CN102159250A - 多臂的聚合烷酸酯偶联物 - Google Patents

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Abstract

除其他方面之外，在此提供了包括一种烷酸酯连接物的多臂聚合物偶联物、包括此类偶联物的多种组合物、以及制造并且将其给药的相关方法。还提供了采用此类偶联物进行治疗的方法以及相关的用途。这些偶联物是以高的载药效率制得的。

Description

多臂的聚合烷酸酯偶联物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2008年8月11提交的临时专利申请号61/087,826；于2008年10月20日提交的临时专利申请号61/106,928；以及于2008年11月11日提交的临时申请号61/113,328的优先权的权益，将它们的内容各自通过引用以其整体清楚地结合在此。
领域
本披露总体上涉及多臂的、水溶性的聚合物以及它们的对应的药物偶联物。具体地，本披露除其他特征之外是针对多臂的聚合物偶联物，这些偶联物具有通过一个烷酸酯连接被共价地附接到该多臂聚合物上的药物。还披露了包括此类偶联物的多种药用组合物，以及用于制备、配制、给药并且使用此种偶联物的方法以及相关的组合物。
背景
多年来，已经提出了用于改进生物活性剂、特别是小分子药物的投递的多种方法。与药用试剂的配制以及投递相关联的挑战可以包括：该药用试剂的差的水溶性、毒性、低的生物利用率、不稳定性、以及迅速的体内降解，这仅是列举几例。尽管已经想出了许多办法来改进药用试剂的投递，但是没有一种单独的方法是没有其缺点的。例如，目的在于解决或至少改进这些挑战中的一项或多项而通常采用的药物投递途径包括药物胶囊化(例如在脂质体、聚合物基质或单分子胶束中)、共价附接到一种水溶性聚合物(即偶联物)如聚乙二醇上(即，PEG或聚乙二醇化)、使用基因靶向剂等等。
聚乙二醇化已经在有限的程度上用来改进生物利用率以及具有差水溶性的小分子疗法的配制容易性。例如，将水溶性聚合物如PEG共价地附接到对羧基苯甲醚(artilinic acid)上来改进其水溶性。参见美国专利号6,461,603。类似地，将PEG共价地附接到基于三嗪的化合物如三甲密醇上来改进它们在水中的溶解性并且增强它们的化学稳定性。参见国际专利申请公开号WO 02/043772。已经采用PEG到双吲哚基马来酰亚胺上的共价的附接来改进此类化合物由于低水溶性而具有的差的生物利用率。参见国际专利申请公开号WO 03/037384。也已经制备了非甾体抗炎药(NSAID)的以及阿片样物质拮抗剂的聚合物偶联物。对应地参见美国专利申请公开号2007/0025956和2006/0105046。还制备了有一个或两个分子的喜树碱被共价附接到一个直链聚乙二醇上的喜树碱药物前体。参见美国专利号5,880,131。
某些药物如生物碱众所周知地是难以溶解(即配制)的。此类生物碱包括：紫杉烷，例如多西他赛；以及喜树碱，例如伊立替康。喜树碱(经常缩写为“CPT”)是首先从喜树(紫树科)的木材以及树皮中分离出的一种毒害植物的生物碱，并且已经显示它展示了抗肿瘤活性。这种化合物具有一个五环的环系统，该环系统在具有一种20S构型的内酯环E中具有一个不对称中心。这种五环的环系统包括吡咯并[3，4-b]喹啉(环A、B以及C)、轭合吡啶酮(环D)以及具有一个20-羟基基团的六元的内酯(环E)。由于它在水中的不溶性，最初喜树碱是以水溶性羧酸盐的形式进行临床评估的，这种形式将该内酯环打开而形成钠盐。这些钠盐尽管与喜树碱本身相比展现了大大改进的水溶性，但是产生了严重的毒性并且证实了非常小的体内抗癌活性，因此证明这种方法是不受欢迎的。在2001年进行了一种直链的PEG-紫杉醇化合物用于治疗带有晚期实体瘤以及淋巴瘤患者的I期临床试验；这个试验自那以后被终止了。
在着手解决与喜树碱及其许多衍生物相关的差水溶性而进行的努力中，许多综合性努力已经定向为将该A环和/或B环衍生或使该20-羟基进行酯化来改进水溶性同时保持细胞毒素的活性。例如，托泊替康(9-二甲氨基甲基-10-羟基CPT)和伊立替康(7-乙基-10[4-(1-哌啶基)-1-哌啶基]羰基氧基CPT)(另外称为CPT-11)是已经在临床上显示出有用活性的两种水溶性的CPT衍生物。作为形成水溶性药物前体的一种手段已经描述了某些喜树碱衍生物如10-羟基喜树碱以及11-羟基喜树碱通过一个酯连接而轭合到一个直链的聚(乙二醇)分子上。参见美国专利号6,011,042。所使用的途径依赖于一种芳香族的含羟基的化合物与一种活化的聚合物的反应。
许多小分子疗法如以上那些、并且特别是溶瘤细胞药物(oncolytics)的临床效果受几个因素的限制，例如与剂量相关的毒性。例如，伊立替康以及其他喜树碱衍生物在碱性条件下经历了不希望的该E环内酯的水解。此外，伊立替康的给药造成了多种麻烦的副作用，包括白血球减少症、嗜中性白细胞减少症以及腹泻。由于其严重的腹泻副作用，可以按其常规的未改性的形式给药的伊立替康的剂量是极受限制的，因此阻碍了这种药物以及这种类型的其他药物的疗效。
这些相关的副作用在严重时可能足以妨碍进一步的使用以及此类药物作为有前途的疗法的发展。小分子面临的另外的挑战包括高的清除率以及关于抗癌剂而言的最小的肿瘤渗透以及停留时间。涉及到使用聚合物附接的这些途径必需针对活性剂的分子量而平衡聚合物的大小，以便允许投递治疗学上有效的剂量，并且是以临床上有用的速率。最后，一种改性的或增强了药物投递的活性剂的合成必须给出合理的产率以及一种可再现地制备的产品，以使得任何这样的途径是经济上有吸引力的。因此，存在着对于有效地投递药物、且特别是小分子药物、并且更特别是溶瘤细胞药物的新方法的需要，这些方法可以降低它们的有害的并且经常有毒的副作用，同时改进它们的制备、疗效并且配制的容易性。甚至更重要的是，存在着提供多种有效地对抗耐药肿瘤的溶瘤细胞制品的需要。确切地说，对于用于投递药物(如以上那些)的改进方法的存在着一种需要，这些方法具有在生物利用率(由于降低的清除时间)、生物活性以及疗效之间的最佳平衡，还伴随有降低的副作用。
概述
在一个第一方面，本披露提供了一种多臂聚合物偶联物，它具有以下结构，
化合物I
其中：R是包括从约3至约150个碳原子的一个有机核心基团；Q是一个连接物；POLY1是一个水溶性的且非肽的聚合物区段；X是一个任选存在的间隔物；R1，每次出现时独立地选自：H、低级烷基、以及一个吸电子基团；n是在从1至7范围内的一个整数(例如，是选自1、2、3、4、5、6以及7)；D是具有小于约800道尔顿的分子量的一个小分子的残基；并且q是3或更大。
在此说明的以下实施方案中的每一个可以单独地或与任何一个或多个另外的实施方案相结合地来考虑，只要这种具体的结合不与在此结合中所包括的具体实施方案相互矛盾。
在关于化合物I的具体实施方案中，D是一种抗癌剂。
在另一些实施方案中，变量“R”是具有从约3至约25个碳原子的一个有机核心基团。在又一些实施方案中，R可以是直链的或环状的。在额外的实施方案中，R是一个饱和的脂肪族的核心。示例性的多臂聚合物偶联物包括这些物质，其中在“q”个臂中的每一个上，R在与Q作为整体时是多元醇、聚硫醇、或聚胺的一个残基。在一个或多个具体实施方案中，在“q”个臂中的每一个上，R在与Q作为整体时是甘油、三羟甲基丙烷、季戊四醇、山梨糖醇、或甘油低聚物的一个残基。
在又一些实施方案中，连接物“Q”是水解地稳定的。关于Q的具体实施方案包括以下各项：在一个或多个实施方案中，Q包含从约1至约10个原子；在其他实施方案中，Q是选自下组，其构成为：-O-、-S-、-NH-、-C(O)-NH-、以及-NH-C(O)-。
在又一些实施方案中，POLY1是选自下组的一种聚合物，该组的构成为：聚(亚烷基二醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡硌烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸羟烷酯)、聚(糖)、聚(α-羟酸)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(N-丙烯酰吗啉)、或它们的共聚物或三聚物。
在优选的实施方案中，POLY1是一种聚乙二醇。
针对POLY1的另外的实施方案包括以下各项：在一个或多个实施方案中，POLY1是直链的；在又一些实施方案中，POLY1的重均分子量范围是从约200至约30,000道尔顿。
在另外的实施方案中，该偶联物的重均分子量是约20,000道尔顿或更大，例如在从约20,000至约80,000道尔顿的分子量范围内。
针对变量“X”(它是任选存在的)的具体实施方案包括以下各项。在一个或多个实施方案中，X具有的原子长度是从约1个原子至约50个原子。在又一些实施方案中，X具有的原子长度是从约1个原子至约25个原子(例如，是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或其中的一个范围)。在另外的实施方案中，X是氧(“-O-”)。在一个具体实施方案中，当POLY1是对应于以下结构-(CH2CH2O)nCH2CH2-的一种直链的聚乙二醇时，X是氧(“-O-”)。
关于变量“R1”的另外的实施方案包括以下内容。在一个或多个实施方案中，R1是H。在又一些实施方案中，对于所有出现“n”时，R1均是H。在又一些其他实施方案中各个R1每次出现时[即，对于(-C(H)R1-)的每个“n”]是独立地选自：甲基、乙基、丙基、正丁基、异丙基以及异丁基。在又一些其他的实施方案中，每个R1独立地选自一种卤化物(例如氟化物、氯化物、溴化物以及碘化物)、一种腈、-NO2、以及-CF3。在优选实施方案中R1是氢。在又一些其他实施方案中R1仅在位于与羰基相邻的a碳上时不是氢。在另外的实施方案中，R1在位于该a碳上时是甲基。
现在转向变量“q”，针对“q”的具体的实施方案包括以下内容。在一个或多个实施方案中，q的值是选自下组，其构成为：3、4、5、6、7、8、9以及10。在又一些其他实施方案中，q是3或4。在又一些其他的实施方案中，“q”个聚合物臂[-Q-POLY1-X-(CH2)2-(CHR1)nC(O)OD]中的每个都是相同的。
针对该偶联物的小分子部分的实施方案包括以下内容。在一个或多个实施方案中，该小分子具有的分子量的范围是从约250-700道尔顿。在又一些其他实施方案中，D是紫杉烷或喜树碱的一个残基。在又一些其他的实施方案中，D是紫杉醇或多西他赛的一个残基。在一个或多个实施方案中，D具有以下结构：
Figure BDA0000050623270000061
在又一个进一步的实施方案中，该多臂的聚合物偶联物具有以下结构：
Figure BDA0000050623270000062
化合物Ia
其中n的范围是从约40至约500。在关于以上结构的一个实施方案中，该偶联物的总的重均分子量范围是从约10,000至约80,000。
在一个第二方面，提供了一种药用组合物，该药用组合物包括在此所述的一种多臂的聚合物偶联物、结合有一种药学上可接受的载体。
在该多臂聚合物偶联物对应于以上所示的化合物Ia的一个相关实施方案中，当在大鼠的单一剂量研究中进行评估时，该组合物展现了与多西他赛相比为2倍的或更大的毒性降低。在又一些其他实施方案中，该偶联物的特征为大于或等于92％的一个载药量。在又一些其他实施方案中，对应于以上所示的化合物Ia的多臂聚合物偶联物进一步的特征是在H460、LoVo、或LS174T小鼠异种移植模型的任何一个中在最大耐受剂量(MTD)下测得的百分比肿瘤生长延迟(TGD)是对于多西他赛所观察到的1.5倍或远大于它。
在一个第三方面，在此提供了将一种多臂聚合物偶联物投递给对其有需要的一个哺乳动物受试者的方法。该方法包括给予该哺乳动物受试者一个治疗上有效量值的一种在此提供的多臂聚合物偶联物。
在一个第四方面，在此提供了用于治疗哺乳动物受试者的癌症的方法。该方法包括：将一个治疗上有效量值的一种在此提供的偶联物(其中D是一种抗癌剂)给予一个被诊断为具有一个或多个实体瘤的受试者，持续的时间段为在所述受试者中有效地产生对所述一个或多个实体瘤生长的一种抑制。
在针对以上第四方面的一个实施方案中，该癌性实体瘤类型是选自下组，其构成为：结肠直肠的、乳腺的、前列腺的以及非小细胞肺的。
在一个第五方面，在此提供了用于治疗哺乳动物受试者的对使用多西他赛进行治疗有反应的一种病症的方法，其中该方法包括给予该受试者一个治疗上有效量值的一种在此提供的多臂聚合物偶联物。
在此还提供了与以上方法相关的用途。
在一个第六方面，在一种具有以下结构的多臂聚合物偶联物中，
R(-Q-POLY1-Y-D)q，
其中R是具有从约3至约150个碳原子的一个有机核心基团，Q是一个连接物，POLY1是一种水溶性的且非肽的聚合物，Y是包括一个可水解的连接的一个间隔物，这样当所述可水解的连接进行水解时，D被释放，D是一个小分子，并且q是大于或等于3，提供了一种包括Y的改进，Y具有以下结构，
其中：X是在此进一步详述的一个间隔物；R1是选自下组，其构成为：H、低级烷基、以及一个吸电子基团，并且n是从1至5的一个整数。
在一个第七方面，提供了具有以下结构的一种多臂聚合物结构，
Figure BDA0000050623270000082
其中：R是包括从约3至约150个碳原子的一个有机核心基团；Q是一个连接物；POLY1是一个水溶性的且非肽的聚合物区段；X是一个间隔物；每个R1独立地选自下组，其构成为：H、低级烷基、以及一个吸电子基团；n是从1至7的一个整数；q是3或更大；W是选自下组，其构成为：D、H以及一种被活化的酯，其中D是分子量小于约800道尔顿的一个小分子的残基。关于包括这种多臂聚合物结构的多种组合物，平均起来并考虑到该组合物内的所有种类，处于0.92(q)或更大一个值时W优选等于D。
在一个第八方面，提供了用于制备一种多臂聚合物药物偶联物的方法。该方法包括：在以上描述的化学过程的界限内使具有“q”个聚合物臂(各自在其末端具有一个反应性羧酸基团或活化酯等效物)的一种多臂的水溶性聚合物结构，与“q”当量或更大的一种小分子药物的空间受阻的仲醇或叔醇在多项条件下进行反应，这些条件有效地导致该小分子药物通过一个酯连接而偶联到该多臂的水溶性聚合物结构上，而形成一种多臂水溶性的聚合物药物偶联物，其中92％或更多的所述聚合物臂具有共价地连接其上的小分子药物。该偶联物在每个聚合物臂中具有与该酯连接相邻的一个连接物，其中该连接物优选地缺少一种官能团，该官能团能够与该酯羰基进行一种邻基相互作用而形成一种能够替换该小分子药物的一种五或六元的环状产物。
在关于第八方面的一个具体实施方案中，该连接物是具有结构-(CH2)2(CR1H)nC(O)-O-的一种烷酸酯连接物，其中R1每次出现时独立地选自：H、低级烷基、以及一个吸电子基团，并且n是从1至7的一个整数。在又一个实施方案中，在该反应步骤之前，使该连接物共价地附接到该药物或每个聚合物臂上。
在一个第九方面，在此提供了具有以下结构的一种多臂聚合物偶联物或试剂：
Figure BDA0000050623270000091
其中所示变量中的每个都是如以上描述的。在以上内容的一个具体实施方案中，该结构具有一个而不是两个与X相邻的亚甲基基团，n等于一，并且R1是低级烷基或一个吸电子基团。4-臂-PEG-甲基丙酸是对于提供此类多臂聚合物偶联物或试剂有用的一种示例性结构。
本发明的方法、组合物以及类似物的另外的实施方案从以下的说明、附图、实例以及权利要求中将是很清楚的。正如从以上和以下的说明中可以了解的，每一个在此描述的特征以及这样的特征中两个或多个的每一种组合都包括在本披露的范围之内，前提是包括在这样一种组合中的这些特征不是相互矛盾的。此外，可以特别地从本发明的任何实施方案中排除任何的特征或特征组合。在以下的说明以及权利要求中列出了本发明的另外的方面以及优点，特别是在结合所附实例以及图进行考虑时。
当结合以下详细说明来阅读时，本发明的这些以及其他的目的和特征将变得更完全清楚。
附图简要说明
图1A-C说明了一种二肽连接的含季戊四醇基核心的多臂聚合物的一种示例性合成。
图2A和2B是展示了对于植入有LS174T(结肠直肠的)肿瘤并且用多西他赛或4-臂-PEG20K-BA-DOC(4-ARM-PEG20K-BA-DOC)治疗的小鼠，肿瘤体积中位数(MTV)随时间的曲线图，如在实例13中详细说明的。图2A提供了对于服用了不同剂量的多西他赛或4-臂-PEG20K-BA-DOC的小鼠而言的剂量响应曲线；图2B是对于服用了最大耐受剂量(MTD)的多西他赛或4-臂-PEG20K-BA-DOC的小鼠，LS174T肿瘤体积中位数随时间的图形表示。
图3A和3B展示了对于植入有H460肿瘤并且用多西他赛
Figure BDA0000050623270000102
或4-臂-PEG20K-BA-DOC治疗的小鼠而言显著增加的肿瘤生长延迟(TGD)，如在实例13中详细说明的。图3A提供了对于服用了不同剂量的多西他赛或4-臂-PEG20K-BA-DOC的小鼠而言的剂量响应曲线；图3B提供了最大耐受剂量(MTD)与对照物的对比。
图4A和4B是展示了对于植入有LoVo肿瘤并且用多西他赛或4-臂-PEG20K-BA-DOC治疗的小鼠而言的肿瘤体积中位数随时间的图示，如在实例13中详细说明的。图4A提供了对于服用了不同剂量的多西他赛或4-臂-PEG20K-BA-DOC的小鼠而言的剂量响应曲线；图4B提供了对于服用了最大耐受剂量(MTD)的多西他赛
Figure BDA0000050623270000104
或4臂-PEG20K-BA-DOC的小鼠与对照物的MTD对比，如在实例13中详细说明的。
详细说明
现在将在下文中更全面地说明本发明的不同方面。然而，这些方面可以按许多不同的形式实施并且不得解释为限制于在此列出的实施方案；而是提供这些实施方案使得本披露内容是充分且完全的，并且完全将本发明的范围传达给本领域的普通技术人员。
在此引用的所有公开物、专利以及专利申请(不论是在上或在下)均通过引用以其整体结合在此。
定义
必须指出的是，如在本说明书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”、以及“该”包括复数对象，除非上下文另外清楚地指示。因此，例如提及一种“聚合物”包括一种单一的聚合物同样包括两种或多种相同或不同的聚合物，提及一种“偶联物”是指一种单一的偶联物同样包括两种或多种相同或不同的偶联物，提及一种“赋形剂”包括一种单一的赋形剂同样包括两种或多种相同或不同的赋形剂，诸如此类。
在对本发明进行说明并且提出权利要求时，以下术语将根据以下描述的定义使用。
一种“官能团”是一种基团，该基团可以在有机合成的正常条件下使用，来在它附接其上的实体与另一个实体之间形成一个共价连接，该另一个实体典型地带有另一个官能团。该官能团一般包括一个或多个多重键和/或一个或多个杂原子。在下面描述了用于本发明的聚合物中的优选官能团。
术语“反应性的”是指一种官能团在有机合成的正常条件下容易地或以一个实际速率进行反应。这与不发生反应或为了进行反应而要求强催化剂或不切实际的反应条件的那些基团(即，“不反应的”或“惰性的”基团)不同。
对于在一种反应混合物中的一个分子上存在的一种官能团，“不容易反应的”表示该基团在对于在该反应混合物中产生一种所希望的反应是有效的条件下仍然是大部分保持原样的。
一种羧酸的“活化的衍生物”是指容易与亲核体反应的一种羧酸衍生物，一般比未衍生的羧酸容易得多。活化的羧酸包括例如酰基卤(例如酰基氯)、酸酐、碳酸酯以及酯类。这样的酯包括例如咪唑基酯、以及苯并三唑酯、以及酰亚胺酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯。一种活化的衍生物可以通过一种羧酸与不同的试剂中的一种的反应而在原位形成，这些不同的试剂是例如苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)，优选是与1-羟基苯并三唑(HOBT)或1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAT)；O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)；或与双(2-氧代-3-噁唑烷基)次磷酰氯(BOP-Cl)结合使用。
一个官能团的“化学等效物”是具有与该官能团基本上相同类型的反应性的物质。例如，经历一个SN2反应的一种官能团被认为是另一个此种官能团的官能等效物。
“保护基”是防止或阻止分子中一个具体的化学反应性官能团在某一反应条件下进行反应的一个部分(moiety)。该保护基将取决于受保护的化学反应性基团的类型连同有待采用的反应条件以及在分子中另外的反应性的或保护性基团的存在与否而改变。作为举例，可能受保护的官能团包括：羧酸基团、氨基基团、羟基基团、硫醇基团、羰基基团以及类似物。针对羧酸的代表性保护基包括酯类(例如一种对甲氧基苄基酯)、酰胺类以及酰肼类；对于氨基基团是氨基甲酸酯(例如叔丁氧基羰基)以及酰胺；对于羟基基团是醚类以及酯类；对于硫醇基团是硫醚类以及硫酯类；对于羰基基团是缩醛类以及缩酮类；等等。此类保护基是本领域技术人员熟知的并且在例如T.W.Greene和G.M.Wuts，Protecting Groups in organic Synthesis，Third Edition，Wiley，New York，1999以及P.J.Kocienski，Protecting Groups，Third Ed.，Thieme Chemistry，2003以及在此引用的参考文献中进行了描述。
处于“受保护形式”的官能团是指带有一个保护基的官能团。如在此使用的，术语“官能团”或者它的任何同义词是意在涵盖它的受保护的形式。
如在此所使用的“PEG”或“聚(乙二醇)”意在涵盖任何水溶性的聚(环氧乙烷)。典型地，在本发明中使用的PEG将包括以下两种结构之一：“(CH2CH2O)n-”或“(CH2CH2O)n-1CH2CH2-”，这取决于例如在合成转化过程中这个或这些末端氧是否被取代，或例如相邻官能团的身份。变量(n)典型地范围是从3至约3000，并且这些末端基团以及整个PEG的结构可以改变。当PEG或包含一个PEG区段的偶联物进一步包括如以上化合物I中的一个间隔物或一个连接物(以下更详细地说明)时，这些包括间隔物(X)或连接物(Q)的原子在共价地附接到一个PEG区段上时不会导致形成(i)一个氧-氧键(-O-O-，一个过氧化物连接)或(ii)一个氮-氧键(N-O、O-N)。本发明中使用的PEG包括具有各种各样将在下面更详细说明的分子量、结构或几何形状的PEG。
