CN105999299B - 一种小分子胶束纳米载药系统及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小分子胶束纳米载药系统，属于生物材料领域。本发明所述载药系统是由两亲性分子自组装形成的纳米胶束，所述两亲性分子包括由亲水药物与疏水链段直接相连形成的两亲性分子，所述纳米胶束可通过内部交联获得稳定结构，所述小分子胶束纳米载药系统载药量高，合成简便，易降解。本发明将亲水药物与带有可交联的疏水烷基链通过敏感键连接形成两亲性分子，并将其制成小分子胶束，将胶束内部进行交联来提高其在体内循环时的稳定性。可在小分子胶束中加入带有靶向的两亲性配体，其可以通过主动和被动靶向到达肿瘤组织，再将敏感键打断，从而释放药物分子，杀死癌细胞。还可在小分子胶束中引入具有长循环功能的配体，提高纳米药物在体内循环时间。同时还可以在胶束中引入不同亲水药物的配体，最终形成多药纳米粒子，达到多药联用的目的。

Description

一种小分子胶束纳米载药系统及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物材料领域，特别涉及一种小分子胶束纳米载药系统及其制备方法与应用。

技术背景

癌症是严重威胁人类健康的常见病、多发病，攻克癌症一直是世界瞩目的研究热点，而药物治疗是目前最常用、最有效的治疗方法之一。小分子药物具有明显的化疗效果，但其对正常组织有很大的损伤，毒副作用大，并且药物不能可控释放。

纳米载药传递系统具有靶向性、缓释性、载体材料可生物降解等显著优点，因此有着广阔的应用前景。纳米药物传递系统的构建离不开性能良好的药物载体，其中纳米胶束载体具有核壳结构，能够物理包载疏水药物，且具有优良的组织渗透性、体内滞留时间长、能使药物有效地到达靶点等特点，因此近年来可以有效克服这些缺点的纳米载药系统成为药物治疗的研究热点。

在现有的纳米胶束载体中研究较为广泛的是聚合物胶束，它是由两亲性嵌段共聚物形成内核疏水-外壳亲水的核-壳结构，其可以通过共价联接亲疏水药物，也可通过物理吸附包载疏水性药物。聚合物纳米胶束尺寸一般在100-200 nm左右，具有较好的EPR效应、稳定性和较长的血液循环时间，但其面临合成复杂、尺寸不均一、载药量低、药物易突释和泄露等问题。小分子胶束具有和聚合物胶束相似的核壳结构，并且相比较聚合物胶束，小分子胶束还具有合成简单、尺寸可调、载药量高等优点。尽管如此，小分子胶束作为纳米载药系统的报道几乎没有，分析原因主要在于其稳定性差，还未到达肿瘤部位即已解离，达不到治疗的目的。

发明内容

本申请针对小分子胶束药物传递系统面临的上述问题，设计构建一种新型的基于交联小分子胶束的多功能抗肿瘤药物传递系统。该系统既具有传统聚合物胶束的特点，同时又兼具了小分子胶束载药本身的优势，非常具有工业化前景。本发明设计了一种疏水内部可交联，且亲水外端通过敏感键共价连接亲水性药物分子的小分子胶束做为一种新型的纳米载药系统。这种纳米载体系统不仅运用到小分子胶束合成简单、易降解的特点，更解决了小分子胶束稳定性差、包载率低等问题。这种小分子胶束是一类稳定性好、载药量高、靶向性好、生物相容性好、可降解、且具有多种抗癌药物联用功能的纳米载体系统。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种两亲性小分子，包括亲水药物和疏水链段，所述亲水药物与疏水链段直接相连形成的两亲性分子，所述疏水链段中含有可交联基团。所得到的两亲性分子是有具体结构式的单体小分子。作为可选，所述两亲性小分子的分子量小于1000。

作为可选，在上述两亲性小分子中，所述可交联基团为二硫键(能被细胞内的谷胱甘肽打断，从而达到完全降解的功效)、丙烯酸酯键（反应活泼，能自交联，能形成网状交联稳定结构）、双键或三键（采用点击反应进行交联，反应效率高）中的至少一种。

作为可选，在上述两亲性小分子中，所述亲水药物与疏水链段通过环境敏感键相连，进一步的，所述环境敏感键为酰胺键（肿瘤组织的溶酶体内含有组织蛋白酶B能打断酰胺键）、还原敏感的二硫键（能被肿瘤细胞内过度表达的谷胱甘肽还原打断成巯基）、PH敏感的缩醛键（能在PH=5-6.5的肿瘤微酸环境下断裂）和腙键（能在溶酶体PH=5.5的环境下断裂）等中的至少一种。

