CN103977433B - 一种前列腺癌超声诊断靶向试剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种前列腺癌超声诊断靶向试剂及制备方法。所述的靶向试剂为EpDT3适体修饰的全氟溴辛烷纳米粒，所述的EpDT3适体选自：a）EpDT3‑SH：5'‑GCGACUGGUUACCCGGUCG‑(CH2)6‑SH‑3'，且具有2'‑氟代嘧啶修饰，或b）EpDT3‑NH2：5’‑NH2‑spacer‑GCGACUGGUUACCCGGUCG inverted T‑3’，具有2'‑氟代嘧啶，3’‑倒置T帽，并且5’‑氨基通过六乙二醇连接。本发明制备的EpDT3适体修饰的靶向试剂能更多的滞留于肿瘤血管床，具备优异的靶向性，显影效果显著增强。
Description
技术领域
本发明涉及超声诊断所用的靶向试剂，具体地说，涉及一种前列腺癌超声诊断靶向试剂及制备方法。
背景技术
超声检查是前列腺疾病的首选而重要的影像学检查手段，但是目前所有的影像学检查都不能敏感地区分慢性前列腺炎、前列腺肥大与早期前列腺癌，其鉴别诊断仍依赖于有创的经直肠超声引导下前列腺多点穿刺活检。近年来，超声仪器性能改进，新一代声学造影剂的出现为超声诊断开创了新的应用领域。同时，超声造影增强技术（ContrastEnhanced Ultrasound，CEUS）在诊断领域得到进一步发展，已成为诊断前列腺癌的无创性影像学手段之一。研究证明，二者结合可有效增强实质性器官的二维超声影像和血流多普勒信号，明显提高超声诊断的敏感性和特异性。
随着各种新型超声造影剂的出现和超声显像技术的不断发展，微泡造影剂（如国内临床采用Braco公司生产的Sonovue造影剂）开始应用于前列腺病变的检查，但其敏感性较低，特异性不高，是一种无定向选择作用的全身性造影剂。此外，尚有采用全氟溴辛烷等氟碳制备纳米造影剂的报道（张华娟等. 一种全氟碳化合物脂质体纳米球及其制备方法.中国专利，申请号201210549252.0），从而克服微泡造影剂无法达到血管外肿瘤组织成像的目的。但是，前列腺癌病人的临床症状相对隐蔽，这为前列腺癌的诊断带来了很大的困难。国内外近几年已经开始了靶向超声造影剂的相关研究（李浪，等. 携载PSMA单抗靶向前列腺癌的纳米级脂质微泡的制备及体外寻靶能力. 中国医学影像技术，2012；28（8）：1449-1453），通过靶向超声造影剂，使其聚集于靶组织，达到特异性增强显影效果。
近年研究发现上皮细胞黏附分子（epithelial cellular adhesion molecule，EpCAM，又称CD326）是一种高表达于大多数恶性上皮肿瘤细胞表面的糖蛋白，具有加快细胞周期、促进细胞增殖、分化、迁移以及免疫逃逸、肿瘤干细胞特性等多种生物学功能，是目前表达最强的肿瘤表面抗原之一。EpCAM在激素非依赖性前列腺癌细胞株（如PC3、DU145等）、激素依赖性前列腺癌细胞株（如LNCaP、DuCaP）、淋巴结转移前列腺癌细胞中均高表达，转移性难治性前列腺癌病人的血循环前列腺癌细胞80%以上高表达EpCAM，因此EpCAM适合作为前列腺癌诊断和治疗的靶点。
适体（aptamer）是一类相对较短的单链DNA或RNA寡聚核苷酸，在体内以特定的三维结构存在，并与靶蛋白通过高亲和力结合，从而发挥生理作用。适体与靶细胞结合的特异性与单克隆抗体相似，甚至更高。适体没有明显的免疫原性，其介导的靶向药物注入人体内不会引发免疫反应。适体分子体积较小，当适体连接到药物载体表面时，系统的体积不会有很大的增加，使药物载体体积更容易控制。更重要的是适体制备方便，且比单克隆抗体有更高的稳定性，可以在许多缓冲溶液中保存。