在本发明的一种聚合物的上下文中，“水溶性的”或“水溶性聚合物区段”是在室温下可溶于水中的任何区段或聚合物。典型地，一种水溶性聚合物或区段在过滤后将透射该同一溶液所透射的光的至少约75％、更优选至少约95％。在重量基础上，一种水溶性聚合物或其区段将优选是至少约35％(按重量计)可溶于水、更优选至少约50％(按重量计)可溶于水、仍然更优选约70％(按重量计)可溶于水、以及仍然更优选约85％(按重量计)可溶于水的。然而最优选的是，该水溶性聚合物或区段是约95％(按重量计)可溶于水的或完全可溶于水的。
一个“封端性”或“封端的”基团是在一种聚合物如PEG的末端上存在的一个惰性基团。一个封端基团是在典型的合成反应条件下不容易经历化学转化的一种基团。封端基团一般是烷氧基基团-OR，其中R是包含1-20个碳的有机基团并且优选是低级烷基(例如，甲基、乙基)或苄基。例如，封端的PEG典型地包括结构“RO-(CH2CH2O)n-”，其中R是如以上定义的。作为替代方案，该封端基团还可以有利地包括一个可检出的标记物。当该聚合物具有一个包括可检出标记物的封端基团时，该聚合物所偶联的聚合物和/或部分(例如活性剂)的量或位置可以使用合适的检测器来确定。此类标记物包括但不限于荧光增光剂、化学发光剂、在酶标记中使用的部分、比色标记物(例如染料)、金属离子、放射性部分等等。
就一种聚合物而言，“非天然存在的”表示一种聚合物尚未在自然界中以其整体被发现。然而，一种非天然存在的聚合物可以含有天然存在的一个或多个亚单元或亚单元区段，只要整个聚合物结构未在自然界中发现。
在一种水溶性聚合物(例如PEG)的上下文中“分子量”是指一种聚合物的标称的平均分子量，该分子量典型地是通过在水或有机溶剂中的尺寸排阻色谱法、光散射技术或特性粘度测定来确定。在水溶性聚合物(如PEG)的上下文中，分子量可以被表示为一种数均分子量或一种重均分子量。除非另外指出，否则在此对分子量的所有引用都是指数均分子量。数均和重均的分子量确定两者都可以使用凝胶渗透色谱技术来测量。还可以使用其他的用于测量分子量值的方法，如使用端基分析或依数性(例如凝固点降低、沸点升高、或渗透压)的测量来确定数均分子量；或使用光散射技术、超速离心法或粘度测定法来确定重均分子量。本发明的聚合物典型地是多分散的(即这些聚合物的数均分子量和重均分子量是不相等的)，具有低的多分散性值，如小于约1.2、小于约1.15、小于约1.10、小于约1.05、并且小于约1.03。如在此所使用的，有时候会提及一种具有重均分子量或数均分子量的单一的水溶性聚合物；这样的提及应理解为是指这种单一的水溶性聚合物是由具有所指出的分子量的多种水溶性聚合物的一种组合物获得的。
在此使用术语“连接物”来指代用来连接多个互连的部分的一种原子或原子集合，例如一个有机基团核心或一个聚合物区段，POLY1。一个连接物部分可以是水解稳定的或可以包括一个生理学上可水解的或酶可降解的连接。
在此使用术语“间隔物”来指代用来连接多个互连的部分的一种原子或原子集合，如POLY1以及一个二亚甲基基团，形成了到小分子药物D上的烷酸酯连接的一部分。一个间隔物部分可以是水解稳定的或可以包括一个生理学上可水解的或酶可降解的连接。
“可水解的”键是在生理学条件下与水进行反应(即，被水解)的一种相对弱的键。一种键在水中水解的趋势将不仅取决于连接两个中心原子的连接的总体类型，而且还取决于附接在这些中心原子上的取代基。示例性的水解不稳定的连接包括羧酸酯、磷酸酯、酸酐类、缩醛类、缩酮类、酰氧基烷基醚、亚胺类、原酸酯类、肽类以及寡核苷酸类。
“酶可降解的连接”表示受到一种或多种酶降解的一种连接。此种连接要求一种或多种酶的作用来完成降解。
“水解稳定的”连接或键是指在水中是实质上稳定的，即在生理条件下在一个延长的时间段内不会经历任何可观程度上的水解的一种化学键，典型地是一种共价键。水解稳定的连接的实例包括但不限于以下各项：碳-碳键(例如在一个脂肪链中)、醚类、酰胺类、氨基甲酸酯类等。总体上，水解稳定的连接是在生理条件下显示出小于约1％至2％每天的水解速率的一种连接。代表性化学键的水解速率可以在大多数标准的化学教科书中找到。
关于一种聚合物的几何形状或总体结构，“多臂的”是指聚合物具有3个或更多个连接到一个“核心”分子或结构上的含聚合物的“臂”。因此，一种多臂的聚合物可以具有3个聚合物臂、4个聚合物臂、5个聚合物臂、6个聚合物臂、7个聚合物臂、8个聚合物臂或更多，这取决于其构型以及核心结构。一种具体类型的高度分枝的聚合物是一种树枝状聚合物或树枝状化合物，为了本发明的目的，认为它具有不同于多臂聚合物的结构的一种结构。这就是说，如在此明确提及的一种多臂聚合物排除了树枝状化合物。此外，如在此提供的一种多臂聚合物具有一个非交联的核心。
一种“树枝状化合物”是一种球形的、尺寸单分散的聚合物，其中所有的键从一个中心焦点或核心放射状地形成，具有规则的分枝图案并且具有多个重复单元(各自贡献了一个分枝点)。树枝状化合物典型地是使用一种纳米级的多步骤的制造过程形成的。每个步骤产生了一个新的“世代”，该世代具有前一个世代两倍的或更多倍的复杂性。树枝状化合物表现出某些树枝状的状态特性例如核心胶囊化，从而使得它们不同于其他类型的聚合物。
“分枝点”是指包括一个或多个原子的一个分叉点，在这个点处一种聚合物从一种直链结构分裂或分枝成一个或多个另外的聚合物臂。一种多臂聚合物可以具有一个分枝点或多个分枝点，只要这些分枝不是产生一种树枝状化合物的规则性重复。
“实质性地”或“基本地”意思是几乎全部地或完全地，例如某一给定量的95％或更大。
“烷基”是指典型地长度范围是从大约1至20个原子的一种烃链。此类烃链优选是但并非必须是饱和的并且可以是支链的或直链的，尽管典型地直链是优选的。示例性的烷基基团包括甲基、乙基、异丙基、正丁基、正戊基、2-甲基-1-丁基、3-戊基、3-甲基-3-戊基，以及类似物。如在此使用的，当提及三个或多个碳原子时，“烷基”包括环烷基。
“低级烷基”是指含有从1至6个碳原子的烷基基团，并且可以是直链或支链的，如举例为：甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基。
“环烷基”是指饱和的或未饱和的环状烃链，包括桥联的、稠合的、或者螺环的化合物，优选地由3至大约12个碳原子、更优选地3至约8个构成。
“非干扰性取代基”是那些存在于分子中时与该分子中所含的其他官能团典型地不反应的基团。
术语“取代的”，如在例如“取代的烷基”中，是指用一个或多个非干扰性取代基所取代的一个部分(例如，一个烷基基团)，这些取代基是例如但不限于：C3-C8环烷基，如环丙基、环丁基等等；卤代，例如氟代、氯代、溴代、以及碘代；氰基；烷氧基、低级苯基；取代的苯基；等等。对于在一个苯环上的取代，这些取代基可以是在任何方位(即邻位、间位、或对位)上。
“烷氧基”是指一种-O-R基团，其中R是烷基或取代的烷基，优选C1-C20烷基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基等)，优选是C1-C7烷基。
如在此所使用的，“链烯基”是指包含至少一个双键的、具有1至15个原子长度的一种支链的或无支链的烃基团，例如亚乙基(乙烯基)、2-丙烯-1-基(烯丙基)、异丙烯基、3-丁烯-1-基，以及类似物。
如在此所使用的术语“炔基”是指包含至少一个三键的、具有从2至15个原子长度的一种支链的或无支链的烃基团，乙炔基、1-丙炔基、3-丁炔-1-基、1-辛炔-1-基，等等。
“芳基”表示一个或多个芳环，各自具有5或6个核心碳原子。芳基包括多种芳基环，这些芳基环可以是稠合的(如在萘基中)或未稠合的(如在联苯基中)。芳基环还可以与一个或多个环烃、杂芳基、或杂环是稠合的或未稠合的。如在此使用的“芳基”包括杂芳基。
“杂芳基”是包含从一个至四个杂原子的一种芳基基团，这些杂原子优选是N、O、或S、或它们的一种组合。杂芳基环还可以与一个或多个环烃、杂环、芳基、或杂芳基环是稠合的。
“杂环”或“杂环的”表示5至12个原子(优选5至7个原子)的一个或多个环，它具有或不具有不饱和性或芳香族特征并且具有至少一个非碳的环原子。优选的杂原子包括硫、氧、以及氮。
“取代的杂芳基”是具有一个或多个非干扰性基团作为取代基的杂芳基。
“取代的杂环”是具有一个或多个由非干扰性取代基形成的侧链的一种杂环。
“亲电体”是指一种离子、原子或者原子集合，它可以是离子性的、具有一个亲电子的中心(即，寻找电子的、能够与一个亲核体进行反应的中心)。
“亲核体”是指一种离子或原子或者原子集合，它可以是离子性的、具有一个亲核的中心(即，寻找一个亲电子的中心的、并且能够与一个亲电体进行反应的中心)。
如在此所使用的“活性剂”包括提供了可以在体内以及体外得到证实的某些药理学(经常是有益的)效果的试剂、药物、化合物以及类似物。如在此所使用的，这些术语进一步包括任何生理学或药理学上活性的物质，该物质在患者身上产生了一种局部性的或全身的效果。
“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”是指可以包括在本发明的组合物中而不对患者造成显著的有害毒理学作用的一种赋形剂。
“药理学上有效的量”、“生理学上有效的量”以及“治疗学上有效的量”在此互换地使用，是指为了在血液中或在身体中的目标组织或位置提供所希望水平的活性剂和/或偶联物所需要的在一种药物制剂中存在的活性剂的量。这个精确的量将取决于多个因素，例如具体的活性剂、药物制剂的组分以及物理特征、既定的患者群体、患者的顾虑等等，并且可以容易地由本领域的普通技术人员基于在此提供的以及在相关文献中可得的信息来确定。
在本发明的一种聚合物的上下文中，“多官能的”是指具有3个或更多个官能团的一种聚合物，其中这些官能团可以是相同或不同的，并且典型地在该聚合物末端存在。本发明的多官能聚合物将典型地包含从大约3-100个官能团、或从3-50个官能团、或从3-25个官能团、或从3-15个官能团、或从3至10个官能团，即包含3、4、5、6、7、8、9或10个官能团。典型地，关于用来制备本发明的聚合物偶联物的一种聚合物前体，该聚合物具有3个或更多个聚合物臂，这些臂在每个臂的末端具有适合于通过一个可水解的酯连接而偶联到一个活性剂部分上的一个官能团。典型地，这样的官能团是相同的。
“二官能的”或“双官能的”在此互换地使用，是指一种有(典型地是在聚合物的末端)两个官能团包含在其中的实体，如聚合物。当这些官能团相同时，称该实体是同二官能的或同双官能的。当这些官能团不同时，称该聚合物是杂二官能的或杂双官能的。
在此说明的一种碱性的或酸性的反应物包括中性、带电的、以及它们的任何对应的盐形式。
“聚烯醇”是指一种包含烯烃聚合物主链的聚合物，如聚乙烯，该聚合物具有多个附接到该聚合物主链上的侧羟基基团。一种示例性的聚烯醇是聚乙烯醇。
如在本文中所使用，“非肽的”是指基本上不含肽连接的一条聚合物主链。然而，该聚合物可能包括沿着这些重复单体亚单元间隔开的少数肽连接，例如像每大约50个单体单元不超过大约1个肽连接。
术语“受试者”、“个体”或“患者”在此互换地使用并且是指一种脊椎动物，优选是一种哺乳动物。哺乳动物包括但不限于鼠类、啮齿动物、猿类、人类、家畜、运动型动物以及宠物。这样的受试者典型地正经受或易患一种病症，该病症可以通过给予本发明的聚合物(典型地但并非必须是以在此描述的一种聚合物-活性剂的偶联物的形式)进行预防或治疗。
术语“约”(特别是关于一个给定的量)意在涵盖加上或减去百分之五的偏差。
一种具体病症的“治疗”(treatment/treating)包括：(1)预防这样一种病症，即，使该病症在可能暴露于或易患该病症的但是还未经历或显现出该病症的受试者中不发展、或以极小的强度或在更小程度上发生，(2)抑制该病症，即，阻止这种发展或逆转这种病症。
“任选的”或“任选地”表示随后说明的状况可能发生或可能不发生，这样该说明包括该状况发生的情况和该状况不发生的情况。
一种“小分子”可以被广义地定义为一种有机的、无机的或有机金属的化合物，该化合物典型地具有小于约1000、优选小于约800道尔顿的分子量。本发明的小分子涵盖低聚肽以及其他具有小于约1000的分子量的生物分子。
“残基”，例如一个小分子(关于在此提供的偶联物)的残基，是指未改性的小分子的部分或残基直到由该小分子(或其一种活化的或化学改性的形式)共价附接到一种多臂聚合物(如在此提供的)上而产生的共价连接。例如，在该小分子部分与该多臂聚合物之间的可水解的酯连接进行水解时，该小分子本身被释放。例如，对于包含一个羟基基团并且通过非正式化学式D-OH所表示的一种小分子药物，关于化合物I，该小分子的残基对应于“D”，它是在除去或替换该羟基-OH时剩余的该小分子的部分。关于该有机的核心分子“R”，提供了以下例子。在其中R是具有三个羟基的一种分子(三元醇)(表示为R-(OH)3)的一个残基的情况下，当关于化合物I进行考虑时，那么对于每个聚合物臂q，将R-(O-)视为该多元醇的残基，其中R与连接物Q相结合地被视为三元醇的一个残基。在上一个例子中，氧(O)对应于连接物Q。
“多元醇”是含有多于两个羟基基团的一种醇，其中前缀“多”在这种情况下是指多个的某项特征而不是指一种聚合的结构。类似地，聚硫醇是含有多于两个硫醇(-SH)基团的一种硫醇，并且聚胺是含有多于两个氨基基团的一种胺。
多臂聚合物偶联物-邻基相互作用及其避免
在此提供的多臂聚合物偶联物还被称为“药物前体”。术语“药物前体”在本申请中是指一种药物的改性形式，其中此种改性作用典型地包括该药物与一个化学物部分(例如一种聚合物)之间的一种共价结合。一种药物前体在体内被酶地或者非酶地转化成其活性药物的形式。
小分子的多臂聚合物偶联物先前已经进行了描述。例如参见美国专利申请公开号2005/0112088以及2007/0197575。在此描述的多臂聚合物偶联物的某些示例的实施方案包含一种氨基酸连接物如甘氨酸，将该活性剂(例如一种喜树碱分子)连接到该多臂聚合物支架上。一种氨基酸连接如甘氨酸由于其双官能的性质以及在体外和体内轻易水解是有吸引力的。产生自该氨基酸连接物的酯连接由于邻近该甘氨酸部分的官能团的吸电子性质而被迅速地水解。然而，尽管这种连接物可以提供有利的水解速率，但是本发明发现一种邻近官能团相互作用在某些情况下可能产生问题，这些问题可能使得此类连接物在最终的多臂聚合物偶联物中是欠佳的。
理解邻基过程如何发生(参见，例如Capon and McManus，Neighboring Group Participation，Plenum Press，New York，1975)并认识它们的可能出现，结果是，记住这种理解诸位发明人已经形成(除其他之外)了新的偶联物、试剂以及合成方案。除其他之外，本发明的多臂聚合物偶联物绕开了和/或减小了一种邻基相互作用，这种作用会导致吖内酯的形成，从而导致在最终的多臂聚合物药物偶联物中欠佳的载药量。吖内酯是这样一种化合物，它是一种α-酰基氨基酸的酸酐；基础环结构是5-恶唑酮类型，例如，
Figure BDA0000050623270000201
当尝试形成一种羧酸的活性酯时，一种吖内酯可以例如在一种缩合剂的存在下形成。
Figure BDA0000050623270000211
吖内酯可以在许多类似的过程中形成。例如参见Benoiton et al.(1981)“Oxazolones from 2-alkoxycarbonyl amino acids and their implication in carbodiimide-mediated reactions in peptide synthesis”Can.J.Chem.，59：384。在考虑以上用于形成一种羧酸的活化酯(例如一种N-羟基琥珀酰亚胺酯)的反应时，例如，如果在该活化过程中使用小于化学计算量的N-羟基琥珀酰亚胺，则大家会预期该碳二亚胺的脱水反应通过以上机理形成吖内酯。此外，因为N-羟基琥珀酰亚胺酯是对应的羧酸的一种活化的形式，所以这种吖内酯还可以通过与由该酸形成吖内酯类似的机理而由该活性酯形成。然后，在形成具有良好产率的所希望产物、以及基本上不存在杂质(例如基本上不存在含吖内酯的杂质)的对应组合物时避免形成吖内酯是在此提供的偶联物、组合物以及方法的一个非限制性的目标。
Figure BDA0000050623270000221
根据一种多臂聚合物药物前体的一个或多个实施方案，其中药物通过一个甘氨酸连接物共价地附接到一种多臂聚合物上，如在美国专利申请公开号2005/0112088中描述的，甘氨酸首先轭合到含有羟基的一种药物上。然后，将该甘氨酸衍生的药物轭合到羧甲基PEG(PEGCM)的一种活性(例如，NHS)酯上，如在方案中所展示的。
Figure BDA0000050623270000222
基于以上讨论，可见吖内酯的形成可以在一种t-BOC受保护的甘氨酸与该药物醇进行反应的这个步骤过程中发生。这在以下方案中展示。吖内酯的形成，即使是以较小的量形成，也可以不利地影响这个过程的效率并且同时产生一种反应性杂质。
Figure BDA0000050623270000231
以上讨论与本披露有关。在不同的甘氨酸轭合的药物醇分子的轭合过程中，例如喜树碱与4-臂-PEG-CM活性酯，已经认识到该四-臂PEG聚合物的端基的取代是欠佳的。这样的取代值(并且小于最佳载药量)尽管是可再现的，但是产生了一种产物，该产物平均具有比所有四个有药物轭合其上的聚合物臂更小的取代值(即，低于药物在该四臂聚合物上的理想的取代程度)。理想地，一种多臂聚合物(例如在此描述的)平均起来具有被取代在每个聚合物臂上的药物，这样该多臂聚合物支架是“完全装载的”，而由此完全利用该聚合物的多臂特征。参见，例如实例3-5与实例2、6、7、8、9、10和12进行比较。
一种多臂聚合物的给定聚合物臂的取代可以从一个从不变得共价地附接到该聚合物臂上的一个药物部分产生。此外，一种多臂聚合物的给定聚合物臂的取代可以由酯形成之后该药物部分的失去而产生。在此方面，一个药物部分(例如一种喜树碱醇)作为一个离去基团起作用，并且以类似于用N-羟基琥珀酰亚胺酯示出的这个反应的方式被去除。如以下所展示的，由于邻近的氨基甲酸酯基团的可能参与，一种吖内酯很有可能是一种中间产物。
Figure BDA0000050623270000241
尽管一般认为N-羟基琥珀酰亚胺是比一种醇(例如像在伊立替康或喜树碱中存在的)好得多的离去基团，但是位阻现象对于具有叔醇的分子(例如伊立替康或喜树碱)中的这个过程可能是一个推动力。在所展示的例子中，结果是该封端基团是一种吖内酯或其水解产物即甘氨酸封端的PEG臂。
一种吖内酯(如果形成的话)代表一种杂质，因为它可能与内源性蛋白的胺基团进行反应而在体内形成不想要的偶联物。参见美国专利号5,321,095。
据信，在此描述的偶联物、试剂以及方法除其他之外具有增加的载药量的优点同时避免了杂质。此外，本发明的偶联物表明了优异的体内抗癌剂活性，以及降低的毒性，连同超越单独的未轭合药物而显著增强的疗效。
此类偶联物的特征将在下面更详细地讨论。
该聚合物偶联物的结构特征
如以上所描述的，在此提供的一种偶联物包括包括一种多臂聚合物，即具有三个或更多个臂，其中该偶联物具有以下广义结构，
Figure BDA0000050623270000251
化合物I
其中：R是包括从约3至约150个碳原子的一个有机核心基团；Q是一个连接物；POLY1是一个水溶性的且非肽的聚合物区段；X是一个任选存在的间隔物；R1，每次出现时独立地选自下组，该组的构成为：H、低级烷基、以及一个吸电子基团；n是从1至7的一个整数；D是一个具有小于约800道尔顿分子量的小分子的残基，优选是一种小分子药物；并且q是3或更大。该多臂聚合物的每个臂是独立于其他的。这就是说，该多臂聚合物的“q”个臂中每个都可以由不同的Q、POLY1、X、R1、n等等构成。代表此类实施方案，对于从该中心有机核心基团发散的这些臂中的每一个，一种广义结构对应于：R[(-Q1-POLY1A-X1-(CH2)2(CR1AH)n1C(O)-O-D1)(-Q2-POLY1B-X2-(CH2)2(CR1BH)n2C(O)-O-D2)(-Q3-POLY1C-X3-(CH2)2(CRAH)n2C(O)-O-D3)...]，等等。然而总体上，该多臂的药物前体的每个臂是相同的，具有某些例外，将在以下更详细地讨论。
如在以上部分中描述的，该多臂聚合物包含一种烷酸酯区段(在该X-(CH2)2(CR1H)nC(O)-O-D部分内的一个烷酸酯区段)的特征。该烷酸酯具有的长度以及性质足以防止或降低邻基参与作用(例如来自该连接物基团，“X”)。一个a或β烷基基团或类似物(例如当R1是烷基时)可以在提供位阻来改进该最终的活性酯试剂的选择性方面提供价值。正如在支持性实例中所见，使用该烷酸酯连接物有效地产生了具有高的载药效率的示例性多臂聚合物药物偶联物。
现在对化合物I的每种可变组分进行详细地说明。关于对应的偶联物在此所描述的每种组分类似地扩展到对应的多臂聚合物试剂中，例如，当D在化合物I中作为一个小分子残基存在时，D可以例如被取代为例如H或对应于一种活化酯的官能团。
有机的核心，“R”
在化合物I中，R是具有从约3至约150个碳原子的一个有机的核心基团。优选地，R包含从约3至约50个碳原子，并且甚至更优选地R包含从约3至约10个碳原子。这就是说，在一个实施方案中R可以具有选自下组的一个碳原子数目，该组的构成为：3、4、5、6、7、8、9、以及10。该有机核心可以任选地包含一个或多个杂原子(例如O、S、或N)，当然这取决于所使用的具体的核心分子。R可以是直链的或环状的，并且典型地由此发散出至少3个独立的聚合物臂，其中至少一个具有共价地附接到其上的一个活性剂部分。优选的有机核心分子是饱和的脂肪族物质。现在看化合物I，“q”对应从“R”发散出的聚合物臂的数目。在一些情况下，一个或多个聚合物臂可能不具有共价地附接到其上的一种活性剂，而是可能在其末端具有一个相对不反应的或未反应的官能团，该官能团典型地是产生自一个未能达到完全的合成或是由于水解。在这种情况下，D不存在并且至少一个聚合物臂的单独结构是处于其前体的形式(或是其衍生物)，即在其末端具有的不是一种活性剂D而是一个官能团。然而，在此提供的多臂偶联物的一个特别有利的特征是它们在该多臂聚合物的每个水溶性聚合物臂上的载药程度。优选地，由于不存在任何潜在的邻基相互作用，该多臂聚合物的载药程度(在多种多臂聚合物的一种组合物内)是大于约92％。例如，对于具有q个聚合物臂的一种多臂聚合物偶联物，该平均载药量(在多种多臂聚合物的一种组合物内)优选地是0.92(q)或更大。甚至更优选地，在此提供的一种多臂聚合物偶联物具有的载药程度(在多种多臂聚合物的一种组合物内)是至少93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％或更大。