作为可选，上述两亲性小分子由含氨基的亲水药物与硫辛酸通过酰胺键相连而成。

作为可选，上述两亲性小分子结构式如下：

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作为可选，在上述两亲性小分子中，还可以采用亲水性的靶向分子代替亲水药物，由靶向分子和带有可交联的疏水分子直接连接形成两亲性分子。进一步的，所述靶向分子可为葡萄糖（能与肿瘤细胞上过度表达的葡萄糖转运蛋白特异性靶向）、乳糖/半乳糖（与肝癌细胞上过度表达的去唾液酸糖蛋白特异性结合）、单克隆抗体（与人类层纤维细胞活化α-蛋白特异性结合）和CRGD(能与整合素蛋白α_vβ₃特异性结合)中的至少一种。

作为可选，上述两亲性小分子结构式如下：

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作为可选，在上述两亲性小分子中，还含有具有长循环功能的分子。例如采用具有长循环功能的分子代替亲水药物，由具有长循环功能的分子与带有可交联基团的疏水分子直接连接形成的两亲性分子，进一步的，所述长循环分子可以为PEG。

作为可选，上述两亲性小分子结构式如下：

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作为另一种可选，亲水药物和具有长循环功能的分子同时存在于上述两亲性小分子中。例如结构式如下的两亲性小分子：

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一种小分子胶束纳米载药系统，所述载药系统是由两亲性分子自组装形成的纳米胶束，所述两亲性分子包括至少一种上述的两亲性小分子。所述小分子胶束纳米载药系统载药量高，合成简便，易降解。所述小分子胶束纳米载药系统通过内部可交联基团进行交联，从而获得稳定结构，这不仅解决所述小分子胶束纳米载药系统的稳定性问题，更提高药物在体内的长循环效果。

作为可选，在上述小分子胶束纳米载药系统可以是由一种亲水药物与疏水链形成的两亲性分子组装而成，也可以是由多种亲水药物与疏水链分别形成的两亲性分子混合组装而成，这可达到多药联用目的。

作为可选，在上述小分子胶束纳载药系统中，所述疏水链段上含有可相互交联基团，通过交联可使所述小分子胶束纳米载药系统更稳定，有利提高药物在体内的长循环效果。

作为可选方式，在上述小分子胶束纳米载药系统中，所述可相互交联基团为二硫键、丙烯酸酯键、双键或三键等中的一种。

作为可选方式，上述小分子胶束纳米载药系统中可交联基团为二硫键。采用二硫键交联既有利于增加载药体系的稳定性，提高体内长循环效果，又可在肿瘤部位和肿瘤细胞中的还原性环境中使二硫键的断裂，体系更加松散，更容易发生解组装从而释放药物，在一定程度上达到完全释放效果。

作为可选，在上述小分子胶束纳米载药系统中，所述亲水药物与疏水链段通过环境敏感键相连，所述环境敏感键能在肿瘤组织或细胞的特殊环境中发生断裂，释放出药物有效成分，实现特异性治疗效果。

作为可选，在上述小分子胶束纳米载药系统中，所述环境敏感键可为酰胺键、还原敏感的二硫键、PH敏感的缩醛键和腙键中的一种。

作为可选，在上述小分子胶束纳米载药系统中，所述酶敏感键为酰胺键。肿瘤细胞内的溶酶体释放出组织蛋白酶B能特异性的打断酰胺键，从而将药物释放出来，达到很好的治疗效果。

作为可选，在上述小分子胶束纳米载药系统中，所述两亲性分子包括由含氨基的亲水药物与硫辛酸通过酰胺键相连形成的两亲性分子。采用该类型的两亲性分子制成的小分子胶束纳米载药系统既能够实现二硫键交联又具有酶敏感效应。

作为可选，在上述小分子胶束纳米载药系统中，所述两亲性分子包括结构式如下的两亲性分子：

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作为可选，在上述小分子胶束纳载药系统中还可含有带有靶向基团的两亲性分子。通过在体系中加入靶向基团，可以进一步通过主动靶向提高入胞效果。进一步的，所述靶向基团可为葡萄糖、乳糖/半乳糖、单克隆抗体和CRGD等。

作为可选，在上述小分子胶束纳米载药系统中，所述靶向基团为葡萄糖。因癌细胞表面过度表达葡萄糖转运蛋白，葡萄糖能特异性的和葡萄糖转运蛋白相结合，实现特异性靶向。

作为可选，在上述小分子胶束纳米载药系统中，所述纳米载药系统中还含结构式如下的两亲性分子：

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作为可选，在上述小分子胶束纳米载药系统中，还含有可长循环基团。进一步的，该小分子胶束纳米载药系统中含有PEG链。PEG具有水溶性和高柔顺性,在脂质体表面形成一层水化膜，能使脂质体在血循环中的半衰期明显延长。