Shigdar等设计了多种靶向EpCAM的核酸酶抵抗适体（Shigdar S, Lin J, Yu Y,Pastuovic M, Wei M, Duan W. RNA aptamer against a cancer stem cell markerepithelial cell adhesion molecule. Cancer Sci, 2011; 102(5):991-8），发现仅有19nt的EpDT3适体与EpCAM结合后能够以能量依赖方式通过受体介导的内吞机制进入肿瘤细胞内，因此EpDT3适体有望用于前列腺癌的靶向诊断。
基于上述认知，理论上可以制备EpDT3修饰的靶向超声造影剂，运用于CEUS中，以实现前列腺癌的特异性显影。但是目前关于此类靶向超声造影剂还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种前列腺癌超声诊断靶向试剂。
本发明的再一的目的是，提供上述前列腺癌超声诊断靶向试剂的制备方法。
本发明的另一的目的是，提供上述前列腺癌超声诊断靶向试剂的用途。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种前列腺癌超声诊断靶向试剂，所述的靶向试剂含有全氟溴辛烷纳米粒，所述的全氟溴辛烷纳米粒被EpDT3适体所修饰，所述的EpDT3适体选自：
a）EpDT3-SH：5' - GCGACUGGUUACCCGGUCG- (CH2)6- SH- 3'，且具有2'-氟代嘧啶修饰，或
b）EpDT3-NH2：5’-NH2-spacer-GCGACUGGUUACCCGGUCG inverted T-3’，具有2'-氟代嘧啶，3’-倒置T帽，并且5’-氨基通过六乙二醇连接。
作为本发明的一个实施例，所述的EpDT3适体为EpDT3-SH，所述的靶向试剂是通过以下方法制备的：按全氟溴辛烷纳米粒表面PEG链末端的马来酰亚胺基与EpDT3-SH的疏基反应摩尔比为（1-3）:1，将全氟溴辛烷纳米乳剂与EpDT3-SH溶液混合，室温条件下缓慢搅拌反应6-10小时即得。
所述的全氟溴辛烷纳米粒是通过以下方法制备的：
a）将PLGA-COOH溶解于二氯甲烷中，然后加入缩合剂、催化剂和N-羟基丁二酰亚胺得到活性酯改性的PLGA-NHS，再加入NH2-PEG-MAL和缚酸剂，得到PEG修饰的共聚物PLGA-PEG-MAL；
b）将PLGA-PEG-MAL、全氟溴辛烷加入到二氯甲烷或氯仿中，然后加入一定量的乳化剂及水，超声或均质化制得所述的全氟溴辛烷纳米粒的乳剂，再搅拌令二氯甲烷或氯仿挥发。
作为本发明的另一实施例，所述的EpDT3适体为氨基修饰的EpDT3适体，所述的靶向试剂是通过以下方法制备的：在室温下向全氟溴辛烷纳米粒混悬液中加入EDC、NHS和TEA，温和搅拌活化10-30min，再加入EpDT3-NH2混匀，室温搅拌反应2-4h，超滤分离即得。
所述的全氟溴辛烷纳米粒是通过以下方法制备的：
a）将PLGA-COOH溶解于二氯甲烷中，然后加入缩合剂、催化剂和N-羟基丁二酰亚胺得到活性酯改性的PLGA-NHS，再加入NH2-PEG-COOH和缚酸剂，得到PEG修饰的共聚物PLGA-PEG-COOH；
b）将PLGA-PEG-COOH、全氟溴辛烷加入到二氯甲烷或氯仿中，然后加入一定量的乳化剂及水，超声或均质化制得所述的全氟溴辛烷纳米粒的乳剂，再搅拌令二氯甲烷或氯仿挥发。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述的前列腺癌超声诊断靶向试剂的制备方法，包括以下步骤：
a）将PLGA-COOH溶解于二氯甲烷中，然后加入缩合剂、催化剂和N-羟基丁二酰亚胺得到活性酯改性的PLGA-NHS，再加入NH2-PEG-MAL/NH2-PEG-COOH和缚酸剂，得到PEG修饰的共聚物PLGA-PEG-MAL/PLGA-PEG-COOH；
b）将PLGA-PEG-MAL/PLGA-PEG-COOH、全氟溴辛烷加入到二氯甲烷或氯仿中，然后加入一定量的乳化剂及水，超声或均质化制得所述的全氟溴辛烷纳米粒的乳剂，再搅拌令二氯甲烷或氯仿挥发；