该中心的核心有机基团R对应于一种不连续的分子，该分子提供了一个数目的聚合物附接位置，该数目近似地等于水溶性且非肽的聚合物臂的所希望的数目。优选地，该多臂聚合物结构的中心核心分子是带有至少三个可用于聚合物附接的羟基、硫醇或氨基基团的一种多元醇、聚硫醇或聚胺的一个残基。“多元醇”是包括多个(3个或更多)可用羟基基团的分子。“聚硫醇”是具有多个(3个或更多)硫醇基的分子。“聚胺”是包括多个(3个或更多)可用氨基基团的分子。取决于所希望的聚合物臂的数目，这种前体多元醇、聚胺或聚硫醇(在POLY1的共价附接之前)典型地分别包含3至约25个适合于POLY1共价附接的羟基或氨基基团或硫醇基团，优选是从3至约10个羟基、氨基基团或硫醇基团(即，3、4、5、6、7、8、9、10)，最优选地包含从3至约8个(例如3、4、5、6、7或8)个羟基、氨基基团或硫醇基团。该多元醇、聚胺或聚硫醇还可以包括其他受保护的或未受保护的官能团。重点放在衍生自多元醇、聚胺的有机核心上，尽管在各个羟基或氨基基团之间的插入原子的数目会改变，但是优选的核心是在各个羟基或氨基基团之间具有从约1至约20个(优选从约1至约5个)插入的核心原子(例如碳原子)长度的那些。关于插入的核心原子以及长度，例如-CH2-被认为是具有一个插入原子的长度，尽管该亚甲基本身包括总共三个原子，但是因为这些H是碳上的取代基，并且例如-CH2CH2-被认为是具有两个碳原子长度，等等。具体的多元醇或聚胺前体取决于在最终的偶联物中所希望的聚合物臂的数目。例如，一种具有4个官能团的多元醇或聚胺核心分子Q适合于制备一种符合化合物I的药物前体，该药物前体具有由此延伸的并且共价地附接到一个活性剂上的四个聚合物臂。
该前体多元醇或聚胺核心在用一种聚合物进行官能化之前典型地具有一种结构R-(OH)p或R-(NH2)p。p的值对应于化合物I中的q值，因为在母体核心有机分子中的每个官能团(典型地是-OH或-NH2)如果是空间上可接近的并且是反应性的，则共价地附接到一个聚合物臂POLY1上。注意在化合物I中，变量“Q”在与R作为整体时典型地代表在此描述的核心有机基团的残基。这就是说，在描述优选的有机核心分子时(特别是通过名称)，这些核心分子是以其前体的形式、而不是以除去例如一个质子之后的基团的形式进行描述的。所以，如果(例如)该有机核心基团是衍生自季戊四醇，则该前体多元醇具有结构C(CH2OH)4，并且该有机核心基团与Q一起对应于C(CH2O-)4，其中Q是O。该核心是非交联的并且在与POLY1作为整体时排除了星型聚合物。
优选的用作聚合物核心的示例性多元醇包括具有从1至10个碳原子以及从3至10个羟基基团的脂肪族多元醇，包括例如三羟基烷类、四羟基烷类、多羟基烷基醚类、多羟基烷基聚醚类以及类似物。脂环族多元醇包括直链的或闭环的糖类以及糖醇类，例如甘露醇、山梨糖醇、肌醇、木糖醇、白雀木醇、苏糖醇、阿糖醇、赤藓糖醇、侧金盏花醇、卫矛醇、岩藻糖(facose)、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、山梨糖、甘露糖、吡喃糖、阿卓糖、塔罗糖、塔格糖(tagitose)、吡喃糖苷、蔗糖、乳糖、麦芽糖以及类似物。脂肪族多元醇的另外的例子包括葡萄糖、核糖、甘露糖、半乳糖以及相关立体异构体的衍生物。也可以使用芳香族多元醇，例如1，1，1-三(4′-羟苯基)烷类，例如1，1，1-三(4-羟苯基)乙烷，2，6-双(羟烷基)甲酚以及类似物。可以使用的其他核心多元醇包括多羟基冠醚、环糊精、糊精以及其他碳水化合物(例如单糖、低聚糖以及多糖、淀粉以及淀粉酶)。
优选的多元醇包括甘油、三羟甲基丙烷、季戊四醇、二季戊四醇、三季戊四醇，甘油、三羟甲基丙烷、季戊四醇、二季戊四醇、三季戊四醇的乙氧基化形式。而且还优选的是还原糖类，例如山梨糖醇以及甘油低聚物，例如二甘油、三甘油、六甘油以及类似物。一种21臂的聚合物可以使用具有21个可用羟基基团的羟丙基-β-环糊精合成。此外，具有平均24个羟基基团的聚甘油是可商购的。
示例性的聚胺包括脂肪族聚酰胺，例如二亚乙基三胺、N，N′，N″-三甲基二亚乙基三胺、五甲基二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺、二亚丙基三胺、三亚丙基四胺、双-(3-氨基丙基)-胺、双-(3-氨基丙基)-甲胺、以及N，N-二甲基-二亚丙基三胺。在本发明中可以使用的天然存在的聚胺包括腐胺、亚精胺以及精胺。适合用在本发明中的众多合适的五胺、四胺、低聚物以及喷他眯类似物在Bacchi et al.(2002)Antimicrobial Agents and Chemotherapy，46(1)：55-61中进行了描述，将其通过引用结合在此。
以下提供了对应于该偶联物的有机基团部分R以及对应的理想化的偶联物的示例性结构，假定母体多元醇中的每个羟基都已被转化成一个聚合物臂并且每个聚合物臂具有共价地附接至其上的药物。注意，以下所示的衍生自多元醇的有机基团包括氧，氧在化合物I的上下文中对于是聚合物臂的这些臂被认为是Q。不必要的是在例如一个多元醇衍生的有机基团中所有羟基都形成一个聚合物臂的一部分。在下面的示例性实例中，Q显示为O，但是可以同等地被认为是对应于S、-NH-、或-NH-C(O)-。此外，最后两个示例性的核心结构展示了通过一个双官能连接物(例如所示的代表性二硫化物或二肽)互连的二-多元醇核心。这些示例性核心分子中的任何一个可以设想类似的结构。参见例如国际专利公开号WO 2007/098466对于适合于制备在此描述的多臂聚合物烷酸酯偶联物的其他多臂聚合物的例子，将该公开物的内容通过引用清楚地结合在此。
有机基团＊/示例性偶联物(＊包括Q)
Figure BDA0000050623270000291
Figure BDA0000050623270000301
V-A
m＝0-40，优选0-10、或0-5(例如0、1、2、3、4、5)
Figure BDA0000050623270000311
Figure BDA0000050623270000321
Figure BDA0000050623270000331
Figure BDA0000050623270000341
适合于制备在此描述的一种多臂聚合物烷酸酯偶联物(对应于R-(Q-POLY1～)q)的另外的多臂聚合物起始材料是例如从NOFCorporation(日本)通过它们的目录可得的，将其通过引用结合在此。
作为替代方案，用于制备一种多臂聚合物药物的多臂聚合物试剂可以合成地制备。例如，多种合适的多元醇核心材料中的任何一种可以从化学品供应商例如Aldrich(St.Louis，MO)那里购买。某些高度衍生的多元醇也是可得的，例如来自Hyperpolymers GmbH的具有平均24个羟基基团的一种聚甘油。该多元醇的末端羟基首先使用例如一种强碱被转化成它们的阴离子形式以提供一个适合于引发聚合反应的位置，之后是单体亚单元(例如氧化乙烯)到该核心上的直接聚合。允许链的构建持续到在每个臂上达到所希望的聚合物链长度，之后终止该反应，例如通过淬灭。
在又一种途径中，一种活化的多臂聚合物试剂可以通过首先提供一种所希望的多元醇核心材料、并且使该多元醇在合适条件下与一种具有所希望长度的杂双官能的PEG甲磺酸酯进行反应来合成地制备，其中该无甲磺酸酯的PEG末端任选地受到保护以防止与该多元醇核心的反应。那么生成的多臂聚合物适合于另外转化或直接偶联到一种活性剂上，是在脱保护(如果必要的话)之后。
可以制备基于聚氨基核心的多臂聚合物试剂，例如通过直接偶联至一种聚合物试剂上来提供具有一种酰胺连接物Q的多臂聚合物前体，该聚合物试剂用一种酰化剂例如一种NHS酯、一种琥珀酰亚胺碳酸酯、一种BTC酯或类似物进行了活化。作为替代方案，可以使具有多个氨基基团的核心分子与一种醛封端的聚合物如一种PEG通过还原性氨基化(例如，使用一种还原剂如氰基硼氢化钠)进行偶联来提供具有一种内部胺连接物Q的多臂聚合物前体。
在此提供了一种二肽连接的含季戊四醇基核心的多臂聚合物的一种示例性合成，如图1A-1C。
尽管聚合物PEG在以上的合成说明中被描述为一种代表性聚合物，但此类途径也同等地适用于在此描述的其他水溶性聚合物。
连接Q以及X
该有机基团R和该聚合物区段POLY1之间或POLY1与该烷酸酯部分之间的连接是由R以及POLY1内包含的不同反应性基团的反应产生的。有用于制备本发明的聚合物偶联物的示例性的连接的化学作用可以在例如：Wong，S.H.，(1991)，″Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking″，CRC Press，Boca Raton，FL and in Brinkley，M.(1992)″A Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates with Dyes，Haptens，and Crosslinking Reagents″，in Bioconjug Chem.，3，2013中找到。该多臂聚合物偶联物的烷酸酯部分向该小分子活性剂提供了一种水解可降解的键(即，一种酯连接)，这样该活性剂随时间从该多臂聚合物核心中释放。
在此提供的多臂聚合物偶联物(连同对应的反应性聚合物前体分子，等等)包括一种连接物区段Q以及任选地一种间隔物区段X。示例性的间隔物或连接物可以包括例如独立地选自下组的那些区段，该组的构成为：-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-O-C(O)-、-C(O)-O-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-C(S)-、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-、-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-O-、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-O-CH2-、-CH2-C(O)-O-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-O-CH2-、-C(O)-O-CH2-CH2-、-NH-C(O)-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-NH-CH2-、-NH-CH2-CH2-、-CH2-NH-CH2-、-CH2-CH2-NH-CH2-、-C(O)-CH2-、-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-N-C(O)-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-[CH2]0-6-(OCH2CH2)0-2-、-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-、以及-NH-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-。
在以上例子中的任何一个中，一个简单的亚环烷基基团，例如1，3-或1，4-亚环己烷基可以替代任何两个、三个或四个碳亚烷基基团。然而，为了本发明的目的，当一系列的原子与一种水溶性聚合物区段紧密相邻并且该系列的原子却是另一种单体时，该系列的原子不是一个间隔物部分，这样所提出的间隔物部分仅代表了该聚合物链的延伸。在此描述的间隔物或连接物还可以包括以上基团中任何两个或多个处于任何取向的一种组合。
参见化合物I，Q是一个连接物，优选是水解稳定的一种连接物。典型地，Q包括至少一个杂原子例如O、或S或NH，其中在Q中邻近R的这个原子在与R作为整体时典型地代表该核心有机基团R的一个残基。总体上Q包括从1至约10个原子、或从1至约5个原子。Q典型地包括以下数目之一的原子：1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。示例性并且优选的Q包括O、S、-NH-、以及-NH-C(O)-.优选地，Q是氧，意味着该有机核心分子是一种多元醇。
再次关于化合物I，X是将POLY1与该烷酸酯区段的二亚甲基基团连接起来的一个间隔物。总而言之，该间隔物具有从约1个原子至约50个原子、或者更优选从约1个原子至约25个原子、或甚至更优选从约1个原子至约10个原子的原子长度。典型地，该间隔物具有选自下组的原子长度，该组的构成为1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。当考虑原子链的长度时，仅考虑贡献于整个距离的原子。例如，具有结构CH2-C(O)-NH-CH2 CH2O-CH2 CH2 O-C(O)-O-的间隔物具有11个原子的链长度，因为不认为取代基显著地贡献于该间隔物的长度。间隔物X可以是水解稳定的或水解可降解的。在一个具体实施方案中，例如当POLY1是一种聚乙二醇时，例如在所附实例中提供的这些示例性烷酸酯偶联物以及对应的多臂聚合物试剂的几个之中，X是氧。例如当POLY1对应于结构-(CH2CH2O)nCH2CH2-时，X可以对应于氧或-O-，这样包括该“X”氧的最终结构为了简化可以以简写形式作为-(CH2CH2O)n-出现。
在又一个实施方案中，X具有以下结构：Y-Z，其中Y是一个共价地附接到Z(一个水解可降级的连接)上的间隔物片段。在某些实施方案中，Z本身可以不构成一个水解可降解的连接，然而当与Y或Y的至少一部分作为整体时，形成了水解地可降解的一个连接。
在该间隔物X的又一个更具体的实施方案中，Y具有以下结构：-(CRxRy)a-K-(CRxRy)b-(CH2CH2O)c-，其中每个Rx和Ry每次出现时独立地是H或选自下组的一个有机基团，该组的构成为：烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、芳基以及取代的芳基，a的范围是从0至12(即，可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12)，b的范围是从0至12(即，可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12)，K是选自-C(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-O-、-S-、O-C(O)-、C(O)-O-、O-C(O)-O-、O-C(O)-NH-、NH-C(O)-O-，c的范围是从0至25，并且Z是选自C(O)-O-、O-C(O)-O-、-O-C(O)-NH-、以及NH-C(O)-O-。K以及Z的具体结构取决于a、b以及c中每一个的值，这样以下的连接均不产生间隔物X的总体结构：-O-O-、NH-O-、NH-NH-。
在该间隔物X的又一个实施方案中，Y具有以下结构：-(CRxRy)a-K-(CRxRy)b-(CH2CH2NH)c-，其中这些变量具有以上所述的值。在某些情况下，在间隔物X中短的氧化乙烯或乙氨基片段的存在可能在该药物前体偶联物的制备过程中实现良好的产率方面是有用的，因为该连接物的存在可以帮助绕开与由于该多臂活性聚合物、该活性剂的结构或两者的组合造成的位阻相关的问题。优选地，c是选自下组，其构成为：0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、以及10。
优选地Rx和Ry每次出现时独立地是H或低级烷基。在一个实施方案中，Rx和Ry每次出现时是H。在又一个实施方案中“a”的范围是从0至5，即，是选自0、1、2、3、4或5。在又一个实施方案中b的范围是从0至5，即，是选自0、1、2、3、4或5。在又一个实施方案中c的范围是从0至10。在又一个实施方案中，K是-C(O)-NH。在此说明的实施方案中的任何一个意在不仅适用于广义的化合物I，而且还扩展至实施方案的特定组合。
间隔物X在存在时还可以对应于一种氨基酸、二或三酸或类似物，或一种肽或低聚肽，特别是由于存在足以防止发生任何邻基相互作用的烷酸酯基团。合适的氨基酸包括以下氨基酸，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、门冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸以及类似物连同非天然存在的氨基酸。
当存在时，一个优选的间隔物是氧(-O-)。
聚合物POLY1
在化合物I中，POLY1代表一种水溶性的且非肽的聚合物。在化合物I的每个聚合物臂中POLY1独立地进行选择，尽管优选地每个聚合物臂包括相同的聚合物。这就是说，最优选地，在该多臂聚合物偶联物的每个臂中的每个POLY1是相同的。优选地，化合物I的每个臂，即每个“(-Q-POLY1-X-D)”也是相同的。非肽的并且水溶性的各种各样聚合物中的任何一种可以用来形成一种根据本发明的偶联物。适当的聚合物的实例包括但不限于：聚(亚烷基二醇)、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚(烯醇)、聚(乙烯吡硌烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸羟烷酯)、聚(糖类)、聚(α-羟酸)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(N-丙烯酰吗啉)，如在美国专利号5,629,384中所说明的(其全文通过引用结合在此)，以及以上任何一种或多种的共聚物、三元共聚物、以及混合物。
优选地，POLY1是一种聚乙二醇或PEG。POLY1可以处于多种几何形状或形式中的任何一种，包括直链、分枝的、叉状的等等，尽管优选地POLY1是直链的(即，在该总体多臂结构的每个臂中)或叉状的。对于具有“叉状”的聚合物构型的多臂聚合物药物前体，一种优选的结构如下：
Figure BDA0000050623270000401
F代表一个分叉基团，并且其余的变量是如以上描述的。优选地，在该分叉基团F中的分叉点包括或者是(-CH)，尽管它还可以是一个氮原子(N)。以此方式，每个聚合物臂是分叉的而具有两个而非一个可释放地共价附接到其上的活性剂部分。
对于制备在结构XII中示出的这一类型的多臂聚合物有用的示例性的叉状聚合物在美国专利号6,362,254中进行了描述。
当POLY1是PEG时，其结构典型地包括-(CH2CH2O)n-，它还可以表示为-(CH2CH2O)nCH2CH2-，其中n的范围可以是从约5至约400，优选从约10至约350，或从约20至约300。在此提供的多臂聚合物偶联物的一个优选实施方案中，POLY1是直链的聚乙二醇。
在此描述的多臂实施方案中，每个聚合物臂POLY1典型地具有对应于以下项之一的分子量：200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、7500、8000、9000、10000、12,000、15000、17,500、18,000、19,000、20,000道尔顿或更大。对于在此描述的多臂聚合物构型，整体分子量(即，该多臂聚合物作为一个整体的分子量)一般对应于以下项之一：800、1000、1200、1600、2000、2400、2800、3200、3600、4000、5000、6000、8000、10,000、12,000、15,000、16,000、20,000、24,000、25,000、28,000、30,000、32,000、36,000、40,000、45,000、48,000、50,000、60,000、80,000或100,000或更大。
典型地，对于本发明的一种多臂聚合物的总体分子量的范围是从约800至约80,000道尔顿，或从约900至约70,000道尔顿。本发明的一种多臂聚合物的其他优选的分子量是范围从约1,000至约40,000道尔顿，或从约5,000至约30,000道尔顿，或者对于本发明的偶联物的更高分子量实施方案甚至是从约20,000至约80,000道尔顿。
烷酸酯区段
在此提供的多臂聚合物偶联物在q个聚合物臂中包括一种烷酸酯区段。该烷酸酯区段被提供来既轭合至该药物上又然后释放该药物。而且，该烷酸酯结构被设计为防止发生可能的邻基相互作用，这种作用可能导致低于最佳的载药量并且在该多臂聚合物偶联物组合物中形成不希望的杂质。这是通过烷酸酯区段的长度以及其中包含的特定原子及官能团所提供的。如在化合物I中展示的q个聚合物臂中的每一个终止在一个烷酸酯区段中，其中该小分子药物(或氢或活性酯官能度)通过一个酯连接(形成该烷酸酯的一部分)共价地附接至该聚合物臂上。该烷酸酯区段对应于：-(CH2)2-(CHR1)nC(O)-O-D，其中R1每次出现时独立地是H、低级烷基、亚烷基或一个吸电子基团，并且n是从1至约7的一个整数。如从R1可见的，在羰基的a、β、γ等位置的碳可以独立地被例如一个低级烷基、亚烷基或一个吸电子基团所取代。在a位置中、以及在更小程度上在β或γ位置的一种取代基(例如甲基或类似基团)可以提供位阻来允许对该试剂的更大控制或选择性，这样它与亲核的基团(如存在于药物分子上的那些(例如醇、硫醇))的反应性被减少。这样一种取代基可以提供对多臂偶联物的水解稳定性的额外控制。参见例如美国专利号6,495,659，将其内容通过引用结合在此。典型地，在a位置存在一个烷基基团会给予相邻酯键一种超过了对于这样的不存在此种烷基基团的烷酸酯所观察到的额外的水解稳定性。
R1可以是例如H或含有从1至约6个碳原子的烷基基团。该低级烷基基团可以是直链的或分枝的，举例如下：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基以及类似物。如果一个亚烷基基团在例如a位置上被取代并且被接回至例如δ位置上，则该结构具有一种性质为环状的烷酸酯基团，如以下所示。
作为替代方案，R1可以是一个吸电子基团(EWG)，例如一种卤化物(例如F、Cl、Br或I)、一种腈、-NO2、CF3、-SO3，或本领域普遍已知的任何其他的EWG。整数n典型地具有选自1、2、3、4、5、6、以及7中的一个值。
因此，这个部分-(CHR1)n-可以对应于以下项中的任何一个：-CHR1-、-CHR1-CHR1-、-CHR1-CHR1-CHR1、-CHR1-CHR1-CHR1-CHR1、CHR1-CHR1-CHR1-CHR1-CHR1-、-CHR1-CHR1-CHR1-CHR1-CHR1-CHR1、-CHR1-CHR1-CHR1-CHR1-CHR1-CHR1-CHR1，其中每个链上的R1是独立地选择的。在一个具体的实施方案中，在前述项的每个中的各个R1是氢。在又一个实施方案中，前述项的每一个中，各个R1是氢，除了在羰基的α位或相邻位置的R1之外，在这种情况下，这个特定的R1单独地是低级烷基。在又一个实施方案中，在前述结构的每一个中，各个R1是氢，除了在羰基的α位或相邻位置的R1之外，在这种情况下，这个特定具体的R1单独地是以上描述的EWG。
活性剂，D
