CN101218280A - 胞苷代谢拮抗剂的聚合衍生物 - Google Patents

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Abstract

[问题]提供一种低剂量即可发挥高疗效的胞苷代谢拮抗剂的衍生物。[解决问题的方式]一种胞苷代谢拮抗剂的聚合衍生物，其包含高分子化合物和胞苷代谢拮抗剂，其中所述高分子化合物含有聚乙二醇部分和侧链含羧基的聚合物部分，所述聚合衍生物的结构为所述高分子化合物侧链中的羧基和所述胞苷代谢拮抗剂中的氨基结合在一起形成酰胺键。

Description

胞苷代谢拮抗剂的聚合衍生物
技术领域
本发明涉及胞苷抗代谢剂的聚合衍生物、其应用及其生产方法。
背景技术
已经开发了用于治疗恶性肿瘤或病毒性疾病的各种胞苷抗代谢剂；如阿糖胞苷、吉西他滨等在临床上用作抗肿瘤剂(抗癌剂)，扎西他滨、拉米夫定等用作抗病毒剂。
然而，许多这些胞苷抗代谢剂需要以高剂量给药，才能充分发挥其效力，因为尽管它们在体外有很高的活性，但它们在体内易被代谢和排泄掉。例如，吉西他滨在体外具有强烈抑制细胞生长的活性，与抗癌剂如紫杉醇和多柔比星相当，但在临床上每次给药需要1,000mg/m2体表面积的高剂量。认为这是由于碱基4位氨基被胞苷脱氨酶分解代谢而失活，这种酶是2′-脱氧胞苷的分解代谢酶，能降低其体内利用度(参见非专利文献1)。
使药物结合于聚合物有时可改善其体内药代动力学，以增强治疗效果。非专利文献2描述了阿糖胞苷结合于平均分子量约为30,000的聚谷氨酸的聚合衍生物。然而，药物的聚合衍生物有时会诱导超敏反应(因免疫反应引起)，在这种情况下，就不能作为药物反复给药。
专利文献1描述了胞苷衍生物结合于聚乙二醇的聚合衍生物，非专利文献3描述了阿糖胞苷结合于两端具有取代的天冬氨酸的支链形式聚乙二醇的天冬氨酸聚合衍生物。然而，这也可能有一个问题，即这些聚合衍生物在临床上的疗效可能受患者间个体差异的显著影响，因为药物从此种衍生物释放很大程度上取决于体内酶的水解作用。
专利文献2描述了使药物结合于聚乙二醇与聚天冬氨酸缩合形成胶束所获得的嵌段型聚合物而产生的分子，来提供药品。此外，专利文献3描述了使抗癌物质结合于聚乙二醇与聚谷氨酸缩合获得的嵌段型聚合物的谷氨酸侧链羧基所形成的聚合物。然而，这些专利文献没有提及胞苷抗代谢剂类结合药物。
非专利文献1：Cancer Science，Japanese Cancer Association，第95卷，第105-111页(2004)
非专利文献2：Cancer Research，American Association for Cancer Research，第44卷，第25-30页(1984)
非专利文献3：Journal of Controlled Release(Elsevier，England)，第79卷：第55-70页(2002)
专利文献1：日本专利申请特表(KOHYO)No.2003-524028
专利文献2：日本专利号2694923
专利文献3：日本专利申请特开(KOKAI)No.05-000955
发明内容
本发明解决的问题
本发明的目的是提供低剂量具有较高效力的用作新型抗癌剂或抗病毒剂的胞苷抗代谢剂。
解决问题的方式
深入研究解决上述问题的方式后，本发明者发现了一种胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，特别是结构为胞苷抗代谢剂4位氨基与由聚乙二醇部分和侧链含羧基的聚合物部分组成的高分子化合物的羧基形成酰胺键连接的衍生物，从而获得本发明。
具体说，本发明涉及以下(1)-(13)：
(1)一种胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其结构为胞苷抗代谢剂的氨基与由聚乙二醇部分和侧链含羧基的聚合物部分组成的高分子化合物侧链中的羧基形成酰胺键连接。
(2)如上述第(1)项所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其中侧链含羧基的聚合物部分包含聚谷氨酸链。
(3)如上述第(1)或(2)项所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其中所述衍生物是通式(1)代表的化合物：
[式1]
Figure S2006800161666D00031
式中，R代表氢原子或C1-C6烷基；A代表氢原子、C1-C6酰基或C1-C6烷氧基羰基；m作为平均值是3-200；n作为平均值是5-2,000；X代表胞苷抗代谢剂残基、羟基或疏水性取代基；3-100％的m中，X代表胞苷抗代谢剂残基，0-95％的m中，X代表羟基，0-80％的m中，X代表疏水性取代基。
(4)如上述第(3)项所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其中，R代表C1-C3烷基；A代表C2-C4酰基；m作为平均值是5-100；n作为平均值是50-1,000；胞苷抗代谢剂残基是式(2)代表的基团：
[式2]
Figure S2006800161666D00032
式中，Z代表氢原子或氟原子；-Rf代表选自式(3)取代基的基团：
[式3]
Figure S2006800161666D00033
(5)如上述第(3)项所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其中，R代表甲基；A代表乙酰基；m作为平均值是10-60；n作为平均值是100-300；X代表胞苷抗代谢剂残基或羟基；胞苷抗代谢剂的代表是阿糖胞苷、吉西他滨或5′-脱氧-5-氟胞苷。
(6)如上述第(3)或(4)项所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其中，疏水性取代基的代表是式(4)的α-氨基酸衍生物：
[式4]
Figure S2006800161666D00041
式中，Q代表天然氨基酸侧链；W代表C1-C6烷基或苄基。
(7)如上述第(6)项所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其中，Q代表异丙基或苄基；W代表苄基。
(8)如上述第(3)或(4)项所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其中所述疏水性取代基的代表是式(5)所示的基团：
[式5]
O-T    (5)
式中，T代表用苯基任选取代的C1-C6烷基。
(9)如上述第(8)项所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其中T代表苄基、3-苯基丙基、4-苯基丁基或5-苯基戊基。
(10)如上述第(8)项所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其中，R代表甲基；A代表乙酰基；m作为平均值是10-60；n作为平均值是100-300；所述胞苷抗代谢剂的代表是阿糖胞苷、吉西他滨或5′-脱氧-5-氟胞苷；所述疏水性取代基的代表是苄氧基、4-苯基丁氧基、(1-苄氧基羰基-2-甲基)丙基氨基或(1-苄氧基羰基-2-苯基)乙基氨基。
(11)一种抗癌剂，其含有第(1)-(10)项中任一项所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物作为药用成分。
(12)一种抗病毒剂，其含有第(1)-(10)项中任一项所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物作为药用成分。
(13)一种生产第(1)-(10)项中任一项所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物的方法，所述方法包括在有机溶剂中用脱水缩合剂使胞苷抗代谢剂的氨基与由聚乙二醇部分和侧链含羧基的聚合物部分组成的高分子化合物侧链中的羧基形成酰胺连接。
技术效果
本发明的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物的结构为：胞苷抗代谢剂4位氨基与由聚乙二醇部分和侧链含羧基的聚合物部分组成的高分子化合物的羧基形成酰胺键连接。该衍生物在体内缓慢释放胞苷抗代谢剂，可用作低剂量具有出色疗效的抗癌剂或抗病毒剂。此外，酶非依赖性缓释药物的这种特性使该衍生物成为疗效受患者个体差异影响较小的药物。能形成胶束的聚合衍生物在患病部位选择性累积，成为副作用少、效力较高的药物。
附图简要说明
图1是显示没有酶时药物释放时程的图；和
图2是显示小鼠血浆中药物释放时程的图。
本发明的最佳实施方式
本发明的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物的结构为：胞苷抗代谢剂氨基与由聚乙二醇部分和侧链含羧基的聚合物部分组成的高分子化合物侧链中的羧基形成酰胺键连接。