作为可选，在上述小分子胶束纳米载药系统中，所述纳米载药系统中还含结构式如下的两亲性分子：

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本发明还提供了一种上述纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：

（1）亲水药物与疏水链段相连，形成两亲性分子；

（2）将步骤（1）中的两亲性分子加入到剧烈搅拌的水中，并控制体系中两亲性分子的浓度大于其临界胶束浓度，得到小分子纳米胶束。

作为可选方式，在上述制备方法中，还包括步骤（3），其是对所述步骤（2）中获得的小分子纳米胶束进行内部交联。

作为可选方式，在上述制备方法中，所述步骤（1）具体为以硫辛酸和含氨基的亲水性药物为原料进行酰胺化反应，获得两亲性分子L1。所述L1的具体合成路线如下：

其中原料是杰西他滨（Gem）和硫辛酸（A），有机碱N,N-二异丙基乙基胺（DIPEA），缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDCI)，溶剂N,N-二甲基甲酰胺（DMF）。将杰西他滨和N,N-二异丙基乙基胺溶于DMF，再将硫辛酸和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶于DMF后缓慢加入杰西他滨中。其中杰西他滨、硫辛酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N,N-二异丙基乙基胺加入比例为1:1.2:1.2:0.3。反应在氮气氛围下进行反应48 h。反应完全后向反应液中加入适量的水和盐酸，调PH值为酸性，再用乙酸乙酯进行萃取，萃取三次，将得到的有机相合并在一起，再用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水洗有机相，最后用无水硫酸镁干燥。有机相浓缩后进行柱层析提纯，最后得到纯的目标分子L1。

作为可选方式，在上述制备方法中，所述步骤（1）中还包括以硫辛酸和2-氨基葡萄糖为原料进行酰胺化反应，获得两亲性分子L2。进一步的，所述L2的具体合成路线如下：

其中原料为硫辛酸、2-氨基葡萄糖、N-羟基琥珀酰亚胺(HOSU)、N,N-二环己基碳二亚胺（DCC）以及三乙胺（Et₃N）。反应过程分为两步，首先是生成活化酯B，再由活化酯B与氨基葡萄糖反应生成目标产物L2。生成活化酯步骤：在氮气氛围下，将硫辛酸、N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二环己基碳二亚胺溶于四氢呋喃（THF），反应在室温下搅拌6 h，反应后有沉淀生成，用布氏漏斗将固体过滤掉，得滤液，再用旋转蒸发仪将滤液中的有机溶剂旋掉，得到活化酯B。生成L2步骤：将活化酯B、2-氨基葡萄糖和三乙胺溶于DMF，再将其搅拌48 h，反应完全后将DMF旋干，最终采用干法上样的方式过柱层析，最后得到了纯的L2。（流动相为CH₂Cl₂:MeOH =10:1）

作为可选方式，在上述制备方法中，所述步骤（1）中还包括以硫辛酸和PEG400为原料进行酯化反应，获得两亲性分子L3。进一步的，所述L3的具体合成路线如下：

反应原料包括：硫辛酸、聚乙二醇（PEG400）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDCI）。在氮气氛围下，将聚乙二醇（PEG400）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDCI）溶于二氯甲烷中，不断搅拌，将其在冰浴中冷却到0 ℃。再将溶于二氯甲烷的硫辛酸逐滴的滴加到上诉混合溶液中，加完硫辛酸后使反应温度上升到室温，搅拌48 h。待反应完全后加入0.1 mol/L 的盐酸将其酸化，再用乙酸乙酯将有机相萃取出来。将萃取出的有机相分别用碳酸氢钠和饱和食盐水进行洗涤，用无水硫酸钠干燥。最后以流动相为二氯甲烷：甲醇（20:1）过柱层析，最终得到纯的L3化合物。

作为可选方式，在上述制备方法中，所述内部交联步骤为在避光条件下加入催化量的二硫苏糖醇（DTT）使胶束内部的疏水链段之间发生交联。进一步的，所述内部交联具体为：向含有胶束溶液的安培瓶中通入N₂，使瓶内的空气完全排出，在避光的条件下加入催化量的DTT，搅拌过夜后向瓶内通1 h空气，最后将材料加入1 KD的透析袋进行透析处理，每12h换一次水，透析4次，最终得到交联纳米胶束。

本发明还提供了一种上述纳米载药系统的应用，其特征在于，将其用于治疗肿瘤相关疾病的药物。亲水端的药物分子可为广谱的抗癌药物，如杰西他滨（用于治疗肺癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌及其他实体肿瘤）、伊立替康（用于胃癌、食管癌、广泛期小细胞肺癌）和阿扎胞苷（用于乳腺癌、肠癌、黑色素瘤等）等。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本发明的有益效果：