现在转向化合物I，D代表一个小分子活性剂残基，并且q(聚合物臂的数目)范围是从约3至约50.示例性的范围是从约3至约10，从约11至约25，从约26至约40，或从约41至约50。优选地，q的范围是从约3至约25。更优选地，例如q是从3至约10，q具有的值是3、4、5、6、7、8、9或10。在一个优选的实施方案中，q是四。该活性剂残基D包括至少一个羟基官能团，该羟基官能团适合于共价附接到在此描述的多臂聚合物上以形成一种可水解的酯连接，这样在水解时，该活性剂以其未改性的形式被释放。
根据本发明的一个实施方案，一种多臂聚合物偶联物的特征为具有从约3至约25个共价地附接至其上的活性剂分子。更具体地说，该偶联物具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个共价地附接至其上的活性剂分子。在一个进一步的实施方案中，本发明的偶联物具有从约3至约8个共价地附接至该水溶性聚合物上的活性剂分子。典型地，尽管并非必要地，聚合物臂的数目对应于共价地附接到该水溶性聚合物上的活性剂的数目。这就是说，在具有某一数目的聚合物臂(例如q)的一种聚合物的情况下，其中每个臂在其末端具有一个反应性烷酸酯官能团，在生成的偶联物中共价地附接至其上的活性剂的数目最希望地是q。在一个优选实施方案中，包括本主题的多臂聚合物偶联物的一种组合物的特征是92百分比或更大的载药程度。这就是说，对于包含一种有q个臂的多臂聚合物偶联物的一种组合物，该组合物的特征是具有平均每物种0.92(q)或更大的载药量。这就是说，该组合物的特征在于平均每物种满足以下项中一项或多项的一个载药量：.92(q)或更大、0.93(q)或更大、0.94(q)或更大、0.95(q)或更大、0.96(q)或更大、0.97(q)或更大、0.98(q)或更大、0.99(q)或更大、以及1(q)。
在又一个实施方案中，并非是具有从一个中心有机基团核心发散的多个聚合物臂，本发明的一种偶联物的特征为具有多个共价地附接至其上的侧向活性剂部分的一种水溶性聚合物，每个优选地是通过一个可降解连接(如在此描述的烷酸酯连接)而共价地附接的。在这样一个实施方案中该聚合物药物前体偶联物的结构总体上描述为POLY1(-X-(CH2)2(CR1H)nC(O)-O-D)q，其中每个药物残基通过该烷酸酯连接物被共价地附接到POLY1上，并且变量POLY1、X、R1、n、D、以及q是如以上所列出的，并且该聚合物(典型地是一种直链聚合物)具有“q”个通过间隔物X而附接至其上(典型地是沿着聚合物链在不连续的长度处)的活性剂残基，该间隔物被连接到该烷酸酯连接物-药物部分上。
在一个具体的实施方案中，该活性剂部分或残基是具有小于约1000的分子量的小分子。在又一些另外的实施方案中，该小分子药物具有的分子量是小于约800，或甚至小于约750。在又一个实施方案中，该小分子药物具有的分子量是小于约500，或者在某些情况下甚至小于约300。
优选的活性剂部分是抗癌剂。特别优选的是带有至少一个羟基基团(即，适合于形成烷酸酯附接的)的溶瘤细胞药物。特别优选的是生物碱细胞毒素剂，例如紫杉烷以及喜树碱，连同长春蔓花生物碱：长春新碱、长春瑞滨、长春碱以及长春地辛。
一个优选类别的活性剂是喜树碱。在一个优选实施方案中，D是紫杉烷或紫杉烷衍生物，例如紫杉醇或多西他赛。为了本披露的目的，术语“紫杉烷”包括萜烯的紫杉烷类中的所有化合物。因此，紫杉酚(紫杉醇)，、3′-取代的叔丁氧基-羰基-胺衍生物(多西他赛)以及类似物连同其他从例如Sigma-Aldrich可得的类似物是在本披露的范围内。一种特别优选的D是多西他赛，其中在最终的多臂聚合物偶联物中在2′位置H是不存在的：
Figure BDA0000050623270000441
其他优选的紫杉烷是能够在该紫杉烷骨架的2′位置经历改性的那些，例如在此的某些实施方案以及所附实例中所描述的。
此外，在本披露的范围内的是紫杉烷，例如多西他赛，其中到该多臂烷酸酯支架上的附接可以是在该紫杉烷骨架中的任何-OH位置上。
又另一个优选类别的活性剂是喜树碱。在一个实施方案中，用于本发明中的一种喜树碱对应于以下结构，
其中：
R1-R5各自独立地选自下组，其构成为：氢；卤代；酰基；烷基(例如C1-C6烷基)；取代的烷基；烷氧基(例如C1-C6烷氧基)；取代的烷氧基；链烯基；炔基；环烷基；羟基；氰基；硝基；叠氮基；酰氨基；肼；氨基；取代的氨基(例如单烷基氨基以及二烷氨基)；羟基羰基；烷氧基羰基；烷基羰基氧基；烷基羰基氨基；氨基甲酰基氧基；芳基磺酰基氧基；烷基磺酰基氧基；-C(R7)＝N-(O)i-R8，其中是R7是H、烷基、链烯基、环烷基或芳基，i是0或1，并且R8是H、烷基、链烯基、环烷基或杂环；以及R9C(O)O-，其中R9是卤素、氨基、取代的氨基、杂环、或取代的杂环；或R10-O-(CH2)m-，其中m是1-10中的一个整数并且R10是烷基、苯基、取代的苯基、环烷基、取代的环烷基、杂环或取代的杂环；或R2与R3一起或R3与R4一起形成了取代的或未取代的亚甲二氧基、亚乙二氧基或亚乙基氧基；
R6是H或OR’，其中R’是烷基、链烯基、环烷基、卤烷基或羟烷基；并且
L是附接到该多臂聚合物偶联物上的位置。
尽管上面显示L是在该20环位置，但该附接位置可以是在喜树碱结构内的任何合适位置。
如在此所使用的术语“喜树碱化合物”包括植物生物碱20(S)-喜树碱，连同其药用活性衍生物、类似物以及代谢产物。喜树碱衍生物的例子包括但不限于：9-硝基-20(S)-喜树碱、9-氨基-20(S)-喜树碱、9-甲基-喜树碱、9-氯-喜树碱、9-氟-喜树碱、7-乙基喜树碱、10-甲基-喜树碱、10-氯-喜树碱、10-溴-喜树碱、10-氟-喜树碱、9-甲氧基-喜树碱、11-氟-喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)、10，11-亚甲二氧基喜树碱、以及10，11-亚乙二氧基喜树碱、以及7-(4-甲基哌嗪基亚甲基)-10，11-亚甲二氧基喜树碱、7-乙基-10-(4-(1-哌啶基)-1-哌啶基)-羰基氧基-喜树碱、9-羟基-喜树碱、以及11-羟基-喜树碱。特别优选的喜树碱化合物包括喜树碱、伊立替康以及托泊替康。
天然的并且未取代的植物生物碱喜树碱可以通过天然提取物的纯化获得，或者可以从Stehlin Foundation for Cancer Research(休斯顿，德克萨斯)获得。取代的喜树碱可以使用文献中已知的方法获得或者可以从商品供应商那里获得。例如，9-硝基-喜树碱可以从SuperGen，Inc.(San Ramon，Calif.)获得，并且9-氨基-喜树碱可以从Idec Pharmaceuticals(San Diego，Calif.)获得。喜树碱以及不同的类似物和衍生物还可以从标准的精细化学品供应厂例如Sigma Chemicals获得。
某些优选的喜树碱化合物对应于下面的广义结构
其中：
R1-R5各自独立地选自下组，其构成为：氢；卤代；酰基；烷基(例如C1-C6烷基)；取代的烷基；烷氧基(例如C1-C6烷氧基)；取代的烷氧基；链烯基；炔基；环烷基；羟基；氰基；硝基；叠氮基；酰氨基；肼；氨基；取代的氨基(例如单烷基氨基以及二烷氨基)；羟基羰基；烷氧基羰基；烷基羰基氧基；烷基羰基氨基；氨基甲酰基氧基；芳基磺酰基氧基；烷基磺酰基氧基；-C(R7)＝N-(O)i-R8，其中R7是H、烷基、链烯基、环烷基或芳基，i是0或1，并且R8是H、烷基、链烯基、环烷基或杂环；以及R9C(O)O-，其中R9是卤素、氨基、取代的氨基、杂环、取代的杂环；或R10-O-(CH2)m-，其中m是1-10中的一个整数并且R10是烷基、苯基、取代的苯基、环烷基、取代的环烷基、杂环、或取代的杂环；或R2与R3一起或R3与R4一起形成了取代的或未取代的亚甲二氧基、亚乙二氧基或亚乙基氧基；并且
R6是H或OR′，其中R′是烷基、链烯基、环烷基、卤烷基或羟烷基。
示例性的取代基团包括羟基、氨基、取代的氨基、卤代、烷氧基、烷基、氰基、硝基、羟基羰基、烷氧基羰基、烷基羰基氧基、烷基羰基氨基、芳基(例如苯基)、杂环以及糖基基团。
例如，在实施方案中，D是伊立替康，此时在最终的多臂药物前体偶联物中在20-位置的羟基上的氢是不存在的。
Figure BDA0000050623270000471
作为替代方案，D是SN-38。
更具体地说，该活性剂落入多个结构类别中的一种之中，包括但不限于小分子、低聚肽、多肽或蛋白模拟物、片段、或类似物、类固醇、核苷酸、寡核苷酸、电解质以及类似物，并且典型地包括至少一个适合于共价地附接至该多臂聚合物上的游离羟基基团，或类似物(即，“手柄”。)
作为替代方案，该药物通过引入一种合适的“手柄”得以改性，优选是通过将其现有的官能团之一转化成一个适合于形成在此描述的烷酸酯连接的官能团。理想地，此种改性不应在一个显著程度上不利地影响该活性剂的治疗效果或活性。这就是说，一种活性剂的任何有助于其附接至本发明的多臂聚合物上的改性都应该导致其生物活性相对于改性前的已知母体活性剂的降低不大于约30％。更优选地，一种活性剂的任何有助于其附接至本发明的多臂聚合物上的改性优选地导致其活性相对于改性前的已知母体活性剂的减小是不大于约25％、20％、15％、10％或5％。
以上示例性药物意在涵盖(可应用的话)类似物、促效剂、拮抗剂、抑制剂、异构体、多形体及其药学上可接受的盐的形式。
药物前体偶联物的组合物/群体
如上所述，在某些情况下，包括在此描述的一种多臂聚合物偶联物的一种组合物可以包括一个种类的药物前体，该药物前体中有一个或多个它的聚合物臂不存在药物D。这样一种情况可能出现，例如由于该多臂的反应性聚合物与药物D的不完全反应。经常地，甚至在有利的化学计算学的情况下，即，使用了相对于反应性聚合物臂的数目而言过量的药物，仍可能难以推动该反应至完成，这样产物可能包括一种混合的聚合物种类。然而，通过采用本发明的烷酸酯连接物，当对在此提供的一种多臂聚合物药物前体组合物进行表征时，最终偶联物的载药程度(即百分比)有利地是很高的，典型地是在92％或更大，例如从约92％至约100％的载药。
然而，出于完整性原因，应该指出本发明的一种组合物在某些情况下可能包括一种总体上被表征为R(-Q1-POLY1-X1-(CH2)2(CR1H)nC(O)-O-D)q的多臂聚合物偶联物，其中一个或多个聚合物臂中不存在药物。假定起始的多臂聚合物试剂的每个臂具有一个附接至其上的链烷酸官能度，则产生的偶联物可能并且优选地将会具有共价地附接至每个聚合物臂上的药物，或者替代地可以缺少药物D。变量D是一种小分子，其中D1指示D的存在并且D0指示其不存在。所以，例如一种组合物可以包括：
R(-Q-POLY1-X-(CH2)2(CR1H)nC(O)-O-D)m(-Q-POLY1-X-(CH2)2(CR1H)nC(O)-O-D0)s，
其中m+s＝q，唯一的注意事项是m(具有附接药物的聚合物臂的数目)是1或更大(例如从1至q)。m的值对应地范围是从0至(q-1)。典型地，当药物不存在时，即，是D0时，该聚合物臂将终止于官能团Y，其中Y是-H或对应的链烷酸或活化的羧基琥珀酰亚胺的一种衍生物(反应产物)。更确切地说，本发明的一种组合物可以包括一个或多个具有以下结构的多臂聚合物偶联物物种：
R(-Q-POLY1-X-(CH2)2(CR1H)nC(O)-O-D)m(-Q-POLY1-X-(CH2)2(CR1H)nC(O)-O-Y)s，
其中Y对应于H或是对应的链烷酸或活化的羧基琥珀酰亚胺的一种衍生物。优选的组合物是在总体表征时具有0.92(q)或更大的m值的那些。理想地，在活化剂的定量取代情况下，s等于零并且m等于q。
作为一个实例，在该多臂聚合物偶联物包括四个聚合物臂的情况下，每个多臂聚合物的共价附接药物分子的数目的理想化值是四，并且每个多臂聚合物的药物分子平均数目是范围从该理想化值的约92％至约100％。这对应于每个多臂聚合物偶联物的D的平均数(范围是从约3.68至4.0)。
在又一个实施方案中，对于一种多臂聚合物偶联物组合物，例如当聚合物臂的数目是范围从约3至约8时，在该聚合物中存在的多数种类是具有一个理想化数目(“q”)的附接至该聚合物核心上的药物分子的那些亦或具有(“q”)及(“q-1”)个附接至该聚合物核心上药物分子的一种组合的那些。
例如，根据本发明的一种优选的多臂聚合物药物前体组合物可以包括以下偶联物种类中的一种或多种：
Figure BDA0000050623270000491
Figure BDA0000050623270000501
等等，其中O-Doc对应于：
并且优选地主要包括第一种类，也就是其中每个聚合物臂都具有共价地连接至其上的药物，在这种情况下是多西他赛。这就是说，最优选地，在此提供的一种多臂聚合物偶联物具有共价地附接至每个聚合物臂上的活性剂，这样在每个聚合物臂中都发生了活性剂的基本上定量的取代。在这样一个实施方案中，本发明的一种组合物特征在于具有的每多臂聚合物的药物分子平均数基本上对应于其理想化值(例如其理想化值的基本上100％)。
本披露意在涵盖在此描述的每种药物前体种类，不管是单独地或作为一种药物前体组合物的组成部分来描述的。
在实例2(4-臂-PEG20K-BA-DOC)中描述了一种示例性的并且优选的偶联物。这就是说，在一个优选实施方案中，在此提供的一种多臂聚合物偶联物具有一个季戊四醇衍生的核心(这样R-Q-对应于季戊四醇基)、一个对应于PEG的POLY1(-(CH2CH2O)nCH2CH2-)、对应于氧O的X的值、以及一个对应于丁酸酯的烷酸酯连接物部分，使得n＝1，R1＝H，并且q等于4。如在实例2中说明的，对于该四-臂聚合物偶联物的取代值是大约98％-100％。载药程度的另外表征在实例11中提供(参见例如表1)。如从实例11中提供的对比数据可见，对于甘氨酸连接的以及羧基亚甲基连接的多臂偶联物的平均载药值显著地更低，平均是从它们的理想化值的约75％至约80％，表明了本发明的烷酸酯连接的多臂聚合物偶联物的值以及它们超越更早描述的多臂聚合物偶联物的改进。
具有一种烷酸酯连接物的另外的示例性多臂聚合物偶联物的制备描述在实例12中。此类偶联物具有以下特征：一个季戊四醇核心(例如，其中R-Q对应于季戊四醇基)；一个水溶性的且非肽的聚合物区段POLY1(即PEG：-(CH2CH2O)nCH2CH2-)；一个间隔物X，即氧；等于4的q值；以及下列烷酸酯连接物：α-甲基丙酸酯、α-甲基戊酸酯、己酸酯、辛酸酯以及癸酸酯。
形成多臂聚合物药物前体偶联物的方法
多臂的反应性聚合物，例如用于制备本发明的一种偶联物的那些可以容易地由可商购的起始材料、考虑在此提出的指导、结合化学合成领域中的已知内容进行制备。
具有一个季戊四醇核心或一个甘油核心的多种羟基封端的多臂PEG从NOF Corporation可得。此类多臂PEG可以直接用来制备在此提供的偶联物，是通过官能化作用来制备对应的链烷酸，以便偶联至存在于一种活性剂上的羟基上。参见例如实例1，该实例描述了4-臂-PEG-丁酸的形成，之后是如实例2中描述的轭合。在所描述的途径中，使该多臂的4-臂-PEG-OH起始材料与一种受保护的溴丁酸在一种强碱的存在下进行反应而形成所希望的多臂PEG链烷酸试剂。参见例如美国专利申请公开号US 2005/0036978。这种途径适用于制备任何的多臂PEG-OH起始材料。可以将生成的多臂聚合物链烷酸偶联到该目标的含羟基的药物上，例如使用一种合适的缩合剂如二异丙基碳二亚胺(DIC)。这在下面示意性地示出，
Figure BDA0000050623270000521
在一种替代的途径中，将该药物功能化以包含该链烷酸部分，之后共价地附接到该多臂聚合物上以提供在此描述的一种偶联物。这种方法在下面展示，使用了一种PEG BTC活性酯而最终在该连接物和PEG区段之间产生了一个氨基甲酸酯键。本领域的普通技术人员可以想出所描述的这些方法的许多变体。
在此描述的方法是足够灵活的而能允许在反应物以及产物的精确结构上的许多变体。例如，一种可以容易地在取代反应中将烷基氯或甲磺酸酯取代为对应的烷基溴。而且，当将活性NHS酯用于说明时，可以使用其他的活性酯，如p-硝基酚盐或BTC。而且增充剂组，尤其是包含亚乙基氧基亚单元的那些可以用作该核心多臂PEG结构与终止性连接物之间的一种第二连接物。为了获得根据本发明的多臂聚合物药物前体而对合适的官能团、连接物、保护基以及类似物的选择部分地取决于该活性剂上的官能团以及该多臂聚合物起始材料，并且本领域的普通技术人员基于本披露的内容对此将是清楚的。
这种药物前体产物可以进一步进行纯化。纯化以及分离方法包括沉淀、之后是过滤以及干燥，连同色谱法。合适的色谱方法包括凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法以及Biotage快速色谱法。
药用组合物
本发明提供了用于兽医学以及人类医学两种用途的药用配制品或组合物，它们包括一种或多种本发明的多臂聚合物偶联物或其一种药学上可接受的盐，带有一种或多种药学上可接受的载体以及任选地任何其他的治疗成分、稳定剂或类似物。该一种或多种载体必须在与该配制品的其他成分相容的意义上是药学上可接受的并且必须不是对其接受者过度有害的。本发明的组合物还可以包括聚合物赋形剂/添加剂或载体，例如聚乙烯吡咯酮，衍生的纤维素如羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、以及羟丙基甲基纤维素，Ficolls(一种聚合物糖)，羟乙基淀粉(HES)、葡聚糖结合剂(例如环糊精，如2-羟丙基β-环糊精以及磺丁基醚-β-环糊精)、聚乙二醇以及果胶。这些组合物可以进一步包括稀释剂、缓冲剂、粘合剂、崩解剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂(包括抗氧化剂)、调味剂、掩味剂、无机盐(例如氯化钠)、抗微生物剂(例如氯化苄烷铵)、增甜剂、防静电剂、表面活性剂(例如聚山梨醇酯如“吐温20”以及“吐温80”、以及普流尼克如从BASF可得的F68和F88、脱水山梨糖醇酯、类脂(例如磷脂，如卵磷脂以及其他磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、脂肪酸以及脂肪酸酯、类固醇(例如胆固醇))以及螯合剂(例如EDTA、锌以及其他合适的阳离子)。其他的适合用在根据本发明的组合物中的药用赋形剂和/或添加剂在以下文件中列出了：″Remington：The Science&Practice of Pharmacy，″19th ed.，Williams&Williams，(1995)，和″Physician′s Desk Reference，″52nd ed.，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)以及″Handbook of Pharmaceutical Excipients，″Third Ed.，Ed.A.H.Kibbe，Pharmaceutical Press，2000。
本发明的药物前体可以配制在组合物中，包括适合于口部的、直肠的、局部的、鼻的、眼的或肠胃外的(包括腹膜内的、静脉内的、皮下的、或肌内的注射)给药的那些。这些组合物可以适宜地以单位剂量形式存在并且可以通过配药学领域熟知的任何方法进行制备。所有方法都包括这个步骤：将该活性剂或化合物(即，该药物前体)带入与构成了一种或多种配合剂的一种载体进行缔合作用。总体上这些组合物是如下制备的：通过将该活性化合物带入与一种液体载体进行缔合作用而形成一种溶液或悬浮液，或者替代地将该活性化合物带入与适合于形成一种固体(任选一种颗粒产物)的配制品组分进行缔合作用、并且然后(若认为合理的话)将该产品成形为所希望的投递形式。本发明的固体配制品在是微粒时典型地包括尺寸范围从约1纳米至约500微米的颗粒。总体上，对于旨在用于静脉给药的固体配制品，颗粒的直径典型地是范围从约1nm至约10微米。特别优选的是在注射之前于水性运载体中重新构成的无菌的、冻干的组合物。
一种优选的配制品是包含该多臂聚合物偶联物(其中活性剂D是多西他赛)的一种固体配制品。这种固体配制品典型地在静脉输注之前用5％葡萄糖注射剂或0.9％的氯化钠注射剂进行稀释。
在该配制品中多臂聚合物偶联物的量将依据以下项而改变：所使用的特定活性剂、其活性、该偶联剂的分子量、以及其他因素，例如剂型、目标患者群以及其他考虑，并且总体上本领域的普通技术人员将容易地对其进行确定。在该配制品中偶联物的量是为了将一个治疗上有效量值的该化合物(例如一种生物碱抗癌剂)投递给对其有需要的一个患者以便达到与该化合物相关的至少一种治疗效果(例如用于治疗癌症)所必须的量。实际上，这将依据该具体的偶联物、其活性、待治疗的病症的严重性、患者群、该配制品的稳定性等等而非常广泛地改变。这种组合物总体上包括从按重量计约1％至按重量计约99％中任一数值的偶联物，典型地从按重量计约2％至约95％的偶联物，并且更典型地是从按重量计约5％至85％的偶联物，并且还取决于在该组合物中所包含的赋形剂/添加剂的相对量值。更确切地说，该组合物典型地包括以下百分比中至少约一项的偶联物：按重量计2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或更多。
适合于经口给药的本发明的组合物可以按以下形式提供：作为不连续的单元，例如胶囊、扁囊剂、片剂、锭剂以及类似物，其中各自含有预定量的作为一种粉末或颗粒的该偶联物；或是在一种水性液体或非水性液体中的悬浮液，例如糖浆、酏剂、乳剂、顿服水剂、以及类似物。
适合于肠胃外给药的配制品适宜地包括该药物前体偶联物的一种无菌水性制剂，它可以被配制为与接受者的血液是等渗的。
鼻喷雾配制品包括该多臂聚合物偶联物的带有防腐剂以及等渗剂的纯化过的水溶液。此类配制品优选被调节到与鼻黏膜相容的pH以及等渗状态。
用于直肠给药的配制品可以作为带有一种合适载体(例如可可豆油或氢化的脂肪或脂肪羧酸)的一种栓剂存在。
眼睛用的配制品是通过一种类似于鼻喷雾的方法制备的，除了将pH以及等渗因素优选地调节至与眼睛的相配。
局部用的配制品包括溶解或悬浮于一种或多种介质(例如矿物油、石油、多羟基醇或其他用于局部用配制品的碱)中的该多臂聚合物偶联物。加入以上所指出的其他配合剂可能是希望的。
还提供了适合作为气溶胶通过例如吸入法进行给药的药物配制品。这些配制品包括该希望的多臂聚合物偶联物或其盐的一种溶液或悬浮液。这种希望的配制品可以置于一个小室中并且进行喷雾。喷雾法可以通过压缩空气或通过超声能量完成以形成多个包含该偶联物或其盐的液滴或固体颗粒。
该多臂聚合物药物前体偶联物的特征
在不同的动物模型中评估了根据本披露的示例性多臂聚合物药物前体的药代动力学，用以至少部分地确定给药后是否实现了于药物中持续的全身暴露。在此提供的例子证实在将一种具有在此描述这些特征的多臂药物前体给药后实现了于药物(例如多西他赛)中持续的全身暴露，如通过不同的体内研究所支持的，并且此外证实了此种于药物中增大的且持续的暴露有效地贡献于对本披露的主题药物前体所观察的优异的抗肿瘤活性。