出于本发明目的，″胞苷抗代谢剂″不受特别限制，只要它是4-氨基嘧啶-2-酮衍生物，而是具有抗肿瘤或抗病毒活性的化合物，″胞苷抗代谢剂″指式(2)所示化合物，其中核酸的碱基部分是胞嘧啶(其中Z是氢原子)或5-氟胞嘧啶(其中Z是氟原子)；与其结合的基团(Rf)是选自上述式(3)取代基的基团。
其具体例子包括阿糖胞苷、吉西他滨、2′-脱氧-2′-亚甲基胞苷(DMDC)、替扎他滨、扎西他滨、拉米夫定、5′-脱氧-5-氟胞苷(5′-DFCR)、曲沙他滨、2′-C-氰基-2′-脱氧-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶(CNDAC)、3′-乙炔基胞苷和(-)-β-L-二氧戊环胞苷。
在本发明中，″由聚乙二醇部分和侧链含羧基的聚合物部分组成的高分子化合物″中侧链含羧基的聚合物部分，包括羧酸链为聚合物主链分枝的接枝型聚合物，或缩合了聚羧酸聚合物的嵌段型聚合物。
例如，侧链含羧基的聚合物部分是接枝型聚合物的高分子化合物的例子包括例如：通过聚乙二醇和丙烯酸的缩合物与丙烯酸、顺丁烯二酸酐等发生共聚反应，然后发生任选的水解反应(如日本专利申请特开(KOKAI)No.11-279083所述)获得的聚合物。
侧链含羧基的聚合物部分是嵌段型聚合物的高分子化合物的例子包括：含有末端官能团的聚乙二醇结合于末端含有官能团的聚羧酸形成的化合物，或用末端含氨基的聚乙二醇开始聚合的氨基酸活化化合物的聚合反应获得的化合物(如专利文献3所述)。
侧链含羧基的聚合物的例子包括聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚苹果酸和聚谷氨酸；优选的是聚谷氨酸。
出于本发明目的，″聚乙二醇″可以是聚乙二醇衍生物，其两端或一端被修饰，修饰两端的基团可以相同或不同。末端修饰基团的例子包括任选地具有取代基的C1-C6烷基；优选任选地具有取代基的C1-C4烷基。
任选地具有取代基的C1-C6烷基中C1-C6烷基的例子包括直链、支链或环状C1-C6烷基。其具体例子包括：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、2-甲基丁基、新戊基、1-乙基丙基、己基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、环丙基、环戊基和环己基。优选的是C1-C4烷基；其具体例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基和叔丁基。特别优选的是甲基、乙基、正丙基或异丙基。
任选地具有取代基的C1-C6烷基中的取代基不受特别限制；因而，其例子包括氨基、甲基氨基、二甲基氨基、乙基氨基和二乙基氨基。优选的是氨基。
在本发明中，优选两端被修饰的聚乙二醇衍生物。其具体例子包括一端含有C1-C6烷基、另一端含有氨基-C1-C6烷基的聚乙二醇衍生物。优选的是一端含有C1-C3烷基、另一端含有氨基-C1-C4烷基的聚乙二醇衍生物。特别优选的是一端含有甲基、另一端含有氨基丙基的聚乙二醇衍生物。
在本发明中，″聚乙二醇″的重均分子量约为200-500,000，优选约为500-100,000，更优选约为2,000-50,000。
在本发明中，″由聚乙二醇部分和侧链含羧基的聚合物部分组成的高分子化合物″优选为嵌段型聚合物，更优选为聚乙二醇与侧链含羧基的聚合物形成的嵌段共聚物。
聚乙二醇与侧链含羧基的聚合物形成的嵌段共聚物的例子包括：烷氧基聚乙二醇-聚丙烯酸、烷氧基聚乙二醇-聚甲基丙烯酸和烷氧基聚乙二醇-聚谷氨酸；优选为甲氧基聚乙二醇-聚谷氨酸。
在本发明中，″由聚乙二醇部分和侧链含羧基的聚合物部分组成的高分子化合物″每个分子中平均羧基数量约为3-200，优选约为5-100，更优选约为10-60。
在本发明中，″由聚乙二醇部分和侧链含羧基的聚合物部分组成的高分子化合物″的重均分子量约为500-500,000，优选约为2,000-100,000，更优选约为3,000-50,000。
在本发明中，与由聚乙二醇部分和侧链含羧基的聚合物部分组成的高分子化合物酰胺键连接的胞苷抗代谢剂的量不受特别限制，只要它在一个至各高分子化合物的羧基总数的范围内，可以是该化合物体内给药时足以发挥药效的任一数目。优选为聚合物羧基总数的3-100％，更优选5-70％。
可通过本发明化合物的紫外吸收光谱的强度测定上述键合数目。也可对本发明的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物进行碱水解，(例如)用高效液相色谱确定胞苷抗代谢剂释放量，从而确定该数目。
可作为本发明胞苷抗代谢剂的聚合衍生物的典型化合物是上述通式(1)的化合物，式中，R代表氢原子或C1-C6烷基；A代表氢原子、C1-C6酰基或C1-C6烷氧基羰基；m作为平均值是3-200；n作为平均值是5-2,000；X代表胞苷抗代谢剂残基、羟基或疏水性取代基；3-100％的m中，X代表胞苷抗代谢剂残基，0-95％的m中，X代表羟基，0-80％的m中，X代表疏水性取代基。
在式(1)中，R代表的C1-C6烷基与上述烷基含义相同；优选基团也与上述基团相同。
就式(1)的A而言，C1-C6酰基的例子包括：甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、新戊酰基和己酰基。优选的是C2-C4酰基，例如乙酰基或丙酰基；更优选的是乙酰基。
就式(1)的A而言，C1-C6烷氧基羰基的例子包括：甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、异丙氧基羰基、正丁氧基羰基、叔丁氧基羰基、戊氧基羰基、己氧基羰基、环丙氧基羰基、环戊氧基羰基和环己氧基羰基。优选的是甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、异丙氧基羰基、丁氧基羰基或叔丁氧基羰基；更优选的是乙氧基羰基或叔丁氧基羰基。
在式(1)中，m作为平均值是3-200，优选5-100，更优选10-60。
在式(1)中，n作为平均值是5-2,000，优选50-1,000，更优选100-300。
在本发明胞苷抗代谢剂的聚合衍生物的通式(1)中，其中X是胞苷抗代谢剂残基、羟基或疏水性取代基的谷氨酸衍生物可以随机结合或通过形成嵌段结合。
在式(1)中，X代表的胞苷抗代谢剂残基指上述胞苷抗代谢剂的残基；胞苷抗代谢剂的特别优选的例子包括阿糖胞苷、吉西他滨和5′-脱氧-5-氟胞苷。
在式(1)中，X代表的疏水性取代基的例子包括各种取代基；所述取代基不受特别限制，只要它不损害胞苷抗代谢剂的聚合衍生物药效的发挥。然而，其优选例子包括上述式(4)所示的α-氨基酸衍生物以及上述式(5)所示基团，式(4)中Q代表中性氨基酸的侧链，W代表C1-C6烷基或苄基；式(5)中T代表用苯基任选取代的C1-C6烷基。
式(4)中Q代表的中性氨基酸的侧链的例子包括：天然氨基酸残基的侧链，如氢原子、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、苄基、羟甲基、1-羟乙基、氨甲酰基甲基和2-氨甲酰基乙基，以及氨基酸残基衍生物的侧链，如叔丁氧基甲基、苄氧基甲基、苄氧基羰基甲基和2-苄氧基羰基乙基。其优选例子包括异丙基、异丁基、仲丁基、苄基、苄氧基甲基、苄氧基羰基甲基和2-苄氧基羰基乙基；更优选的是异丙基、苄基、苄氧基甲基或2-苄氧基羰基乙基；尤其优选的是异丙基或苄基。
式(4)中W代表的C1-C6烷基的例子包括与上述烷基相同的基团；优选基团与上述基团相同。
式(5)中T代表的C1-C6烷基与上述烷基含义相同；优选基团也与上述基团相同。式(5)所示基团的例子包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、正己氧基、环丙氧基、环戊氧基、环己氧基、环己基甲氧基、苄氧基、2-苯乙基氧基、3-苯基丙氧基、4-苯基丁氧基、5-苯基戊氧基和二苯基甲氧基。
疏水性取代基的例子也包括氨基如甲基氨基、乙基氨基、正丙基氨基、异丙基氨基、正丁基氨基、异丁基氨基、正戊基氨基、正己基氨基、环丙基氨基、环戊基氨基、环己基氨基、环己基甲基氨基、二环己基甲基氨基、苯胺基、苄基氨基、2-苯乙基氨基、3-苯基丙基氨基、4-苯基丁基氨基和二苯基甲基氨基。
式(1)中X代表的疏水性取代基特别优选苄氧基、3-苯基丙氧基、4-苯基丁氧基、5-苯基戊氧基、(1-苄氧基羰基-2-甲基)丙基氨基或(1-苄氧基羰基-2-苯基)乙基氨基，更特别优选为苄氧基、4-苯基丁氧基、(1-苄氧基羰基-2-甲基)丙基氨基或(1-苄氧基羰基-2-苯基)乙基氨基。
在式(1)中，根据该聚合物的羧基总数(m)计，X是胞苷抗代谢剂残基的比例为3-100％，优选5-70％；以m计，X是羟基的比例是0-95％，优选5-70％；以m计，X是疏水性取代基的比例为0-80％，优选20-70％。
在本发明胞苷抗代谢剂的聚合衍生物中，当存在胞苷抗代谢剂未结合的侧链羧基时，该羧基可以是其游离形式或者是其碱性盐形式。获得其游离形式时，可用其已知的方法或基于其的方法将该羧基转变为所需的盐形式。反之，获得其盐形式时，可用其已知的方法或基于其的方法将羧基转变为游离形式或另一种所需的盐形式。