c）按全氟溴辛烷纳米粒表面PEG链末端的马来酰亚胺基与EpDT3-SH的疏基反应摩尔比为（1-3）:1，将PLGA-PEG-MAL制成的全氟溴辛烷纳米的乳剂与EpDT3-SH溶液混合，室温条件下缓慢搅拌反应6-10小时即得所述的靶向试剂；或者
在室温下向PLGA-PEG-COOH制成的全氟溴辛烷纳米粒混悬液中加入EDC、NHS和TEA，温和搅拌活化10-30min，再按全氟溴辛烷纳米粒表面PEG链末端的羧基与EpDT3-NH2的氨基反应摩尔比为（1-3）:1加入EpDT3-NH2混匀，室温搅拌反应2-4h，超滤分离即得所述的靶向试剂。
步骤a）中所述的缩合剂选自EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺）或DCC（二环己基碳二亚胺），步骤a）中所述的催化剂选自三乙胺（TEA）、N，N-二异丙基乙胺（DIEA）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）中的一种或几种的组合，步骤a）中所述的缚酸剂为三乙胺和/或N，N-二异丙基乙胺，步骤b）中所述的乳化剂选自胆酸钠、聚乙烯醇（PVA）、泊洛沙姆、十二烷基硫酸钠（SDS-Na）、吐温80、司盘80中的一种或几种的组合。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
如上任一所述的靶向试剂在制备前列腺癌诊断试剂中的应用。
需要说明的是，所采用的PLGA-COOH为端基为羧基的不同比例的乙交酯、丙交酯所得到的共聚物，优选乙丙交酯比的数值范围为1-3，但不仅限于此；所用的“/”的意思是“或”。
本发明优点在于：本发明将巯基或氨基修饰的EpDT3核酸适体用于修饰全氟溴辛烷纳米粒，制备获得适体靶向的全氟溴辛烷纳米粒前列腺癌超声诊断试剂。通过荷瘤裸鼠靶向显像研究得出，本发明的靶向试剂相比于未加修饰的全氟溴辛烷纳米粒造影剂，能更多的滞留于肿瘤血管床，具备优异的靶向性，显影效果显著提高，同时，相比于使用巯基或氨基化A10-3.2核酸适体修饰的全氟溴辛烷纳米粒造影剂，本发明的靶向试剂显影效果也显著增强，取得了预料不到的技术效果。
具体实施方式
下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1 EpDT3-SH修饰的前列腺癌超声诊断靶向试剂制备（一）
1、巯基修饰的EpDT3适体（EpDT3-SH）的制备
取0.1μmol巯基保护的EpDT3适体（巯基保护的EpDT3适体具体序列组成为5' -GCGACUGGUUACCCGGUCG- (CH2)6- S- S- (CH2)6- OH- 3'），溶于2.5ml 0.1mol/l二硫苏糖醇（DTT）溶液（pH 8.0），室温搅拌反应30分钟，过Glen Gel-Pak™ 2.5脱盐柱（GlenResearch, Sterling, VA）除去未反应的DTT，获得纯的巯基修饰的EpDT3适体。巯基修饰的EpDT3适体具体序列组成为5' - GCGACUGGUUACCCGGUCG- (CH2)6- SH- 3'，且具有2'-氟代嘧啶修饰。EpDT3适体的核苷酸序列编号如SEQ ID NO.1所示。
2、纳米载体材料PLGA-PEG-MAL的合成
取5g PLGA-COOH（乙丙交酯比：75/25）溶于20ml二氯甲烷，加入50mg 缩合剂EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺）、20mg DMAP（4-二甲氨基吡啶）和NHS（N-羟基丁二酰亚胺）30mg，混合均匀，室温下反应24h；然后加入560mg NH2-PEG-MAL（双功能聚乙二醇）和150µL 缚酸剂TEA（三乙胺）继续反应12h，反应结束后采用旋转蒸发仪减压除去二氯甲烷；加入N,N -二甲基甲酰胺（DMF）溶解，把溶液用透析袋透析除掉小分子杂质和未反应掉的PEG，冷冻干燥得到纳米载体材料PLGA-PEG-MAL。核磁分析结果表明，约85%的PEG连接到PLGA上。
