDI(18mg,0.112mmol,4eq)用甲酰胺溶解于圆底烧瓶中室温搅拌一小时溶解，之后将化合物7(128mg,0.126mmol,1eq)、DMAP(16mg,0.126mmol,1eq)、4-PPy(18mg,0.126mmol,1eq)用DMSO溶解后加入反应瓶中，在常温下反应24小时，反应结束后，将所得混合物放入透析袋(3000Da)中用去离子水透析，每六小时换一次水，换三次，后过滤、冻干，获得化合物9(FA-HA-SS-PPT)，为淡黄色固体，PTT接枝率在5％左右。
方案二：将化合物8(50mg,0.007mmol,相当于0.126mmol-COOH)和CDI(18mg,0.112mmol,4eq)用甲酰胺溶解于圆底烧瓶中室温搅拌一小时溶解，之后将化合物7(128mg,0.126mmol,1eq)、DMAP(16mg,0.126mmol,1eq)、4-PPy(18mg,0.126mmol,1eq)用DMSO溶解后加入反应瓶中，在30℃下反应24小时，反应结束后，将所得混合物放入透析袋(3000Da)中用去离子水透析，每六小时换一次水，换三次，后过滤、冻干，获得化合物9(FA-HA-SS-PPT)，为淡黄色固体，PTT接枝率在7.5％左右。
方案二：将化合物8(50mg,0.007mmol,相当于0.126mmol-COOH)和CDI(18mg,0.112mmol,4eq)用甲酰胺溶解于圆底烧瓶中室温搅拌一小时溶解，之后将化合物7(128mg,0.126mmol,1eq)DMAP(16mg,0.126mmol,1eq)、4-PPy(18mg,0.126mmol,1eq)用DMSO溶解后加入反应瓶中，在40℃下反应24小时，反应结束后，将所得混合物放入透析袋(3000Da)中用去离子水透析，每六小时换一次水，换三次，后过滤、冻干，获得化合物9(FA-HA-SS-PPT)，为淡黄色固体，PTT接枝率在15％左右。
方案三：将化合物8(50mg,0.007mmol,相当于0.126mmol-COOH)和CDI(18mg,0.112mmol,4eq)用甲酰胺溶解于圆底烧瓶中室温搅拌一小时溶解，之后将化合物7(128mg,0.126mmol,1eq)DMAP(16mg,0.126mmol,1eq)、4-PPy(18mg,0.126mmol,1eq)用DMSO溶解后加入反应瓶中，在60℃下反应24小时，反应结束后，将所得混合物放入透析袋(3000Da)中用去离子水透析，每六小时换一次水，换三次，后过滤、冻干，获得化合物9(FA-HA-SS-PPT)，为淡黄色固体，鬼臼毒素接枝率为13％。
方案四：将化合物8(50mg,0.007mmol,相当于0.126mmol-COOH)和CDI(18mg,0.112mmol,4eq)用甲酰胺溶解于圆底烧瓶中室温搅拌一小时溶解，之后将化合物7(128mg,0.126mmol,1eq)DMAP(16mg,0.126mmol,1eq)、4-PPy(18mg,0.126mmol,1eq)用DMSO溶解后加入反应瓶中，在40℃下反应48小时，反应结束后，将所得混合物放入透析袋(3000Da)中用去离子水透析，每六小时换一次水，换三次，后过滤、冻干，获得化合物9(FA-HA-SS-PPT)，为淡黄色固体，鬼臼毒素接枝率为24％。
方案五：将化合物8(50mg,0.007mmol,相当于0.126mmol-COOH)和CDI(18mg,0.112mmol,4eq)用甲酰胺溶解于圆底烧瓶中室温搅拌一小时溶解，之后将化合物7(128mg,0.126mmol,1eq)DMAP(16mg,0.126mmol,1eq)、4-PPy(18mg,0.126mmol,1eq)用DMSO溶解后加入反应瓶中，在40℃下反应60小时，反应结束后，将所得混合物放入透析袋(3000Da)中用去离子水透析，每六小时换一次水，换三次，后过滤、冻干，获得化合物9(FA-HA-SS-PPT)，为淡黄色固体，接枝率为25％。