碱性盐的例子包括锂、钠、钾、镁、铵和三乙胺的盐。
在本发明胞苷抗代谢剂的聚合衍生物中，存在光学异构体时，组成侧链含羧基的聚合物部分的结构单元可以是光学活性物质、其外消旋体或其任何比例二者的混合物。例如，侧链含羧基的聚合物部分是聚谷氨酸衍生物时，该衍生物可以是聚-L-谷氨酸、聚-D-谷氨酸和侧链-取代的L-谷氨酸或侧链-取代的D-谷氨酸以任何顺序、任何比例结合形成的聚合物。
本发明胞苷抗代谢剂的聚合衍生物的特别优选的例子包括下表1所示的化合物。
在表1中，Bzl指苄基；Val，缬氨酸；Phe，苯丙氨酸；C4H8Ph，4-苯基丁基。在X中，取代百分数为近似值；表中所示残基和基团以外的其它基团是羟基。作为X的胞苷抗代谢剂，阿糖胞苷、吉西他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、2′-脱氧-2′-亚甲基胞苷(DMDC)、3′-乙炔基胞苷、2′-C-氰基-2′-脱氧-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶(CNDAC)和(-)-β-L-二氧戊环胞苷是以下化合物。
[式6]
Figure S2006800161666D00101
阿糖胞苷                     吉西他滨         5′-脱氧-5-氟胞苷
Figure S2006800161666D00102
2′-脱氧-2′-亚甲基胞苷                            3′-乙炔基胞苷
Figure S2006800161666D00103
2′-C-氰基-2′-脱氧-1-b-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶
Figure S2006800161666D00104
(-)-b-L-二氧戊环胞苷
[表1]
No. R   n(平均值)   m(平均值) A    X：胞昔抗代谢剂(百分数)  X：疏水性取代基(百分数)
1 CH3 272 32 CH3CO    阿糖胞苷(30％)  OBzl(50％)
2 CH3 272 32 CH3CO    阿糖胞苷(30％)  Phe-OBzl(40％)
3 CH3 272 25 CH3CO    阿糖胞苷(20％)  Phe-OBzl(60％)
4 CH3 272 23 CH3CO    吉西他滨(15％)  Phe-OBzl(60％)
5 CH3 272 23 CH3CO    吉西他滨(15％)  Val-OBzl(60％)
6 CH3 272 23 CH3CO    吉西他滨(15％)  OC4H8Ph(60％)
7 CH3 272 26 CH3CO    吉西他滨(30％)  OBzl(50％)
8 CH3 272 26 CH3CO    吉西他滨(30％)  Phe-OBzl(40％)
9 CH3 272 26 CH3CO    吉西他滨(25％)  Phe-OBzl(50％)
10 CH3 272 26 CH3CO    吉西他滨(15％)  Phe-OBzl(60％)
11 CH3 272 26 CH3CO    吉西他滨(15％)  Val-OBzl(60％)
12 CH3 272 26 CH3CO    吉西他滨(25％)  OC4H8Ph(40％)
13 CH3 272 26 CH3CO    吉西他滨(20％)  OC4H8Ph(50％)
14 CH3 272 26 CH3CO    吉西他滨(15％)  OC4H8Ph(60％)
15 CH3 272 32 CH3CO    吉西他滨(30％)  Phe-OBzl(40％)
16 CH3 272 32 CH3CO    吉西他滨(30％)  Phe-OBzl(50％)
17 CH3 272 32 CH3CO    吉西他滨(20％)  Phe-OBzl(60％)
No. R   n(平均值)   m(平均值) A     X：胞苷抗代谢剂(百分数)  X：疏水性取代基(百分数)
18 CH3 272 32 CH3CO     吉西他滨(15％)  Val-OBzl(60％)
19 CH3 272 32 CH3CO     吉西他滨(15％)  OC4H8Ph(60％)
20 CH3 272 35 CH3CO     吉西他滨(15％)  OC4H8Ph(55％)
21 CH3 272 26 CH3CO     5′-脱氧-5-氟胞苷(15％)  Phe-OBzl(60％)
22 CH3 272 26 CH3CO     5′-脱氧-5-氟胞苷(15％)  OC4H8Ph(60％)
23 CH3 272 26 CH3CO      2′-脱氧-2′-亚甲基胞苷(15％)  Phe-OBzl(60％)
24 CH3 272 26 CH3CO      2′-脱氧-2′-亚甲基胞苷(15％)  OC4H8Ph(60％)
25 CH3 272 26 CH3CO     3′-乙炔基胞苷(15％)  Phe-OBzl(60％)
26 CH3 272 26 CH3CO     3′-乙炔基胞苷(15％)  OC4H8Ph(60％)
27 CH3 272 26 CH3CO     2′-C-氰基-2′-脱氧-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶(15％) Phe-OBzl(60％)
28 CH3 272 26 CH3CO     2′-C-氰基-2′-脱氧-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶(15％) OC4H8Ph(60％)
29 CH3 272 26 CH3CO     (-)-β-L-二氧戊环胞苷(15％)  Phe-OBzl(60％)
30 CH3 272 26 CH3CO     (-)-β-L-二氧戊环胞苷(15％)  OC4H8Ph(60％)
采用具体的非限制性实施例方法，在有机溶剂中用脱水缩合剂使胞苷抗代谢剂与按照专利文献3所述方法制备的甲氧基聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物缩合，从而产生本发明胞苷抗代谢剂的聚合衍生物。
用于上述反应的溶剂不受特别限制，只要它能使反应进行；因而，其例子包括：芳族烃如甲苯和二甲苯，卤代烃如二氯甲烷、氯仿和1，2-二氯乙烷，醚如四氢呋喃、二烷、二甲氧基乙烷和二乙二醇二甲基醚，腈如乙腈和丙腈，酰胺如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺和N-甲基吡咯烷酮，脲如1，3-二甲基咪唑烷酮(1，3-dimethylimidazolidinone)，以及它们的混合溶剂。优选酰胺和脲；更优选二甲基甲酰胺或1，3-二甲基咪唑烷酮。
用于上述反应的脱水缩合剂不受特别限制，只要它能使胞苷抗代谢剂4位氨基与羧基发生缩合反应；因而，其优选例子包括DMT-MM(4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯)和2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉。
上述反应的反应温度一般为4-60℃，优选15-50℃。
上述反应之后，可适当地应用其已知的分离方法，例如，真空浓缩、溶剂萃取、结晶、透析和层析(如果需要)，以分离和纯化所需的化合物。
用上述方法，可获得其中X由单独的胞苷抗代谢剂残基组成或由胞苷抗代谢剂残基和羟基组成的聚合衍生物。
当本发明胞苷抗代谢剂的聚合衍生物含有疏水性取代基时，可在有机溶剂中用脱水缩合剂使胞苷抗代谢剂的氨基，与按照(例如)专利文献3所述方法制备的在甲氧基聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物的一部分羧基中引入了疏水性取代基而获得的聚乙二醇部分和侧链含羧基的聚合物部分组成的高分子化合物的侧链中未取代的羧基缩合，从而产生此衍生物。
可用以下方式引入此种疏水性取代基。例如，所述疏水性取代基为烷氧基时，引入如下进行：在溶剂中用脱水缩合剂使相应醇与羧基缩合(酯化)，或在溶剂中、碱存在下使相应的烷基卤等和羧基发生亲核取代反应。例如，所述疏水性取代基是取代氨基时，可在溶剂中用脱水缩合剂使相应胺与羧基缩合(酰胺化)产生含有该取代基的衍生物。
用于上述脱水缩合(酯化)的溶剂不受特别限制，只要它能使反应得以进行。因而，可采用的溶剂与上述甲氧基聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物与胞苷抗代谢剂脱水缩合中所用的溶剂相同；优选的溶剂与上述溶剂相同。所述脱水缩合剂不受特别限制，只要它能使醇与羧基的脱水缩合得以进行；因而，优选的是二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、1-二甲基氨基丙基-3-乙基碳二亚胺、羰基二咪唑、氯甲酸异丁酯或特戊酸氯。