本发明所述的小分子胶束纳米载药系统载药量高、稳定性高、靶向性好、生物相容性好、可降解、可实现多药联用且制备方法简单。

在本发明中可选方式中将一种亲水药物与硫辛酸通过酰胺键共价连接形成一种两亲性分子，直接利用这种两亲性分子形成了小分子胶束。在小分子胶束中加入带有靶向（葡萄糖）的两亲性配体，且采用二硫键将小分子胶束内部交联，形成了一种新颖的小分子胶束纳米载体。由于纳米粒子内部交联，在体内循环时非常稳定，其可以通过主动和被动靶向到达肿瘤组织，再通过酶将酰胺键打断，释放出药物分子，达到杀死癌细胞的目的。且可以合成接不同亲水药物的配体，最终可以形成多药纳米粒子，达到多药联用的目的。

附图说明：

图1为本发明所述小分子胶束纳米载药系统的示意图；

图2为实施例1中所述的L1形成的交联的小分子胶束纳米载药系统的示意图；

图3为实施例1中交联小分子胶束纳米载药系统的形成过程；

图4（a）为实施例1中L1交联胶束(胶束1)的扫描电镜图，（b）为实施例1中形成的带有靶向的混合交联胶束（胶束2）的扫描电镜图；

图5为实施例2中稳定性测试结果，其中：（a）L1交联胶束和L1未交联胶束在血清里的稳定性；（b）L1交联胶束稀释至不同浓度时的DLS变化。

图6为实施例3中材料的体外释放实验结果。

图7为实施例4中空白纳米载体的细胞毒性实验结果：（a）人小细胞肺癌(A549细胞)，（b）人胚成纤维细胞(MRC-5细胞)。

图8为实施例4中纳米材料的体外毒性实验结果。

图9为实施例5中交联小分子胶束纳米载药系统的体内生物学评价，(a)小鼠体重变化图,(b)

小鼠肿瘤体积变化图。

图10为实施案例6中交联小分子胶束纳米载药系统的靶向性能评价，图中分别表示靶向纳米胶束和非靶向纳米胶束的流式实验数据。

具体实施方式：

以下通过实施例的具体实施方式对本发明的上述内容作进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。

实施例1 交联小分子胶束纳米载药系统的制备。

一种如图2所述的小分子胶束纳米载药系统，其中L1是一个两亲性分子，疏水端为可交联的烷基链，亲水端是亲水的药物。我们采用的疏水端为硫辛酸，亲水端是亲水药物杰西他滨，L1通过两亲性原理自组装形成胶束，再通过内部交联形成稳定的交联胶束载药系统。

(1)以下是L1的合成路线：

合成方法：

其中原料是杰西他滨和硫辛酸、有机碱N,N-二异丙基乙基胺（DIPEA）、缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（EDCI）、溶剂DMF。将杰西他滨和N,N-二异丙基乙基胺溶于DMF，再将硫辛酸和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶于DMF后缓慢加入杰西他滨中。其中杰西他滨、硫辛酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N,N-二异丙基乙基胺加入比例为1:1.2:1.2:0.3。反应在氮气氛围下进行反应48 h。向反应液中加入适量的水和盐酸，调PH值为酸性，再用乙酸乙酯进行萃取，萃取三次，将得到的有机相合并在一起，再用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水洗有机相，最后用无水硫酸镁干燥。所得有机相过滤浓缩后，通过柱层析分离得到纯的目标分子L1。

（2）以下是L2的合成路线：

合成方法：

其中原料为硫辛酸、2-氨基葡萄糖、N-羟基琥珀酰亚胺(HOSU)、N’N-二环己基碳二亚胺(DCC)以及三乙胺(Et₃N)。反应过程分为两步，首先是生成活化酯B,再由活化酯B与氨基葡萄糖反应生成目标产物L2。生成活化酯步骤：在氮气氛围下，将硫辛酸、N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二环己基碳二亚胺溶于四氢呋喃（THF），反应在室温下搅拌6 h，反应后有沉淀生成，用布氏漏斗将固体过滤掉，得滤液，再用旋转蒸发仪将滤液中的有机溶剂旋掉，得到活化酯B。生成L2步骤：将活化酯B、2-氨基葡萄糖和三乙胺溶于DMF，再将其搅拌48 h，反应完全后将DMF旋干，最终采用柱层析（CH₂Cl₂:MeOH =10:1）分离得到纯的化合物L2。

