CN108727583B

CN108727583B - 多臂靶向抗癌偶联物

Info

Publication number: CN108727583B
Application number: CN201710263114.9A
Authority: CN
Inventors: 袁建栋; 黄仰青; 宋云松; 丁海峰
Original assignee: Gaoruiyaoye Beijing Technology Co ltd
Current assignee: GLORYPHARM CO., LTD.
Priority date: 2017-04-21
Filing date: 2017-04-21
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2037-04-21
Also published as: CN108727583A

Abstract

本发明公开了具有如下结构式(Ⅰ)的多支链药物偶联物或其药学上可接受的盐：

R为有机中心，POLY为聚合物，L为多价接头，T为靶向分子，D为活性剂，q为3‑8之间的任一整数，其中L为：

Description

多臂靶向抗癌偶联物

技术领域

本发明涉及多臂聚合物修饰的靶向抗癌偶联物，更具体地说，本发明涉及将靶向分子通过多臂聚合物与抗癌药物连接成偶联物。

背景技术

多年来，已经提出了用于改进生物活性剂的稳定性和递送的多种方法。与药用试剂的配制以及投递相关联的挑战可以包括：该药用试剂的差的水溶性、毒性、低的生物利用率、不稳定性、以及迅速的体内降解。尽管已经设计了许多办法来改进药用试剂的递送，但是没有一种单独的方法是没有其缺点的。例如，通常采用的药物递送方法的目标在于解决或至少改善一个或多个以下问题，包括如在一种脂质体、聚合物基质、或单分子胶束中的药物胶囊化、共价附接至一种水溶性聚合物如聚乙二醇上、基因靶向剂的使用、盐类的结构、等等。

WO2005028539、WO2010019233、WO2011063156、WO2011063158公开了一种处于临床三期的药物nktr 102，该药物主要用于转移性乳腺癌，由Nektar Therapeutics研发。该药物是一种水溶性的多支链聚合物药物前体，以提高药物的负载，结构如下：

该化合物是使用多臂PEG与伊立替康连接，以提高水溶性，增加载药量，在抗癌作用不变的情况下，降低副作用。但该药物仍具有缺点，比如，靶向性较差，不能作用于特定的癌细胞，在杀死癌细胞的同时，也会影响正常细胞的性能，而使不良反应发生率仍然比较高。

发明内容

本发明公开了一种全新的具有靶向性的多支链药物偶联物，该偶联物具有三个或更多的支链，该偶联物可表示为下式：

R为有机中心，POLY为聚合物，L为多价接头，T为靶向分子，D为活性剂，q为3-8之间的任一整数，其中L为：

符号“*”代表多价接头L与靶向分子T的连接点，“#”代表多价接头L与活性剂D的连接点，“％”代表多价接头L与POLY的连接点，其中，l为2-20之间的任一整数，m、n分别为0-10之间的任一整数；

D为如式(Ⅱ)所示的喜树碱类药物：

R₁-R₅相互独立地选自于以下基团：氢、卤素、酰基、烷基、取代烷基、烷氧基、取代烷氧基、烯基、炔基、环烷基、羟基、氰基、硝基、叠氮基、酰胺基、肼、胺基、取代胺基、羟基羰基、烷氧羰基、烷氧羰氧基、氨基甲酰氧基、芳基磺酰氧基、烷基磺酰氧基；R₆为H或OR₈，R₈为烷基、烯基、环烷基、卤代烷基或羟烷基；R₇为羟基、氨基、或硫醇。

POLY为聚合物，L为多价接头，T为靶向分子，D为活性剂，四者共同构成该多支链药物偶联物的“支链”。该多支链药物偶联物的每一个支链和其他的支链是相互独立的。每一个支链从有机中心“R”发出。然而，一般来说，该偶联物的每个支链都是相同的。

现在详细地描述结构式(Ⅰ)中的每一个变量部分。

有机中心，“R”

在结构式(Ⅰ)中，“R”是一个1-100个原子的有机核心基团。比较好地是，R含有3-50个原子，更好地是，R含有大约3-30个原子。R可以为全部为碳原子的核心，也可选择性的含有1个或多个杂原子，例如，O、S、N、P等，依赖于所使用的特殊中心分子。R可以是直链、支链或环状的，发出至少3个独立的聚合物支链。结构式(Ⅰ)中，“q”与从“R”发出的聚合物支链的数量相对应。

有机中心“R”，是从一个分子衍生而来的，该分子提供许多聚合物连接的位置，近似等于聚合物支链的数量。更好地是，多链聚合物结构的主要中心分子式至少带有适合作为聚合物支链的3个及3个以上的羟基、硫基或氨基的多羟基化合物、多硫化合物或多胺化合物的残基。一个“多羟基化合物”是一个由多个(大于2个)可利用的羟基基团组成的分子。一个“多硫化合物”是一个由多个(大于2个)可利用的硫基基团组成的分子。一个“多胺化合物”是一个由多个(大于2个)可利用的胺基基团组成的分子。依据聚合物支链的数量，多羟基化合物、多胺化合物或多硫化合物的母体(在POLY共价键结合前)典型地包括3-25个羟基、硫基或氨基，较好的是3-10个羟基、硫基或氨基，最好是包括从3到大约8个(如3、4、5、6、7或8)适合与POLY共价键结合的羟基、硫基或氨基。

多羟基化合物或多胺化合物中心的母体在和聚合物作用之前典型地有一个结构式R-(OH)p或者R-(NH₂)p。在结构式(Ⅰ)中，p值和q值是相对应的，因为在母体有机分子中的每一个功能性基团，典型地有-OH和-NH₂，如果位置易受影响或易发生反应，它们就和聚合物支链的POLY共价键结合。结构式(Ⅰ)中，与POLY连接后，R母体的多羟基化合物的羟基都已经转换成了一个聚合物支链，所描述的R为连接后的残基。例如，如果有机中心分子是从季戊四醇衍生得来的，多羟基化合物的母体拥有结构式C(CH₂OH)₄，有机中心基R表示为：

优选的作为聚合物中心的说明性多羟基化合物包括含有1到10个碳原子和1到10个羟基基团的脂肪族多羟基化合物，例如，乙烯乙二醇、烷二醇、烃基乙二醇、亚烷基烃基二醇、烃基环烷基二醇、1,5-萘烷二醇、4,8-二(羟甲基)三环癸烷、环亚烷基二醇、二羟基烷烃、三羟基烷烃、四羟基烷烃等。环脂肪族多羟基化合物包括直链的或者闭环糖类和糖醇，如甘露醇、山梨糖醇、纤维醇、木糖醇、白雀醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、赤藻糖醇、己六醇、核糖、树胶醛糖、木糖、来苏糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、山梨糖、甘露糖、吡喃糖、阿卓糖、塔罗糖、塔格糖、吡喃糖苷、蔗糖、乳糖、麦芽糖等。也可采用芳香族多羟基化合物，如苯磷二酚、烃基苯磷二酚、焦酚、氟代甘氨酸酚、1,2,4-苯三酚、间苯二酚、烃基间苯二酚、二烃基间苯二酚、苔黑酚一水合物、橄榄酚、对苯二酚、烃基对苯二酚、苯基对苯二酚等。其他可能采用的多羟基化合物中心可能包括冠醚、环式糊精、糊精或其它碳水化合物。