脱水缩合反应中可采用反应助剂；其例子包括：N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三唑、4-二甲基氨基吡啶和2，6-二-叔丁基-4-甲基吡啶。
脱水缩合反应的反应温度一般为4-60℃，优选15-50℃。反应时间是2小时至数天，优选4-48小时。
上述亲核取代反应所用的溶剂不受特别限制，只要它能使该反应得以进行。因而，可采用的溶剂与上述甲氧基聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物与胞苷抗代谢剂脱水缩合中所用的溶剂相同；优选的溶剂也与上述溶剂相同。碱的例子包括碱金属碳酸盐如碳酸锂、碳酸钠和碳酸钾；碱金属氢化物如氢化锂、氢化钠和氢化钾；碱金属氢氧化物如氢氧化锂、氢氧化钠和氢氧化钾；碱金属醇盐如甲醇锂、甲醇钠、乙醇钠和叔丁醇钾；以及有机胺如三乙胺、三丁胺、N，N-二异丙基乙胺、N-甲基吗啉、吡啶、4-(N，N-二甲基氨基)吡啶、N，N-二甲基苯胺、N，N-二乙基苯胺、1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯、1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)和1，8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯(DBU)；优选的是有机胺。
上述亲核取代反应的反应温度一般是4-60℃，优选室温-50℃。反应时间为1小时至数天，优选4-48小时。
上述脱水缩合反应(酰胺化反应)所用的溶剂不受特别限制，只要它能使该反应得以进行。因而，可采用的溶剂与上述甲氧基聚乙二醇-聚谷氨酸嵌段共聚物与胞苷抗代谢剂脱水缩合中所用的溶剂相同；优选的溶剂与上述溶剂相同。所述脱水缩合剂不受特别限制，只要它能使得胺与羧基的反应得以进行；因而，优选的是二环己基碳二亚胺，二异丙基碳二亚胺，1-二甲基氨基丙基-3-乙基碳二亚胺，羰基二咪唑，氯甲酸异丁酯，特戊酸氯，DMT-MM(4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯)，TFFH(四甲基氟代脲六氟磷酸酯)或BOP(六氟磷酸苯并三唑-1-基氧三(二甲基氨基))。
所述脱水缩合反应中可采用反应助剂；其例子包括N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三唑、4-二甲基氨基吡啶和2，6-二-叔丁基-4-甲基吡啶。
所述脱水缩合反应的反应温度一般为4-60℃，优选室温-50℃。反应时间为1小时至数天，优选4-48小时。
由于疏水性取代基和胞苷抗代谢剂结合于高分子化合物的反应顺序无关紧要，可将它们混合进行反应。然而，优选在混合胞苷抗代谢剂之前将疏水性取代基引入聚合物载体，以避免抗代谢剂作为具有多官能基团的活性本体发生反应和分解。
本发明胞苷抗代谢剂的聚合衍生物可在水中形成含有聚乙二醇部分外壳的胶束。可通过(例如)凝胶过滤色谱(GPC)或动态光散射鉴定此胶束的形成。
在本发明中，未结合于胞苷抗代谢剂的羧基与疏水性取代基的结合有助于此胶束形成。
本发明包括含有上述胞苷抗代谢剂的聚合衍生物作为药用成分的抗肿瘤剂或抗病毒剂。胞苷抗代谢剂的聚合衍生物可以其原型或药物组合物的形式给药，在药物组合物中它与药学上可接受的物质混合。此药物组合物的剂型可以是任何剂型，如注射剂、粉末剂、粒剂、片剂和栓剂。这些制剂也可含有各种药用辅助物质，即载体和其它助剂，包括添加剂如稳定剂、防腐剂、镇静剂和乳化剂。
在制剂中，胞苷抗代谢剂的聚合衍生物的含量因制剂不同而有很大变化；然而，一般为0.1-100重量％，优选1-98重量％。
含有胞苷抗代谢剂的聚合衍生物作为药用成分的本发明抗癌剂的适应症不受特别限制；因而，该药物可用于癌症，例如非小细胞性肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌和AIDS-相关性卡波济氏肉瘤。
含有胞苷抗代谢剂的聚合衍生物作为药用成分的本发明抗病毒剂的适应症不受特别限制；因而，该药物可用于(例如)获得性免疫缺陷综合症(AIDS)、带状疱疹、单纯疱疹病毒感染性疾病等，还可用于预防感染。
本发明胞苷抗代谢剂的聚合衍生物可通过任何方法给药，包括口服给药、注射、直肠内给药、门静脉内给药、混入器官灌注液和局部给予患病器官。然而，优选的是胃肠道外给药；更优选通过注射静脉内或动脉内给药或者局部给予患病器官。本发明胞苷抗代谢剂的聚合衍生物的剂量取决于疾病状态、给药方法、患者的疾病、年龄和体重等；然而，剂量一般为每m2体表面积1mg-5,000mg，优选10mg-2,000mg，可以每天一次或分多次给药。可每天给药，间隔数天至数月重复给药。如果需要，也可采用除上述以外的给药方法、剂量和给药方案。
本发明的聚合衍生物也包括所结合的前药。在本文中，前药是有生物活性的母体化合物的化学衍生物，给予这种化合物时，能在体内释放母体化合物。
实施例
以下参照实施例、参比实施例和测试实施例进一步详细描述本发明。然而，本发明的范围不应受它们的限制。
参比实施例1：合成分子量约12,000的单甲氧基聚乙二醇与聚合数约为26的聚谷氨酸的N-乙酰化的嵌段共聚物
将一端含有甲氧基、另一端含有3-氨基丙基的聚乙二醇(SUNBRIGHTMEPA-12T，购自NOF Corporation，平均分子量：12,000，16g)溶解于二甲亚砜(320mL)中，然后向其中加入γ-苄基-L-谷氨酸N-羧酸酐(BLG-NCA，9.48g；27当量，基于聚乙二醇)，然后于30℃搅拌过夜。将该反应溶液逐滴加入搅拌的异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1，6.4L)中，然后再搅拌3小时。过滤收集沉淀的沉积物，用异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1，400mL)洗涤。将得到的产物(22.78g)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(370mL)中，加入乙酸酐(6.83mL)，然后于20℃搅拌过夜。将得到的溶液逐滴加入搅拌的异丙基醚-乙酸乙酯混合溶剂(4∶1，3.7L)中，然后再搅拌3小时。过滤收集沉淀的沉积物，用异丙基醚-乙酸乙酯混合溶剂(4∶1，300mL)洗涤。将得到的产物(22.92g)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(370mL)，加入5％碳载钯(含有55％水，2.50g)，接着于30℃、氢气气氛下搅拌4小时，然后室温过夜。滤除碳载钯后，将滤出液逐滴加入搅拌的异丙基醚-乙酸乙酯混合溶剂(4∶1，5L)，然后再搅拌1小时。过滤收集沉淀的沉积物，用异丙基醚-乙酸乙酯混合溶剂(4∶1，300mL)洗涤。将得到的产物(16g)溶解于蒸馏水(800mL)中，加入1M氢氧化钠水溶液，以将该溶液的pH调节为11。向其中加入蒸馏水，使溶液终体积为1,600mL，然后加入氯化钠(80g)。使该溶液通过吸附树脂柱HP-20ss(购自Mitsubishi Chemical Corporation，500mL)；用5％氯化钠水溶液(2,000mL)和蒸馏水(20,000mL)洗涤该柱，然后用50％乙腈水溶液(2,500mL)洗脱。使含有所需化合物的洗脱组分通过阳离子交换树脂柱Dowex 50W(购自The DowChemical Company，质子型，100mL)；用50％乙腈水溶液(150mL)洗脱。减压浓缩含有所需化合物的洗脱组分，直到溶液体积达到约300mL，然后冻干，以提供标题化合物(15.84g)。
根据用氢氧化钠水溶液获得的滴定值，该化合物一个分子中聚合的谷氨酸平均数(羧酸数)为26.22个。
参比实施例2：合成分子量约为12,000的单甲氧基聚乙二醇与聚合数约为41的聚谷氨酸的N-乙酰化的嵌段共聚物
按照参比实施例1所述方法，以聚乙二醇计，采用45当量BLG-NCA，以提供标题化合物。
根据用氢氧化钠水溶液获得的滴定值，此化合物的一个分子中聚合的谷氨酸平均数(羧酸数)为41.45个。
参比实施例3：合成分子量约为12,000的单甲氧基聚乙二醇与聚合数约为24的聚谷氨酸的N-乙酰化的嵌段共聚物
按照参比实施例1所述方法，以聚乙二醇计，采用25当量BLG-NCA，以提供标题化合物。
根据用氢氧化钠水溶液获得的滴定值，此化合物的一个分子中聚合的谷氨酸平均数(羧酸数)为23.70个。
参比实施例4：合成分子量约为12,000的单甲氧基聚乙二醇与聚合数约为32的聚谷氨酸的N-乙酰化的嵌段共聚物
按照参比实施例1所述方法，以聚乙二醇计，采用35当量BLG-NCA，以提供标题化合物。
根据用氢氧化钠水溶液获得的滴定值，此化合物的一个分子中聚合的谷氨酸平均数(羧酸数)为31.71个。
参比实施例5：合成分子量约为12,000的单甲氧基聚乙二醇与聚合数约为36的聚谷氨酸的N-乙酰化的嵌段共聚物
按照参比实施例1所述方法，以聚乙二醇计，采用40当量BLG-NCA，以提供标题化合物。
根据用氢氧化钠水溶液获得的滴定值，此化合物的一个分子中聚合的谷氨酸平均数(羧酸数)为35.90个。