(3)以下是合成L3的合成路线：

反应原料是：硫辛酸、聚乙二醇（PEG400）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDCI）。在氮气氛围下，将聚乙二醇（PEG400）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDCI）溶于二氯甲烷中，不断搅拌，将其在冰浴中冷却到0℃。再将溶于二氯甲烷的硫辛酸逐滴的滴加到上诉混合溶液中，加完硫辛酸后使反应温度上升到室温，搅拌48 h。待反应完全后加入0.1 mol/L 的盐酸将酸化，再用乙酸乙酯将有机相萃取出来。将萃取出的有机相分别用碳酸氢钠和饱和食盐水进行洗涤，用无水硫酸钠干燥。最后以流动相为二氯甲烷：甲醇（20:1）柱层析，最终得到纯的化合物L3。

（4）一种交联小分子胶束纳米载药系统的制备：

将得到的L1溶解在DMF中，配置成浓度为0.1 mmol/mL的溶液。取10 mL水在20 mL小瓶中，在水剧烈搅拌的情况下加入50 uL L1 (0.1 mmol/mL)溶液，最后可以制得浓度为0.5 mmol/L的胶束溶液。向小瓶通入N₂，使瓶内的空气完全排出，用锡箔纸将小瓶包住进行避光处理，在避光的条件下加入催化量的DTT，搅拌过夜后向瓶内通1 h空气，最后将材料加入1KD的透析袋进行透析处理，每12 h换一次水，透析4次，最终得到L1交联的纳米胶束（胶束1），其载药量为58 %。

(5) 一种带有葡萄糖靶向的混合交联小分子胶束纳米载药系统的制备：

将L2溶于DMF中，制备出浓度为0.1 mmol/mL的溶液。在20 mL小瓶中加入10 mL水，在水剧烈搅拌的情况下同时加入50 uL L1（0.1 mmol/mL）和5 uL L2（0.1 mmol/mL），最后得到的L1浓度为0.5 mmol/L的混合纳米胶束。将小瓶通入N₂，使瓶内的空气完全排出，用锡箔纸将小瓶包住进行避光处理，在避光的条件下加入催化量的DTT，搅拌过夜后向瓶内通1h空气，最后将材料加入1KD的透析袋进行透析处理，每12 h换一次水，透析4次，最终得到带有靶向功能的小分子胶束纳米载药系统（胶束2）。

(6) 一种带有PEG长循环的混合交联小分子胶束纳米载药系统的制备：

将L3溶于DMF中，制备出浓度为0.1 mmol/mL的溶液。在20 mL小瓶中加入10 ml水，在水剧烈搅拌的情况下同时加入50 uL L1（0.1mmol/mL）、5 uL L2（0.1mmol/mL）和10 uLL3 (0.1 mmol/mL)，最后得到的L1浓度为0.5 mmol/L的具有长循环功能的混合纳米胶束。将小瓶通入N₂，使瓶内的空气完全排出，用锡箔纸将小瓶包住进行避光处理，在避光的条件下加入催化量的DTT，搅拌过夜后向瓶内通1 h空气，最后将材料加入1KD的透析袋进行透析处理，每12 h换一次水，透析4次，最终得到带有靶向功能的小分子胶束纳米载药系统（胶束3）。

实施例2 小分子交联胶束纳米载药系统的稳定性检测。

分别取5 mL水在10 mL小瓶中，分别标为1号、2号瓶。在水剧烈搅拌的情况下分别加入25 μL L1 (0.1 mmol/ml )溶液，最后可以制得浓度为0.5 mmol/L的胶束溶液。根据前面的方法，根据实施例1（4）的方法将1号小瓶中的胶束交联，最终分别制备出L1交联胶束和L1未交联胶束。分别取4.5 mL L1交联胶束和L1未交联胶束与0.5 mL牛胎血清孵育，在不同时间点分别测两种胶束的DLS值。结果如图5(a)所示，L1交联胶束和L1未交联胶束分别在血清里孵育1 h后，测其孵育前后的粒径变化，L1交联胶束尺寸未发生改变，保持在70 nm左右，而L1未交联胶束则从50 nm下降到仅几纳米，说明L1交联胶束稳定，而L1未交联胶束不稳定。进一步的稀释实验表明：通过实验测得L1的CMC为50.1 umol/L。取浓度为0.5 mmol/L的L1交联胶束稀释到不同浓度（甚至低于CMC），测其粒径变化，发现L1交联胶束的粒径几乎未发生改变，如图5(b)所示。结果表明，交联胶束具有很好的稳定性。