在结构式(Ⅰ)中，q为对应“R”上连接的聚合物支链的个数，具体的数字可以为3～20。典型的，“q”的具体数字为3、4、5、6、7、8。具体来讲，以“R”为中心发出三、四、五、六、七、八个聚合物支链。

在一些具体的方案中，“R”具有三个聚合物支链，“R”优选为：

在一些具体的方案中，“R”具有四个聚合物支链，“R”优选为：

在一些具体的方案中，“R”具有六个聚合物支链，“R”优选为：

在一些具体的方案中，“R”具有八个聚合物支链，“R”优选为：

聚合物，“POLY”

在结构式(Ⅰ)中，“POLY”为聚合物，每一个聚合物支链中的POLY是独立地选择出来的，较好的，每一个聚合物是相同的聚合物，更适宜地，每一个结构式(Ⅰ)中的聚合物支链是相同的。优选的聚合物为水溶性的，任意的水溶性聚合物可以用于形成本发明的偶联物，本发明所指聚合物可以是任意几何形态或形式的。代表性的聚合物包括但并不限于：聚乙二醇、聚丙二醇、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酸胺)、聚(羟烷基甲基丙烯酸盐)、聚(糖类)、聚(±-羟基酸)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯乙酸)、聚膦嗪、聚唑啉、聚(N-丙烯酰吗啉)等。

在典型的化合物中，“POLY”为聚乙二醇(PEG)，可为任意几何形态或形式，包括直链、支链、叉形链等，在此使用的“聚乙二醇”，意思是涵盖任何水溶性聚(氧化乙烯)。典型地，用于本发明中的PEG将包括二个以下结构的一种：“(CH₂CH₂O)_k-”或“(CH₂CH₂O)_k-CH₂CH₂-”，取决于一个或多个末端氧是否已经例如在一个合成转化期间被置换。变量k范围是从5至约500，并且这些末端基团以及总体PEG的结构可以改变。所述的聚乙二醇结构通常还含有部分末端部分残基，类似于POLY的终端基团，可以为H、NH₂、OH、CO₂H、C_1-6烷基(例如，甲基、乙基、丙基)、C_1-6烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基)、酰基或芳基来结束。

本发明优选的“POLY”为直线型的聚乙二醇，典型的结构为：

代表原子的连接处，标“&”号的氧原子为与有机中心“R”连接的原子。其中k的取值范围为大约5～500，最好为50～200，r为1-10之间的任一整数，更优选的，本发明“POLY”为：

本发明POLY还可为：

等。

本发明所指的活性剂“D”为喜树碱类抗癌剂，喜树碱类药物是用于临床的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂，在高活性的同时，具有水溶性差、对正常机体组织毒副作用大等缺点，极大的限制了喜树碱类抗癌剂的临床应用。

D结构中的R₇为与多价接头L共价连接的基团，如羟基、氨基、或硫醇，优选为羟基。活性剂D连接到多价接头L时，应没有重大的生物活性损失。

本发明活性剂优选伊立替康、SN-38、10-羟基喜树碱、鲁比替康。

其中，伊立替康结构如下：

SN-38的结构如下：

10-羟基喜树碱的结构如下：

鲁比替康的结构如下：

本发明中，“T”为靶向分子，具有或不具有药用作用，该靶向分子的作用是增加靶向性，使得该偶联物在目标组织的浓度更高，提高生理活性或药用作用。“T”可为单功能的靶向分子，也可为多功能的靶向分子，在一些可选择的方案中，“T”还可为两个或两个以上靶向分子组成的靶向部分。在一些具体的方案中，“T”可为含有“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”序列的RGD肽，RGD肽是整合素与其配体蛋白相互作用的识别位点。优选的RGD肽包括iRGD和cRGD等。

iRGD结构如下：

cRGD是一系列化合物，典型的化合物包括：

等。

优选的cRGD为：

其他优选的靶向分子包括tLyp-1、Lyp-1、RPARPAR。

tLyp-1的结构如下：

Lyp-1的结构如下：

RPARPAR的多肽序列为精氨酸-脯氨酸-丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-丙氨酸-精氨酸，其结构如下：

本发明所指的活性剂“D”指的是非改性母体活性剂的一部分或由药物与本发明的多价接头共价连接所产生的共价链(或者是它的活化的或化学改性的形式)之前的未改性母体活性剂的残基。活性剂部分与多价接头之间的连接基水解或酶解时，活性剂本身就得到释放。

根据本发明的目的，术语“残基”应该理解为化合物的一部分，它是指经历了与另一个化合物取代反应后的剩余物。

本发明偶联物进入生物体内，到达靶细胞或靶组织时，活性剂D与多价接头L断裂，活性剂D以它未经改进，即未形成共价键的形式被释放出来，与母体分离，发挥生理活性。

本发明优选的方案中，“POLY”为线状的聚乙二醇连接臂，即本发明偶联物包括以下几种类型的化合物：

四臂：

三臂：

八臂：

其中k的取值范围为大约5～500，最好为50～200，r为1-10之间的任一整数。

本发明优选式(Ⅲ)化合物，在式(Ⅲ)的基础上，k优选113。本领域技术人员应该知晓，在高分子领域，k代表所述的聚合物的聚合度，并取决于所述的聚合物的分子量，并不是绝对的数值，当k取值113时，是指平均值为113。

在更优选的方案中，本发明偶联物的靶向部分“T”选自iRGD、cRGD、tLyp-1、Lyp-1、RPARPAR中的一种，活性剂“D”选自伊立替康、SN-38、10-羟基喜树碱、鲁比替康中的一种。

在更优选的方案中，L选自：

中的一种。

基于式(Ⅲ)，在一些具体的方案中，本发明化合物如下：

化合物a：D为伊立替康，T为cRGD

更具体地，化合物a也可写做如下形式：

化合物A为化合物a的药用盐酸盐：

化合物b：D为伊立替康，T为iRGD

化合物B为化合物b的药用盐酸盐：

化合物c：D为伊立替康，T为tLyP-1

化合物C为化合物c的药用盐酸盐：

化合物d：D为伊立替康，T为RPARPAR

化合物D为化合物d的药用盐酸盐

在这里需要说明的是，成盐时，是本发明偶联物的支链和HCl分别成盐，例如化合物A，每个支链上带有2分子HCl，整个分子将带有8HCl，化合物B、化合物C、化合物D同理。