作为一个例子，实例14描述了给予大鼠4-臂-PEG20K-BA-多西他赛对比多西他赛。基于在此描述的结果，4-臂-PEG20K-BA-多西他赛在给予大鼠时展现出了一个低清除率以及低的分布容积，从而产生了约65小时的长的4-臂-PEG20K-BA-多西他赛终末半衰期。与多西他赛剂量相比，在给予了相等的4-臂-PEG20K-BA-多西他赛之后血浆多西他赛Cmax大约低了6倍，而AUC是相似的。评估出在给予4-臂-PEG20K-BA-多西他赛之后的血浆多西他赛半衰期比在给予多西他赛之后所观察到的长约4倍(168对比40小时)，从而证明了给予药物前体之后持续的全身性多西他赛暴露。
为了进一步支持在此描述的示例性药物前体(描述为在给药后提供于药物(例如，多西他赛)中持续的全身暴露)，实例15在狗中证实了类似的结果。确切地说，实例15证实了31小时的一个长的4-臂-PEG20K-BA-多西他赛终末半衰期。在给予等量的4-臂-PEG20K-BA-多西他赛以及多西他赛剂量之后，血浆多西他赛Cmax以及AUC分别低了约110以及7倍。此外，评估出在给予4-臂-PEG20K-BA-多西他赛之后的血浆多西他赛半衰期比在给予多西他赛之后所观察到的长约8倍(199对比25小时)。
应用于所获得的药代动力学数据的群体建模法进一步支持：相对于给予多西他赛，在给予4-臂-PEG20K-BA-多西他赛之后血浆多西他赛浓度持续了一个延长的且长时间的时期，这不依赖物种以及剂量，如实例16中所描述的。
本披露的示例性药物前体的所观察到的并且增强的抗肿瘤活性在下面以及所附实例中更详细地进行描述。
使用方法
在此提供的多臂聚合物药物前体可以用来治疗或预防任何动物中、特别是哺乳动物(包括人)中对未改性的活性剂有反应的病症。
本发明的多臂聚合物偶联物作为抗癌剂是特别有用的，即，已经显示在显著降低某些实体瘤的生长方面是有效的，如通过在此提供的代表性体内研究所证明的。这就是说，当该小分子药物是一种抗癌剂，如喜树碱化合物或其他溶瘤细胞如多西他赛时，在此提供的偶联物可以用来治疗癌症。适合于通过给予在此提供的一种多臂聚合物烷酸酯偶联物进行治疗的癌症类型包括：乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胃癌、恶性黑色素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、甲状腺癌、肾癌、胆管的癌、脑癌、头部以及颈部的癌、淋巴瘤、白血病、横纹肌肉瘤、成神经细胞瘤，以及类似病症。本发明的多臂聚合物偶联物对于在实体瘤中进行靶向并且累积是特别有效的。这些多臂聚合物偶联物还在治疗HIV以及其他病毒方面是有用的。
该多臂聚合物偶联物还可以对具有难治癌症(即对不同其他治疗没有反应的癌症)的患者提供改进的抗肿瘤活性。而且，与未改性活性剂的给药相比，给予该多臂聚合物偶联物的一项附加优点是减小患者骨髓抑制的可能性。
治疗方法包括将一个治疗学上有效量值的含有在此提供的多臂聚合物偶联物的一种组合物或配制品给予对其有需要的哺乳动物。任何特定的多臂聚合物偶联物的治疗学有效的剂量会从偶联物到偶联物、患者到患者而变化，并且取决于多个因素，例如患者的病症、所使用的具体活性剂的活性、投递路径以及所治疗的病症。
对于喜树碱类型的活化剂，从约0.5至约100mg喜树碱/kg体重、优选从约10.0至约60mg/kg的剂量是优选的。对于紫杉烷类型的活化剂，基于该紫杉烷部分的量，从约5至约500mg/m2、优选从约25至约125mg/m2的剂量是优选的。当结合其他药用活性剂进行给药时，甚至更少的多臂聚合物偶联物也可能是治疗学上有效的。以上列出的范围是说明性的并且本领域的普通技术人员将基于临床经验以及具体的治疗征候来确定该多臂聚合物偶联物的最佳剂量。
治疗方法还包括结合一种第二抗癌剂来给予一个治疗学上有效量值的一种组合物或配制品，该组合物或配制品含有一种抗癌剂(例如在此描述的喜树碱或紫杉烷化合物)的多臂聚合物偶联物。例如，在结肠直肠癌的治疗中，一种喜树碱或多西他赛类型化合物的多臂聚合物药物前体的给药可以结合化学疗法，例如5-氟尿嘧啶或亚叶酸希罗达，或结合多种试剂例如阿瓦斯丁、(西妥昔单抗)、或VectibixTM(帕尼单抗)。在乳腺癌的治疗中，疗法可以包括给予在此描述的一种多臂聚合物偶联物，任选地结合希罗达、紫杉醇、多西他赛或abraxane(一种紫杉醇新制剂)。在治疗肺癌中，疗法可以包括与给予一种本发明的多臂聚合物偶联物一起，还给予顺铂、卡铂、吉西他滨、力比泰(alimpta)以及多西他赛(后者是在该多臂聚合物偶联物本身不包括多西他赛的情况下)。
在一个实施方案中，将在此描述的一种多臂聚合物的含喜树碱的偶联物与5-氟尿嘧啶以及亚叶酸结合地进行给药，如在美国专利号6,403,569中描述的。
本发明的多臂聚合物偶联物可以一天给药一次或多次，优选是一天一次或更少。示例性的给药计划包括一周一次，每两周一次或每三周一次。在维持剂量的情况下，给药可以甚至比每三周一次更不频繁地发生，例如一月一次。治疗的持续时间可以是每天一次持续从二周至三周的一个时期并且可以持续几个月或甚至几年的时间。每天的剂量可以通过单个剂量单元形式或几个更小剂量单元的单剂量形式亦或通过以某些间隔再分的剂量的多次给药来进行给药。
在此提供的多臂聚合物偶联物与缺少该多臂聚合物烷酸酯支架的对应的未改性小分子药物相比展现出了改进的疗效，改进的容忍度以及降低的与运载体相关的毒性。
支持性实例展示了一种代表性的多臂聚合物烷酸酯偶联物在不同的体内小鼠异种移植模型中对不同类型的癌症的抗肿瘤活性。如在实例13中详细描述的，在H460和LS174T小鼠异种移植模型中，4-臂-PEG20K-BA-DOC展现出了比多西他赛自身更大的抗肿瘤活性。在对于4-臂-PEG20K-BA-DOC进行诊查的三个细胞系的两个之中观察了部分消退，而对于多西他赛没有观察到消退。此外，如在实例13中所示，在最大耐受剂量下，在H460、LoVo、以及LS174T异种移植模型中4-臂-PEG20K-BA-DOC的百分比肿瘤生长延迟(TGD)分别于多西他赛大2.5、2.0以及1.6倍，所有的均指向在此提供的多臂偶联物的非常优异的特征。
应当理解，虽然已经结合本发明的优选的特定实施方案说明了本发明，但以上说明连同下面的这些实例旨在展示而非限制本发明的范围。在本发明的范围之内的其他的方面、优点以及变更对于本发明所涉及的领域内的普通技术人员而言将是清楚的。
实验
除非另外指明，本发明的实施将采用本领域技能之内的有机合成以及类似的常规技术。此类技术在文献中全面地进行了描述。除非确切地指出是与此相反，否则试剂以及材料是可商购的。参见例如M.B.Smith and J.March，March′s Advanced organic Chemistry：Reactions Mechanisms and Structure，6th Ed.(New York：Wiley-Interscience，2007)，supra，以及Comprehensive organic Functional Group Transformations II，Volumes 1-7，Second Ed.：A Comprehensive Review of the Synthetic Literature 1995-2003(Organic Chemistry Series)，Eds.Katritsky，A.R.，et al.，Elsevier Science。
在以下的例子中，已经作出了努力来确保关于所使用的数字(例如量、温度等)的准确度，但对此仍应将一定的实验误差和偏差考虑在内。除非另外指明，温度是以摄氏度(C)为单位并且压强是在或接近海平面的大气压。
以下实例展示了本发明的某些方面和优点，然而，本发明不得被视为限制于以下描述的具体实施方案。
缩写
CM    羧甲基或羧基亚甲基(-CH2COOH)
DCC   1，3-二环己基碳二亚胺
DCM   二氯甲烷
DIC   N，N’-二异丙基碳二亚胺
DPTS  4-(二甲氨基)-吡啶鎓-p-对甲苯磺酸酯
DMF   二甲基甲酰胺
DMAP  4-(N，N-二甲氨基)吡啶
DMSO  二甲亚砜
DI    去离子的
HCl   盐酸
HOBT  羟基苄基三唑
HPLC  高效液相色谱法
IPA   异丙醇
K或kDa  千道尔顿
MALDI-TOF基质辅助激光解吸电离飞行时间
MeOH 甲醇
MW   分子量
NMR  核磁共振
RT   室温
SCM  琥珀酰亚胺基羧甲基(-CH2-COO-N-琥珀酰亚胺基)
SDS-PAGE十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SEC  尺寸排阻色谱法
TFA  三氟乙酸
THF  四氢呋喃
TLC  薄层色谱法
材料以及方法
多西他赛
Figure BDA0000050623270000611
购自中华人民共和国Hangzhou HETD Pharm&Chem Co.，Ltd。
基于季戊四醇的4-臂-PEG10K-OH、4-臂-PEG20K-OH、4-臂-PEG30K-OH、以及4-臂-PEG40K-OH是从NOF Corporation(日本)获得的。4-臂-PEG20K-OH具有以下结构：C-(CH2O-(CH2CH2O)nH)4，如以下结构性地示出的：
在每个臂中变量“n”代表着对应于2.5、5、7.5或10千道尔顿的PEG平均分子量的单体亚单元的数目，这样对该4-臂结构的缩写表明该分子的聚合物部分的总体平均分子量分别为10、20、30或40千道尔顿。
所有1HNMR数据是通过由Bruker制造的一种300或400MHz核磁共振波谱仪产生的。
实例1
合成4-臂-PEG 20K -丁酸(“4-臂-PEG 20K -BA”)
Figure BDA0000050623270000621
将基于季戊四醇的4-臂-PEG20K-OH(100.0g，0.020当量)(NOF Corporation)在甲苯(750ml)中的一种溶液通过蒸馏掉150ml甲苯来共沸干燥。加入叔丁醇钾在叔丁醇(60ml，0.060摩尔)中的1.0M溶液以及1-(3-溴丙基)-4-甲基-2，6，7-三噁二环[2，2，2]辛烷(12.6g，0.052摩尔)，并且将该混合物在70℃在氩气气氛下搅拌过夜。在减压下蒸馏掉溶剂并且将残余物溶解在蒸馏水(1,000ml)中。将溶液的pH用5％的磷酸调节到2并且将溶液在室温下搅拌15分钟。接着，通过加入1M的氢氧化钠将pH调节到12，并且将溶液搅拌两小时，通过周期性加入1M的氢氧化钠保持在pH为12。此后，通过加入5％的磷酸将pH调节到3并且用二氯甲烷来萃取产物。
将萃取液在无水硫酸镁上干燥、进行过滤并且然后加入异丙醇中。将沉淀的产物通过过滤除去并且在减压下进行干燥。
产量95.0g。1H NMR(d6-DMSO)：δ1.72ppm(q，CH 2 -CH2-COO-)，2.24ppm(t，-CH2-COO-)，3.51ppm(s，PEG主链)。取代＝约100％(意味着在NMR方法的精确度之内，位于该4-臂-PEG起始材料每个臂的末端上的每个OH-基团均被转化成对应的丁酸)。
实例2
合成4-臂-PEG 20K -丁酸酯连接的多西他赛偶联物 (“4-臂-PEG 20K -BA-DOC”)
Figure BDA0000050623270000631
向4-臂-PEG20K-丁酸(5.0g，0.0010当量，实例1)、多西他赛(1.0g，0.0012摩尔)、以及对甲苯磺酸4-二甲基氨基吡啶盐(0.15g，0.00051摩尔)在60ml的无水二氯甲烷的一种溶液中加入N，N’-二异丙基碳二亚胺(0.63g，0.005摩尔)，并且将该混合物在室温下在氩气氛中搅拌过夜。在减压下将溶剂蒸馏掉。将残余物溶解在二氯甲烷(7.5ml)中并且加至异丙醇以及二乙醚的1∶1混合物(100ml)中。将沉淀的产物过滤掉并且在减压下干燥。重复这种沉淀作用，给出了3.8g的白色固体产物。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.06(s，12H)，1.16(s，12H)，1.27(s，36H)，1.68(s，12H)，1.84(m，8H)，2.20-2.60(m，14H)，3.30-3.80(m，～1900H)，3.90(d，4H)，4.12(d，4H)，4.20(m，4H)，4.26(d，4H)，4.97(d，4H)，5.15(s，4H)，5.28(s，4H)，5.38(m，8H)，5.62(d，4H)，6.30(t，4H)，7.24(m，8H)，7.30(m，8H)，7.44(m，8H)，7.54(m，4H)，8.04(d，8H)。
产物在作为溶剂的CDCl3中的NMR分析显示，在每个分子的4臂-PEG20K-丁酸(4-臂-PEG20K-BA)上连接了4个分子的多西他赛。取代：约98-100％。
实例3
合成4-臂-PEG 20K -甘氨酸 (季戊四醇基-4-臂-(PEG-1-亚甲基-2氧代-乙烯基氨基乙酸)-20K) (“4-臂-PEG 20K -CM-GLY”)
提供以下的实例作为基础用于比较在实例1中描述的4-臂-PEG-OH起始材料上的药物(即，多西他赛)取代程度，是4-臂-PEG20K-丁酸对比4-臂-PEG20K-CM-甘氨酸。
A.形成4-臂-PEG20K-乙酸(“4-臂-PEG20K-CM”)
将基于季戊四醇的4-臂-PEG20K-OH(100.0g，0.020当量)(NOF Corporation)在甲苯(750ml)中的一种溶液通过蒸馏掉150ml甲苯来共沸干燥。加入叔丁醇钾在叔丁醇(60ml，0.060摩尔)中的1.0M溶液以及叔丁基溴乙酸酯(12.9g，0.066摩尔)，并且将该混合物在45℃在氩气气氛下搅拌过夜。在减压下蒸馏掉溶剂并且将残余物溶解在蒸馏水(1,000ml)中。通过加入1M的氢氧化钠将该溶液的pH调节到12并且将该溶液搅拌过夜，通过周期性加入1M的氢氧化钠将pH保持在12.0。通过加入1M的磷酸将pH调节到2。生成的产物4-臂-PEG20K-乙酸(也称为“4-臂-PEG20K-CM”)用二氯甲烷萃取。将萃取液在无水硫酸钠上干燥、进行过滤并且浓缩。然后将浓缩的萃取液加入乙醚中。
将沉淀的产物通过过滤收集并且在减压下干燥。产量95.5g。1HNMR(d6-DMSO)：δ3.51ppm(s，PEG主链)，4.01ppm(s，-CH2-COO-)。取代100％。取代＝约100％(意味着在NMR方法的精确度之内，位于该4-臂-PEG起始材料的每个臂末端上的每个OH-基团均被转化成对应的乙酸)。
B.形成4-臂-PEG20K-乙酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)
将4-臂-PEG20K-乙酸(90.0g，0.018当量)溶解在二氯甲烷(270ml)中，并且加入N-羟基琥珀酰亚胺(2.20g，0.019mol)。接着加入二环己基碳二亚胺(4.13g，0.020摩尔)，并且将溶液在室温下搅拌过夜。将该反应混合物过滤、浓缩并且通过加至异丙醇中进行沉淀。
最终产物的产量：82g。1H NMR(d6-DMSO)：δ2.81ppm(s，琥珀酰亚胺)，3.51ppm(s，PEG主链)，4.60ppm(s，-CH2-COO-)。取代100％。
C.形成4-臂-PEG20K-CM-甘氨酸(“4-臂-PEG20K-CM-GLY”)
4-臂-PEG20K-CM-甘氨酸
将4-臂-PEG20K-乙酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯(80.0g，0.016当量)溶解在二氯甲烷(240ml)和甘氨酸中，并加入叔丁基酯盐酸盐(3.22g，0.019摩尔)。接着加入三乙胺(6.90g)并且将溶液在室温下搅拌过夜。通过在减压下蒸馏掉160ml二氯甲烷来浓缩该反应混合物，接着加入80ml的三氟乙酸。将该混合物在室温下搅拌三小时，接着在减压下蒸馏以除去二氯甲烷以及三氟乙酸。将粗产物溶解在120ml的二氯甲烷中并且通过加入异丙醇进行沉淀。
收集沉淀物(4-臂-PEG20K-CM-GLY)并进行干燥以提供74g的一种白色固体产物。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ3.64ppm(s，PEG主链)，4.05ppm(s，-CH2-COO-)，4.09ppm(d，-CH2-，甘氨酸)。取代约100％。
实例4
合成4-臂-PEG 20K -CM-甘氨酸连接的多西他赛偶联物 (“4-臂-PE-PEG 20K -CM-GLY-DOC”)
向4-臂-PEG20K-乙酸酯连接的甘氨酸(4-臂-PEG20K-CM-GLY，5.0g，0.0010当量)、多西他赛(1.0g，0.0012摩尔)、以及对甲苯磺酸4-二甲基氨基吡啶盐(1.5g，0.0051摩尔)在60ml无水二氯甲烷中的一个溶液中加入N，N′-二异丙基碳二亚胺(0.63g，0.005摩尔)，并且将该混合物在室温下在氩气氛中搅拌过夜。在减压下将溶剂蒸馏掉。将残余物溶解在二氯甲烷(7.5ml)中并且加至异丙醇与二乙醚的1∶1混合物(100ml)中。将沉淀的产物过滤掉并且在减压下干燥。重复这种沉淀，给出了3.7g的白色固体产物。
产物(4-臂-PEG20K-CM-GLY-DOC)在作为溶剂的CDCl3中的NMR分析显示，取代是大约75％。这意味着每个分子的4臂-PEG20K-CM-GLY分子被连接在约3个分子的而非所希望的4个分子的多西他赛上。
实例5
合成另外的4-臂-PEG 10K -CM-甘氨酸连接的多西他赛偶联物： (“4-臂-PE-PEG 10K -CM-GLY-DOC”)
以类似于以上描述的一种方式制备4-臂-PEG10K-CM-甘氨酸连接的多西他赛偶联物，除了它们的分子量之外，起始的基于季戊四醇的4-臂-PEG-OH的平均分子量是10kDa。
该4臂-PEG(10K)-甘氨酸连接的多西他赛的1H NMR分析指示了约84％的取代。
实例6
合成4-臂-PEG 20K -TEG-α-甲基丙酸 (“4-臂-PEG 20K -TEG-α-MPA”)
Figure BDA0000050623270000661
I.合成四(乙二醇)-(α-硫酸胺盐)-ω-(α-甲基丙酸甲基酯)
A.四(乙二醇)单-α-甲基丙腈
Figure BDA0000050623270000662
将四(乙二醇)“TEG”(194.2g，1.0摩尔)、四丁基溴化铵(9.6g)以及甲苯(350ml)的一种混合物通过在减压下将甲苯蒸馏掉来共沸地干燥。加入固体氢氧化钾(粉末，2.2g)并且将该混合物在室温下搅拌30分钟。接着在两个小时的过程中滴加甲基丙烯腈(50ml)并且将该混合物在室温下在氩气气氛下搅拌92小时。将该粗产物溶解在1500ml的去离子水中并且将产生的溶液通过活性炭(50g)以及由Amberlite IR 120 plus(500ml)以及Amberlite IR 67组成的脱盐柱进行过滤。加入氯化钠(300g)，并且用二氯甲烷(500、300、以及200ml)萃取产物。将萃取液干燥(MgSO4)，并且在减压下将溶剂蒸馏掉。
产量：54.0g。1H NMR(D2O)：δ1.21ppm(d，CH 3 -C-)，3.00ppm(m，-CH-CN)，3.62ppm(bm，-OCH2CH2O-)。纯度：约100％。
B.四(乙二醇)单-α-甲基丙酰胺
Figure BDA0000050623270000671
将四(乙二醇)单-α-甲基丙腈(54g)溶解在浓盐酸(180ml)中，并且将产生的溶液在室温下搅拌20小时。加入去离子水(250ml)，并且用7℃-8℃的10％的氢氧化钠溶液将pH调节到7.6。在减压下将水蒸馏出并且用无水乙醇(200ml)从固体残余物中萃取产物。从萃取液中蒸馏出乙醇并且将粗产物溶解在二氯甲烷(150ml)中。将溶液用无水MgSO4干燥，并且在减压下将溶剂蒸馏掉。
产量：53.3g。1H NMR(D2O)：
Figure BDA0000050623270000672
0.89ppm(d，CH 3 -C-)，2.55ppm(m，-CH-(C＝O)NH2)，3.47ppm(bm，-OCH2CH2O-)。纯度：约100％。
C.四(乙二醇)单-α-甲基丙酸
Figure BDA0000050623270000673
将四(乙二醇)单-α-甲基丙酰胺(45g)溶解在氢氧化钾溶液(浓度6.67％，450ml)中，并且将产生的溶液在室温下搅拌70小时。接着，将反应混合物的pH用7℃-8℃温度下的10％的磷酸调节到7.5。在减压下将水蒸馏出，并且用无水乙醇(300ml)从固体残余物中萃取产物。将乙醇从萃取液中蒸馏出。将粗产物溶解在去离子水(50ml)中，并且用二氯甲烷(4x100ml)萃取杂质。加入NaCl(10g)并且用10％的盐酸将溶液的pH调节到3.0。用二氯甲烷(100、100、以及80ml)萃取产物。将萃取液用无水MgSO4干燥，并且在减压下将溶剂蒸馏掉。
产量：25.3g。1H NMR(D2O)：
Figure BDA0000050623270000674
1.06ppm(d，CH 3 -C-)，2.73ppm(m，-CH-COO-)，3.60ppm(bm，-OCH2CH2O-)。纯度：约100％。
D.四(乙二醇)单-α-甲基丙酸甲基酯
Figure BDA0000050623270000681
将四(乙二醇)单-α-甲基丙酸(25g)溶解在无水甲醇(350ml)中，加入浓硫酸(6.5ml)并且将该溶液在室温下搅拌三小时。用8％的NaHCO3水溶液将反应混合物的pH调节到6.0，并且在减压下蒸馏掉甲醇。用二氯甲烷(100、80、以及50ml)萃取产物。将萃取液用无水MgSO4干燥，并且在减压下将溶剂蒸馏掉。
产量：24.0g。1H NMR(d6-DMSO)：
Figure BDA0000050623270000682
1.06ppm(d，CH 3 -C-)，2.69ppm(m，-CH-COO)，3.47ppm(bm，-OCH2CH2O-)，360ppm(s，CH3O-)。纯度：约100％。
E.四(乙二醇)-α-甲磺酸酯-ω-(-α-甲基丙酸甲基酯)
Figure BDA0000050623270000683
将四(乙二醇)单-α-甲基丙酸甲基酯(24g，0.0815摩尔)与甲苯(240ml)的一种混合物通过在减压下蒸馏掉甲苯来共沸地干燥。将经干燥的四(乙二醇)单-α-甲基丙酸甲基酯溶解在无水甲苯(200ml)中。向该溶液加入40ml无水二氯甲烷以及12.5ml三乙胺(0.0897摩尔)。然后在0至5℃滴加10.0g的溶解在二氯甲烷(50ml)中的甲磺酰氯(0.0873摩尔)。将该溶液在室温下在氩气气氛下搅拌过夜。接下来，加入碳酸钠(10g)，将该混合物搅拌一小时。然后，将该溶液过滤，并且在减压下将溶剂蒸馏掉。