参比实施例6：合成分子量约为12,000的单甲氧基聚乙二醇与聚合数约为21的聚谷氨酸的N-乙酰化的嵌段共聚物
按照参比实施例1所述方法，以聚乙二醇计，采用23当量BLG-NCA，以提供标题化合物。
根据用氢氧化钠水溶液获得的滴定值，此化合物的一个分子中聚合的谷氨酸平均数(羧酸数)为21.38个。
参比实施例7：合成分子量约为12,000的单甲氧基聚乙二醇与聚合数约为26的聚谷氨酸的N-乙酰化的嵌段共聚物
按照参比实施例1所述方法，以聚乙二醇计，采用30当量BLG-NCA，以提供标题化合物。
根据用氢氧化钠水溶液获得的滴定值，此化合物的一个分子中聚合的谷氨酸平均数(羧酸数)为26.48个。
参比实施例8：合成L-苯丙氨酸苄酯与分子量约为12,000的单甲氧基聚乙二醇和聚合数约为24的聚谷氨酸的N-乙酰化的嵌段共聚物的酰胺偶联物
将参比实施例3所述的分子量约为12,000的单甲氧基聚乙二醇与聚合数约为24的聚谷氨酸的N-乙酰化的嵌段共聚物(1.533g)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(32mL)，然后加入L-苯丙氨酸苄酯4-甲苯磺酸盐(0.464g)、TFFH(0.286g)、N，N-二异丙基乙胺(0.672mL)和2，6-二-叔丁基-4-甲基吡啶(0.495g)，接着于37℃搅拌该混合物20小时。将该反应溶液冷却至室温，然后用乙醇(64mL)稀释，接着在搅拌下逐滴加入二异丙基醚(256mL)。搅拌30分钟后，过滤收集沉淀的沉积物，用二异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1)洗涤。将得到的产物溶解于30％乙腈水溶液(45mL)，用透析膜(分子量截取值为12,000-14,000)以蒸馏水(2L×3)进行透析。将乙腈(15mL)加入透析过的溶液中，使该混合物通过阳离子交换树脂Dowex 50W(质子型)，用50％乙腈水溶液洗脱。将含有所需化合物的洗脱组分减压浓缩至1/2体积，冻干得到标题化合物(1.689g)。
水解该化合物后，用高效液相色谱(HPLC)定量释放的苯甲醇，以测定此化合物中Phe-Obzl基团的酰胺键合率。结果是，以聚谷氨酸的羧基计，键合率为32.8％。
水解方法
将标题化合物(34.48mg)溶解于甲醇(1mL)，然后加入0.5M氢氧化钠水溶液(1mL)，40℃搅拌1小时。用乙酸中和该溶液，蒸馏水稀释，准确制备5mL溶液。
HPLC的分析条件(分析苄醇)
柱：Inertsil ODS-3(粒度：5μm)，4.6φ×150mm；
柱温：40℃；
洗脱液：溶液A：1％磷酸水溶液，溶液B：乙腈；
梯度：％溶液B(时间：分钟)30(0)，80(10)；
流速：1mL/分钟；
检测器(检测波长)：UV(260nm)
参比实施例9：合成L-苯丙氨酸苄酯与分子量约为12,000的单甲氧基聚乙二醇和聚合数约为41的聚谷氨酸的N-乙酰化的嵌段共聚物的酰胺偶联物
将参比实施例2所述的分子量约为12,000的单甲氧基聚乙二醇与聚合数约为41的聚谷氨酸的N-乙酰化的嵌段共聚物(176.5mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(5.3mL)，然后加入L-苯丙氨酸苄酯4-甲苯磺酸盐(63.0mg)、TFFH(38.9mg)、N，N-二异丙基乙胺(117.3μL)和2，6-二-叔丁基-4-甲基吡啶(87.0mg)，接着于37℃搅拌该混合物22小时。将该反应溶液冷却至室温，然后用乙醇(10.6mL)稀释，接着在搅拌下向其中逐滴加入二异丙基醚(42.4mL)。搅拌30分钟后，过滤收集沉淀的沉积物，用二异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1)洗涤。将得到的产物溶解于20％乙腈水溶液(16mL)，用透析膜(分子量截取值为12,000-14,000)以蒸馏水(2L×3)进行透析。使透析过的溶液通过阳离子交换树脂Dowex 50W(质子型，9mL)，用50％乙腈水溶液洗脱。将含有所需化合物的洗脱组分冻干，以得到标题化合物(194.0mg)。
以参比实施例8所述的方法水解该化合物后，在与参比实施例8所述相同的条件下，用高效液相色谱(HPLC)定量释放的苯甲醇，以测定该化合物中Phe-Obzl基团的酰胺键合率。结果是，以聚谷氨酸的羧基计，键合率为32.6％。
参比实施例10：合成L-苯丙氨酸苄酯与分子量约为12,000的单甲氧基聚乙二醇和聚合数约为32的聚谷氨酸的N-乙酰化的嵌段共聚物的酰胺偶联物
将参比实施例4所述的分子量约为12,000的单甲氧基聚乙二醇与聚合数约为32的聚谷氨酸的N-乙酰化的嵌段共聚物(668mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(13mL)，加入L-苯丙氨酸苄酯4-甲苯磺酸盐(282mg)、TFFH(175mg)和N，N-二异丙基乙胺(345μL)，然后于40℃搅拌该混合物20小时。将该反应溶液冷却至室温，然后用乙醇(26mL)稀释，接着在搅拌下逐滴加入二异丙基醚(104mL)。过滤收集沉淀的沉积物，用二异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1)洗涤。将得到的产物溶解于50％乙腈水溶液(16mL)，用透析膜(分子量截取值为12,000-14,000)以蒸馏水(2L×3)透析。使透析过的溶液通过阳离子交换树脂Dowex 50W(质子型，10mL)，然后用50％乙腈水溶液洗脱。将含有所需化合物的洗脱组分冻干，以得到标题化合物(762mg)。
以参比实施例8所述的方法水解该化合物后，在与参比实施例8所述相同的条件下，用高效液相色谱(HPLC)定量释放的苯甲醇，以测定该化合物中Phe-Obzl基团的酰胺键合率。结果是，以聚谷氨酸的羧基计，键合率为41.8％。
参比实施例11：合成L-缬氨酸苄酯与分子量约为12,000的单甲氧基聚乙二醇和聚合数约为36的聚谷氨酸的N-乙酰化的嵌段共聚物的酰胺偶联物
将参比实施例5所述的分子量约为12,000的单甲氧基聚乙二醇与聚合数约为36的聚谷氨酸的N-乙酰化的嵌段共聚物(531mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(10.6mL)中，加入L-缬氨酸苄酯4-甲苯磺酸(195mg)、TFFH(135mg)和N，N-二异丙基乙胺(288μL)，然后于40℃搅拌该混合物30小时。将该反应溶液冷却至室温，然后用乙醇(20mL)稀释，接着在搅拌下逐滴加入二异丙基醚(80mL)。搅拌30分钟后，过滤收集沉淀的沉积物，用二异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1)洗涤。将得到的产物溶解于30％乙腈水溶液(25mL)，用透析膜(分子量截取值为12,000-14,000)以蒸馏水(2L×3)透析。将阳离子交换树脂Dowex 50W(质子型，3mL)加入透析过的溶液中，搅拌30分钟，随后滤除树脂。将含有所需化合物的滤出液冻干，以得到标题化合物(559mg)。
以参比实施例8所述的方法水解该化合物后，在与参比实施例8所述相同的条件下，用高效液相色谱(HPLC)定量释放的苯甲醇，以测定该化合物中Val-OBzl基团的酰胺键合率。结果是，以聚谷氨酸的羧基计，键合率为41.3％。
参比实施例12：合成L-苯丙氨酸苄酯与分子量约为12,000的单甲氧基聚乙二醇和聚合数约为26的聚谷氨酸的N-乙酰化的嵌段共聚物的酰胺偶联物
将参比实施例1所述的分子量约为12,000的单甲氧基聚乙二醇与聚合数约为26的聚谷氨酸的N-乙酰化的嵌段共聚物(6.00g)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(150mL)，加入L-苯丙氨酸苄酯盐酸盐(2.08g)、DMT-MM(2.37g)和N，N-二异丙基乙胺(1.24mL)，然后于40℃搅拌该混合物过夜。将该反应溶液冷却至室温，接着逐滴加入二异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1，1,500mL)。搅拌30分钟后，过滤收集沉淀的沉积物，用二异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1)洗涤。将得到的产物溶解于97重量％的DMF水溶液(150mL)中，加入阳离子交换树脂Dowex 50W(质子型，15mL)，室温搅拌2小时，然后滤除树脂，用DMF(75mL)洗涤该树脂。将得到的滤出液逐滴加入二异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1)(2,400mL)中，搅拌30分钟，随后过滤收集沉淀的沉积物，以得到标题化合物(6.88g)。
以参比实施例8所述的方法水解该化合物后，在与参比实施例8所述相同的条件下，用高效液相色谱(HPLC)定量释放的苯甲醇，以测定该化合物中Phe-Obzl基团的酰胺键合率。结果是，以聚谷氨酸的羧基计，键合率为62.4％。