根据本发明的发明精神，除以上公开的具体化合物外，本领域技术人员还能根据本发明所述的技术方案和制备方法，制备出更多偶联物，例如：

①D为SN-38，T分别为iRGD、cRGD、tLyp-1、Lyp-1或RPARPAR的偶联物；

②D为10-羟基喜树碱，T分别为iRGD、cRGD、tLyp-1、Lyp-1或RPARPAR的偶联物；

③D为鲁比替康，T分别为iRGD、cRGD、tLyp-1、Lyp-1或RPARPAR的偶联物。

本发明偶联物是典型的药物前体，通过水解作用或酶解作用，活性剂D被释放出来，与母体分离，发挥生理活性。

本发明偶联物呈现出高载荷能力，这样就可以降低总剂量来治疗一种特殊的疾病，例如癌症等。也就是说，本发明偶联物活性剂载体能够有效地和多种活性剂分子以共价键结合，允许每一定的偶联物量可以服用更多量的治疗剂型(也就是活性剂部分)。本发明偶联物通过水溶性聚合物的修饰，本质上是偶联物也是亲水的，特别是活性剂为水难溶药物时，提高偶联物的生物利用度。

相比未偶联的药物，本发明偶联物能够表现出更强的作用，在人体或其他动物体内组织更加富集。

本发明中偶联物药物前体含有许多独特的性质，尤其是在活性剂为一个抗癌化合物的情况下。这种药物前体能以较高效率来抑制肿瘤的生长。我们使用的这种小分子是一种已知具有抗癌特性的小分子。然而，通过如上所述与多支链聚合物结合，其疗效和药物代谢动力学与该小分子(例如，抗癌化合物本身)相比，有了很大的改进。适合的实体肿瘤类型包括结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、脑胶质瘤及乳房、卵巢、结肠、肾、胆管、肺和脑的恶性肉瘤、癌和淋巴瘤。

综上，本发明为一个多臂聚合物修饰的靶向抗癌偶联物，其中，水溶性的聚合物修饰可增强该偶联物的水溶性，从而提高载药量；靶向分子增加靶向性，使得该偶联物在目标组织的浓度更高；L为任意的连接接头，其作用是首先将靶向分子与抗癌药物连接起来，再将“靶向分子、抗癌药物与聚合物臂连接起来，使得整个偶联物形成一个有机的整体。

本发明偶联物，药学上可接受的盐优选为盐酸盐，可用药物化学领域的常规手段成盐，还可为三氟乙酸盐、硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐等。

另一方面，本发明提供了所述偶联物的制备方法。在本发明偶联物制备过程中，POLY和有机中心R实际上组成了多臂聚合物，在本发明优选的实施例中，该多臂聚合物为多臂聚乙二醇，能够从商业可利用的原材料中获得，例如，可从北京键凯科技有限公司购得多种类型的四臂、三臂、八臂聚乙二醇衍生物。市售的这些多臂PEG可直接参与反应。

制备式(Ⅲ)偶联物时，优选使用的四臂聚乙二醇如下：

该优选的四臂聚乙二醇被称为4ARM-PEG20K-SCM，其分子量约为20kDa左右。同理，制备式(Ⅳ)和式(Ⅴ)偶联物时，使用的三臂和八臂聚乙二醇的分子量也优选为20kDa左右。

具体实施例

在下面将对本发明进行详细描述。然而，本发明可能具体体现为许多不同的形式，而且它不应该被局限于此处所描述的实施例中，提供这些实施例中的目的是使所披露内容更完整与全面。所用试剂和原料，除了提供制备方法的除外，其余均为市售，其中4ARM-PEG20K-SCM购自北京键凯科技有限公司

名词解释

DMF：N,N-二甲基甲酰胺

DCM：二氯甲烷

Boc-Gly-OH：

DMAP：4-二甲氨基吡啶

DCC：二环己基碳二亚胺

IPA：异丙醇

TFA：三氟乙酸

TBME：叔丁基甲醚

EA：乙酸乙酯

DME：乙二醇二甲醚

Fmoc-OSU：9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺碳酸酯

THF：四氢呋喃

H-Lys(Boc)-OBzl·HCl：

DIEA：N,N-二异丙基乙胺

DEPC：氰基磷酸二乙酯

DEA：三乙胺

Pbf：

HOBT：1-羟基苯并三唑

DIC：N,N-二异丙基碳二亚胺

TFE：三氟乙醇

DPPA：叠氮磷酸二苯酯

SPPS：固相有机合成

NMM：N-甲基吗啉

TIS：三异丙基硅烷

MTBE：叔丁基甲醚

实施例1

化合物2的制备

向250mL圆底烧瓶中加入3.50g化合物1(1.0eq)，52.5mlDMF，加热至60℃溶解，5-10min后减压蒸去DMF，加入300ml正庚烷减压蒸馏，重复三次，旋干后加入105mlDCM，1.08gBoc-Gly-OH(1.2eq)，63mg DMAP(0.1eq)，滴加1.59gDCC(1.5eq)溶于10mlDCM的溶液，20℃反应4小时，TLC监控反应完毕后，过滤，浓缩至剩余25％体积时加入120ml IPA，蒸去75％的溶剂，加入150ml正庚烷，室温搅拌1小时，过滤，正庚烷洗涤2次，干燥得淡黄色固体4.02g化合物2。

化合物3的制备

向100mL三口瓶中加入4.02g化合物2，50mlDCM，搅拌溶解后滴加11.6ml TFA，室温反应2h，TLC监控反应完毕后加入150ml乙腈，减压蒸馏120ml溶剂后倒入320mlTBME溶液中，搅拌30min，过滤，滤饼用TBME洗涤得4.00g淡黄色固体化合物3。

实施例2

化合物5的制备

向250mL三口瓶中加入6.9g化合物4，30ml EA，搅拌溶解后降温至0℃，加40ml0.3M的HCl/EA,保温反应2h，TLC监控反应完毕浓缩至干，得到化合物5，直接进行下一步反应。

化合物6的制备

将化合物5(1.0eq)用50ml纯化水溶解，加入3.96g碳酸氢钠(2.0eq),用50mlDME将5.30g Fmoc-OSU(1.0eq)溶解，加入到化合物5的反应瓶中，补加25mlTHF，室温搅拌2小时，TLC监控反应完毕后，蒸去有机溶剂，EA萃取杂质，水相用稀盐酸调节pH至3-4，EA萃取2次，合并有机相，水洗一次，饱和食盐水洗涤后无水硫酸钠干燥，浓缩得8.4g淡黄色油状物化合物6。

化合物7的制备

在100ml反应瓶中加入4.00g化合物6(1.0eq)、2.92g H-Lys(Boc)-OBzl·HCl、40mlDCM溶解，加入2.76gDIEA(3.0eq)，1.74g DEPC(1.5eq)，室温搅拌2小时，TLC监控反应完毕后，醋酸水溶液洗涤，碳酸氢钠溶液洗涤，水洗一次，饱和食盐水洗涤一次后无水硫酸钠干燥，浓缩得7.0g淡黄色油状物化合物7，不纯化直接进行下一步反应。(利用同样的方法制备化合物16)