以上五种方案对比发现：核磁共振氢谱表征发现，随着反应时间和温度的增加，鬼臼毒素的接枝率会增加，但在60℃加热情况下叶酸与鬼臼毒素前药可能会有所断裂，导致鬼臼毒素的接枝率下降，同时，时间过48h后，鬼臼毒素的接枝率增加的不明显，所以选择最优的条件即在40℃下反应48h后，在透析，冻干后的到聚合物前药。
聚合物前药胶束的制备条件筛选：
方案一：取化合物9(1mg)溶解在超纯水(2mL)中，使其均匀分散，静置半小时，即得FA-HA-SS-PPT前药胶束，其粒径图见图23-1。
方案二：取化合物9(1mg)溶解在超纯水(2mL)中，用超声细胞破碎仪(功率为20w,处理2min,每五秒一次)，使其均匀分散，静置半小时，即得FA-HA-SS-PPT前药胶束，其粒径图见图23-2。
方案三：取化合物9(2.5mg)溶解在超纯水(2mL)中，用超声细胞破碎仪(功率为20w,处理3min,每五秒一次)，使其均匀分散，静置半小时，即得FA-HA-SS-PPT前药胶束，其粒径图见图23-3。
方案四：取化合物9(2.5mg)溶解在超纯水(3mL)中，用超声细胞破碎仪(功率为20w,处理3min,每五秒一次)，使其均匀分散，静置半小时，即得FA-HA-SS-PPT前药胶束，其粒径图见图23-4。
方案五：取化合物9(2.5mg)溶解在超纯水(2mL)中，用超声细胞破碎仪(功率为20w,处理5min,每五秒一次)，使其均匀分散，静置半小时，即得FA-HA-SS-PPT前药胶束，其粒径图见图23-5。
方案六：取化合物9(2.5mg)溶解在超纯水(2mL)中，用超声细胞破碎仪(功率为20w,处理6min,每五秒一次)，使其均匀分散，静置半小时，即得FA-HA-SS-PPT前药胶束，其粒径图见图23-6。
比较上述五种方案做出的聚合物胶束制备方法发现：在不经过超声破碎所得的聚合物胶束普遍粒径较大，经过超声破碎过后粒径有所变小，但随着功率的增大和时间的增加其粒径又会变大，可能是由于其中胶束的聚集以及将胶束打碎，所以选择的最佳条件是2.5mg聚合物前药溶解在超纯水(2mL)中，用超声细胞破碎仪(功率为20w,处理5min,每五秒一次)。
对比例1：
其具体方法如下：
化合物30的合成：将FMOC-缬氨酸(1g,2.9mmol,1eq)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(980mg,2.9mmol,1eq)用二氯甲烷溶解于圆底烧瓶中，搅拌三分钟之后加入EDCI(2215mg,8.7mmol,4eq)。室温下搅拌8小时。点板和LC-MS检测反应结束，用甲基叔丁基醚打浆后得到。目标化合物30，为白色固体。HRMS(ESI)m/z caled for C24H24N2O6H[M+H]+:437.1714,found 437.1716.
化合物31的合成：将化合物30(2.0g,)用10mL THF溶解后加入丙氨酸(0.43g，4.81mmol，1.05eq)和碳酸氢钠(0.40g，4.81mmol，1.05eq)溶解的15mL水溶液中。这个无色的溶液立即变得浑浊起来，并在40℃下回流24h，点板和LC-MS检测反应结束，用二氯甲烷和食盐水萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠上干燥，减压去除溶剂，浓缩得到粗品。将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物30，为白色固体。HRMS(ESI)m/z caled for C23H25N2O5H[M+H]+:411.1922,found 411.1926
化合物32的合成：在氮气条件下，将化合物31(0.36g，0.88mmol，1eq)、对氨基苄醇(0.13g，1.06mmol，1.2eq)和EEDQ(0.33g，1.33mmol，1.5eq)的二氯甲烷用甲醇处理，直到得到透明的溶液。在接下来的两天里，反应会析出了一种沉淀物。过滤后，用二氯甲烷和甲基叔丁基醚洗涤沉淀物，并在室温下超声15min。此过程重复两次，得到化合物32为白色固体。HRMS(ESI)m/z caled for C30H33N3O5Na[M+Na]+:538.2317,found 538.2320