3、全氟溴辛烷纳米粒的制备
将20mg PLGA-PEG-MAL、12µL PFOB（全氟溴辛烷）加入0.4ml二氯甲烷溶液中，然后加1%胆酸钠水溶液2 mL，在冰水浴中用均质机混合约60 s，将分散液在冰水浴中用200W功率间断超声180 s后再用均质机间断处理300 s。将所得纳米乳剂在20℃条件下开口搅拌约3小时使二氯甲烷挥发。所得纳米乳剂经激光光散射测定全氟溴辛烷纳米粒粒径为110 nm，PFOB包封率约80%。
4、巯基修饰的EpDT3适体和全氟溴辛烷纳米粒表面的连接
按全氟溴辛烷纳米粒表面PEG链末端的马来酰亚胺基与巯基修饰的EpDT3适体的疏基反应摩尔比为3:1，将全氟溴辛烷纳米乳剂与巯基修饰的EpDT3适体溶液混合，20℃条件下缓慢搅拌反应8小时即得终产物靶向超声造影剂。所得靶向超声造影剂经激光光散射测定其粒径为180 nm，PFOB的含量为2.4mg/g。
实施例2 EpDT3-SH修饰的前列腺癌超声诊断靶向试剂制备（二）
1、巯基修饰的EpDT3适体的制备
具体方法同实施例1。
2、纳米载体材料PLGA-PEG-MAL的合成
取5g PLGA-COOH（乙丙交酯比：75/25）溶于20ml二氯甲烷，加入50mg 缩合剂DCC（二环己基碳二亚胺）、20mg TEA（三乙胺）和NHS 30mg，混合均匀，室温下反应24h；然后加入560mg NH2-PEG-MAL和150µL缚酸剂DIEA（N,N-二异丙基乙胺）继续反应12h，反应结束后采用旋转蒸发仪减压除去二氯甲烷；加入DMF（N,N -二甲基甲酰胺）溶解，把溶液用透析袋透析除掉小分子杂质和未反应掉的PEG，冷冻干燥得到纳米载体材料PLGA-PEG-MAL。核磁分析结果表明，约82%的PEG连接到PLGA上。
3、全氟溴辛烷纳米粒的制备
将20mg PLGA-PEG-MAL、12µL PFOB加入0.4ml氯仿溶液中，然后加1%十二烷基硫酸钠（SDS-Na）水溶液2 mL，在冰水浴中用均质机混合约60 s，将分散液在冰水浴中用200W功率间断超声180 s后再用均质机间断处理300 s。将所得纳米乳剂在20℃条件下开口搅拌约3小时使氯仿挥发。所得纳米乳剂经激光光散射测定全氟溴辛烷纳米粒粒径为110 nm，PFOB包封率约80%。
4、巯基修饰的EpDT3适体和全氟溴辛烷纳米粒表面的连接
按全氟溴辛烷纳米粒表面PEG链末端的马来酰亚胺基与巯基修饰的EpDT3适体的疏基反应摩尔比为2:1，将全氟溴辛烷纳米乳剂与巯基修饰的EpDT3适体溶液混合，20℃条件下缓慢搅拌反应6小时即得终产物靶向超声造影剂。所得靶向超声造影剂经激光光散射测定其粒径为180 nm，PFOB的含量为2.36mg/g。
实施例3 EpDT3-SH修饰的前列腺癌超声诊断靶向试剂制备（三）
1、巯基修饰的EpDT3适体的制备
具体方法同实施例1。
2、纳米载体材料PLGA-PEG-MAL的合成
具体方法同实施例1。
3、全氟溴辛烷纳米粒的制备
将20mg PLGA-PEG-MAL、12µL PFOB加入0.4ml氯仿溶液中，然后加1%聚乙烯醇（PVA）水溶液2 mL，在冰水浴中用均质机混合约60 s，将分散液在冰水浴中用200W功率间断超声180 s后再用均质机间断处理300 s。将所得纳米乳剂在20℃条件下开口搅拌约3小时使氯仿挥发。所得纳米乳剂经激光光散射测定全氟溴辛烷纳米粒粒径为110 nm，PFOB包封率约80%。
4、巯基修饰的EpDT3适体和全氟溴辛烷纳米粒表面的连接
按全氟溴辛烷纳米粒表面PEG链末端的马来酰亚胺基与巯基修饰的EpDT3适体的疏基反应摩尔比为1:1，将全氟溴辛烷纳米乳剂与巯基修饰的EpDT3适体溶液混合，20℃条件下缓慢搅拌反应10小时即得终产物靶向超声造影剂。所得靶向超声造影剂经激光光散射测定其粒径为180 nm，PFOB的含量为2.36mg/g。