产量：28.3g。1H NMR(d6-DMSO)：1.06ppm(d，CH3-C-)2.70ppm(m，-CH-COO-)，3.18ppm(s，CH3-，甲磺酸酯)，3.49ppm(bm，-OCH2CH2O-)，3.60ppm(s，CH3O-)，3.67ppm(m，-CH 2 -CH2-甲磺酸酯)，4.31ppm(m，-CH2-甲磺酸酯)。纯度：约100％。
F.四(乙二醇)-(α-盐酸胺盐)-ω-(-α-甲基丙酸)
Figure BDA0000050623270000684
Figure BDA0000050623270000691
在六小时的过程中向四(乙二醇)-α-甲磺酸酯-ω-(-α-甲基丙酸甲基酯)(23.8g)以及去离子水(50ml)的一个混合物中逐步加入70ml的5-％NaOH，保持pH在12.0-12.3。接着，加入浓缩的氢氧化铵(1,500ml)并且将该混合物在室温下搅拌64小时。然后将该混合物在减压下浓缩至干燥。将残余物溶解在去离子水(150ml)中，并且用1M HCl将该溶液的pH调节至3.0。在减压下蒸馏掉水并且将粗产物溶解在二氯甲烷(150ml)中。将溶液过滤、用无水MgSO4干燥，并且在减压下将溶剂蒸馏掉。
产量19.4g。1H NMR(D2O)：1.06ppm(d，CH3-C-)2.72ppm(m，-CH-COO-)，3.13ppm(t，-CH 2 -NH2 ＊HCD，3.64ppm(bm，-OCH2CH2O-)。纯度：约100％。
G.四(乙二醇)-(α-硫酸胺盐)-ω-(α-甲基丙酸甲基酯)
将四(乙二醇)-(α-盐酸胺盐)-ω-(α-甲基丙酸)(19.4g)溶解在无水甲醇(280ml)中，加入浓缩的硫酸(5.2ml)并且将该溶液在室温下搅拌三小时。用8％的NaHCO3水溶液将该反应混合物的pH调节到6.0并且在减压下蒸馏掉这些溶剂。将该粗产物溶解在二氯甲烷(250ml)中。将溶液用无水MgSO4干燥，并且在减压下将溶剂蒸馏掉。
产量：15.7g。1H NMR(D2O)：1.04ppm(d，CH3-C-)2.77ppm(m，-CH-COO-)，3.11ppm(t，-CH 2 -NH2 ＊H2SO4)，3.62ppm(bm，-OCH2CH2O-)。纯度：约100％。
II.合成4-臂-PEG20K-苯并三唑基碳酸酯(“4-臂-PEG20K-BTC”)
Figure BDA0000050623270000693
将基于季戊四醇的4-臂-PEG20K-OH(10.0g，0.0020当量)(NOF Corporation)在乙腈(100ml)中的一个溶液通过蒸馏掉溶剂来共沸地干燥。接着，将产物溶解在50ml的无水乙腈和吡啶(0.49ml)中并且加入二(1-苯并三唑基)碳酸酯(1.31g的在三氯乙烷中的59％分散体)，并且将该混合物在室温下在氮气气氛下搅拌过夜。在减压下将溶剂蒸馏掉并且用异丙醇使产物沉淀。将沉淀的产物溶解在二氯甲烷(10ml)中并且用异丙醇进行再沉淀，过滤并且在减压下干燥。
产量9.8g。1H NMR(d6-DMSO)：3.51ppm(s，聚合物主链)，4.62ppm(m，PEG-OCH2-CH 2 -OCO2-，2H)，7.41-8.21ppm(络合物mult，苯并三唑质子，4H)。取代＝约100％(意味着在NMR方法的精确度之内，位于该4-臂-PEG起始材料的每个臂末端上的每个OH-基团均被转化成对应的苯并三唑基碳酸酯基团)。
III.合成4-臂-PEG20K-TEG-α-甲基丙酸(“4-臂-PEG20K-TEG-α-MPA”)
向四(乙二醇)-(α-硫酸胺盐)-ω-(α-甲基丙酸甲基酯)(0.75g)在无水二氯甲烷(80ml)的一个溶液中加入三乙胺(0.56ml)，并且然后滴加固体的4-臂-PEG20K-苯并三唑基碳酸酯(“4-臂-PEG20K-BTC”)(8.0g)并且将产生的溶液在室温下在氩气气氛下搅拌过夜。接着将溶液在减压下浓缩并且用异丙醇使产物沉淀并且将产物在真空中干燥。接着将其溶解在蒸馏水(200ml)中。用1M的氢氧化钠将该溶液的pH调节到12.1并且将该溶液搅拌五小时，通过周期性加入1M的氢氧化钠将pH保持在12.1。此后，加入NaCl(10g)，并通过添加10％的磷酸将pH调节到3并且用二氯甲烷萃取产物。将萃取液在无水硫酸钠上干燥、进行过滤并且浓缩。然后将浓缩的萃取液加至异丙醇中。
将沉淀的产物通过过滤收集并且在减压下干燥。产量7.4g。1HNMR(d6-DMSO)：δ1.00ppm(d，CH3-C-)，2.55ppm(m，-CH-COO-)，3.08ppm(q，-CH2N-NH-)，3.51ppm(s，PEG主链)，4.00ppm(s，-CH2-COO-)，7.16ppm(t，-(C＝O)-NH-)。取代约100％(意味着位于该4-臂-PEG起始材料的每个臂末端上的每个OH-基团均转化成了对应的α-甲基丙酸)。
实例7
合成4-臂-PEG 20K -己酸(“4-臂-PEG20K-HA”，)
Figure BDA0000050623270000711
将基于季戊四醇的4-臂-PEG20K-OH(50.0g，0.010当量)(NOF Corporation)在无水甲苯(500ml)中的一个溶液通过蒸馏掉甲苯来共沸地干燥。将经干燥的产物溶解在无水甲苯(500ml)中，并且添加叔丁醇钾在叔丁醇(30ml，0.030摩尔)中的1.0M溶液以及1-(5-溴戊基)-4-甲基-2，6，7-三噁二环[2，2，2]辛烷(7.8g，0.028摩尔)，并且在72℃下在氩气气氛下将该混合物搅拌过夜。在减压下蒸馏掉溶剂并且将残余物溶解在蒸馏水(400ml)中。用10％的磷酸将溶液的pH调节到2并且将溶液在室温下搅拌15分钟。接着，通过添加1M的氢氧化钠将pH调节到12.5，并且将溶液搅拌两小时，通过周期性加入1M的氢氧化钠将pH保持在12.1-12.5。此后，通过加入10％的磷酸将pH调节到3并且用二氯甲烷萃取产物。
将萃取液在无水硫酸镁上干燥、进行过滤、在减压下浓缩并且然后加至乙醚中。将沉淀的产物通过过滤除去并且在减压下干燥。
产量48.5g。1H NMR(d6-DMSO)：δ1.28ppm(m，-CH2-CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH2-COO-)，1.48ppm(m，-CH2-CH2-CH 2 -CH2-CH2-COO-)，2.18ppm(t，-CH2-COO-)，3.51ppm(s，PEG主链)。取代＝约100％(意味着位于该4-臂-PEG起始材料的每个臂末端上的每个OH-基团均转化成了对应的己酸)。
实例8
合成4-臂-PEG 20K -辛酸 (“4-臂-PEG 20K -OA”)
I.合成3-甲基-3-环氧丙烷甲醇的8-溴代辛酸酯
向8-溴代辛酸(22.5g，0.101摩尔)、3-甲基-3-环氧丙烷甲醇(11.0g，0.108摩尔)以及1-羟基苯并三唑(1.6g)在冷却到0-5℃的无水二氯甲烷(500ml)中的一种溶液中，在45分钟的过程中滴加N，N′-二环己基二碳二亚胺(22.3g，0.108摩尔)在无水二氯甲烷(110ml)中的一种溶液。接着，加入4-(二甲氨基)吡啶(1.8g)并且将混合物在室温下在氩气气氛下搅拌过夜。将该溶液过滤并且用5-％的磷酸洗涤两次(2x250ml)。接着，将其用无水MgSO4干燥并且蒸馏掉溶剂。粗产物的产量是28.0g。
II.合成1-(7-溴庚基)-4-甲基-2，6，7-三噁二环[2，2，2]辛烷
将3-甲基-3-环氧丙烷甲醇(14.0g)的8-溴代辛酸酯溶解在无水二氯甲烷(70ml)中并且将该溶液冷却到0-5℃。加入三氟化硼合二乙醚(1.49ml)并且将该混合物在0-5℃搅拌四小时。加入三乙胺(7.2ml)并且将该混合物在0-5℃搅拌15分钟。在减压下将溶剂蒸馏掉。将残余物溶解在乙醚(200ml)中并且将该溶液过滤。接下来，在减压下将溶剂蒸馏掉。产量13.5g。
III.合成4-臂-PEG 20K -辛酸
将基于季戊四醇的4-臂-PEG20K-OH(20.0g，0.004当量)(NOF Corporation)在无水甲苯(200ml)中的一种溶液通过蒸馏掉甲苯进行共沸地干燥。将经干燥的产物溶解在无水甲苯(400ml)中，并且加入叔丁醇钾在叔丁醇中(12ml，0.012摩尔)中的1.0M溶液以及1-(7-溴庚基)-4-甲基-2，6，7-三噁二环[2，2，2]辛烷(3.7g，0.012摩尔)，并且在72℃下在氩气气氛下将该混合物搅拌过夜。在减压下蒸馏掉溶剂并且将残余物溶解在蒸馏水(300ml)中。用10％的磷酸将溶液的pH调节到2并且将溶液在室温下搅拌45分钟。接着，通过加入1M的氢氧化钠将pH调节到12.5，并且将该溶液搅拌三小时，通过周期性加入1M的氢氧化钠将pH保持在12.1-12.5。此后，通过加入10％的磷酸将pH调节到3并且用二氯甲烷萃取产物。
将萃取液在无水硫酸镁上干燥、进行过滤、在减压下浓缩并然后用异丙醇使其沉淀。沉淀的产物通过过滤去除并且在减压下干燥，然后将其溶解在二氯甲烷(15ml)中并且用异丙醇使其再沉淀。产量15.5g。
产量48.5g。1H NMR(d6-DMSO)：δ1.25ppm(m，-CH2-CH 2 -CH 2 -CH2-CH2-CH 2 -CH2-COO-)，1.47ppm(m，-CH2-CH2-CH2-CH2-CH 2 -CH 2 -CH2-COO-)，2.15ppm(t，-CH2-COO-)，3.51ppm(s，PEG主链)。取代＝约100％(意味着位于该4-臂-PEG起始材料的每个臂末端上的每个OH-基团均转化成了对应的辛酸)。
实例9
合成4-臂-PEG 20K -癸酸 (“4-臂-PEG 20K -DA”)
Figure BDA0000050623270000731
I.合成3-甲基-3-环氧丙烷甲醇的10-溴代癸酸酯
向10-溴代辛酸(25.0g，0.100摩尔)、3-甲基-3-环氧丙烷甲醇(10.9g，0.107摩尔)以及1-羟基苯并三唑(1.6g)在冷却至0-5℃的无水二氯甲烷(500ml)中的一种溶液中，在45分钟的过程中滴加N，N′-二环己基二碳二亚胺(22.1g，0.107摩尔)在无水二氯甲烷(110ml)中的一种溶液。接着，加入4-(二甲氨基)吡啶(1.8g)并且将混合物在室温下在氩气气氛下搅拌过夜。将该溶液过滤并且用5-％的磷酸洗涤两次(2x250ml)。接着，将其用无水MgSO4干燥并且蒸馏掉溶剂。产量29.0g。
II.合成1-(9-溴壬基)-4-甲基-2，6，7-三噁二环[2，2，2]辛烷
将3-甲基-3-环氧丙烷甲醇(29.0g)的10-溴代癸酸酯溶解在无水二氯甲烷(300ml)中并且将该溶液冷却到0-5℃。加入三氟化硼合二乙醚(2.83ml)并且将该混合物在0-5℃搅拌四小时。加入三乙胺(13.7ml)并且混合物在0-5℃搅拌15分钟。在减压下将溶剂蒸馏掉。将残余物溶解在乙醚(400ml)中并且将该溶液过滤。接下来，在减压下将溶剂蒸馏掉。产量28.0g。
III.合成4-臂-PEG20K-癸酸
将基于季戊四醇的4-臂-PEG20K-OH(20.0g，0.004当量)(NOF Corporation)在无水甲苯(200ml)中的一种溶液通过蒸馏掉甲苯来共沸地干燥。将经干燥的产物溶解在无水甲苯(400ml)中，并且加入叔丁醇钾在叔丁醇中(12ml，0.012摩尔)中的1.0M溶液以及1-(9-溴壬基)-4-甲基-2，6，7-三噁二环[2，2，2]辛烷(4.0g，0.012摩尔)，并且在72℃下在氩气气氛下将该混合物搅拌过夜。在减压下蒸馏掉溶剂并且将残余物溶解在蒸馏水(300ml)中。用10％的磷酸将溶液的pH调节到2并且将溶液在室温下搅拌45分钟。接着，通过加入1M的氢氧化钠将pH调节到12.5，并且将该溶液搅拌三小时，通过周期性加入1M的氢氧化钠将pH保持在12.1-12.5。此后，通过加入10％的磷酸将pH调节到3并且用二氯甲烷萃取产物。
将萃取液在无水硫酸镁上干燥、进行过滤、在减压下浓缩并且然后用异丙醇使之沉淀。沉淀的产物通过过滤去除并且在减压下干燥，然后将其溶解在二氯甲烷(15ml)中并且用异丙醇使之再沉淀。产量15.5g。
1H NMR(d6-DMSO)：δ1.24ppm(m，-CH2-CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH2-COO-)，1.46ppm(m，-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH 2 -CH2-CH2-COO-)，2.14ppm(t，-CH2-COO-)，3.51ppm(s，PEG主链)。取代＝约100％(意味着位于该4-臂PEG起始材料的每个臂末端上的每个OH-基团均转化成了对应的癸酸)。
实例10
合成4-臂-PEG 20K -β-甲基戊酸 (“4-臂-PEG 20K -β-MPA”)
Figure BDA0000050623270000751
I.合成β-甲基-δ-戊内酯
Figure BDA0000050623270000752
向硼氢化钠(8.0g)在冷却到0-5℃的无水的四氢呋喃(160ml)中的一种悬浮液中加入3-甲基戊二酸酐(25.6g)在无水四氢呋喃(80ml)中的一种溶液，并且将该混合物在室温下搅拌过夜。接着，将该混合物冷却到0-5℃并且在40分钟的过程中加入盐酸(20％溶液，80ml)。将该混合物在0-5℃下搅拌15分钟并且在室温下搅拌四小时，接着将其在减压下浓缩、过滤，并且用氯仿萃取粗产物。将萃取液用无水MgSO4干燥，并且在减压下将溶剂蒸馏出。
将粗产物通过真空蒸馏进行纯化，收集到在2.6mm Hg和78℃下沸腾的馏分。产量13.1g。NMR，约100％纯的产物。
II.合成5-溴-3-甲基戊酸
用溴化氢气体使β-甲基-δ-戊内酯(3.0g)在冷却到0-5℃的无水二氯甲烷(30ml)中的一种溶液达到饱和并且将该混合物在室温下搅拌三天。将该混合物用二氯甲烷(100ml)稀释并且将产生的溶液用10-％的NaCl(3x30ml)洗涤。接着将该溶液用无水MgSO4干燥并且将溶剂在减压下蒸馏掉，产量4.6g。NMR，约100％纯的产物。
III.合成3-甲基-3-环氧丙烷甲醇的5-溴-3-甲基戊酸酯
Figure BDA0000050623270000761
向5-溴-3甲基戊酸(4.6g，0.024摩尔)、3-甲基-3-环氧丙烷甲醇(2.65g，0.026摩尔)以及1-羟基苯并三唑(0.40g)在冷却至0-5℃的无水二氯甲烷(100ml)中的一种溶液中，在5分钟的过程中滴加N，N′-二环己基二碳二亚胺(5.35g，0.026摩尔)在无水二氯甲烷(20ml)中的一种溶液。接着加入4-(二甲氨基)吡啶(0.045g)并且将混合物在室温下在氩气气氛下搅拌过夜。将该溶液过滤并且用5-％的磷酸洗涤两次(2x50ml)。接着，将其用无水MgSO4干燥并且蒸馏掉溶剂。产量5.4g。NMR纯度约95％。
IV.合成1-(4-溴-2-甲基丁基)-4-甲基-2，6，7-三噁二环[2，2，2]辛烷
Figure BDA0000050623270000762
将3-甲基-3-环氧丙烷甲醇(5.4g)的5-溴-3-甲基戊酸酯溶解在无水二氯甲烷(400ml)中并且将该溶液冷却到0-5℃。加入三氟化硼合二乙醚(0.7ml)并且将该混合物在0-5℃搅拌四小时。加入三乙胺(3.4ml)并且将混合物在0-5℃搅拌15分钟。在减压下将溶剂蒸馏掉。将残余物溶解在乙醚(50ml)中并且将该溶液过滤。接下来，在减压下将溶剂蒸馏掉。产量4.6g。
V.合成4-臂-PEG20K-α-甲基戊酸
将基于季戊四醇的4-臂-PEG20K-OH(7.5g，0.0015当量)(NOF Corporation)在无水甲苯(37.5ml)中的一种溶液通过蒸馏掉甲苯来共沸地干燥。将经干燥的产物溶解在无水甲苯(37.5ml)中，并且加入叔丁醇钾在叔丁醇中(9ml，0.0090摩尔)的1.0M溶液以及1-(4-溴-2-丁基)-4-甲基-2，6，7-三噁二环[2，2，2]辛烷(2.3g，0.0083摩尔)，并且在70℃下在氩气气氛下将该混合物搅拌过夜。在减压下蒸馏掉溶剂并且将残余物溶解在蒸馏水(100ml)中。用10％的磷酸将溶液的pH调节到2并且将溶液在室温下搅拌15分钟。接着，通过加入1M的氢氧化钠将pH调节到12.5，并且将该溶液搅拌三小时，通过周期性加入1M的氢氧化钠将pH保持在12.1-12.5。此后，通过加入10％的磷酸将pH调节到3并且用二氯甲烷萃取产物。将萃取液在无水硫酸镁上干燥、进行过滤、在减压下浓缩并且然后用异丙醇使之沉淀。将沉淀的产物通过过滤除去并且在减压下干燥。产量3.2g。
1H NMR(D2O)：δ0.88ppm(d，-CH3)，1.44ppm and 1.56ppm(m，.-CH 2 -CH 2 -CH(CH 3 )-CH2-COO-)，1.93ppm(m，CH-CH3)，2.11ppm and 2.31ppm(m，-CH2-COO-)，3.24ppm(s，-OCH3)，3.51ppm(s，PEG主链)。取代＝约75.5％。
实例11
偶联物的表征
以下概述了多西他赛的不同的多臂偶联物的药物取代程度，如通过1H NMR确定的。
药物取代：通过1H NMR计算药物取代
通过1H NMR对于在氘化的氯仿(CDCl3)中的不同的4-臂-PEG-多西他赛偶联物样品进行了分析，并且在8.10ppm将聚合物主链的整体性与的多西他赛的芳香族质子的整体性进行比较。基于所获得的所有光谱的平均质子峰的积分法，确定了药物取代的程度。
表1
＊药物取代值平均起来对于BA连接的偶联物4-臂-PEG20K-BA-DOC是约98％的取代(95％-100％)。
实例12
合成另外的多臂聚合物烷酸酯连接的多西他赛偶联物
按实例1中描述的制备了以下4-臂-PEG20K-链烷酸：4-臂-PEG20K-α-甲基丙酸(4-臂-PEG20K-MPA)、4-臂-PEG20K-己酸(4-臂-PEG20K-HA)、4-臂-PEG20K-辛酸(4-臂-PEG20K-OA)、以及4-臂-PEG20K-癸酸(4-臂-PEG20K-DA)。还制备了以下多臂丁酸：4-臂-PEG10K-丁酸(4-臂-PEG10K-BA)、4-臂-PEG30K-丁酸(4-臂-PEG30K-BA)、以及4-臂-PEG40K-丁酸(4-臂-PEG40K-BA)。该合成的详细说明分别是按照实例12A-C。
将多西他赛(1.03g、1.20mmol)、对应的4-臂-PEG20K-酸[α-甲基丙酸(4-臂-PEG20K-MPA)、4-臂-PEG20K-己酸(4-臂-PEG20K-HA)、4-臂-PEG20K-辛酸(4-臂-PEG20K-OA)、4-臂-PEG20K-癸酸(4-臂-PEG20K-DA)、4-臂-PEG10K-丁酸(4-臂-PEG10K-BA)、4-臂-PEG30K-丁酸(4-臂-PEG10K-BA)、或4-臂-PEG40K-丁酸(4-臂-PEG40K-BA)、0.25mmol]、以及DPTS(0.15g、0.50mmol)溶解在50mL DCM中。在搅拌地加入DIC(0.38g，3.00mmol，在5mL的DCM中)之前，将产生的溶液在一个冰-盐(NaCl)浴(-15℃至-5℃)中冷却20分钟。将该反应混合物在-15℃至-5℃搅拌另外的12小时。将溶液过滤以除去任何固体并且然后在减压下浓缩到一半的体积。将产生的溶液在搅拌下加至400mL的醚/IPA(1∶1)中。收集到白色固体并且使用以上方法使之再次沉淀。将产物在真空中干燥(产率：对于所有的合成均是约90％)。
4-臂-PEG20K-MPA-多西他赛：1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.02-1.20(m，24H)，1.21(s，12H)，1.32(s，36H)，1.65(d，4H)，1.74(s，12H)，1.85(m，4H)，1.93(s，12H)，2.10-2.38(m，8H)，2.41(s，12H)，2.60(m，4H)，2.80(m，4H)，3.30-3.92(m，～2180H)，4.10-4.30(m，23H)，4.95(d，4H)，5.21(s，4H)，5.47(m，4H)，5.52(br.，10H)，6.21(t，4H)，7.26(m，8H)，7.40(m，8H)，7.50(m，8H)，7.60(m，4H)，8.12(d，8H)。
4-臂-PEG20K-HA-多西他赛：1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.12(s，12H)，1.22(s，12H)，1.32(s，36H)，1.34-1.70(m，15H)，1.74(s，12H)，1.80-1.95(m，16H)，2.10-2.38(m，16H)，2.43(s，12H)，2.60(m，4H)，3.30-3.90(m，～1950H)，3.91(d，4H)，4.12-4.26(m，8H)，4.30(d，4H)，4.97(d，4H)，5.28(s，4H)，5.25-5.55(m，10H)，5.68(d，4H)，6.21(t，4H)，7.26(m，8H)，7.40(m，8H)，7.50(m，8H)，7.60(m，4H)，8.11(d，8H)。
4-臂PEG20K-OA-多西他赛1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.11(s，12H)，1.13-1.24(m，40H)，1.33(s，36H)，1.40-1.60(m，18H)，1.74(m，12H)，1.83-2.00(m，16H)，)，2.00-2.20(m，4H)，2.220-2.40(m，13H)，2.43(s，12H)，2.60(br.，4H)，3.32-3.89(m，～2180H)，3.90(d，4H)，4.12-4.20(m，12H)，4.26(d，4H)，4.96(d，4H)，5.21(s，4H)，5.38(m，8H)，5.50(br.4H)，5.68(d，4H)，6.23(t，4H)，7.24(m，8H)，7.38(m，8H)，7.50(m，8H)，)，7.61(m，4H)，8.12(d，8H)。
4-臂PEG20K-DA-多西他赛1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.11(s，12H)，1.22(s，12H)，1.23-1.30(m，44H)，1.33(s，36H)，1.40-1.60(m，18H)，1.74(m，12H)，1.84-2.00(m，16H)，2.00-2.20(m，4H)，2.20-2.40(m，13H)，2.43(s，12H)，2.60(br.，4H)，3.30-3.88(m，～2100H)，3.90(d，4H)，4.12-4.20(m，12H)，4.26(d，4H)，4.96(d，4H)，5.21(s，4H)，5.38(m，8H)，)，5.50(br.4H)，5.68(d，4H)，6.23(t，4H)，7.24(m，8H)，7.38(m，8H)，7.50(m，8H)，7.61(m，4H)，8.12(d，8H)。