参比实施例13：合成苄基溴与分子量约为12,000的单甲氧基聚乙二醇和聚合数约为26的聚谷氨酸的N-乙酰化的嵌段共聚物的酯偶联物
将参比实施例1所述的分子量约为12,000的单甲氧基聚乙二醇与聚合数约为26的聚谷氨酸的N-乙酰化的嵌段共聚物(342mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(6.8mL)，加入苄基溴(29.0μL)和N，N-二异丙基乙胺(53.1μL)，随后于37℃搅拌该混合物过夜。将该反应溶液冷却至室温，用乙醇(13.6mL)稀释，在搅拌下向其中逐滴加入二异丙基醚(54.4mL)。搅拌1小时后，过滤收集沉淀的沉积物，用二异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1)洗涤。将得到的产物溶解于50％乙腈水溶液(20mL)中，使该溶液通过阳离子交换树脂Dowex 50W(质子型，4mL)，然后用50％乙腈水溶液洗脱。将含有所需化合物的洗脱组分减压浓缩至1/2体积，冻干，以得到标题化合物(352mg)。
以参比实施例8所述的方法水解该化合物后，在与参比实施例8所述相同的条件下，用高效液相色谱(HPLC)定量释放的苯甲醇，以测定该化合物中Obzl基团的酰胺键合率。结果是，以聚谷氨酸的羧基计，键合率为25.0％。
参比实施例14：合成4-苯基丁基溴与分子量约为12,000的单甲氧基聚乙二醇和聚合数约为26的聚谷氨酸的N-乙酰化的嵌段共聚物的酯偶联物
将参比实施例7所述的分子量约为12,000的单甲氧基聚乙二醇与聚合数约为26的聚谷氨酸的N-乙酰化的嵌段共聚物(2.33g)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(50mL)，加入4-苯基丁基溴(682mg)和1，8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯(DBU，598μL)，随后于38℃搅拌该混合物过夜。将该反应溶液冷却至室温，然后逐滴加入二异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1，500mL)。搅拌1小时后，过滤收集沉淀的沉积物，用二异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1)洗涤。将得到的产物溶解于50％乙腈水溶液中，加入阳离子交换树脂Dowex 50W(质子型，5mL)，接着搅拌该混合物2小时，随后滤除树脂，冻干该滤出液，以得到标题化合物(2.54g)。
以参比实施例8所述的方法水解该化合物后，在与参比实施例8所述相同的条件下，用高效液相色谱(HPLC)定量释放的苯甲醇，以测定该化合物中4-苯基丁氧基的酰胺键合率。结果是，以聚谷氨酸的羧基计，键合率为65.7％。
实施例1：式(1)胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其中R是甲基；A是乙酰基；n的平均值是272；m的平均值是21；X是吉西他滨或羟基
将N，N-二甲基甲酰胺(15mL)和N，N-二异丙基乙胺(192μL)加入参比实施例6所述的分子量约为12,000的单甲氧基聚乙二醇与聚合数约为21的聚谷氨酸的N-乙酰化的嵌段共聚物(759mg)和盐酸吉西他滨(330mg)中，于37℃搅拌。溶解后，加入2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉(EEDQ，300mg)，于37℃搅拌20小时。将该反应溶液冷却至室温，然后用乙醇(30mL)稀释，在搅拌下逐滴加入二异丙基醚(120mL)。搅拌1小时后，过滤收集沉淀的沉积物，用二异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1)洗涤。将得到的产物溶解于25％乙腈水溶液(40mL)中，用透析膜(分子量截取值为12,000-14,000)以蒸馏水(2L×3)透析。将透析过的溶液冻干，以得到标题化合物(1,078mg)。
水解该化合物后，用高效液相色谱(HPLC)定量释放的吉西他滨，以二氮该化合物的吉西他滨含量。结果是，盐酸吉西他滨含量为20.8％(w/w)(以聚羧酸的羧基计为58.0％)。此外，对本发明化合物进行HPLC分析时，游离吉西他滨的含量为0.3％或更低。
水解方法
将标题化合物(3.60mg)溶解于甲醇(0.5mL)，加入浓氨水(0.5mL)，然后密封，37℃搅拌1小时。用乙酸中和该溶液，用蒸馏水稀释，准确制备10mL溶液。
HPLC的分析条件(分析吉西他滨)
柱：Inertsil ODS-3(粒度：5μm)，4.6φ×150mm；
柱温：40℃；
洗脱液：95％磷酸盐缓冲液(10mM，pH 6.9)-5％乙腈；
流速：1mL/分钟；
检测器(检测波长)：UV(275nm)
实施例2：式(1)胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其中R是甲基；A是乙酰基；n的平均值是272；m的平均值是24；X是吉西他滨、羟基或L-苯丙氨酸苄酯残基
将N，N-二甲基甲酰胺(26mL)和N，N-二异丙基乙胺(0.213mL)加入参比实施例8所述的化合物(1.298g)和盐酸吉西他滨(0.366g)中，37℃搅拌。溶解后，加入2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉(EEDQ，0.362g)，37℃搅拌过夜。将该反应溶液冷却至室温，然后用乙醇(52mL)稀释，在搅拌下逐滴加入二异丙基醚(208mL)。搅拌1小时后，过滤收集沉淀的沉积物，用二异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1)洗涤。将得到的产物溶解于25％乙腈水溶液(40mL)中，用透析膜(分子量截取值为12,000-14,000)以蒸馏水(2L×3)透析。将透析过的溶液冻干，以得到标题化合物(1.330g)。
以实施例1所述方法水解该化合物后，在与参比实施例1所述相同的条件下，用高效液相色谱(HPLC)定量释放的吉西他滨，以测定该化合物的吉西他滨含量。结果是，盐酸吉西他滨含量为10.7％(w/w)(以聚羧酸的羧基计为28.1％)。此外，对本发明化合物进行HPLC分析时，游离吉西他滨的含量为0.3％或更低。
实施例3：式(1)胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其中R是甲基；A是乙酰基；n的平均值是272；m的平均值是41；X是吉西他滨、羟基或L-苯丙氨酸苄酯残基
将N，N-二甲基甲酰胺(3.3mL)和N，N-二异丙基乙胺(39.2μL)加入参比实施例9所述的化合物(165mg)和盐酸吉西他滨(67.4mg)中，37℃搅拌。溶解后，加入2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉(EEDQ，56.0mg)，37℃搅拌23小时。将该反应溶液冷却至室温，然后用乙醇(6.6mL)稀释，在搅拌下逐滴加入二异丙基醚(26.4mL)。搅拌30分钟后，过滤收集沉淀的沉积物，用二异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1)洗涤。将得到的产物溶解于10％乙腈水溶液(16mL)中，用透析膜(分子量截取值为12,000-14,000)以蒸馏水(2L×3)透析。将透析过的溶液冻干，以得到标题化合物(183mg)。
以实施例1所述方法水解该化合物后，在与参比实施例1所述相同的条件下，用高效液相色谱(HPLC)定量释放的吉西他滨，以测定该化合物的吉西他滨含量。结果是，盐酸吉西他滨含量为21.2％(w/w)(以聚羧酸的羧基计为42.6％)。此外，对本发明化合物进行HPLC分析时，游离吉西他滨的含量为0.3％或更低。
实施例4：式(1)胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其中R是甲基；A是乙酰基；n的平均值是272；m的平均值是26；X是吉西他滨、羟基或苄氧基
将N，N-二甲基甲酰胺(6mL)和N，N-二异丙基乙胺(63.1μL)加入参比实施例13所述的化合物(295mg)和盐酸吉西他滨(108.5mg)中，37℃搅拌。溶解后，加入2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉(EEDQ，98.2mg)，37℃搅拌23小时。将该反应溶液冷却至室温，然后用乙醇乙醇(12mL)稀释，在搅拌下逐滴加入二异丙基醚(48mL)。搅拌30分钟后，过滤收集沉淀的沉积物，用二异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1)洗涤。将得到的产物溶解于10％乙腈水溶液(16mL)中，用透析膜(分子量截取值为12,000-14,000)以蒸馏水(2L×3)透析。将透析过的溶液冻干，以得到标题化合物(334mg)。