实施例4 EpDT3-NH2修饰的前列腺癌超声诊断靶向试剂制备（一）
1、氨基修饰的EpDT3适体（EpDT3-NH2）的制备
委托生物科技公司合成5’ 端通过六乙二醇连接氨基，3’ 端是倒置的T帽结构，RNA 的嘧啶环2’ 位羟基用氟原子取代的适体EpDT3，即氨基修饰的EpDT3适体：EpDT3-NH2，其具体序列组成为5’-NH2-spacer-GCGACUGGUUACCCGGUCG inverted T-3’，具有2'-氟代嘧啶，3’-倒置T帽，并且5’-氨基通过六乙二醇连接。
2、纳米载体材料PLGA-PEG-COOH的合成
取0.25g PLGA-COOH（乙丙交酯比：50/50）溶于3ml二氯甲烷，加入3mg EDC、1mgTEA、4.8mg NHS，混合均匀，室温下搅拌反应24h；然后加入20.4mg NH2-PEG-COOH和7.5mg缚酸剂DIEA（N，N-二异丙基乙胺）继续反应24h，反应结束后采用旋转蒸发仪减压除去二氯甲烷；沉淀用乙醚/甲醇清洗，离心除去未反应的PEG，冷冻干燥得到纳米载体材料PLGA-PEG-COOH。核磁分析结果表明，约80%的PEG连接到PLGA上。
3、全氟溴辛烷纳米粒的制备
将20mg PLGA-PEG-COOH、12µL PFOB加入0.4ml二氯甲烷溶液中，然后与1% PVA水溶液2 mL在冰水浴中用均质机混合约60 s。将分散液在冰水浴中超声120 s后再用均质机处理120 s。将所得纳米乳剂在20℃条件下开口搅拌约3小时使二氯甲烷挥发。然后低温透析5小时得到终产物。所得纳米乳剂粒径经激光光散射测定其水合动力学粒径为105 nm，PFOB包封率约80%。
4、氨基修饰的EpDT3适体和全氟溴辛烷纳米粒表面的连接
在20℃下将40mmol EDC、100mmol NHS及10µL TEA加入2ml全氟溴辛烷纳米粒混悬液中，温和搅拌活化20min，按全氟溴辛烷纳米粒表面PEG链末端的羧基与氨基修饰的EpDT3适体的氨基反应摩尔比为3:1加入氨基修饰的EpDT3适体，混匀，室温搅拌反应3h，超滤分离得到适体修饰的靶向纳米粒。所得靶向超声造影剂经激光光散射测定其粒径为160 nm。
实施例5 EpDT3-NH2修饰的前列腺癌超声诊断靶向试剂制备（二）
1、氨基修饰的EpDT3适体的制备
具体方法同实施例4。
2、纳米载体材料PLGA-PEG-COOH的合成
取0.25g PLGA-COOH（乙丙交酯比：50/50）溶于3ml二氯甲烷，加入3mg EDC、4.8mgNHS、1mg DMAP，混合均匀，室温下搅拌反应24h；然后加入20.4mg NH2-PEG-COOH和7.5mg缚酸剂TEA继续反应24h，反应结束后采用旋转蒸发仪减压除去二氯甲烷；沉淀用乙醚/甲醇清洗，离心除去未反应的PEG，冷冻干燥得到纳米载体材料PLGA-PEG-COOH。核磁分析结果表明，约82%的PEG连接到PLGA上。
3、全氟溴辛烷纳米粒的制备
将20mg PLGA-PEG-COOH、12µL PFOB加入0.4ml氯仿溶液中，然后与2%泊洛沙姆水溶液2 mL在冰水浴中超声约1 min。将分散液在冰水浴中超声120 s后再超声3 min。将所得纳米乳剂在20℃条件下开口搅拌约3小时使氯仿挥发。然后低温透析5小时得到终产物。所得纳米乳剂粒径经激光光散射测定其水合动力学粒径为105 nm。
4、氨基修饰的EpDT3适体和全氟溴辛烷纳米粒表面的连接
在20℃下将40mmol EDC、100mmol NHS、10µL TEA加入2ml全氟溴辛烷纳米粒混悬液中，温和搅拌活化10min，按全氟溴辛烷纳米粒表面PEG链末端的羧基与氨基修饰的EpDT3适体的氨基反应摩尔比为2:1加入氨基修饰的EpDT3适体，混匀，室温搅拌反应4h，超滤分离得到适体修饰的靶向纳米粒。所得靶向超声造影剂经激光光散射测定其粒径为160 nm。