化合物33的合成：在氮气条件下，将N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(4.2mL，4.55mmol，3eq)缓慢滴加到化合物32(4.22g，8.18mmol，1eq)和双(对硝基苯)碳酸酯(3.73g，18.2mmol，12.28eq，)的100mL二氯甲烷悬浮液中。将得到的黄色混合物用干N，N-二甲基甲酰胺处理，直到得到透明的溶液，并在室温下搅拌过夜。后用水洗涤溶液，并分离有机相。用二氯甲烷萃取水层4次，无水硫酸钠干燥有机相，并在减压下去除溶剂得到粗品。将粗品过硅胶柱纯化，得到目标化合物33，为白色固体。HRMS(ESI)m/z caled for C37H36N4O9Na[M+Na]+:703.2379,found 703.2381
化合物34的合成：在氮气条件下，将4-二甲基氨基吡啶(448mg,3.66mmol,2eq)用二氯甲烷溶解于圆底烧瓶中，然后将化合物33(800mg,2.01mmol,1.1eq eq)和鬼臼毒素(760mg,1.83mmol,1eq)用注射器同时缓慢滴加入圆底烧瓶中，室温下搅拌反应，LC-MS未检测到所需要的产物，反应未成功。
根据该对比例可见，采用二肽键是无法合成得到所需的聚合物前药化合物。
对比例2：
化合物35的合成：将化合物8(50mg,0.046mmol)和CDI用甲酰胺溶解于圆底烧瓶中室温搅拌一小时，之后将二羟基二硫醚，DMAP用DMSO溶解后加入反应瓶中，在40℃下反应48小时，反应结束后，将所得混合物放入透析袋(3000Da)中用去离子水透析，每六小时换一次水，换三次，后过滤、冻干，获得化合物36，为淡黄色固体。
化合物36的合成：将化合物35(50mg,0.046mmol)和CDI用甲酰胺溶解于圆底烧瓶中室温搅拌一小时，之后将化合物22、DMAP用DMSO溶解后加入反应瓶中，在40℃下反应48小时，反应结束后，将所得混合物放入透析袋(3000Da)中用去离子水透析，每六小时换一次水，换三次，后过滤、冻干，得到浅黄色固体，后用氘代水做核磁鉴定，但在核磁谱图中未看鬼臼毒素的标志峰，反应未成功。
根据该对比例可见，更改本发明实施例提供的制备步骤，无法得到所需的聚合物前药化合物。
实验例1：FA-HA-SS-PPT和FA-HA-CC-PPT前药胶束的释药行为
使用透析方法研究实施例1制得的FA-HA-SS-PPT前药胶束和实施例2制得的FA-HA-CC-PPT前药胶束的释放行为。将2mL前药胶束加入透析袋(截留分子量为3000Da)中，然后将透析袋浸入50mL pH 5.0和pH 7.4的PBS(pH5.0、pH 5.0+20mM GSH、pH 7.4及pH 7.4+20mM GSH)离心管中。然后放置于恒温摇床中，振荡速度为200r/min，温度控制在37℃。在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h时，从释放介质中取出2.0mL液体并用2.0mL相应pH的PBS替换以维持体积不变。用HPLC测量释放到PBS溶液中的鬼臼毒素的浓度。
结果见图16，对于FA-HA-CC-PPT胶束，在pH 7.4下孵育24h后，只有不到24.3％的PPT缓慢释放，而在pH5.0下孵育24h后累积释放量增加至65.4％。对于FA-HA-SS-PPT胶束，在pH 7.4下孵育时，仅25.3％的PPT释放，当pH值为5.0时，PPT累积释放量从增加到66.5％，尤其在pH 5.0的PBS中加入20mM GSH时，PPT的累积释放显著增加到88.3％。
实验例2：FA-HA-SS-PPT和FA-HA-CC-PPT前药胶束的溶血评估