化合物8的制备

用140ml 25％的DEA/DCM将7.0g化合物7溶解，室温搅拌6小时，TLC监控反应完毕后，浓缩至干，加入100ml，50mlEA，用稀盐酸将pH调节至3-4，分液，水相用EA萃取2次后浓缩至干，得3.5g淡黄色固体化合物8。(利用同样的方法制备化合物17)

实施例3

连有保护基的靶向分子cRGD(化合物11)的制备

化合物9的制备

利用2Cl-Trt Resin，Fmoc保护法，偶联试剂采用HOBT/DIC，DMF为反应溶剂，反应监控采用茚三酮检测，依次将下列保护氨基酸连接到树脂上：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OBzl)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)OH、脱除Fmoc，DMF洗涤、DCM洗涤、甲醇洗涤后干燥，加入裂解试剂：醋酸/TFE/DCM＝1/2/7，反应2小时，冰的MTBE沉淀、洗涤，干燥得类白色固体化合物9。

化合物10的制备

2L的三口烧瓶中加入14.0g化合物9(1.0eq)，加入1L DMF，降温至0℃，加入9.2g碳酸氢钠(8.0eq)，溶清后加入15.1g DPPA(4.0eq)，保温过夜，TLC反应完毕后倒入5L水中，EA萃取2次，水洗，饱和氯化钠洗涤后无水硫酸钠干燥，浓缩得类白色固体化合物10 11.5g

化合物11的制备

1L的氢化釜中加入11.5g化合物10，1L甲醇，2.5gPd/C，加氢过夜，TLC反应完毕后过滤，浓缩得灰色固体化合物11 11.0g

实施例4

连有保护基的靶向分子iRGD(化合物20)的制备

利用Fmoc-Sieber Resin，偶联试剂采用HOBT/DIC，DMF为反应溶剂，反应监控采用茚三酮检测法，依次将下列保护氨基酸连接到树脂上：Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Asp(Alloc)OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、DMF洗涤后加入三氟乙酸铊(2.0eq)搅拌18小时后DMF洗涤，脱除Fmoc，缩合Fmoc-Cys(Trt)-OH，DMF洗涤、脱除Fmoc，加入醋酐吡啶反应20min，DMF洗涤，加入3eq的Pd(PPh₃)₄的CHCl₃:AcOH:NMM(18:1:0.5)的溶液，反应2h，脱除Alloc，随后用氯仿(6*20ml)洗涤，20％HOAc的DCM溶液、DCM和DMF洗涤，加DMF洗涤、DCM洗涤、甲醇洗涤后干燥，加入1％TFA/DCM，反应2小时，冰的MTBE沉淀、洗涤，干燥得类白色固体化合物20。

实施例5

连有保护基的靶向分子tLyP-1(化合物30)的制备

利用2Cl-Trt Resin，偶联试剂采用HOBT/DIC，DMF为反应溶剂，反应监控采用茚三酮检测法，依次将下列保护氨基酸连接到树脂上：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-Cys(Trt)-OH，加入裂解试剂：醋酸/TFE/DCM＝1/2/7，反应2小时，冰的MTBE沉淀、洗涤，干燥得类白色固体化合物30。

实施例6

连有保护基的靶向分子RPARPAR(化合物40)的制备

利用2Cl-Trt Resin，偶联试剂采用HOBT/DIC，DMF为反应溶剂，反应监控采用茚三酮检测法，依次将下列保护氨基酸连接到树脂上：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Boc-Arg(Pbf)-OH加入裂解试剂：醋酸/TFE/DCM＝1/2/7，反应2小时，冰的MTBE沉淀、洗涤，干燥得类白色固体化合物40。

实施例7化合物a和化合物A的制备

化合物12的制备

5ml反应瓶中加入480mg化合物11(1.0eq)，380mg化合物8(1.1eq)，1ml DMF，203mgDIEA(3.0eq)，128mg DEPC(1.5eq)，室温反应2h，TLC反应完毕后倒入10mL水中，EA萃取2次，稀盐酸洗涤，碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠洗涤后无水硫酸钠干燥，浓缩得果冻状固体化合物12 0.8g，直接进行下一步反应。

化合物13的制备

200ml的氢化釜中加入0.8g化合物10，30ml甲醇，0.28gPd/C，加氢过夜，TLC反应完毕后过滤，浓缩得灰色固体化合物13 0.66g

化合物14的制备

100ml反应瓶中加入6.60g化合物13(1.0eq)，3.59g化合物3(1.05eq)，66ml DMF，1.16gDIEA(3.0eq)，1.10g DEPC(1.5eq)，室温反应2h，TLC反应完毕后倒入700ml TBME中，打浆后抽滤，固体用150DCM溶解后倒入1.5L TBME中，打浆抽滤，干燥灰色粉末化合物149.0g，直接进行下一步反应。

化合物15的制备

250ml反应瓶中，加入9.0g化合物14，裂解试剂92.5％TFA/2.5％水/2.5％TIS，室温搅拌2h，用冰的MTBE沉淀、离心、洗涤，粗品经反相HPLC纯化、冻干，得淡黄色絮状物5.0g化合物15。

化合物a的制备

反应瓶中加入2.3g化合物15(4.5eq)，6.0g 4ARM-PEG20K-SCM(1.0eq)，60ml DMF，0.27gTEA(9.0eq)，室温反应，HPLC监控反应无明显进展后，倒入1000ml TBME中，打浆、抽滤，干燥得类色粉末粗品a 7.6g，HPLC纯化后脱盐，浓缩除去有机溶剂，冻干得类白色粉末化合物a 3.4g。

化合物A的制备

得到化合物a的粉末粗品后，HPLC纯化后脱盐，浓缩除去有机溶剂，用稀盐酸调节pH＝5～6，冻干得黄绿色粉末化合物A3.4g。

MALDI-TOF检测分子量为25480.27。

实施例8化合物b和化合物B的制备

化合物21的制备

100ml反应瓶中加入5.00g化合物20(1.0eq)，2.36g化合物17(1.1eq)，50ml DMF，1.11g DIEA(3.0eq)，0.71g DEPC(1.5eq)，室温反应2h，TLC反应完毕后倒入300mL水中，EA萃取2次，醋酸水溶液洗涤，碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠洗涤后无水硫酸钠干燥，浓缩得淡黄色固体21 7.18g，直接进行下一步反应。

化合物22的制备

200ml的氢化釜中加入7.00g化合物21，120ml甲醇，0.35g Pd/C，加氢过夜，TLC反应完毕后过滤，浓缩得灰色固体化合物22 7.05g

化合物23的制备

100ml反应瓶中加入7.00g化合物22(1.0eq)，2.22g化合物3(1.05eq)，70ml DMF，1.10gDIEA(3.0eq)，0.70g DEPC(1.5eq)，室温反应2h，TLC反应完毕后倒入700ml TBME中，打浆后抽滤，固体用100DCM溶解后倒入1.0L TBME中，打浆抽滤，干燥得灰色粉末化合物238.60g，直接进行下一步反应。