实施例3 交联小分子胶束纳米载药系统的体外释放（酶敏感检测）

纳米胶束的体外释放实验：分别制备出浓度为0.5 mmol/L的L1交联胶束和L1未交联胶束溶液，且调溶液PH=5.5。分别取5 mL材料，将其放置在37℃水浴摇床里,且分别加入40 μL Cathepsin B (5 U/mL)或不加Cathepsin B，震荡、孵育，在设定好的时间点取样100μL，将取出的样品通过高效液相色谱检测每个样品中释放出的药物杰西他滨的含量，最后做出L1交联胶束和L1未交联胶束在有无蛋白酶B存在下的释放曲线，结果如图6所示。从图中可以看出纳米粒子在无蛋白酶B存在的情况下几乎不释放（作为对比，本实施例还进行了纯药的体外释放实验：制备0.5mmol/L的杰西他滨水溶液，取5ml放入透析袋中，再将其放在30ml水溶液中，定时取透析袋外的溶液，通过高效液相色谱测杰西他滨的含量，得到纯药的体外释放曲线，结果显示纯的杰西他滨在1h内即释放完全），而所制备的纳米胶束在蛋白酶B存在情况下能很好的释放，且前4天具有一个明显的药物突释现象，后面一段时间，纳米胶束开始缓慢释放药物，在10天内，L1未交联胶束释放量能达到80%左右，而L1交联胶束释放量能达到70%左右。从实验结果可以看出，我们所制备的纳米载药系统有很好的缓释作用。

实施例4 交联小分子胶束纳米载药系统的体外生物学评价

（1）空白纳米载体体外生物学评价

取8 mL水加入20 mL的安培瓶中，在水剧烈搅拌的条件下加入10 μL硫辛酸母液（C=20 mg/mL ,溶于DMF）形成纳米粒子。将小瓶通入N₂，使瓶内的空气完全排出，用锡箔纸将小瓶包住进行避光处理，在避光的条件下加入催化量的DTT，搅拌过夜后向瓶内通1 h空气，最后将材料加入1KD的透析袋进行透析处理，每12 h换一次水，透析4次，最终得到交联的硫辛酸纳米粒子。

CCK-8法测定交联的硫辛酸纳米粒子对人非小细胞肺癌（A549细胞）和人胚肺成纤维细胞（MRC-5细胞）的体外毒性实验。选择处于生长活跃期的A549细胞和MRC-5细胞接种于96孔板中，培养24 h后，加入不同浓度的交联的硫辛酸，每个浓度设置6个平行样，并设置对照组。继续培养72 h后，用PBS缓冲液（pH 7.4）冲洗后并更换新的培养基，加入CCK-8继续培养2 h，用酶标仪测定490 nm处的吸光值，计算细胞存活率，结果如图7所示。(a)图为空白材料对A549细胞的毒性测试结果，(b)图为空白材料对MRC-5细胞的毒性测试结果。从图中可以明显看出，我们所用的空白纳米载体材料对肿瘤细胞和正常细胞均无明显毒副作用。

（2）载药纳米粒子的体外生物学评价

CCK-8法测定纯药、L1未交联胶束、L1交联胶束（胶束1）、带靶向混合纳米胶束（胶束2）和带有PEG长循环的纳米胶束（胶束3）的体外毒性实验。选择处于生长活跃期的肿瘤细胞接种于96孔板中，培养24 h后，加入不同浓度的纯药以及不同浓度的载药纳米胶束，每个浓度设置6个平行样，并设置对照组。继续培养72 h后，用PBS缓冲液（pH 7.4）冲洗后并更换新的培养基，加入CCK-8，继续培2 h，用酶标仪测定490 nm处的吸光值，计算细胞存活率，结果如图8所示。从图中可以看出纯的杰西他滨具有很好的细胞毒性，L1未交联胶束和L1交联胶束的细胞的毒性较纯药来说相对较差，而当在纳米胶束中加入靶向配体和长循环配体时其表现出比纯药更好的细胞毒性。从材料的体外毒性试验来看，所制备纳米载药胶束适宜肿瘤治疗。

实施例5 交联小分子胶束纳米载药系统的体内生物学评价

在4周龄裸鼠（约20 g）建立肿瘤模型，待肿瘤长至100 mm³时，将小鼠随机分组，每组5只，将杰西他滨、L1未交联胶束、胶束1、胶束2和胶束3配置成一定浓度(所有材料中杰西他滨含量相同)，并且设置一组注射0.9 % NaCl作为对照组，每只老鼠进行尾静脉注射，每只100 μL，每隔3天进行一次尾静脉给药，共给药7次，同时每隔3天对肿瘤大小及小鼠体重记录，观察期为21天。小鼠的体重变化如图9所示，小鼠的肿瘤体积变化如图10所示。从图中可以看出纯的杰西他滨药物有很好的肿瘤治疗效果，但其毒副作用大，使小老鼠的体重下降；而我们所制备的纳米载药胶束对肿瘤细胞也有相对较好的抑制作用，且对小鼠的毒副作用较小，其体重几乎没有太大的变化。从小鼠的体重变化图和肿瘤细胞变化图可以进一步的看出，交联的纳米粒子比未交联的纳米粒子治疗效果好，因为在体内循环过程中，交联的纳米粒子比未交联的纳米粒子更稳定；而当在交联的纳米粒子中加入靶向分子后其治疗效果更进一步，这是由于加入的葡萄糖配体能很好的靶向A549细胞，因此其治疗效果更好；当同时加入靶向分子和长循环分子时，加入的长循环配体能延长纳米粒子在体内的循环时间，更能增强纳米粒子在肿瘤处的富集，因此其治疗效果更好。