首先对新鲜的小鼠血浆进行脱纤维处理，取2mL的小鼠血液，用玻璃棒沿顺时针方向轻轻搅拌15min，除去血液中的纤维蛋白。然后加入8mL的PBS溶液，放入离心机中，以2500r/min离心10min,除去上清液，重复离心三次至上清液无色，得到血红细胞悬浮液。用PBS稀释该细胞悬浮液，旋涡振荡5min使悬液混合均匀，获得浓度约5％(v/v)的红细胞悬浮液。将红细胞悬浮液分别与5mg/mL的FA-HA-SS-PPT、FA-HA-CC-PPT前药胶束、吐温80 溶液混合，使混合物中两类前药胶束或吐温80的最终浓度范围为0.1至2mg/mL(分别为0.1、0.25、0.5、1、2mg/mL)。同时取1mL的红细胞悬液分别和超纯水、PBS等量混合作为阳性和阴性对照。在37℃恒温摇床上孵育4h和12h后，以2500r/min离心10min。用酶标仪检测上清液在541nm处的吸光度，使用以下等式计算溶血程度：
溶血率(％)＝(Atest-Aneg)/(Apos-Aneg)×100
其中Atest，Aneg，Apos分别是样品，阴性对照(PBS)和阳性对照(水)的吸光度值。结果见图17，根据图17可知，当浓度从0.1增加到2.0mg/mL时，吐温80诱导的溶血率从11.5％显著增加到75.5％。然而，FA-HA-SS-PPT和FA-HA-CC-PPT前药胶束在相同浓度下表现出不超过7％的溶血率，其结果明显低于吐温80，这说明所制备的前药胶束具有好的血液。
实验例3：FA-HA-SS-PPT聚合物前药的药物靶向性研究
将HeLa、4T1细胞分别以每孔6×104的细胞密度接种在12孔板上，孵育24h后，观察细胞约占瓶壁80％。分别加入10mg/mL透明质酸(分子量为7000Da)和10mg/mL叶酸，培养2h，以不加透明质酸或叶酸处理的作为对照组。之后移去培养基(DMEM)，分别加入新鲜含5μg/mL实施例1制得的FA-HA-SS-PPT前药胶束的DMEM，继续培养4h。用1×PBS(pH 7.4)洗涤细胞三次，通过胰蛋白酶消化，吹打并收集细胞，过筛。选择流式细胞仪进行检测。
结果见图18，根据图18可知，当采用FA或HA与CD44和FR双受体高表达的4T1和HeLa细胞共孵育后，细胞对罗丹明标记的FA-HA-SS-PPT摄入量降低，这证明FA-HA-SS-PPT通过CD44和FR介导的内吞作用进入肿瘤细胞，这证实FA-HA-SS-PPT与CD44和FR存在相互作用，而CD44靶向透明质酸，FA靶向叶酸受体FR，因此，FA-HA-SS-PPT与CD44和FR存在靶向作用。
实验例4：FA-HA-SS-PPT聚合物前药的抗肿瘤活性研究
通过MTT法测定FA-HA-SS-PPT聚合物前药、FA-HA-CC-PPT聚合物前药、HA-PPT聚合物前药、游离PPT对宫颈癌细胞(HeLa)和乳腺癌细胞(4T1)的毒性。取生长状态良好的HeLa、4T1细胞，同细胞传代实验操作，细胞重悬后，用血球计数板进行细胞计数，以2500个/孔，种植于96孔板中，待细胞培养24h后，除去原来培养基，加入含不同浓度药物的培养基继续培养48h。药物作用结束后，除去原来培养基，加入新鲜培养基100μL，加入10μL MTT溶液，置于培养箱中孵育2h后，加入150mL DMSO，摇床孵育15min，于490nm处，用酶标仪测定OD值，并计算细胞增殖抑制率。重复上述步骤三次。
结果见图19，由图19可知，FA-HA-SS-PPT聚合物前药、HA-SS-PPT聚合物前药的对CD44和FR双表达的HeLa、4T1的抗肿瘤活性均高于PPT，以碳酸酯键连接的FA-HA-CC-PPT聚合物前药其抗肿瘤活性低于游离PPT，这证明以二硫键连接的药物在肿瘤微环境中能释放更多的PPT，二硫键的肿瘤微环境响应性高于碳酸酯键。同时，FA-HA-SS-PPT聚合物前药抗肿瘤活性高于HA-SS-PPT聚合物前药，这证明与单靶向相比，双靶向的PPT纳米胶束其抗肿瘤效果更好，肿瘤细胞对其摄入量更高。
实验例5：EdU法测定FA-HA-SS-PPT聚合物前药对HeLa、4T1细胞的细胞增殖抑制作用