实施例6 EpDT3-NH2修饰的前列腺癌超声诊断靶向试剂制备（三）
1、氨基修饰的EpDT3适体的制备
具体方法同实施例4。
2、纳米载体材料PLGA-PEG-COOH的合成
具体方法同实施例4。
3、全氟溴辛烷纳米粒的制备
将20mg PLGA-PEG-COOH、12µL PFOB加入0.4ml二氯甲烷溶液中，然后与1%泊洛沙姆水溶液2 mL在冰水浴中用均质机混合约60 s。将分散液在冰水浴中超声120 s后再用均质机处理120 s。将所得纳米乳剂在20℃条件下开口搅拌约3小时使二氯甲烷挥发。然后低温透析5小时得到终产物。所得纳米乳剂粒径经激光光散射测定其水合动力学粒径为105nm，PFOB包封率约80%。
4、氨基修饰的EpDT3适体和全氟溴辛烷纳米粒表面的连接
在20℃下将40mmol EDC、100mmol NHS及10µL TEA加入2ml全氟溴辛烷纳米粒混悬液中，温和搅拌活化30min，按全氟溴辛烷纳米粒表面PEG链末端的羧基与氨基修饰的EpDT3适体的氨基反应摩尔比为1:1加入氨基修饰的EpDT3适体，混匀，室温搅拌反应3h，超滤分离得到适体修饰的靶向纳米粒。所得靶向超声造影剂经激光光散射测定其粒径为160 nm。
实施例7 本发明的前列腺癌超声诊断靶向试剂的靶向显影实验
一、实验材料与仪器
BALB／c-nu裸鼠50，雄性，4～6周龄，体质量18～22 g，平均（20±2）g。人前列腺癌细胞株LNCaP。ATL HDI 5000彩色多普勒超声诊断仪。
二、实验方法
1.建立荷人前列腺癌裸鼠移植瘤模型：常规培养LNCaP细胞，制备细胞悬液。BALB/c-nu裸鼠按1-50编号，每鼠无菌条件下消毒局部，分别于颈背部和腋下部皮下注射LNCaP人前列腺癌细胞悬液0.1ml，细胞数约1.0×107个/ml，定期观察肿瘤的生长情况。
2.研究方案：肉眼观察裸鼠瘤体长至直径约1.0cm左右时，进行荷瘤裸鼠超声造影检查。50只实验鼠随机分为5组，每组10只。实验前将检查室用紫外线灯照射1h，实验人员穿无菌衣，戴无菌手套。将裸鼠瘤体置于温水浴中，探头与瘤体之间距离约1.0cm左右。采用C5-2探头FICon/Gen条件扫查，探头中心频率3.5MHz，图像深度5.0-6.0cm，平均灰度40，TGC居中，机械指数1.4，以上条件在实验过程中保持不变。造影前每只实验鼠均先行能量多普勒血流检查，然后经尾静脉分别推注造影剂。普通组：全氟溴辛烷纳米粒造影剂；EpDT3-SH组：实施例1制备的超声诊断靶向试剂；EpDT3-NH2组：实施例4制备的超声诊断靶向试剂；A10-3.2-SH组：按照实施例1的方法制备的A10-3.2-SH修饰的前列腺癌超声诊断靶向试剂，不同之处仅在于使用巯基修饰的A10-3.2适体来修饰全氟溴辛烷纳米粒，巯基修饰的A10-3.2适体序列组成为 5'-GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCU- (CH2)6- SH- 3'，且具有2'-氟代嘧啶修饰；A10-3.2-NH2组：按照实施例4的方法制备的A10-3.2-NH2修饰的前列腺癌超声诊断靶向试剂，不同之处仅在于使用氨基修饰的A10-3.2适体来修饰全氟溴辛烷纳米粒，A10-3.2适体序列组成为5’-NH2-spacer-GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCU inverted T-3’ ，具有2'-氟代嘧啶，3’-倒置T帽，并且5’-氨基通过六乙二醇连接。A10-3.2适体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。每只实验鼠推注造影剂0.05ml，12min后行能量多普勒显像，显示肿瘤能量多普勒信号增强图像，按照2min内每5s、2min后每30s，连续观察5min，将图像以BMP格式存入电脑硬盘，继续观察直至信号完全消失。实验中密切观察实验鼠生命体征变化。