实施例6 葡萄糖靶向的交联小分子纳米胶束载药体系的靶向性能评价

靶向胶束与非靶向胶束的流式实验：首先将所制备的非靶向纳米胶束（胶束1）和靶向纳米胶束(胶束2)进行物理包载DiI疏水的荧光分子。选择处于生长活跃期的肿瘤细胞接种于6孔板中，孵育24 h待其长满与孔板中，加入上诉的胶束1和胶束2材料。孵育4 h后，将细胞消化吹散收集与EP管中。将得到的细胞进行离心、吹散再离心操作，左后的离心后的细胞。再将得到的细胞复溶于300 μL的PBS中最后将样品进行流式测试，结果如图10。从实验结果也可以看出胶束1和胶束2与细胞孵育4 h后，具有靶向能力的胶束2入胞能力明显比没有靶向能力的胶束1的细胞摄取能力强，从而也说明靶向分子确实能提高细胞的摄取能力。

实施例7 不同交联基团形成的交联小分子胶束纳米载药系统的体外生物学评价

在上述实施例1中将所述可交联的疏水烷基链分别换成带有丙烯酸酯键的烷基疏水链、带有双键的烷基疏水链、带有三键的烷基疏水链，分别得到三种两亲性小分子。

分别取三种两亲性小分子进行自组装，获得自组装纳米胶束，然后对所得纳米胶束进行内部交联，其中含丙烯酸酯键的两亲性小分子反应活泼，能自交联，交联后形成网状结构；含双键的两亲性小分子可采用紫外光交联方式进行交联；含三键的两亲性小分子采用点击反应进行交联。参照实施例2所述的方法对本实施例中所得的交联纳米胶束和未交联纳米胶束分别的稳定性进行对比，结果与实施例2中的对比结果一致，说明三种内部交联胶束的稳定性均得到了显著提升，可满足纳米载药系统的应用要求。

参照实施例3（5）所述的方法对本实施例中制备的各种自组装纳米胶束进行检测和评价，所得结果与实施例3（5）中结果一致。说明无论采用何种交联基团，只要能对胶束进行内部交联，得到的交联胶束比未交联胶束的生物学效果好。

实施例8 不同敏感键的相关性能评价

在实施例1和实施例7中将亲水药物与疏水链段之间的连接方式分别换成二硫键、缩醛键、腙键和非敏感的直接连接，分别制得不同类型的两亲性小分子。

分别取以上制得的两亲性小分子进行自组装，获得自组装纳米胶束，然后对所得纳米胶束进行内部交联，获得具有不同敏感键的纳米胶束。

按照与实施例3类似的方法检测本实施例中各纳米胶束的环境敏特性，结果显示，通过二硫键连接的两亲性小分子对应的纳米胶束，在谷胱甘肽浓度高于10 mM时（对应肿瘤细胞内的浓度），二硫键能被谷胱甘肽还原打断成巯基，实现药物的突释，展现出还原敏感特性；通过缩醛键连接的两亲性小分子对应的纳米胶束，在PH=5-6.5时（肿瘤微酸环境），缩醛键断裂，实现药物的突释，展现出PH敏感特性；通过腙键连接的两亲性小分子对应的纳米胶束，在PH=5.5时（溶酶体内的PH值），腙键键断裂，实现药物的突释，展现出PH敏感特性；通过非敏感的直接连接的两亲性小分子对应的纳米胶束，未展现出任何环境敏感特性。

参照实施例4和5所述的方法对本实施例中制备的各种自组装纳米胶束进行检测和评价，结果显示通过二硫键连接的两亲性小分子对应的纳米胶束，通过缩醛键连接的两亲性小分子对应的纳米胶束和通过腙键连接的两亲性小分子对应的纳米胶束，对肿瘤细胞显示出明显的细胞毒性。实验证明，通过相关的敏感键连接亲疏水端的纳米胶束载药系统对肿瘤细胞具有一个特异性释放。