将HeLa、4T1细胞分别以每孔6×104的细胞密度接种在提前放置细胞爬片的12孔板上，孵育24h后。分别加入含同浓度PPT的药物中继续培养24h。配制2X的EdU工作液，将37℃预热的2X的EdU工作液(20μM)，等体积加入12孔板中，使12孔板中的EdU终浓度变为1X。例如设计终浓度为10μM。继续孵育细胞2h。EdU标记细胞完成后，去除培养液，并加入1mL固定液。去除固定液，每孔用1ml洗涤液洗涤细胞3次，每次3-5分钟。除去洗涤液，每孔用1mL通透液，室温孵育10-15min。去除通透液，每孔用1mL洗涤液洗涤细胞1-2次，每次3-5min。结束后将爬片封片保存，并置于激光共聚焦显微镜下观察。
结果如图20所示，FA-HA-SS-PPT对CD44和FR受体高表达的4T1和HeLa细胞均具有较好的细胞增殖抑制作用，正常条件下，处于细胞增殖状态的4T1细胞比例约为96％，FA-HA对细胞增殖几乎无明显影响，其处于增殖细胞的4T1细胞占比约为95％。当采用游离PPT、FA-HA-SS-PPT、FA-HA-CC-PPT和HA-SS-PPT处理细胞后，细胞增殖数量减少，其中FA-HA-SS-PPT细胞增殖抑制作用最强，其处于增殖状态的细胞数量低至9％，其次为单靶向的HA-PPT和游离PPT，以非二硫键连接的FA-HA-CC-PPT药物作用效果最差。人宫颈癌细胞的EdU细胞增殖实验中观察到相同的现象。这证实，双靶向且以二硫键连接的FA-HA-SS-PPT的效果较好，FA和HA的靶向作用增强了游离PPT对肿瘤细胞的增殖抑制作用，双靶向抗肿瘤效果优于单靶向药物，同时，二硫键GSH响应的二硫键赋予药物更强的肿瘤微环境响应性，可显著增强药物的抗肿瘤效果。
实验例6：Annexin V-FITC/PI双染法测定FA-HA-SS-PPT聚合物前药对HeLa、4T1细胞细胞凋亡的影响
取处于对数生长期的HeLa、4T1细胞，将细胞、离心并以1x105个/孔接种于6孔板中，细胞贴壁培养24小时后。将鬼臼毒素有效浓度为等量PPT的FA-HA、游离PPT、FA-HA-SS-PPT、HA-SS-PPT、FA-HA-CC-PPT分别作用于HeLa、4T1细胞，继续培养48小时。加入PBS缓冲液清洗细胞，随后采用胰酶消化，将消化后的细胞离心，以1000r离心5分钟，弃上清，收集细胞。除去上清，加入195μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5μL Annexin V-FITC，轻轻混匀。加入10μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀。室温避光孵育15min，随后置于冰浴中。采用流式细胞仪检测药物作用结束后细胞凋亡情况。
结果如图21所示，为了进一步阐明FA-HA-SS-PPT对FR和CD44过表达肿瘤细胞的作用机制，我们药物作用于HeLa和4T1细胞后，采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。HA-FA对HeLa和4T1细胞的细胞凋亡无明显影响，其细胞凋亡率均低于5％，与正常组相比，P<0.05。当FA-HA-CC-PPT作用于细胞后，诱导了FR和CD44高表达细胞凋亡，使32％的HeLa细胞和23％的4T1细胞发生凋亡。同时，当以同浓度的游离PPT作用于细胞后，HeLa细胞和4T1细胞的凋亡率分别为43％和34％。在同等浓度下，HA-SS-PPT和FA-HA-SS-PPT诱导肿瘤细胞凋亡能力最强，HA-SS-PPT诱导62％的HeLa细胞和61％的4T1细胞发生凋亡，但其抗肿瘤能力仍低于FA-HA-SS-PPT(P<0.05)，其诱导3/4的HeLa细胞和4T1细胞凋亡。这证明FA-HA-SS-PPT对CD44和FR双受体高表达的肿瘤细胞系的促细胞凋亡能力强于单靶向的HA-SS-PPT和游离PPT，同时GSH响应的二硫键连接的纳米前药的肿瘤细胞杀伤能力强于非二硫键连接的药物。
实验例7：Annexin V-FITC/PI双染法测定FA-HA-SS-PPT聚合物前药对HeLa、4T1细胞细胞凋亡的影响