4-臂PEG10K-BA-多西他赛1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ1.10(s，12H)，1.21(s，12H)，1.33(s，36H)，1.74(s，12H)，1.85(m，12H)，1.94(m，12H)，2.15(m，4H)，2.30(m，4H)，2.41(m，15H)，2.55(m，8H)，3.30-3.80(m，～960H)，3.90(d，4H)，4.18(m，8H)，4.25(m，4H)，4.30(d，4H)，4.97(d，4H)，5.19(s，4H)，5.30(s，4H)，5.45(m，8H)，5.64(d，4H)，6.30(t，4H)，7.24(m，8H)，7.35(m，8H)，7.49(m，8H)，7.60(m，4H)，8.01(d，8H)。
4-臂PEG30K-BA-多西他赛1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ1.11(s，12H)，1.21(s，12H)，1.33(s，36H)，1.74(s，12H)，1.85(m，12H)，1.94(m，12H)，2.15(m，4H)，2.30(m，4H)，2.41(m，15H)，2.55(m，8H)，3.30-3.80(m，～2840H)，3.90(d，4H)，4.18(m，8H)，4.25(m，4H)，4.30(d，4H)，4.97(d，4H)，5.19(s，4H)，5.30(s，4H)，5.45(m，8H)，5.64(d，4H)，6.30(t，4H)，7.24(m，8H)，7.35(m，8H)，7.49(m，8H)，7.60(m，4H)，8.01(d，8H)。
4-臂PEG40K-BA-多西他赛1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ1.11(s，12H)，1.21(s，12H)，1.33(s，36H)，1.74(s，12H)，1.85(m，12H)，1.94(m，12H)，2.15(m，4H)，2.30(m，4H)，2.41(m，15H)，2.55(m，8H)，3.30-3.80(m，～4050H)，3.90(d，4H)，4.18(m，8H)，4.25(m，4H)，4.30(d，4H)，4.97(d，4H)，5.19(s，4H)，5.30(s，4H)，5.45(m，8H)，5.64(d，4H)，6.30(t，4H)，7.24(m，8H)，7.35(m，8H)，7.49(m，8H)，7.60(m，4H)，8.09(d，8H)。
实例12A
合成4-臂-PEG 10K -丁酸(“4-臂-PEG 10K -BA”)
Figure BDA0000050623270000801
将基于季戊四醇的4-臂-PEG10K-OH(50.0g，0.020当量)(NOF Corporation)在甲苯(450ml)中的一种溶液通过蒸馏掉100ml甲苯来共沸地干燥。加入叔丁醇钾在叔丁醇(50ml，0.050摩尔)以及1-(3-溴丙基)-4-甲基-2，6，7-三噁二环的[2，2，2]辛烷(14.0g，0.056摩尔)中的一种1.0M溶液，并且将该混合物在70℃在氩气气氛下搅拌过夜。在减压下蒸馏掉溶剂并且将残余物溶解在蒸馏水(600ml)中。用5％的磷酸将溶液的pH调节到2并且将溶液在室温下搅拌15分钟。接着，通过加入1M的氢氧化钠将pH调节到12，并且将溶液搅拌两小时，通过周期性加入1M的氢氧化钠将pH保持在12。此后，通过加入5％的磷酸将pH调节到3并且用二氯甲烷萃取产物。
将萃取液在无水硫酸镁上干燥、进行过滤并且然后加入异丙醇中。将沉淀的产物通过过滤除去并且在减压下干燥。
产量45.0g。1H NMR(d6-DMSO)：δ1.72ppm(q，CH 2 -CH2-COO-)，2.24ppm(t，-CH2-COO-)，3.51ppm(s，PEG主链)。取代＝约100％(意味着位于该4-臂-PEG起始材料的每个臂的末端上的每个OH-基团均转化成了对应的丁酸)。
实例12B
合成4-臂-PEG 30K -丁酸(“4-臂-PEG 30K -BA”)
Figure BDA0000050623270000811
将基于季戊四醇的4-臂-PEG30K-OH(50.0g，0.0067当量)(ChemOrganics，Houston TX)在甲苯(450ml)中的一种溶液通过蒸馏掉100ml甲苯来共沸地干燥。加入叔丁醇钾在叔丁醇(20ml，0.020摩尔)以及1-(3-溴丙基)-4-甲基-2，6，7-三噁二环的[2，2，2]辛烷(5.9g，0.023摩尔)中的一种1.0M溶液，并且将该混合物在70℃在氩气气氛下搅拌过夜。在减压下蒸馏掉溶剂并且将残余物溶解在蒸馏水(600ml)中。用5％的磷酸将溶液的pH调节到2并且将溶液在室温下搅拌15分钟。接着，通过加入1M的氢氧化钠将pH再调节到12，并且将溶液搅拌两小时，通过周期性加入1M的氢氧化钠将pH保持在12。此后，通过加入5％的磷酸将pH调节到3并且用二氯甲烷萃取产物。
将萃取液在无水硫酸镁上干燥、进行过滤并且然后加入异丙醇中。将沉淀的产物通过过滤除去并且在减压下干燥。
产量46g。1H NMR(d6-DMSO)：δ1.72ppm(q，CH 2 -CH2-COO-)，2.24ppm(t，-CH2-COO-)，3.51ppm(s，PEG主链)。取代＝约100％(意味着位于该4-臂-PEG起始材料的每个臂的末端上的每个OH-基团均转化成了对应的丁酸)。
实例12C
合成4-臂-PEG 40K -丁酸(“4-臂-PEG 40K -BA”)
Figure BDA0000050623270000821
将基于季戊四醇的4-臂-PEG40K-OH(50.0g，0.005当量)(NOF Corporation)在甲苯(450ml)中的一种溶液通过蒸馏掉100ml甲苯来共沸地干燥。加入叔丁醇钾在叔丁醇(15ml，0.015摩尔)以及1-(3-溴丙基)-4-甲基-2，6，7-三噁二环的[2，2，2]辛烷(4.4g，0.018摩尔)中的一种1.0M溶液并且将该混合物在70℃在氩气气氛下搅拌过夜。在减压下蒸馏掉溶剂并且将残余物溶解在蒸馏水(600ml)中。用5％的磷酸将溶液的pH调节到2并且将溶液在室温下搅拌15分钟。接着，通过加入1M的氢氧化钠将pH调节到12，并且将溶液搅拌两小时，通过周期性加入1M的氢氧化钠将pH保持在12。此后，通过加入5％的磷酸将pH调节到3并且用二氯甲烷萃取产物。
将萃取液在无水硫酸镁上干燥、进行过滤并且然后加入异丙醇中。将沉淀的产物通过过滤除去并且在减压下干燥。
产量48.0g。1H NMR(d6-DMSO)：δ1.72ppm(q，CH 2 -CH2-COO-)，2.24ppm(t，-CH2-COO-)，3.51ppm(s，PEG主链)。取代＝约100％(意味着位于该4-臂-PEG起始材料的每个臂的末端上的每个OH-基团均转化成了对应的丁酸)。
实例13
4-臂-PEG 20K -BA-多西他赛在人肺以及结肠癌的小鼠异种移植模 型中的抗肿瘤活性
以下研究的目的是为了评估4-臂-PEG20K-BA-DOC在非小细胞肺(H460)以及结肠直肠的(LS174T、LoVo)的小鼠肿瘤异种移植模型中的抗肿瘤活性，表现出了有限的多西他赛敏感性。
在雌性无胸腺小鼠中建立H460、LS174T以及LoVo肿瘤。10只小鼠的多个组接受了总计三个单剂量的4-臂-PEG20K-BA-DOC或多西他赛，是每7天(q7dx3)以几个计量进行给药的直至一个最大耐受剂量(MTD)。对照组在肿瘤移植后没有接受任何治疗。在最先的五天每天对这些动物称重并且之后每周称量两次。在第一次注射药物之后每周测量两次肿瘤体积。
肿瘤的端点体积对于LS174T是1500mm3，对于LoVo是1000mm3并且对于H460是2000mm3。
将抗肿瘤活性测量为肿瘤体积、达到端点的时间以及完全或部分的肿瘤消退方面的变化。
治疗结果是通过肿瘤生长延迟(TGD)来评估的，肿瘤生长延迟被定义为治疗组与对照组相比在达到端点的中位时间方面的增加。在此将它表示为％TGD，是比上对照组的到达端点的中位时间的一个百分比。
对于三次顺序的测量，与第1天的体积相比，体积减小至50％或更小的一种肿瘤被认为是处于部分消退中。完全消退被定义为对于三次顺序的测量，体积等于或大于13.5mm3。
可接受的毒性被定义为在研究过程中一个组的平均体重(BW)损失小于20％并且在十个受治疗的动物中最多一个的与治疗相关的死亡。任何导致更大毒性的配量方案被认为是在最大耐受剂量(MTD)之上。
结果如下。
非小细胞肺癌模型(H460)：4-臂-PEG20K-BA-DOC治疗在以MTD(33mg/kg 4-臂-PEG20K-BA-DOC，25mg/kg多西他赛)携带H460肿瘤的小鼠中产生了在肿瘤生长延迟(TGD)上的统计上显著的(p＜0.05)剂量相关的增大，其中在4-臂-PEG20K-BA-DOC以及多西他赛治疗的组中，％TGD值分别是122％以及48％。参见图3A(全部剂量的组)以及3B(仅仅对照组以及MTD组)连同下表2A在MTD时4-臂-PEG20K-BA-DOC与多西他赛之间的体重上的减轻是相当的(分别是14.2％和15.5％)。
为了评估改进的抗肿瘤活性是否是因为在4-臂-PEG20K-BA-DOC给药之后更大的血浆以及肿瘤的多西他赛暴露，在带有H460肿瘤的小鼠中进行4-臂-PEG20K-BA-DOC或多西他赛的单一IV给药之后分析了血浆以及肿瘤匀浆。参见以其对应的最大耐受剂量(MTD)33和25mg/kg给药的每一4-臂-PEG20K-BA-DOC和多西他赛，观察到了以下结果。在4-臂-PEG20K-BA-DOC给药之后，血浆的多西他赛浓度保持高于5ng/mL长达168小时，而多西他赛给药后72小时内多西他赛浓度落在1ng/mL之下。使用4-臂-PEG20K-BA-DOC的最大血浆多西他赛浓度比使用多西他赛的低13倍。尽管两种治疗均达到了浓度-时间曲线(AUC)下相似的血浆多西他赛面积，但4-臂-PEG20K-BA-DOC治疗产生的肿瘤多西他赛浓度比关于多西他赛的要大0.4至4倍，从而给出了大2倍的肿瘤多西他赛AUC。在4-臂-PEG20K-BA-DOC给药后肿瘤在多西他赛中这种更大的且持续的暴露是与超过多西他赛的显著更长的肿瘤生长延迟相关的(122％对比48％)。4-臂-PEG20K-BA-DOC在19mg/kg(其MTD的58％)时保留了显著的抗肿瘤活性，而小于25mg/kg的多西他赛剂量则没有。
表2A
在H460异种移植中用4-臂-PEG20K-BA-DOC和多西他赛治疗后的响应概述
Figure BDA0000050623270000841
Figure BDA0000050623270000851
＊与没有治疗的组相比p＜0.05。
＊＊与没有治疗的组相比p＜0.01。
1肿瘤生长延迟是基于2000mm3或57天的一个研究端点。
20/0表明没有观察到体重减少。
3没有对统计显著性进行评估，因为治疗超过了MTD。
表2B
Figure BDA0000050623270000852
&以q7dx3给药
#从33mg/kg的剂量外推。
结肠(LS174T)癌模型：在携带了LS174T肿瘤的小鼠中利用4-臂-PEG20K-BA-DOC治疗的TGD是与剂量有关的并且在MTD时产生了三种部分消退；使用多西他赛没有观察到部分消退。在携带LS174T肿瘤的小鼠中，4-臂-PEG20K-BA-DOC表现了比多西他赛显著地(p＜0.0001)更大的TGD；在MTD(40mg/kg 4-臂-PEG20K-BA-DOC，30mg/kg多西他赛)时是266％对比166％。在30mg/kg时，4-臂-PEG20K-BA-DOC表现了250％的TGD以及一种部分消退，而30mg/kg多西他赛产生了166％的TGD并且没有消退。在MTD时，4-臂-PEG20K-BA-DOC与多西他赛之间的体重上的减轻是相当的(分别是18.8％和16.6％)。
参见图2A和2B以及下表3。
表3
在LS174T结肠癌异种移植中用4-臂-PEG20K-BA-DOC和多西他赛治疗后的响应概述
Figure BDA0000050623270000861
Figure BDA0000050623270000871
＊与没有治疗的组相比p＜0.001。
1TGD是基于1500mm3或79天的一个研究端点。
2 0/0表明没有观察到体重减少。
结肠(LoVo)癌模型：在携带LoVo肿瘤的小鼠中4-臂-PEG20K-BA-DOC治疗在TGD方面产生了类似的与剂量相关的改进。在相同的当量剂量下，关于4-臂-PEG20K-BA-DOC治疗的体重变化总体上小于或类似于对于多西他赛的体重变化。由于22.6％的体重减小，40mg/kg 4-臂-PEG20K-BA-DOC超过了MTD并且导致了148％的TGD以及两个PR。尽管并非显著不同，但是当以30mg/kg的多西他赛当量剂量(两种试剂的MTD)给药之后，4-臂-PEG20K-BA-DOC与多西他赛相比产生了两倍的肿瘤生长延迟(128％对比64％)。在更低的多西他赛当量剂量(22.5和16.9mg/kg)下，4-臂-PEG20K-BA-DOC与多西他赛的活性是相当的。参见图4A和4B。
表4
在LoVo异种移植中用4-臂-PEG20K-BA-DOC和多西他赛治疗后的响应概述
Figure BDA0000050623270000872
Figure BDA0000050623270000881
＊p＜0.01＊＊＊p＜0.001，是与没有治疗的组相比。
1没有对统计显著性进行评估，因为治疗超过了MTD。
2TGD是基于1000mm3或77天的一个研究端点。
3 0/0表明没有观察到体重减少。
以上内容说明，在H460和LS174T小鼠异种移植模型中4-臂-PEG20K-BA-DOC比多西他赛具有显著更大的抗肿瘤活性。对于4-臂-PEG20K-BA-DOC，在这三个细胞系的两个中观察到了部分消退，而对于多西他赛没有观察到消退。在MTD时，在H460以及LS174异种移植模型中对于4-臂-PEG20K-BA-DOC的％TGD分别比多西他赛大2.5以及1.6倍。此外，4-臂-PEG20K-BA-DOC被很好地忍受，其中在MTD时的重量损失与多西他赛是相当的并且没有显著的临床观察。总言之，以上内容说明，该示例性的偶联物4-臂-PEG20K-BA-DOC在显著改善多西他赛的时间-浓度曲线以及抗肿瘤活性方面是有效的。
实例14
多西他赛和4-臂-PEG 20K -BA-多西他赛在斯普拉-道来大鼠中的药代动 力学
本研究的目的是评估多西他赛以及4-臂-PEG20K-BA-多西他赛在静脉内注入大鼠中之后的药代动力学以及分泌。
在服用了5、10、以及15mg/kg(30，60，90mg/m2)的4-臂-PEG20K-BA-多西他赛或5mg/kg(30mg/m2)多西他赛的雄性大鼠(15只大鼠/剂量水平)中评估4-臂-PEG20K-BA-多西他赛以及多西他赛的药代动力学。4-臂-PEG20K-BA-多西他赛以及多西他赛是以4mL/kg通过一个股静脉导管作为30-分钟静脉输注来给药的。血液样品(n＝15个时间点其中n＝5个样品/剂量水平/时间点)是通过颈部静脉穿刺在给药前以及给药后144小时之间获得的。药代动力学参数总结在表5中。
表5
在进行5mg/kg多西他赛或5、10、15mg/kg 4-臂-PEG20K-BA-多西他赛的单一IV给药之后雄性大鼠中多西他赛与4-臂-PEG20K-BA-多西他赛的药代动力学参数
Figure BDA0000050623270000901
1ND＝未确定；最终阶段未明确定义
2NA＝对于多西他赛代谢产物是不适用的
＊偶联物＝4-臂-PEG20K-BA-多西他赛
血浆的4-臂-PEG20K-BA-多西他赛浓度以一种多阶段的方式下降，平均终末半衰期是65小时。4-臂-PEG20K-BA-多西他赛清除率很低，为0.33mL/min/kg。Vss与总的体液相似，指示了在血管空间外的分布。T1/2、CL、以及Vss不依赖于剂量。Cmax以及AUC值以一种剂量相关的并且一般是与剂量成比例的方式增大。
在进行4-臂-PEG20K-BA-多西他赛的给药之后，血浆的多西他赛浓度以多阶段的方式降低并且保持不变。在4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药之后0.5-2小时之间达到了多西他赛的Cmax值，表明一部分多西他赛被迅速释放。在相等剂量(5mg/kg或30mg/mm2)的4-臂-PEG20K-BA-多西他赛下，4-臂-PEG20K-BA-多西他赛治疗产生了约小6倍的Cmax但相似的AUC。4-臂-PEG20K-BA-多西他赛过后多西他赛Cmax以及AUC以一种剂量相关的且一般是与剂量成比例的方式增大。
标准的非隔室分析不允许对4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药之后的长的多西他赛半衰期进行精确评估，一部分是由于多西他赛的持续存在以及最慢的处置阶段中与浓度相关的变化性(发生在定量下限(1ng/mL)附近)。为了进一步评估持续不变的血浆多西他赛终末半衰期，采用了一种群体药代动力学途径。这种群体药代动力学分析评估了4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药之后168小时以及多西他赛给药之后40小时的多西他赛的终末半衰期。
基于以上内容，4-臂-PEG20K-BA-多西他赛在给予大鼠时具有一个低的清除率以及低的分布容积，从而给出了65小时的一个长的4-臂-PEG20K-BA-多西他赛终末半衰期。在给予相等的4-臂-PEG20K-BA-多西他赛以及多西他赛剂量后，血浆多西他赛Cmax大约是低了6倍，而AUC是相似的。评估出血浆多西他赛半衰期在给予4-臂PEG20K-BA-多西他赛之后比在给予多西他赛之后所观察到要长约4倍(168对比40小时)，从而导致了持续不变的全身性多西他赛暴露。
实例15
多西他赛和4-臂-PEG 20K -BA-多西他赛在小猎狗中的药代动力学
本研究的目的是评估多西他赛以及4-臂-PEG20K-BA-多西他赛在静脉内输注给狗之后的药代动力学以及分泌。
在服用了0、0.75、2、或4mg/kg(0、15、40、以及80mg/m2/剂量)的4-臂-PEG20K-BA-多西他赛或0.75mg/kg(15mg/m2)多西他赛的雄性狗(4只狗/剂量水平)中评估药代动力学。4-臂-PEG20K-BA-多西他赛以及多西他赛是以4mL/kg/hr通过一个头部或隐静脉一次性导管作为60-分钟静脉输注来给药的。通过颈部静脉穿刺或Abbacoth IV导管在0与给药后168小时之间获得了十七个血液样品。对4-臂-PEG20K-BA-多西他赛以及多西他赛的血浆浓度进行确定。
药代动力学参数总结在表6中。
表6
在进行0.75mg/kg多西他赛或0.75、2、4mg/kg 4-臂-PEG20K-BA-多西他赛的单一IV给药之后雄性狗中多西他赛与4-臂-PEG20K-BA-多西他赛的药代动力学参数
Figure BDA0000050623270000931
1ND＝未确定；最终阶段未明确定义
2NA＝对于多西他赛代谢产物是不适用的
＊偶联物＝4-臂-PEG20K-BA-多西他赛
血浆的4-臂-PEG20K-BA-多西他赛浓度以一种多阶段的方式下降，平均的终末半衰期是31小时。4-臂-PEG20K-BA-多西他赛清除率很低，是0.13mL/min/kg。Vss小于总的体液，指示了在血管空间外的有限分布。T1/2、CL、以及Vss不依赖于剂量。在进行4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药之后Cmax以及AUC值以一种剂量相关的且一般是与剂量成比例的方式增大。
在给予4-臂-PEG20K-BA-多西他赛之后，血浆多西他赛浓度以一种多阶段的方式降低并且保持持续。在4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药之后0.88-12小时之间达到了多西他赛的Cmax值，表明了一部分多西他赛被迅速释放。在0.75mg/kg的多西他赛与4-臂-PEG20K-BA-多西他赛的相等剂量水平下，4-臂-PEG20K-BA-多西他赛治疗给出了低110倍的Cmax以及低7倍的AUC。多西他赛Cmax以及AUC以一种剂量相关的且一般是与剂量成比例的方式增大。
标准的非隔室分析不允许对4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药之后长的多西他赛终末半衰期进行评估，一部分是由于多西他赛的持续存在以及最缓慢的处置阶段中与浓度相关的变化性(发生在定量下限(1ng/mL)附近)。为了进一步评估持续不变的血浆多西他赛终末半衰期，采用了一种群体药代动力学方法。该群体药代动力学分析预测了在4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药之后199小时、以及多西他赛给药之后25小时的狗中的多西他赛终末半衰期。
4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药后更低的多西他赛AUC很可能是因为AUC的不完全捕获，这是由于在存在199小时的表观半衰期时较短的采样期(168小时)。基于这一发现，很可能的是在给药之后多西他赛从4-臂-PEG20K-BA-多西他赛中的释放会持续一段显著时间。
基于这一研究，4-臂-PEG20K-BA-多西他赛具有一个低的清除率以及低的分布容积，从而给出了31小时的一个长的4-臂-PEG20K-BA-多西他赛终末半衰期。在给予相等的4-臂-PEG20K-BA-多西他赛以及多西他赛剂量之后，血浆多西他赛Cmax以及AUC分别小了约110以及7倍。4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药之后更低的多西他赛AUC很可能是因为AUC的不完全捕获，这是由于在存在199小时的表观半衰期时较短的采样期(168小时)。评估出在4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药之后的血浆多西他赛半衰期比在多西他赛给药之后所观察到的要长8倍(199对比25小时)，从而证实了在大鼠中观察到的持续的全身性多西他赛暴露。
实例16
末端处置速率常数的非线性混合效应模型