化合物24的制备

8.60g化合物23加入200ml裂解试剂：醋酸/TFE/DCM＝1/2/7，反应2小时，冰的MTBE沉淀、洗涤，干燥得并HPLC纯化得2.10类白色固体24。

化合物25的制备

50ml反应瓶中加入1.23g化合物24(4.5eq)，2.00g 4ARM-PEG20K-SCM(1.0eq)，20ml DMF，0.09gTEA(9.0eq)，室温反应，HPLC监控反应无明显进展后，倒入400ml TBME中，打浆、抽滤，干燥得25 3.05g，直接进行下一步反应。

化合物b的制备

50ml反应瓶中，加入3.0g化合物25，30ml裂解试剂：92.5％TFA/2.5％水/2.5％TIS，室温搅拌2h，用冰的MTBE沉淀、离心、洗涤，粗品经反相HPLC纯化后脱盐，浓缩除去有机溶剂，冻干得类白色粉末化合物b 1.02g。

化合物B的制备

化合物b粗品经反相HPLC纯化后脱盐，浓缩除去有机溶剂，用稀盐酸调节pH＝5～6，冻干得黄绿色粉末化合物B 1.02g。

MALDI-TOF检测分子量为29013.19。

实施例9化合物c和化合物C的制备

化合物31的制备

100ml反应瓶中加入5.60g化合物30(1.0eq)，2.39g化合物17(1.1eq)，60ml DMF，1.03gDIEA(3.0eq)，0.65g DEPC(1.5eq)，室温反应2h，TLC反应完毕后倒入300mL水中，EA萃取2次，醋酸水溶液洗涤，碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠洗涤后无水硫酸钠干燥，浓缩得淡黄色固体化合物31 7.08g，直接进行下一步反应。

化合物32的制备

200ml的氢化釜中加入7.05g化合物31，150ml甲醇，0.35gPd/C，加氢过夜，TLC反应完毕后过滤，浓缩得灰色固体化合物32 6.95g。

化合物33的制备

100ml反应瓶中加入6.80g化合物32(1.0eq)，1.89g化合物3(1.05eq)，70ml DMF，0.94gDIEA(3.0eq)，0.59g DEPC(1.5eq)，室温反应2h，TLC反应完毕后倒入700ml TBME中，打浆后抽滤，固体用100DCM溶解后倒入1.0L TBME中，打浆抽滤，干燥得灰色粉末化合物338.20g，直接进行下一步反应。

化合物34的制备

8.20g化合物33加入160ml裂解试剂：醋酸/TFE/DCM＝1/2/7，反应2小时，冰的MTBE沉淀、洗涤，干燥得并HPLC纯化得5.6g类白色固体化合物网34。

化合物35的制备

50ml反应瓶中加入0.75g化合物34(4.5eq)，1.00g 4ARM-PEG20K-SCM(1.0eq)，10ml DMF，0.05gTEA(9.0eq)，室温反应，HPLC监控反应无明显进展后，倒入200ml TBME中，打浆、抽滤，干燥得化合物35 1.69g，直接进行下一步反应。

化合物c的制备

50ml反应瓶中，加入1.65g化合物25，20ml裂解试剂：92.5％TFA/2.5％水/2.5％TIS，室温搅拌2h，用冰的MTBE沉淀、离心、洗涤，粗品经反相HPLC纯化后脱盐，浓缩除去有机溶剂，冻干得类白色粉末化合物c 0.84g。

化合物C的制备

化合物c粗品经反相HPLC纯化后脱盐，浓缩除去有机溶剂，用稀盐酸调节pH＝5～6，冻干得黄绿色粉末化合物C 0.84g。

MALDI-TOF检测分子量为28076.21。

实施例10化合物d和化合物D的制备

化合物41的制备

100ml反应瓶中加入6.20g化合物40(1.0eq)，3.30g化合物17(1.1eq)，62ml DMF，1.43gDIEA(3.0eq)，0.90g DEPC(1.5eq)，室温反应2h，TLC反应完毕后倒入310mL水中，EA萃取2次，醋酸水溶液洗涤，碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠洗涤后无水硫酸钠干燥，浓缩得淡黄色固体化合物41 8.84g，直接进行下一步反应。

化合物42的制备

200ml的氢化釜中加入8.80g化合物41，150ml甲醇，0.44gPd/C，加氢过夜，TLC反应完毕后过滤，浓缩得灰色固体化合物42 8.84g。

化合物43的制备

100ml反应瓶中加入8.50g化合物42(1.0eq)，2.77g化合物3(1.05eq)，85ml DMF，1.38g DIEA(3.0eq)，0.87g DEPC(1.5eq)，室温反应2h，TLC反应完毕后倒入850ml TBME中，打浆后抽滤，固体用110DCM溶解后倒入1.1L TBME中，打浆抽滤，干燥得灰色粉末化合物439.86g，直接进行下一步反应。

化合物44的制备

9.80g化合物43加入200ml裂解试剂：醋酸/TFE/DCM＝1/2/7，反应2小时，冰的MTBE沉淀、洗涤，干燥得并HPLC纯化得5.92g类白色固体化合物44。

化合物45的制备

50ml反应瓶中加入0.60g化合物34(4.5eq)，1.00g 4ARM-PEG20K-SCM(1.0eq)，10ml DMF，0.05gTEA(9.0eq)，室温反应，HPLC监控反应无明显进展后，倒入200ml TBME中，打浆、抽滤，干燥得化合物45 1.45g，直接进行下一步反应。

化合物d的制备

50ml反应瓶中，加入1.45g化合物45，15ml裂解试剂：92.5％TFA/2.5％水/2.5％TIS，室温搅拌2h，用冰的MTBE沉淀、离心、洗涤，粗品经反相HPLC纯化后脱盐，浓缩除去有机溶剂，冻干得类白色粉末化合物d 0.57g。

化合物D的制备

化合物d粗品经反相HPLC纯化后脱盐，浓缩除去有机溶剂，用稀盐酸调节pH＝5～6，冻干得黄绿色粉末化合物D 0.57g。

MALDI-TOF检测分子量为27963.54。

实施例11系列化合物在HT-29裸鼠移植瘤模型体内药效评价

1.实验目的

评价化合物a、化合物A、化合物b、化合物B、化合物c、化合物C、化合物d、化合物D给药后在人结肠癌HT-29细胞株异种移植BALB/c nude小鼠动物模型中药效评价。

2.实验材料

2.1供试品

伊立替康(原料药)系购买所得，nktr-102和8个受试化合物均由博瑞生物医药(苏州)股份有限公司提供。

其中，nktr-102的制备方法参考CN102711837A所公开的方法，如下：

将实施例1中的化合物3(829mg,4.5eq)添加到250mL的反应瓶中，加入DCM(50mL)，三乙胺(221mg,9.0eq)，溶解后加入4ARM-PEG20K-SCM(5.00g,1.0eq)添加到该反应瓶中。HPLC监控反应没有明显进展后，减压蒸馏出去约20mL DCM，将溶液倒入300mL TBME中搅拌沉淀，过滤，得到5.4g粗品，粗品经HPLC制备纯化，脱盐，用稀盐酸调节pH至5-6，冻干得到2.71g淡绿色粉末nktr-102。