3.资料分析：以Photoshop软件对存入硬盘的BMP图像进行分析。选取肿瘤区域为感兴趣区，以直方图法测量能量图肿瘤最大截面内血流信号与该截面的像素数，计算肿瘤界面内血流信号所占的面积比（blood flow area ratio，BFAR）。本研究中，BFAR=肿瘤内血流面积/肿瘤截面面积。比较每组不同时间点的BFAR，观察其变化趋势，并记录其峰值。
三、统计学方法
采用SPSS10.0软件对各组造影后能量多普勒显像的BFAR峰值进行配对t检验。
四、实验结果
1、成功建立荷人前列腺癌裸鼠模型
50只裸鼠均于颈背部皮下和腋下长出肿瘤结节，经测量最小者约0.8×0.9cm，最大者约1.4×1.5cm，呈椭圆形或结节状，突出于体表，质稍硬，瘤体表面呈粉红色，肉眼可见移植瘤组织表面有细小的血管分支。模型建立过程中无动物死亡。实验过程中生命体征平稳。
2、荷瘤裸鼠能量多普勒显像
每只实验鼠造影前肿瘤组织行能量多普勒血流检测，可见瘤体周边散在的环绕血流信号和内部稀疏的点状血流信号，经尾静脉推注携带巯基修饰EpDT3适体-SH或氨基修饰适体EpDT3-NH2的靶向造影剂12min后行能量多普勒显像，视觉观察实验鼠瘤体周边及内部能量多普勒信号明显增多，而后能量多普勒信号逐渐减少，持续显影时间约2.5min，而普通组、A10-3.2-SH组和A10-3.2-NH2组的实验鼠在推注相应造影剂12min后，瘤体内能量多普勒信号与造影前相比变化不明显。
3、统计学分析
结果见表1。EpDT3-SH组和EpDT3-NH2组的BFAR峰值造影前后差异均有统计学意义（P<0.01），A10-3.2-SH组和A10-3.2-NH2组造影前后差异也有统计学意义（P<0.05），而普通组造影前后差异无统计学意义（P>0.05）。造影后，EpDT3-SH组和EpDT3-NH2组分别与普通组比较，BFAR差异有统计学意义（P<0.01），分别与A10-3.2-SH组比较，BFAR差异有统计学意义（P<0.05），分别与A10-3.2-NH2组比较，BFAR差异有统计学意义（P<0.05）。以上结果表明实施例1和3制备的造影剂更多的滞留于肿瘤血管床，具备优异的靶向性。
表1 能量多普勒显像后各组BFAR峰值（%，±S）
SEQUENCE LISTING
<110> 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院
<120> 一种前列腺癌超声诊断靶向试剂及制备方法
<130> /
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcgacugguu acccggucg 19
<210> 2
<211> 39
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
gggaggacga ugcggaucag ccauguuuac gucacuccu 39
Claims (8)
1.一种前列腺癌超声诊断靶向试剂，所述的靶向试剂为全氟溴辛烷纳米粒，其特征在于，所述的全氟溴辛烷纳米粒被EpDT3适体所修饰，所述的EpDT3适体选自：
a）EpDT3-SH：5' - GCGACUGGUUACCCGGUCG- (CH2)6- SH- 3'，且具有2'-氟代嘧啶修饰，或
b）EpDT3-NH2：5' -NH2-spacer-GCGACUGGUUACCCGGUCG inverted T-3'，具有2'-氟代嘧啶，3'-倒置T帽，并且5'-氨基通过六乙二醇连接，所述spacer即六乙二醇。