尽管确定了多西他赛或4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药之后的多西他赛药代动力学，但观察到末端处置速率常数λz的可靠值是对于绝大多数的动物不能获得的，这是由于在相邻的采样时间之间的血浆多西他赛浓度的波动和/或出现了不完全的浓度时间曲线(这是因为浓度是靠近或在定量下限(1ng/mL))。此外，在实例14中，大鼠是以15个的组使用交替、重叠的稀疏采样方案跨组进行采样的以便覆盖总的采样持续时间。所有的这些因素促成了在给定动物的末端浓度时间曲线中出现了稀疏数据。
为了进一步研究并比较在多西他赛与4-臂-PEG20K-BA-多西他赛之间的多西他赛末端处置模式，对于来自大鼠(实例14)以及狗(实例15以及在一个另外的研究中)的数据应用了群体药代动力学方法。这允许在单个动物内存在不完全数据时对于每个治疗组来评估群体λz值以及对应的半衰期值。确切地说，使用程序Monolix对来自一个治疗组内的所有动物以及所有治疗组的数据与非线性混合效应药代动力学模型进行拟合。多西他赛或4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药后的血浆多西他赛浓度、以及4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药后的血浆4-臂-PEG20K-BA-多西他赛浓度与一个模型进行拟合，该模型指定了在一个定义的输注时期内剂量的零阶输入以及双指数处置(Monolix PK Model 26)。4-臂-PEG20K-BA-多西他赛后的多西他赛浓度-时间数据与一个模型进行拟合，该模型具有一阶输入(用以反映4-臂-PEG20K-BA-多西他赛到活性的多西他赛代谢产物的新陈代谢)以及双指数处置(Monolix PK Model 31)。对这项研究有意义的参数是群体末端处置速率常数λz，用以补充以上描述的结果。
A.斯普拉-道来大鼠中多西他赛的群体建模结果
将多西他赛或4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药后的大鼠中的血浆多西他赛浓度-时间曲线与对应的模型进行很好地拟合。有可能获得对于所有4个治疗组的λz的群体评估。这些结果显示，在给予所有剂量的4-臂-PEG20K-BA-多西他赛之后在最终处置阶段中的多西他赛浓度比给予多西他赛后的那些值更加得以持续。
在将多西他赛以及4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药于大鼠之后对多西他赛的群体平均的(SE)λz评估结果分别是0.0174(0.0018)hr-1和0.00412(0.001)hr-1，其中对应的t1/2λz值是40和168小时。
B.小猎狗中多西他赛的群体建模结果
将多西他赛或4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药后的狗中血浆多西他赛浓度-时间曲线与对应的模型进行很好地拟合。有可能获得对于所有4个治疗组的λz的群体评估。这种建模支持了：在给予所有剂量的4-臂-PEG20K-BA-多西他赛之后在最终处置阶段中的多西他赛浓度要比给予多西他赛后的那些更加得以持续，这与在大鼠中观察到的趋势是一致的。
在将多西他赛以及4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药于狗之后对于多西他赛的群体平均(的SE)λz评估结果分别是0.0276(0.0022)hr-1和0.00349(0.0021)hr-1，其中对应的t1/2λz值是25和199小时。
在该另外的研究中，狗在第1天和第22天接受了7mg/kg剂量的4-臂-PEG20K-BA-多西他赛，其中每次给药后进行系列的血液采集用于确定血浆的4-臂-PEG20K-BA-多西他赛以及多西他赛浓度。
在将4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药于狗之后对于4-臂-PEG20K-BA-多西他赛以及多西他赛的群体平均的(SE)λz评估结果分别是0.0141(0.00041)hr-1和0.00627(0.00086)hr-1，其中对应的t1/2λz值是49和110小时。
当在多个研究内并且跨研究进行比较时，群体平均的λz评估结果显示，4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药后的血浆多西他赛浓度相对于多西他赛给药后是持续不变的，不依赖于物种以及剂量。
表7
跨越物种和研究的多西他赛群体平均λz评估结果以及对应的t1/2λz值的概括
Figure BDA0000050623270000961
＊偶联物＝4-臂-PEG20K-BA-多西他赛
在大鼠以及狗中4-臂-PEG20K-BA-多西他赛后的多西他赛t1/2λz的值要比多西他赛后的那些大4至8倍，从而提供了长时间的多西他赛半衰期以及延长的暴露这些所希望特征的证据。
实例17
皮下植入了H460 NSCLC肿瘤片段的雌性无胸腺小鼠中4-臂 -PEG 20K -BA-多西他赛的药代动力学研究
这一研究的目的是比较在携带H460 NSCLC肿瘤的雌性无胸腺小鼠的血浆和肿瘤组织中4-臂-PEG20K-BA-多西他赛与多西他赛过后的多西他赛药代动力学并且确定对全血计数的影响。这个实例概述了药代动力学的结果。
H460肿瘤细胞是在体外生长的并且皮下植入雌性HRLN裸小鼠中。当肿瘤大小达到172与288mg之间时，以10mL/kg的剂量体积通过静脉内弹丸注射给予动物25mg/kg的多西他赛或33mg/kg的4-臂-PEG20K-BA-多西他赛。这些剂量水平对应于在这种肿瘤模型中按q7dx3的方案给予多西他赛以及4-臂-PEG20K-BA-多西他赛的最大耐受剂量。在IV注射后从0至7天收集血液以及肿瘤样品(n＝7时间点，其中n＝3/时间点)。对于多西他赛以及4-臂-PEG20K-BA-多西他赛进行血浆以及肿瘤样品分析。
两个4-臂-PEG20K-BA-多西他赛批量都产生了相当的血浆以及肿瘤的药物浓度时间曲线。4-臂-PEG20K-BA-多西他赛散布到该肿瘤组织中并保留在其中，从而导致了在给药后168hr时肿瘤与血浆的比率为大约7。
血浆多西他赛浓度在多西他赛给药后72hr时落在定量限值(1ng/mL)以下，而对于4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药后长达168hr时它们保持在5ng/mL以上。这些结果证实了在第三个动物种类中4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药后持续的全身性暴露于多西他赛中。两个批量的4-臂-PEG20K-BA-多西他赛均产生了相当的血浆以及肿瘤多西他赛浓度时间曲线。
血浆以及肿瘤的4-臂-PEG20K-BA-多西他赛以及多西他赛暴露数据概述在表8中。
表8
向携带H460的裸小鼠给予25mg/kg多西他赛和33mg/kg 4-臂-PEG20K-BA-多西他赛后的血浆及肿瘤暴露
Figure BDA0000050623270000981
＊偶联物＝4-臂-PEG20K-BA-多西他赛
血浆的4-臂-PEG20K-BA-多西他赛Cmax在给药后0.5hr(第一个测量时间点)内达到。肿瘤Cmax在给药后4hr内达到。与血浆相比，肿瘤中的4-臂-PEG20K-BA-多西他赛Cmax要低17倍并且AUC低约2倍。
血浆的多西他赛Cmax在给药后0.5小时(第一个测量时间点)内达到，不依赖于治疗。肿瘤的多西他赛Cmax在多西他赛给药后4小时内并且在4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药后12小时内达到。4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药后血浆的多西他赛Cmax降低了约14倍，但是4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药之后持续的血浆药物浓度对两种治疗均产生了在4-臂-PEG20K-BA-多西他赛后相似的平均多西他赛AUC值。多西他赛以及4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药后肿瘤中多西他赛浓度的降低速度看上去是相似的，尽管4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药后肿瘤多西他赛浓度在从给药后24小时至采样结束的这个时间段内要高大约5倍，表明了更大且持续的肿瘤的多西他赛暴露。
在4-臂-PEG20K-BA-多西他赛给药后这种更大的且持续的肿瘤的多西他赛暴露与对于4-臂-PEG20K-BA-多西他赛对比多西他赛(122对比48％)而言的显著更长的H460肿瘤生长延迟相关。
这个研究提供了证据，即4-臂-PEG20K-BA-多西他赛优异的抗肿瘤活性是通过增加的且持续不变的肿瘤的多西他赛暴露而促成的。
实例18
4-臂-PEG 20K -BA-多西他赛在小鼠、大鼠、狗以及人的血浆中的稳定性
这个研究的目的是评估4-臂-PEG20K-BA-多西他赛在小鼠、大鼠、狗以及人的血浆中的稳定性。
将4-臂-PEG20K-BA-多西他赛(50μg/mL；60μM)刺入肝素化的组合的雄性小鼠、大鼠以及狗的血浆；混合性别组合的人血浆；以及磷酸盐缓冲盐水中。将三份样品在37℃孵育0、15、30、60、120以及240分钟。在每个时间点移出多个等分部分并使用验证过的狗血浆分析方法进行分析以便得到4-臂-PEG20K-BA-多西他赛的消失以及多西他赛的出现。
表9概述了在240分钟孵育期结束时4-臂-PEG20K-BA-多西他赛的消失以及多西他赛的出现。
表9
用缓冲液、小鼠、大鼠、狗以及人血浆孵育后4-臂-PEG20K-BA-多西他赛的血浆稳定性
Figure BDA0000050623270001001
1平均的(n＝3)，表示为起始偶联物浓度的百分比
2平均的(n＝3)，表示为总的多西他赛含量的百分比
＊偶联物＝4-臂-PEG20K-BA-多西他赛
孵育4小时之后在来自所有4个物种的血浆中检测了从4-臂-PEG20K-BA-多西他赛中的多西他赛释放量。在小鼠和大鼠血浆中释放的多西他赛百分比是20％，但是在狗(3％)以及人的血浆(4％)中是显著更小的且相似的。这个发现与以下报道是一致的：啮齿动物比非啮齿的物种具有更多的带有更大酯酶活性的酯酶(Williams F.M.，Clin.Pharmacokin et.1985：10：392-403，Kaliste-Korhonen E，et al.，Human&Experimental Toxicology 1996：15：972-978，Li，B.，et al.，Biochem.Pharmacol 2005：70：1673-1684)，并且啮齿动物典型地以更大的速率并且在更大程度上代谢含有酯的药物以及药物前体(Li，B.，et al.，Biochem.Pharmacol 2005：70：1673-1684；Cook C.S.，et al.，Pharm.Res.1995：12：1158-1164；Quon C.Y.，et al.，Drug Metabolism and Disposition 1988：16：425-428；Minagawa T，et al.，Biochem.Pharmacol.1995：49：1361-1365；Ericsson H.，et al.，Eur.J.Pharm.Sci.1999：8：29-37)。这一研究的结果与以下报道是一致的：啮齿动物对含有酯的药物以及药物前体的代谢并不必然代表或预测了人类的代谢。
在小鼠、大鼠、狗以及人类血浆中孵育之后，从4-臂-PEG20K-BA-多西他赛中释放了多西他赛。多西他赛的释放在啮齿动物血浆中比在非啮齿动物的血浆中是显著更快的，表明作为4-臂-PEG20K-BA-多西他赛的人类代谢的预示者，啮齿动物不及狗可靠。
实例19
示例性的多臂聚合物烷酸酯连接的多西他赛偶联物的剂量升级研究
进行这一研究是为了研究聚合物大小以及连接物身份对偶联物毒性的影响。对实例12中描述的多西他赛偶联物进行研究来确定它们按单一剂量被给予斯普拉-道来大鼠时的最大耐受剂量(MTD)。
将健康的大鼠随机地分成十八个组，每组五只雄性鼠以及5只雌性鼠。这些动物的体重变化不超过平均体重的±10％。在给药之前，将每个试验物品溶解在无菌水中的5％的葡萄糖溶液中用于注射。这些物品各自按单一的静脉内弹丸注射给有知觉的大鼠服用。剂量体积保持在2mL/kg体重。
首先向5只雄性鼠以及5只雌性鼠的多个组给予对所有试剂而言12.5mg/kg(多西他赛当量)的剂量。如果在给药后48小时死亡率为10％或更低，则将20mg/kg剂量的试验试剂给予接下来的具有5只雄性鼠以及5只雌性鼠的多个组。如果来自这一12.5mg/kg剂量的死亡率是大于10％，则在后面改变该第二剂量。基于最先两个剂量的结果来给予第三剂量并且根据获得的死亡率结果相应地进行调整。
在给药后15分钟、30分钟、1、2、3、以及4小时进行临床观察并且在给予试验物品当日进行一次午后观察。在剩余的14天观察期，继续以每天两次进行观察，一次在早上并且一次在下午。
在每个剂量水平进行14天观察之后确定总的死亡率。结果见下表10。如上所指出的，将给药的前48小时内的死亡率用来升级到下一个更高剂量。死亡之前的临床体征包括降低的自发活动、共济失调步态、多尿(polyurea)、腹泻以及消瘦。
表10
Figure BDA0000050623270001011
Figure BDA0000050623270001021
参看这些结果，可以看到对于丁酸酯连接的偶联物，初步的毒性数据表明在大鼠中基于聚合物分子量的毒性相对顺序是：10K＜20K＜30K＜40K。在一个聚合物分子量(即，20K的恒定的聚合物大小)上将针对连接物结构的数据进行对比(仅仅基于大鼠的数据)，看起来MPA的毒性的相对顺序与OA＜BA＜HA是大约相同的。
已经关于具体的示例性实施方案对在此列出的这个或这些发明进行了说明。然而，以上说明并非旨在将本发明限制于这些示例性实施方案，并且这些技术人员应该认识到可以在以上说明书所描述的本发明的精神和范围内做出多种改变。

Claims (44)

1.一种多臂聚合物偶联物，具有以下结构，
其中：
R是包括从约3至约150个碳原子的一个有机核心基团；
Q是一个连接物；
POLY1是一个水溶性的且非肽的聚合物区段；
X是一个任选的间隔物；
R1，每次出现时独立地选自下组，其构成为：H、低级烷基、以及一个吸电子基团；
n是从1至7的一个整数；
D是具有小于约800道尔顿分子量的一个小分子的残基；并且
q是3或更大。
2.如权利要求1所述的多臂聚合物偶联物，其中D是一种抗癌剂。
3.如权利要求1或2所述的多臂聚合物偶联物，其中R具有从约3至约25个碳原子。
4.如权利要求3所述的多臂聚合物偶联物，其中R是直链的或环状的。
5.如权利要求1-4中任一项所述的多臂聚合物偶联物，其中R在与Q作为整体时是多元醇、聚硫醇、或聚胺的一个残基。
6.如权利要求5所述的多臂聚合物偶联物，其中在“q”个臂上R在与Q作为整体时是甘油、三羟甲基丙烷、季戊四醇、山梨糖醇、或甘油低聚物的一个残基。
7.如权利要求1所述的多臂聚合物偶联物，其中Q是水解稳定的。
8.如权利要求7所述的多臂聚合物偶联物，其中Q包含从约1至约10个原子。
9.如权利要求7或8所述的多臂聚合物偶联物，其中Q选自下组，其构成为：-O-、-S-、-NH-、和-NH-C(O)。
10.如权利要求1-9中任一项所述的多臂聚合物偶联物，其中POLY1是选自下组的一种聚合物，该组的构成为：聚(亚烷基二醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡硌烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸羟烷酯)、聚(糖)、聚(α-羟酸)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(N-丙烯酰吗啉)、以及它们的共聚物或三聚物。
11.如权利要求10所述的多臂聚合物偶联物，其中POLY1是一种聚乙二醇。
12.如权利要求11所述的多臂聚合物偶联物，其中POLY1是直链的。
13.如权利要求1至12中任一项所述的多臂聚合物偶联物，其中POLY1的重均分子量范围是从约200至约30,000道尔顿。
14.如权利要求1-13中任一项所述的多臂聚合物偶联物，其中该偶联物的重均分子量是约20,000道尔顿或更大。
15.如权利要求1-14中任一项所述的多臂聚合物偶联物，其中X具有从约1个原子至约50个原子的原子长度。
16.如权利要求15所述的多臂聚合物偶联物，其中X具有从约1个原子至约25个原子的原子长度。
17.如权利要求15所述的多臂聚合物偶联物，其中X是-O-。
18.如以上权利要求中任一项所述的多臂聚合物偶联物，其中q的值是选自下组，其构成为：3、4、5、6、7、8、9、以及10。
19.如以上权利要求中任一项所述的多臂聚合物偶联物，其中所述“q”个聚合物臂(-Q-POLY1-X-(CH2)2-(CHR1)nC(O)OD)中的每一个是相同的。
20.如以上权利要求中任一项所述的多臂聚合物偶联物，其中D是紫杉烷或喜树碱的一个残基。
21.如权利要求20所述的多臂聚合物偶联物，其中D是紫杉醇或多西他赛的一个残基。
22.如权利要求21所述的偶联物，其中D具有以下结构：
Figure FDA0000050623260000031
23.如权利要求22所述的偶联物，其中q是3或4。
24.如权利要求21所述的多臂聚合物偶联物，具有以下结构：
Figure FDA0000050623260000041
其中n的范围是从大约40至大约500。
25.如权利要求24所述的多臂聚合物偶联物，其中总体的标称的平均分子量范围是从约10,000至约80,000。
26.如权利要求1-23中任一项所述的多臂聚合物偶联物，其中R1是选自甲基、乙基、丙基、正丁基、异丙基以及异丁基。
27.如权利要求1-23中任一项所述的多臂聚合物偶联物，其中R1是选自一种卤化物、一种腈、-NO2、和-CF3。
28.一种药用组合物，包括以上权利要求中任一项所叙述的一种多臂聚合物偶联物以及一种药学上可接受的载体。
29.一种药用组合物，包括如权利要求24所述的多臂聚合物偶联物以及一种药学上可接受的载体。
30.如权利要求29所述的一种组合物，其中当在一种合适的动物模型中对于实体瘤类型的癌症进行评估并且以一个治疗上有效的量值来给药时，所述组合物有效地将肿瘤生长抑制到以下程度：是对于以一个等效量值给药的未改性抗癌剂所观察到的结果的至少2倍，该结果是在给药后34天的实体瘤体积(mm3)的基础上进行评估的。
31.如权利要求30所述的组合物，其中所述动物模型是对于人类前列腺癌的一种小鼠D-145异种移植模型。
32.如权利要求29所述的组合物，其中当在大鼠的单一剂量研究中进行评估时，该组合物与多西他赛相比时表现出了3倍或更大的毒性减小。
33.一种将多臂聚合物偶联物投递给对其有需要的哺乳动物受试者的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物受试者一个治疗上有效量值的如权利要求1至27中任一项所述的偶联物。
34.一种用于治疗哺乳动物受试者的癌症的方法，所述方法包括：
将一个治疗上有效量值的权利要求1-27中任一项所述的一种偶联物在一个持续时间内给予被诊断为具有一个或多个癌性实体瘤的受试者，该持续时间将在所述受试者中有效地产生对所述一个或多个实体瘤生长的抑制。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述癌性实体瘤类型是选自下组，其构成为：结肠直肠的、乳腺的、前列腺的以及非小细胞肺的。
36.一种用于治疗哺乳动物受试者的对于用多西他赛进行治疗有反应的一种病症的方法，所述方法包括向所述受试者给予一个治疗上有效量值的如权利要求24所述的偶联物。
37.如权利要求29所述的组合物，其中所述偶联物的特征在于大于或等于92％的载药量。
38.一种多臂聚合物偶联物，具有以下结构：
Figure FDA0000050623260000061
其中n的范围是从大约40至大约500。
39.如权利要求38所述的多臂聚合物偶联物，其中该偶联物的重均分子量是约20,000道尔顿。
40.在一种具有以下结构的多臂聚合物偶联物中，
R(-Q-POLY1-Y-D)q
I
其中：
R是具有从约3至约150个碳原子的一个有机核心基团；
Q是一个连接物；
POLY1是一种水溶性的且非肽的聚合物；
Y是包括一个可水解的连接的一个间隔物，这样当所述可水解的连接进行水解时，D被释放；
D是一个小分子；并且
q是大于或等于3，
该改进包括具有以下结构的Y，
Figure FDA0000050623260000062
其中：
X是一个选择的间隔物
R1每次出现时独立地选自下组，其构成为：H、低级烷基、或一个吸电子基团；并且
n是从1至5的一个整数。
41.一种多臂聚合物偶联物，具有以下结构，
Figure FDA0000050623260000071
其中：
R是包括从约3至约150个碳原子的一个有机核心基团；
Q是一个连接物；
POLY1是一个水溶性的并且非肽的聚合物区段；
X是一个间隔物；
R1每次出现时独立地选自下组，其构成为：H、低级烷基、或一个吸电子基团；
n是从1至7的一个整数；
q是3或更大；
W是选自下组，其构成为：D、H以及一种活化的酯，其中D是具有小于约800道尔顿分子量的一个小分子的残基，并且在处于0.92(q)或更大的一个值时W是等于D。
42.一种制备多臂聚合物药物偶联物的方法，所述方法包括：
使具有“q”个各自在其末端具有一个反应性羧酸基团或活化、酯等效物的聚合物臂的一种多臂的水溶性聚合物试剂、与“q”当量或更多的一种小分子药物的一种空间受阻的伯醇或叔醇、在有效地导致所述小分子药物通过一个酯连接而轭合到所述多臂水溶性聚合物试剂上的条件下进行反应，以形成一种多臂水溶性聚合物药物偶联物，其中所述聚合物臂的92％或更多具有共价地附接至其上的小分子药物，其中所述偶联物在所述聚合物臂的每一个中具有与所述酯连接相邻的一个连接物，所述连接物缺少一种官能团，该官能团能够与所述酯羰基进行一种邻基相互作用而形成能够替换所述小分子药物的一种五或六元的环状产物。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述连接物是具有结构-(CH2)1或2(CR1H)nC(O)-O-的一种烷酸酯连接物，其中R1每次出现时独立地选自：H、低级烷基、或一个吸电子基团，并且n是从1至7的一个整数。
44.如权利要求42或43所述的方法，其中，在进行所述反应之前，所述连接物是共价地附接到所述药物上或所述聚合物臂的每一个上的。
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