2.2试剂

McCoy’s 5A培养液，胎牛血清(FBS)，胰蛋白酶，青-链双抗，注射用水，生理盐水，乳酸，山梨糖醇。

2.3实验动物

雌性BALB/c裸小鼠(只数：150只；周龄：6～7周)从北京维通利华实验动物技术有限公司购买，饲养于SPF动物房，温度20～25℃，相对湿度40％～70％，明暗照明各12小时；动物自由饮水及采食。正常喂养约1周后，经兽医检验，体征状况良好小鼠可入选本实验。分组前使用记号笔于动物尾根部进行标识，分组后每只动物均用耳部剪缺方式标识。

2.4移植性肿瘤瘤株

人结肠癌细胞HT-29，来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(CAS，本实验室液氮冻存)。

3.实验方法

3.1HT-29细胞培养

在5％CO₂、37℃培养条件下，HT-29细胞在含10％胎牛血清McCoy’s 5A培养液中进行常规细胞培养；以0.25％胰酶消化传代；根据细胞生长情况，每周传代2到3次，传代比例为1:4到1:6。

3.2动物模型制备

收取对数生长期HT-29细胞，细胞计数后重悬于无血清McCoy’s 5A培养基中，调整细胞浓度至4×10⁷细胞/mL；用移液器吹打细胞使其分散均匀后装入50mL离心管中，将离心管置于冰盒中；用1mL注射器吸取细胞悬液，注射到裸鼠前右肢腋窝皮下，每只动物接种100μL(4×10⁶细胞/只)，建立HT-29裸鼠移植瘤模型。接种后定期观察动物状态及肿瘤生长情况，使用电子游标卡尺测量瘤径，数据直接输入Excel电子表格，计算肿瘤体积。待肿瘤体积达到100～300mm³，挑选健康状况良好、肿瘤体积相近的动物66只，采用随机区组法分为11组(n＝6)。实验开始后每周测量2次瘤径，计算肿瘤体积，同时称量动物体重并记录。

肿瘤体积(TV)计算公式如下：

TV(mm³)＝l×w²/2

其中，l表示肿瘤长径(mm)；w表示肿瘤短径(mm)。

3.3溶剂配制

称取0.5g山梨糖醇装入50mL离心管中，在离心管中加入50mL注射用水，涡旋振荡使固体物质完全溶解，配制成浓度1％的山梨糖醇水溶液(w/v)，保存于4℃冰箱备用。

3.4给药制剂配制

3..4.1伊立替康给药制剂配制

称取12.0mg的伊立替康，加入0.15mL的1％乳酸，涡旋振荡使药物完全溶解，再分别加入2.85mL的1％山梨糖醇水溶液，涡旋振荡混合均匀，溶液中1％乳酸、1％山梨糖醇水溶液的比例约为5:95(v/v)。溶液中伊立替康有效浓度为4.0mg·mL^-1。

3.4.2nktr-102给药制剂配制

每次给药前，准确称量101.5mg的nktr-102，加入2.5mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中伊立替康有效浓度为4.0mg·mL^-1。

3.4.3化合物a和化合物A给药制剂配制

每次给药前，分别准确称量120.3mg的化合物a和化合物A，加入2.5mL的生理盐水，涡旋振荡，超声(如需要)使药物完全溶解，溶液中伊立替康有效浓度为4.0mg·mL^-1。

3.4.4化合物b和化合物B给药制剂配制

每次给药前，分别准确称量137.0mg的化合物B，加入2.5mL的生理盐水，涡旋振荡，超声(如需要)使药物完全溶解，溶液中伊立替康有效浓度为4.0mg·mL^-1。

3.4.5化合物c和化合物C给药制剂配制

每次给药前，分别准确称量132.6mg的化合物C，加入2.5mL的生理盐水，涡旋振荡，超声(如需要)使药物完全溶解，溶液中伊立替康有效浓度为4.0mg·mL^-1。

3.4.6化合物d和化合物D给药制剂配制

每次给药前，分别准确称量132.0mg的化合物D，加入2.5mL的生理盐水，涡旋振荡，超声(如需要)使药物完全溶解，溶液中伊立替康有效浓度为4.0mg·mL^-1。

3.5动物分组及给药

动物分组及给药方案见表1。于分组当天开始第一次给药，21天左右后结束实验，给药体积均为10mL·kg^-1。折合伊立替康的有效剂量均为40mg·kg^-1。第一组为溶剂对照组，尾静脉注射给予生理盐水，每4天1次，共给药3次(Q4D×3)。第2-11组分别尾静脉注射给予受试样品伊立替康、nktr-102、化合物a等，均为每4天给药一次，Q4D×3。

表1.裸鼠移植瘤模型药效实验给药方案

3.6实验结束

实验最后一天，称量体重、测量瘤径后动物安乐死(CO₂)。剥取肿瘤组织并称重，计算瘤重抑瘤率。

4.数据记录、计算公式

相对肿瘤体积(RTV)的计算公式为：

RTV＝TV_t/TV_initial

其中，TV_initial为分组给药时测量到的肿瘤体积；TV_t为给药期间每一次测量时的肿瘤体积。

相对肿瘤增殖率(％T/C)的计算公式为：

％T/C＝100％×(RTV_T/RTV_C)

其中，RTV_T表示治疗组RTV；RTV_C表示溶剂对照组RTV。

肿瘤生长抑制率TGI(％)的计算公式为：

TGI＝100％×[1－(TV_t(T)－TV_initial(T))/(TV_t(C)－TV_initial(C))]

其中，TV_t(T)表示治疗组每次测量的肿瘤体积；TV_initial(T)表示分组给药时治疗组的肿瘤体积；TV_t(C)表示溶剂对照组每次测量的肿瘤体积；TV_initial(C)表示分组给药时溶剂对照组的肿瘤体积。

动物体重下降率的计算公式为：

动物体重下降率＝100％×(BW_initial－BW_t)/BW_initial

其中，BW_t表示给药期间每次测量的动物体重；BW_initial表示分组给药时的动物体重。

瘤重抑瘤率IR(％)的计算公式为：

IR(％)＝100％×(W_C－W_T)/W_C

其中，W_C表示对照组瘤重；W_T表示治疗组瘤重。

5.统计分析方法

试验数据用Microsoft Office Excel 2007软件进行计算和相关统计学处理。数据除特别说明外，用均数±标准误(Mean±SE)表示，两组间比较采用t检验。

6.实验观察

在实验过程中，实验人员和兽医需对实验动物的体征和健康状况进行持续观察。动物的任何异常表现，例如疼痛、抑郁、活动减少等，需记录在实验原始记录中。如果实验动物的异常表现超过IACUC相关动物福利的文件规定，可经由兽医判断是否中止实验，并通报实验项目负责人。