以实施例1所述方法水解该化合物后，在与参比实施例1所述相同的条件下，用高效液相色谱(HPLC)定量释放的吉西他滨，以测定该化合物的吉西他滨含量。结果是，盐酸吉西他滨含量为20.5％(w/w)(以聚羧酸的羧基计为49.9％)。此外，对本发明化合物进行HPLC分析时，游离吉西他滨的含量为5.1％。
实施例5：式(1)胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其中R是甲基；A是乙酰基；n的平均值是272；m的平均值是36；X是吉西他滨、羟基或L-缬氨酸苄酯残基
将N，N-二甲基甲酰胺(10.3mL)和N，N-二异丙基乙胺(77.9μL)加入参比实施例11所述的化合物(515mg)和盐酸吉西他滨(134mg)中，40℃搅拌。溶解后，加入2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉(EEDQ，166mg)，40℃搅拌20小时。将该反应溶液冷却至室温，然后用乙醇(20.6mL)稀释，在搅拌下逐滴加入二异丙基醚(82.4mL)。过滤收集沉淀的沉积物，用二异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1)洗涤。将得到的产物溶解于30％乙腈水溶液(20mL)中，用透析膜(分子量截取值为12,000-14,000)以蒸馏水(2L×3)透析。将透析过的溶液冻干，以得到标题化合物(574mg)。
以实施例1所述方法水解该化合物后，在与参比实施例1所述相同的条件下，用高效液相色谱(HPLC)定量释放的吉西他滨，以测定本发明化合物中的吉西他滨含量。结果是，盐酸吉西他滨含量为14.1％(w/w)(以聚羧酸的羧基计为28.8％)。此外，对本发明化合物进行HPLC分析时，游离吉西他滨的含量为0.2％或更低。
实施例6：式(1)胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其中R是甲基；A是乙酰基；n的平均值是272；m的平均值是26；X是吉西他滨、羟基或L-苯丙氨酸苄酯残基
将N，N-二甲基甲酰胺(75mL)和N，N-二异丙基乙胺(286μL)加入参比实施例12所述的化合物(3.0g)和盐酸吉西他滨(492mg)中，40℃搅拌。溶解后，加入2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉(EEDQ，508mg)，40℃搅拌24小时。将该反应溶液冷却至室温，然后逐滴加入二异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1)(750mL)。搅拌30分钟后，过滤收集沉淀的沉积物，用二异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1)洗涤。将得到的产物溶解于50％乙腈水溶液(50mL)中，用透析膜(分子量截取值为12,000-14,000)以蒸馏水(3L×3)透析。将透析过的溶液冻干，以得到标题化合物(2.94g)。
以实施例1所述方法水解该化合物后，在与参比实施例1所述相同的条件下，用高效液相色谱(HPLC)定量释放的吉西他滨，以测定该化合物的吉西他滨含量。结果是，盐酸吉西他滨含量为4.67％(w/w)(以聚羧酸的羧基计为11.9％)。此外，对本发明化合物进行HPLC分析时，游离吉西他滨的含量为0.2％或更少。
实施例7：式(1)胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其中R是甲基；A是乙酰基；n的平均值是272；m的平均值是26；X是吉西他滨、羟基或4-苯基丁醇残基
将N，N-二甲基甲酰胺(50mL)和N，N-二异丙基乙胺(218μL)加入参比实施例14所述的化合物(2.07g)和盐酸吉西他滨(375mg)中，40℃搅拌。溶解后，加入2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉(EEDQ，386mg)，40℃搅拌24小时。将该反应溶液冷却至室温，然后逐滴加入二异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1，750mL)。搅拌1小时后，过滤收集沉淀的沉积物，用二异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1)洗涤。将得到的产物溶解于50％乙腈水溶液(25mL)中，用透析膜(分子量截取值为12,000-14,000)以蒸馏水(3L×3)透析。将透析过的溶液冻干，以得到标题化合物(2.05g)。
以实施例1所述方法水解该化合物后，在与参比实施例1所述相同的条件下，用高效液相色谱(HPLC)定量释放的吉西他滨，以测定本发明化合物中的吉西他滨含量。结果是，盐酸吉西他滨含量为7.35％(w/w)(以聚羧酸的羧基计为17.5％)。此外，对本发明化合物进行HPLC分析时，游离吉西他滨的含量为0.2％或更低。
实施例8：式(1)胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其中R是甲基；A是乙酰基；n的平均值是272；m的平均值是32；X是阿糖胞苷或羟基
将参比实施例4所述的分子量约为12,000的单甲氧基聚乙二醇与聚合数约为32的聚谷氨酸(130mg)的N-乙酰化的嵌段共聚物和阿糖胞苷(50.0mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(2.6mL)，加入2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉(EEDQ，63.6mg)，40℃搅拌24小时。将该反应溶液冷却至室温，然后用乙醇(5.2mL)稀释，接着在搅拌下逐滴加入二异丙基醚(20.8mL)。搅拌30分钟后，过滤收集沉淀的沉积物，用二异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1)洗涤。将得到的产物溶解于20％乙腈水溶液，用透析膜(分子量截取值为12,000-14,000)以蒸馏水(2L×3)透析。将透析过的溶液冻干，以得到标题化合物(143mg)。
水解该化合物后，用高效液相色谱(HPLC)定量释放的阿糖胞苷，以测定该化合物的阿糖胞苷含量。结果是，阿糖胞苷含量为22.5％(w/w)(以聚羧酸的羧基计为59.2％)。
水解方法
将标题化合物(3.20mg)溶解于甲醇(0.5mL)，加入浓氨水(0.5mL)，然后密封，37℃搅拌1小时。用乙酸中和该溶液，接着用蒸馏水稀释，准确制备10mL溶液。
HPLC的分析条件(分析阿糖胞苷)
柱：SUPELCO Discovery HS F5(粒度：5μm)，4.6φ×250mm；
柱温：40℃；
洗脱液：磷酸盐缓冲液(10mM，pH 6.9)；
流速：1mL/分钟；
检测器(检测波长)：UV(275nm)
实施例9：式(1)胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其中R是甲基；A是乙酰基；n的平均值是272；m的平均值是32；X是阿糖胞苷、羟基或L-苯丙氨酸苄酯残基
将参比实施例10所述的化合物(267mg)和阿糖胞苷(50.0mg)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(5.3mL)，加入2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉(EEDQ，63.6mg)，40℃搅拌21小时。将该反应溶液冷却至室温，然后用乙醇(10.6mL)稀释，在搅拌下逐滴加入二异丙基醚(42.4mL)。搅拌30分钟后，过滤收集沉淀的沉积物，用二异丙基醚-乙醇混合溶剂(4∶1)洗涤。将得到的产物溶解于30％乙腈水溶液中，用透析膜(分子量截取值为12,000-14,000)以蒸馏水(2L×3)透析。将透析过的溶液冻干，以得到标题化合物(290mg)。
按照实施例8所述方法水解该化合物后，在与实施例8所述相同的条件下，用高效液相色谱(HPLC)定量释放的阿糖胞苷，以测定该化合物的阿糖胞苷含量。结果是，阿糖胞苷的含量为11.3％(w/w)(以聚羧酸的羧基计为31.5％)。
测试实施例1：没有酶的药物释放测试
将实施例1化合物(图1中的化合物1)、实施例2化合物(图1中的化合物2)或实施例7化合物(图1中的化合物7)溶解于磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)中，浓度为1.0mg/mL，然后37℃恒温静置。用HPLC随时间推移测定吉西他滨释放量，以测定吉西他滨释放量占所用化合物中吉西他滨总量的百分数。结果见图1。结果是，本发明化合物以不依赖酶的方式缓慢释放吉西他滨。
测试实施例2：小鼠血浆中的药物释放测试