为了评估药物对体内实体肿瘤组织的影响，将有效浓度为等量PPT的FA-HA、游离PPT、FA-HA-SS-PPT、FA-HA-CC-PPT及依托泊苷分别作用于采用尾静脉给药，每2天给药1次，一共8次，对照组注射相同剂量的生理盐水溶液。每次给药结束后，采用分析天平称量小鼠体重，并采用游标卡尺测量肿瘤的长径(L)和短径(W)，按照V＝(L×W^2)/2计算肿瘤体积。给药结束后，采用眼球取血方式获取小鼠血液并置于抗凝管，保存于-80℃冰箱备用。随后对小鼠进行解剖，取其心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织。采用分析天平精确称量各给药组肿瘤和器官重量，并将其浸泡于4％多聚甲醛溶液中备用。随后，根据给药过程中记录数据，绘制肿瘤生长曲线和各给药组体重变化曲线，并按照[(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％计算肿瘤生长抑制率。
如图22所示，为了评价FA-HA-SS-PPT对CD44和FR高表达肿瘤组织的体内抗肿瘤效果，我们采用4T1细胞建立体内肿瘤模型，并通过尾静脉注射方式测定不同药物的体内抗肿瘤效果。由图可知，FA-HA-SS-PPT给药后，小鼠肿瘤体积生长体积最小，肿瘤组织重量最轻，其次为依托泊苷和游离PPT，FA-HA-CC-PPT的小鼠肿瘤体积最大，肿瘤肿瘤较重，这证明FA-HA-CC-PPT的体内抗肿瘤效果较差。这证明，FA-HA-SS-PPT的体内抗肿瘤作用远优于FA-HA-CC-PPT，这得益于其二硫键连接，同时通过FA和HA的靶向作用，FA-HA-SS-PPT的抗肿瘤效果优于游离的PPT及PP衍生物依托泊苷。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种聚合物前药化合物，其特征在于，其结构式如下所示：
其中，A选自聚乙二醇基团或其衍生基团、同时含烯基和羰基的复合基团或复合长链基团、同时含羰基和苯基的复合基团或复合长链基团、同时含胺基和羰基的复合基团或复合长链基团、同时含羰基和醚基的复合长链基团，同时含氨基酸残基和羰基的复合基团或复合长链基团、同时喊羰基、烯基、苯基、胺基、醚基和氨基酸残基中的至少一种基团和Su的复合基团或复合长链基团以及仅含羰基和亚烷基的复合基团或复合长链基团中的任意一种；
B选自含硫基团、含硒基团、含氨基酸残基基团和含胺基的基团中的任意一种；
Y选自N、O或C；
U选自抗肿瘤化合物；
m为8-17。
2.根据权利要求1所述的聚合物前药化合物，其特征在于，A选自-CH2-(OCH2)n-CH2-、-CO-(CH2)n-CO-、-CH＝CH-CO-、-CH＝CH-(CH2)n-CO-、-CH(OH)-Ph-CO-、-CH(OH)-Ph-(CH2)n-CO-、-CH2-Ph-(CH2)n-CO-、-CH(OCH3)-Ph-CO-、-CH(OCH3)-Ph-(CH2)n-CO-、-CO-NH-CO-、-CO-NH-(CH2)n-CO-、、-CH2-CH＝CH-CO-、-CH2-CH＝CH-(CH2)n-CO-、-CO-(CH2)n-、-(CH2)n-CO-、-CO-O-(CH2)n-CO-、-SO2-Ph-CO-、-SO2-Ph-(CH2)n-CO-、-CO-O-PAB-Cit-Val-CO-(CH2)n-CO-、-CO-O-PAB-Lys-Phe-CO-(CH2)n-CO-、-CO-(CH2)n--Su-、-CH＝CH-Su-、-CH＝CH-(CH2)n-Su-、-CH(OH)-Ph-Su-、-CH(OH)-Ph-(CH2)n-Su-、-CH2-Ph-(CH2)n-Su-、-CO-NH-Su-、-CO-NH-(CH2)n-Su-、-CH2-CH＝CH-Su-、-CH2-CH＝CH-(CH2)n-Su-、-CO-(CH2)n-、-(CH2)n-Su-、-CO-O-(CH2)n-Su-、-SO2-Ph-Su-、-SO2-Ph-(CH2)n-Su-、-CO-O-PAB-Cit-Val-CO-(CH2)n-Su-、-CO-O-PAB-Lys-Phe-CO-(CH2)n-Su-中的任意一种，其中1≤n≤14；优选为1≤n≤7；
优选地，B选自-S-S-S-、-S-S-、-S-、-Se-Se-、-Se-、-C＝N-NH-和-CO-O-PAB-Cit-Val-CO-(CH2)n-CO-中的任意一种；