7.结果

针对人癌异体移植瘤模型，推荐采用相对肿瘤增殖率T/C(％)作为试验评价指标，增殖率越低，说明抑制肿瘤效果越良好，见表2。

表2对肿瘤增殖率T/C(％)

*与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的RTV相比，P＜0.05

#与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的％T/C相比，P＜0.05

实验结果显示，本发明化合物对人结肠癌HT-29裸鼠移植瘤模型肿瘤体内生长有良好抑制作用，且优于伊立替康和nktr-102。

实施例12人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠异种移植模型的抑制作用

1.实验目的

本研究用人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠移植瘤模型对化合物a、化合物A、化合物b、化合物B、化合物c、化合物C、化合物d、化合物D的体内抗肿瘤活性进行评价。

2.实验动物

2.1动物种类

小鼠。

2.2品种

BALB/c裸鼠。

2.3性别

雌性。

2.4数量

接种150只，实验用66只。

2.5年龄

6-8周。

2.6体重

20-22g±20％体重均值。

2.7动物来源(供应商)

上海西普尔-必凯实验动物有限公司(BK)，许可证号SCXK(沪)2008-0016。

2.8实验动物管理

所有实验动物均饲养在SPF级别实验室。实验人员负责日常护理和实验研究。

2.8.1动物身份鉴定方法

每个鼠笼均佩挂有实验编号、实验组别、实验人员姓名、小鼠品种和性别等信息的身份卡片，小鼠用耳钉标记。

2.8.2随机分组

当肿瘤体积达到150-200mm³后用随机区组法分为11组，每组6只小鼠，保证各组间肿瘤体积和小鼠体重均一。各组肿瘤体积的均值与所有实验动物肿瘤体积的均值差异不超过±10％。

2.8.3操作管理规范

所有实验动物的操作和管理均严格遵守动物使用和管理指导原则。

2.8.4饲养条件

居住条件：IVC系统，每笼6只

温度：20℃-26℃

湿度：40％±70％

光照：12小时昼夜交替

2.8.5饲料

辐照大小鼠饲料，购自北京科澳协力饲料有限公司。自由进食。

2.8.6饮水

城市自来水，经过滤高压灭菌后饮用。

2.8.7垫料

玉米芯，上海茂生衍生物科技有限公司，高压灭菌后使用。每周换两次垫料。

2.8.8适应期

实验前给予小鼠最短一周环境适应期。

3.实验材料

3.1测试药品

3.2其他化学试剂和材料

3.2.1生理盐水

生理盐水购自上海华源长富药业(集团)有限公司。

3.2.2无菌注射器

1ml无菌注射器购自上海康德莱企业发展集团股份有限公司(上海，中国)。3.2.3细胞株

人乳腺癌MDA-MB-231购于上海中科院细胞生物研究所。

MDA-MB-231培养于DMEM培养基(GIBCO,美国)，含10％胎牛血清FBS(GIBCO，美国)，培养于含5％CO₂的37℃培养箱。

3.2.4基质胶(BD Matrigel)

基质胶Matrigel购自美国BD公司

3.3仪器

生物安全柜(型号：AC2-6E1)，购自ESCO；

CO₂隔水细胞培养箱(型号：3111)，购自Thermo Scientific Forma；

倒置显微镜(型号：CKX41SF)，购自Olympus；

电动吸引器(型号YX930D)，购自上海医疗器械工业(集团)有限公司；

天平(梅特勒-托利多AB135-S)，购自梅特勒-托利多；

低速离心机(型号LD5-2A)，购自北京雷勃尔离心机有限公司；

电子数显卡尺(型号：SF2000)，购自桂林广陆数字测控股份有限公司。

4.实验设计

建立人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠皮下移植瘤模型，每只接种1×10⁶个细胞。

本次试验设计如下(表3)给药剂量和给药方案。

表3：人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠移植瘤模型中的抗肿瘤作用

5.化合物配制

配制方法由博瑞生物医药技术(苏州)有限公司提供。

单次给药需要的体积3mL。

5.1伊立替康给药制剂配制

称取12.0mg的伊立替康，加入0.15mL的1％乳酸，涡旋振荡使药物完全溶解，再分别加入2.85mL的1％山梨糖醇水溶液，涡旋振荡混合均匀，溶液中1％乳酸、1％山梨糖醇水溶液的比例约为5:95(v/v)。溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

5.2nktr-102给药制剂配制

每次给药前，准确称量101.5mg的nktr-102，加入2.5mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

5.3化合物a、化合物A、化合物b、化合物B、化合物c、化合物C、化合物d、化合物D给药制剂配制：分别准确称量，加入2.5mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

6.实验方法

MDA-MB-231细胞培养于DMEM，含10％胎牛血清FBS(GIBCO，美国)。细胞放置于5％CO₂培养箱37℃培养。

细胞接种法建立肿瘤裸鼠皮下移植模型：收集对数生长期的肿瘤细胞，计数后重悬于1×PBS，调整细胞悬液浓度至1×10⁷/ml。用1ml注射器(4号针头)在裸鼠右侧背部皮下接种肿瘤细胞，1×10⁶/0.1ml/鼠。

在肿瘤体积达到100-200mm³时，将动物按随机区组法进行随机分组，分为11组，使各组肿瘤差异小于均值的10％，每组6只，分组当日作为Day1，分组当天给药。

实验周期进行3周，实验期间每周测定两次动物体重和肿瘤大小。每日观察记录临床症状。实验最后一天处死动物，称量体重，剥离肿瘤，称重并拍照记录。

所有动物实验操作严格遵守动物使用和管理规范。肿瘤相关参数的计算参考中国CFDA《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》。

肿瘤体积(Tumor volume，TV)的计算公式为：TV＝a×b²/2。其中a、b分别代表肿瘤测量长和宽。相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)计算公式为：RTV＝Vt/V₀。其中V₀为分组给药时的肿瘤体积，Vt为测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增值率T/C(％)和抑瘤率(％)，计算公式分别为：T/C(％)＝(T_RTV/C_RTV)×100％。T_RTV为治疗组RTV，C_RTV为阴性对照组RTV；抑瘤率(％)＝(阴性对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100％。

荷瘤动物的体重变化(％)计算如下：(测量时体重-分组时体重)/分组时体重×100。

7.数据分析

8.结果和报告

根据中国CFDA《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》(2006年11月)，T/C(％)≤40％并经统计学分析p<0.05为有效，见表4。

表4对肿瘤增殖率T/C(％)

*与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的RTV相比，P＜0.05

#与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的％T/C相比，P＜0.05

实验结果显示，本发明化合物对人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠移植瘤有良好抑制作用，且优于伊立替康和nktr-102。