实施例9 不同靶向分子的小分子胶束纳米载药系统的相关性能评价

在实施例1中将L2两亲性小分子中的葡萄糖分别换成乳糖/半乳糖、单克隆抗体和CRGD，所得两亲性小分子与本发明中的其他两亲性小分子混合形成自组装体并进行内部交联后得到具有不同主动靶向功能的自组装纳米胶束，其中乳糖/半乳糖与肝癌细胞上过度表达的去唾液酸糖蛋白特异性结合，从而实现主动靶向；单克隆抗体可与人类层纤维细胞活化α-蛋白特异性结合，从而实现主动靶向；CRGD(能与整合素蛋白α_vβ₃特异性结合，从而实现主动靶向。参照实施例4和6所述的方法对带有不同靶向基团的小分子胶束纳米载药系统进行细胞毒性实验和相应细胞内摄取实验，相应的结果与实施例4和6所述的相同。通过该实验进一步证明了具有靶向基团的小分子纳米载药系统能够提高纳米胶束的胞内摄取，从而提高药效。

实施例10 交联小分子胶束纳米载药系统的长循环效果验证

在上述各实施例中制备的任意一种两亲性小分子中，插入具有PEG的两亲性配体L3，然后进行自组装和内部交联获得纳米胶束。

参照实施例5所述的方法对本实施例中制备的各种自组装纳米胶束进行检测和评价，结果与实施例5的结果一致。结果表明，在形成的不同的小分子纳米载药系统中加入具有长循环效果的PEG，其都能延长纳米胶束在血液的循环时间，从而进一步提高纳米载药系统在生物体内的药效。

实施例11不同亲水性药物应用于所述交联小分子纳米载药系统的相关性能评价

在上述各实施例中将亲水性药物分别换成伊立替康和阿扎胞苷，制备所得的一系列内部交联的纳米胶束。参照实施例3、4和5方法对所制备的纳米胶束进性相关性能的评价，其表现出了与杰西他滨作为亲水性药物时基本一致的性能，证明该交联的小分子纳米载药系统适用于各种亲水性药物。另外，将两种或两种以上的连接不同亲水药物的两亲性小分子混合自组装，值得一系列含多种亲水药物的小分子纳米载药系统，药效分析显示所得载药系统具有对应药物的综合药效，证明采用该交联的小分子纳米载药系统可实现多药联用。

Claims (13)

1.一种小分子胶束纳米载药系统，其特征在于，所述载药系统是由两亲性分子自组装形成的纳米胶束，所述两亲性分子中包括两亲性小分子，所述两亲性小分子包括亲水药物和疏水链段，所述亲水药物与疏水链段直接相连形成两亲性分子，所述疏水链段中含有可交联基团，所述疏水链段为硫辛酸，所述载药系统在使用前通过交联剂进行交联。

2.根据权利要求1所述的纳米载药系统，其特征在于，所述载药系统是由一种亲水药物与疏水链形成的两亲性分子组装而成，或者是由多种亲水药物与疏水链分别形成的两亲性分子混合组装而成。

3.根据权利要求1所述的纳米载药系统，其特征在于，所述两亲性小分子由含氨基的亲水药物与硫辛酸通过酰胺键相连而成。

4.根据权利要求1所述的纳米载药系统，其特征在于，其特征在于，所述两亲性小分子结构式如下：

5.根据权利要求1所述的纳米载药系统，其特征在于，所述亲水药物为靶向分子。

6.根据权利要求5所述的纳米载药系统，其特征在于，所述两亲性小分子结构式如下：

7.根据权利要求1所述的纳米载药系统，其特征在于，所述两亲性小分子由亲水药物与硫辛酸通过酯键相连而成。

8.根据权利要求1所述的纳米载药系统，其特征在于，所述亲水药物为具有长循环功能的分子。

9.根据权利要求1所述的纳米载药系统，其特征在于，所述两亲性小分子结构式如下：

10.一种如权利要求1所述的纳米载药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)亲水药物与疏水链段相连，形成两亲性分子；

(2)将步骤(1)中的两亲性分子加入到剧烈搅拌的水中，并控制体系中两亲性分子的浓度大于其临界胶束浓度，得到小分子纳米胶束；

(3)将步骤(2)中小分子纳米胶束通过交联剂进行交联，得到稳定的纳米粒子。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为以硫辛酸和含氨基的亲水性药物为原料进行酰胺化反应，获得两亲性分子。

12.一种如权利要求1所述的纳米载药系统的应用，其特征在于，将其用于制备治疗肿瘤疾病的药物。

13.一种两亲性小分子，其特征在于，包括亲水药物和疏水链段，所述亲水药物与疏水链段直接相连形成两亲性分子，所述疏水链段中含有可交联基团，所述疏水链段为硫辛酸，所述两亲性小分子结构式如下：