优选地，U选自鬼臼毒素、羟基喜树碱、紫杉醇、长春花碱、去甲长春花碱、甲氨蝶呤和培美曲塞中的任意一种。
3.根据权利要求1或2所述的聚合物前药化合物，其特征在于，其选自下述结构式所示的化合物：
其中，A选自-CH2-(OCH2)n-CH2-、-CO-(CH2)n-CO-、-CH＝CH-CO-、-CH＝CH-(CH2)n-CO-、-CH(OH)-Ph-CO-、-CH(OH)-Ph-(CH2)n-CO-、-CH2-Ph-(CH2)n-CO-、-CH(OCH3)-Ph-CO-、-CH(OCH3)-Ph-(CH2)n-CO-、-CO-NH-CO-、-CO-NH-(CH2)n-CO-、、-CH2-CH＝CH-CO-、-CH2-CH＝CH-(CH2)n-CO-、-CO-(CH2)n-、-(CH2)n-CO-、-CO-O-(CH2)n-CO-、-SO2-Ph-CO-、-SO2-Ph-(CH2)n-CO-、-CO-O-PAB-Cit-Val-CO-(CH2)n-CO-、-CO-O-PAB-Lys-Phe-CO-(CH2)n-CO-、-CO-(CH2)n--Su-、-CH＝CH-Su-、-CH＝CH-(CH2)n-Su-、-CH(OH)-Ph-Su-、-CH(OH)-Ph-(CH2)n-Su-、-CH2-Ph-(CH2)n-Su-、-CO-NH-Su-、-CO-NH-(CH2)n-Su-、-CH2-CH＝CH-Su-、-CH2-CH＝CH-(CH2)n-Su-、-CO-(CH2)n-、-(CH2)n-Su-、-CO-O-(CH2)n-Su-、-SO2-Ph-Su-、-SO2-Ph-(CH2)n-Su-、-CO-O-PAB-Cit-Val-CO-(CH2)n-Su-、-CO-O-PAB-Lys-Phe-CO-(CH2)n-Su-中的任意一种，其中1≤n≤14；优选为1≤n≤7；
B选自-S-S-S-、-S-S-、-S-、-Se-Se-、-Se-、-C＝N-NH-和-CO-O-PAB-Cit-Val-CO-(CH2)n-CO-中的任意一种；
Y选自N、O或C；
m为8-17；
优选地，其选自下述结构式所示的化合物中的任意一种：
其中，n为1-14，优选为1-7；m为8-117。
4.一种权利要求1所述的聚合物前药化合物的制备方法，其特征在于，包括：参照下述合成路径进行合成：
优选地，包括：将叶酸与透明质酸进行反应形成中间体1；
将抗肿瘤化合物与含有B基团的物质反应，而后与含有A基团的化合物反应形成中间体2；
所述中间体1和所述中间体2反应形成所述聚合物前药化合物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，形成所述中间体1的步骤包括：将叶酸、CDI和DMSO混合反应，而后与透明质酸、DMAP和酰胺类溶液混合反应24-26小时；
优选地，反应后进行透析。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，形成所述聚合物前药化合物的步骤包括：将所述中间体1和酰胺类溶液混合，而后与所述中间体2、DMSO、4-PPy、CDI和DMAP在40-45℃条件下反应48-52小时。
7.一种聚合物前药胶束，其特征在于，其通过权利要求1所述的聚合物前药化合物制备得到。
8.一种权利要求7所述的聚合物前药胶束的制备方法，其特征在于，包括：利用权利要求1所述的聚合物前药化合物形成所述聚合物前药胶束。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，包括：将所述聚合物前药化合物和水混合，而后超声，再静置；优选地，2.5mg聚合物前药化合物对应2.2-2.5ml水，超声时间为5-6分钟，超声功率为18-22W。
10.一种抗肿瘤药剂，其特征在于，其包括权利要求1所述的聚合物前药化合物或权利要求8所述的聚合物前药胶束。
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