将实施例1化合物(2.3mg；图2中的化合物1)或实施例2化合物(3.7mg；图2中的化合物2)溶解于磷酸盐缓冲盐水(0.1mL，pH 7.4)中，加入4倍量(v/v)的从小鼠收集和制备的血浆(0.4mL)，让该混合物37℃恒温静置。随时间推移每次取50微升等份，用50％甲醇水溶液(450μL)稀释。用滤膜(孔径：0.45μm)对该溶液进行脱蛋白处理，接着用HPLC测定吉西他滨的释放量，以测定吉西他滨释放量占所用化合物中吉西他滨总量的百分数。结果见图2。显示本发明化合物在血浆中也缓慢释放吉西他滨。
测试实施例3：对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用(1)
通过连续皮下植入小鼠培养鼠结肠癌Colon 26细胞。将Colon 26肿瘤切成约2-mm见方的片段，用套管针将这些瘤块皮下植入小鼠。植入肿瘤7天后，将实施例1化合物(表2的化合物1)、实施例2化合物(表2的化合物2)、实施例4化合物(表2的化合物4)和作为对照药物的盐酸吉西他滨分别溶解于5％葡萄糖注射液中，各化合物或对照药物以表2所述剂量静脉内给药一次。在开始给药那天和开始给药后第7天测定肿瘤大小，用以下公式计算肿瘤体积。评估给药7天后与开始给药那天的相对肿瘤体积。结果见表2。
[公式1]
Figure S2006800161666D00271
[表2]
  药物    剂量(盐酸吉西他滨)(mg/kg)     相对肿瘤体积*
  未治疗    0     8.8±4.9
化合物1    5025     0.4±0.21.5±0.5
化合物2    12.56.25     0.5±0.32.4±1.1
化合物4    256.25     0.5±0.13.6±0.5
对照药物    200100     1.4±0.12.6±0.7
*将开始给药那天的肿瘤体积设定为1.0时，开始给药7天后的平均相对肿瘤体积(平均值±SD)。
从这些结果可以明显看出，与对照药物盐酸吉西他滨相比，本发明化合物在较低剂量下具有相同或更高的抗肿瘤作用。也证明，含疏水性取代基的本发明化合物(实施例2或4的化合物)降低剂量后的疗效与没有疏水性取代基的化合物(实施例1化合物)相当。
测试实施例4：对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用(2)
通过小鼠连续皮下植入培养鼠结肠癌Colon 26细胞。将Colon 26肿瘤切成约2-mm见方的片段，用套管针将这些肿瘤块皮下植入小鼠。植入肿瘤7天后，将实施例7化合物(表3的化合物7)和作为对照药物的吉西他滨分别溶解于5％葡萄糖注射液中，各自以表3所述剂量静脉内给药一次。如测试实施例3所述，在开始给药那天和开始给药后第10天测定肿瘤体积。评估给药10天后与开始给药那天的相对肿瘤体积。结果见表3。
[表3]
    药物    剂量(盐酸吉西他滨)(mg/kg)     相对肿瘤体积*
    未治疗    0     10.5±5.0
化合物7    2516.7     0.3±0.31.1±0.5
对照药物    200100     3.4±0.63.9±0.5
*将开始给药那天的肿瘤体积设定为1.0时，开始给药7天后的平均相对肿瘤体积(平均值±SD)。
从这些结果可以明显看出，与作为对照药物的盐酸吉西他滨相比，本发明化合物降低剂量时仍具有相同或更高的抗肿瘤作用。
测试实施例5：对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用(3)
通过小鼠连续皮下植入培养鼠结肠癌Colon 26细胞。将Colon 26肿瘤切成约2-mm见方的片段，用套管针将这些肿瘤块皮下植入小鼠。植入肿瘤7天后，将实施例8化合物(表4的化合物8)、实施例9化合物(表4的化合物9)和作为对照药物的阿糖胞苷分别溶解于5％葡萄糖注射液中，各化合物或对照药物以表4所述剂量静脉内给药一次。如测试实施例3所述，在开始给药那天和开始给药后第10天计算肿瘤体积。评估给药10天后与开始给药那天的相对肿瘤体积。结果见表4。
[表4]
    药物    剂量(阿糖胞苷)(mg/kg)     相对肿瘤体积*
    未治疗    0     10.4±4.0
化合物8    200100     6.9±1.39.4±2.8
化合物9    150100     5.7±1.56.4±0.5
对照药物    1600800100×5**     8.4±2.910.0±3.39.0±2.0
*将开始给药那天的肿瘤体积设定为1.0时，开始给药10天后的平均相对肿瘤体积(平均值±SD)。
**以100mg/kg连续给药5天
从这些结果可以明显看出，与作为对照药物的阿糖胞昔相比，本发明化合物在较低剂量下具有更高的抗肿瘤作用。也证明，含有疏水性取代基的化合物(实施例9化合物)降低剂量后的疗效与没有疏水性取代基的化合物(实施例8化合物)相当。

Claims (13)

1.一种胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其结构为胞苷抗代谢剂的氨基与由聚乙二醇部分和侧链含羧基的聚合物部分组成的高分子化合物侧链中的羧基形成酰胺键。
2.如权利要求1所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其特征在于，所述侧链含羧基的聚合物部分包含聚谷氨酸链。
3.如权利要求1或2所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其特征在于，所述衍生物是通式(1)所示的化合物：
[式7]
式中R代表氢原子或C1-C6烷基；A代表氢原子、C1-C6酰基或C1-C6烷氧基羰基；m作为平均值是3-200；n作为平均值是5-2,000；X代表胞苷抗代谢剂残基、羟基或疏水性取代基；3-100％的m中，X代表胞苷抗代谢剂残基，0-95％的m中，X代表羟基，0-80％的m中，X代表疏水性取代基。
4.如权利要求3所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其特征在于，R代表C1-C3烷基；A代表C2-C4酰基；m作为平均值是5-100；n作为平均值是50-1,000；所述胞苷抗代谢剂残基是式(2)代表的基团：
[式8]
Figure S2006800161666C00012
式中，Z代表氢原子或氟原子；-Rf代表选自式(3)取代基的基团：
[式9]
Figure S2006800161666C00021
5.如权利要求3所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其特征在于，R代表甲基；A代表乙酰基；m作为平均值是10-60；n作为平均值是100-300；X代表胞苷抗代谢剂残基或羟基；所述胞苷抗代谢剂是阿糖胞苷、吉西他滨或5′-脱氧-5-氟胞苷。
6.如权利要求3或4所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其特征在于，所述疏水性取代基代表式(4)所示的α-氨基酸衍生物：
[式10]
式中，Q代表天然氨基酸侧链；W代表C1-C6烷基或苄基。
7.如权利要求6所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其特征在于，Q代表异丙基或苄基；W代表苄基。
8.如权利要求3或4所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其特征在于，所述疏水性取代基代表式(5)所示的基团：
[式11]
O-T    (5)
式中，T代表被苯基任选取代的C1-C6烷基。
9.如权利要求8所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其特征在于，T代表苄基、3-苯基丙基、4-苯基丁基或5-苯基戊基。
10.如权利要求3所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物，其特征在于，R代表甲基；A代表乙酰基；m作为平均值是10-60；n作为平均值是100-300；所述胞苷抗代谢剂是阿糖胞苷、吉西他滨或5′-脱氧-5-氟胞苷；所述疏水性取代基是苄氧基、4-苯基丁氧基、(1-苄氧基羰基-2-甲基)丙基氨基或(1-苄氧基羰基-2-苯基)乙基氨基。
11.一种抗癌剂，其含有权利要求1-10中任一项所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物作为药用成分。
12.一种抗病毒剂，其含有权利要求1-10中任一项所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物作为药用成分。
13.一种生产权利要求1-10中任一项所述的胞苷抗代谢剂的聚合衍生物的方法，所述方法包括在有机溶剂中用脱水缩合剂使胞苷抗代谢剂的氨基与由聚乙二醇部分和侧链含羧基的聚合物部分组成的高分子化合物侧链中的羧基形成酰胺连接。
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