2.根据权利要求1所述的前列腺癌超声诊断靶向试剂，其特征在于，所述的EpDT3适体为EpDT3-SH，所述的靶向试剂是通过以下方法制备的：按全氟溴辛烷纳米粒表面PEG链末端的马来酰亚胺基与EpDT3-SH的巯基反应摩尔比为（1-3）:1，将全氟溴辛烷纳米乳剂与EpDT3-SH溶液混合，室温条件下缓慢搅拌反应6-10小时即得。
3.根据权利要求2所述的前列腺癌超声诊断靶向试剂，其特征在于，所述的全氟溴辛烷纳米粒是通过以下方法制备的：
a）将PLGA-COOH溶解于二氯甲烷中，然后加入缩合剂、催化剂和N-羟基丁二酰亚胺得到活性酯改性的PLGA-NHS，再加入NH2-PEG-MAL和缚酸剂，得到PEG修饰的共聚物PLGA-PEG-MAL；
b）将PLGA-PEG-MAL、全氟溴辛烷加入到二氯甲烷或氯仿中，然后加入一定量的乳化剂及水，超声或均质化制得所述的全氟溴辛烷纳米粒的乳剂，再搅拌令二氯甲烷或氯仿挥发。
4.根据权利要求1所述的前列腺癌超声诊断靶向试剂，其特征在于，所述的EpDT3适体为EpDT3-NH2，所述的靶向试剂是通过以下方法制备的：在室温下向全氟溴辛烷纳米粒混悬液中加入EDC、NHS和TEA，温和搅拌活化10-30min，再加入EpDT3-NH2混匀，室温搅拌反应2-4h，超滤分离即得。
5.根据权利要求4所述的前列腺癌超声诊断靶向试剂，其特征在于，所述的全氟溴辛烷纳米粒是通过以下方法制备的：
a）将PLGA-COOH溶解于二氯甲烷中，然后加入缩合剂、催化剂和N-羟基丁二酰亚胺得到活性酯改性的PLGA-NHS，再加入NH2-PEG-COOH和缚酸剂，得到PEG修饰的共聚物PLGA-PEG-COOH；
b）将PLGA-PEG-COOH、全氟溴辛烷加入到二氯甲烷或氯仿中，然后加入一定量的乳化剂及水，超声或均质化制得所述的全氟溴辛烷纳米粒的乳剂，再搅拌令二氯甲烷或氯仿挥发。
6.权利要求1所述的前列腺癌超声诊断靶向试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a）将PLGA-COOH溶解于二氯甲烷中，然后加入缩合剂、催化剂和N-羟基丁二酰亚胺得到活性酯改性的PLGA-NHS，再加入NH2-PEG-MAL或NH2-PEG-COOH，同时加入缚酸剂，得到PEG修饰的共聚物PLGA-PEG-MAL/PLGA-PEG-COOH；
b）将PLGA-PEG-MAL/PLGA-PEG-COOH、全氟溴辛烷加入到二氯甲烷或氯仿中，然后加入一定量的乳化剂及水，超声或均质化制得所述的全氟溴辛烷纳米粒的乳剂，再搅拌令二氯甲烷或氯仿挥发；
c）按全氟溴辛烷纳米粒表面PEG链末端的马来酰亚胺基与EpDT3-SH的巯基反应摩尔比为（1-3）:1，将PLGA-PEG-MAL制成的全氟溴辛烷纳米的乳剂与EpDT3-SH溶液混合，室温条件下缓慢搅拌反应6-10小时即得所述的靶向试剂；或者
在室温下向PLGA-PEG-COOH制成的全氟溴辛烷纳米粒混悬液中加入EDC、NHS和TEA，温和搅拌活化10-30min，再按全氟溴辛烷纳米粒表面PEG链末端的羧基与EpDT3-NH2的氨基反应摩尔比为（1-3）:1加入EpDT3-NH2混匀，室温搅拌反应2-4h，超滤分离即得所述的靶向试剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤a）中所述的缩合剂选自1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺或二环己基碳二亚胺，步骤a）中所述的催化剂选自三乙胺、N，N-二异丙基乙胺DIEA和4-二甲氨基吡啶中的一种或几种的组合，步骤a）中所述的缚酸剂为三乙胺和/或N，N-二异丙基乙胺，步骤b）中所述的乳化剂选自胆酸钠、聚乙烯醇、泊洛沙姆、十二烷基硫酸钠、吐温80、司盘80中的一种或几种的组合。
8.权利要求1-5任一所述的靶向试剂在制备前列腺癌诊断试剂中的应用。
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