实施例13对人胰腺癌MIA Paca-2裸鼠异种移植模型的抑制作用

1.实验目的

本研究用人胰腺癌MIA Paca-2裸鼠移植瘤模型对化合物a、化合物A、化合物b、化合物B、化合物c、化合物C、化合物d、化合物D的体内抗肿瘤活性进行评价。

2.实验动物

2.1动物种类

小鼠。

2.2品种

BALB/c-nu/nu裸鼠。

2.3性别

雌性。

2.4数量

150。

2.5.年龄

6-8周。

2.6.体重

20-22g±20％体重均值。

2.7.动物来源(供应商)

2.8.实验动物管理

所有实验动物均饲养在SPF级别实验室。

2.8.1动物身份鉴定方法

2.8.2随机分组

2.8.3操作管理规范

所有实验动物的操作和管理均严格遵守实验动物使用和管理指导原则。

2.8.4饲养条件

居住条件：IVC系统，每笼6只

温度：25℃±1℃

湿度：65％±10％

光照：12小时昼夜交替

2.8.5饲料

2.8.6饮水

城市自来水，经过滤高压灭菌后饮用。

2.8.7垫料

2.8.8适应期

实验前给予小鼠最短一周环境适应期。

3.实验材料

3.1测试药品

3.2其他化学试剂和材料

3.2.1生理盐水

生理盐水购自上海华源长富药业(集团)有限公司(上海，中国)。

3.2.2无菌注射器

1ml无菌注射器购自上海康德莱企业发展集团股份有限公司(上海，中国)。

3.2.3细胞株

人胰腺癌MIA Paca-2购于上海中科院细胞生物研究所。

MIA Paca-2培养于DMEM培养基(GIBCO，美国)，含10％胎牛血清FBS(GIBCO，美国)和2.5％HS，培养于含5％CO₂的37℃培养箱。

3.2.4基质胶(BD Matrigel)

基质胶Matrigel购自美国BD公司

3.3仪器

生物安全柜(型号：AC2-6E1)，购自ESCO；

CO₂隔水细胞培养箱(型号：3111)，购自Thermo Scientific Forma；

倒置显微镜(型号：CKX41SF)，购自Olympus；

天平(梅特勒-托利多AB135-S)，购自梅特勒-托利多；

低速离心机(型号LD5-2A)，购自北京雷勃尔离心机有限公司；

4.实验设计

建立人胰腺癌MIA Paca-2裸鼠皮下移植瘤模型，每只接种3×10⁶个细胞。

本次试验设计如下(表5)给药剂量和给药方案。

表5：在人胰腺癌MIA Paca-2裸鼠移植瘤模型中的抗肿瘤作用

瘤株：MIA Paca-2；共接种66只

5.化合物配制

配制方法由博瑞生物医药技术(苏州)有限公司提供。

单次给药需要的体积为3mL。

5.1伊立替康给药制剂配制

5.2nktr-102给药制剂配制

每次给药前，准确称量101.5mg的nktr-102，加入2.5mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL-1。

6.实验方法

MIA Paca-2细胞培养于DMEM，含10％胎牛血清FBS(GIBCO，美国)和2.5％HS。细胞放置于5％CO₂培养箱37℃培养。

细胞接种法建立肿瘤裸鼠皮下移植模型：收集对数生长期的肿瘤细胞，计数后重悬于1×PBS，调整细胞悬液浓度至3×10⁷/ml。用1ml注射器(4号针头)在裸鼠右侧背部皮下接种肿瘤细胞，3×10⁶/0.1ml/鼠。

所有动物实验操作严格遵守动物使用和管理规范。肿瘤相关参数的计算参考中国SFDA《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》。

根据中国SFDA《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》(2006年11月)，T/C(％)≤40％并经统计学分析P<0.05为有效。

7.数据分析

试验数据用Microsoft Office Excel 2007软件进行计算和相关统计学处理。数据除特别说明外，用均数±标准误(Mean±SE)表示，组间比较采用t-检验，P<0.05为显著性差异。

8.结果和报告

根据中国CFDA《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》(2006年11月)，T/C(％)≤40％并经统计学分析P<0.05为有效，见表6。

表6对肿瘤增殖率T/C(％)

*与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的RTV相比，P＜0.05

#与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的％T/C相比，P＜0.05

实验结果显示，本发明化合物对人胰腺癌MIA Paca-2裸鼠移植瘤有良好抑制作用，且优于伊立替康和nktr-102。

实施例14对人胃癌NCI-N87细胞株裸鼠移植瘤模型肿瘤体内生长的抑制作用。1.实验目的

评价受试药化合物a、化合物A、化合物b、化合物B、化合物c、化合物C、化合物d、化合物D对人胃癌NCI-N87细胞株裸鼠移植瘤模型肿瘤体内生长的抑制作用。

2.实验材料

2.1供试品

伊立替康(原料药)系购买所得，、nktr-102和8个受试化合物均由博瑞生物医药(苏州)股份有限公司提供。

2.2试剂

RPMI-1640培养液，胎牛血清(FBS)，胰蛋白酶，青-链双抗，生理盐水。2.3实验动物

雌性BALB/c裸小鼠(只数：150只；周龄：6～8周)从北京维通利华实验动物技术有限公司购买，饲养于苏州圣苏新药开发有限公司SPF动物房，温度20～25℃，相对湿度40％～70％，明暗照明各12小时；动物自由饮水及采食。正常喂养约1周后，经兽医检验，体征状况良好小鼠可入选本实验。分组前使用记号笔于动物尾根部进行标识，分组后每只动物均用耳部剪缺方式标识。

2.4移植性肿瘤瘤株

人胃癌细胞NCI-N87，来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(CAS，本实验室液氮冻存)。

3实验方法

3.1NCI-N87细胞培养

在5％CO₂、37℃培养条件下，NCI-N87细胞在含10％胎牛血清RPMI-1640培养液中进行常规细胞培养；以0.25％胰酶消化传代；根据细胞生长情况，每周传代1到2次，传代比例为1:2到1:6。

3.2动物模型制备

收取对数生长期NCI-N87细胞，细胞计数后重悬于无血清的RPMI-1640培养基中，调整细胞浓度至5×10⁷细胞/mL；用移液器吹打细胞使其分散均匀后装入50mL离心管中，将离心管置于冰盒中；用1mL注射器吸取细胞悬液，注射到裸鼠前右肢腋窝皮下，每只动物接种100μL(5×10⁶细胞/只)，建立NCI-N87裸鼠移植瘤模型。接种后定期观察动物状态及肿瘤生长情况，使用电子游标卡尺测量瘤径，数据直接输入Excel电子表格，计算肿瘤体积。待肿瘤体积达到100～300mm³，挑选健康状况良好、肿瘤体积相近的动物66只，采用随机区组法分为11组(n＝6)。实验开始后每周测量2次瘤径，计算肿瘤体积，同时称量动物体重并记录。

肿瘤体积(TV)计算公式如下：

TV(mm³)＝l×w²/2

其中，l表示肿瘤长径(mm)；w表示肿瘤短径(mm)。

3.3溶剂配制

3.4给药制剂配制

3..4.1伊立替康给药制剂配制

3.4.2nktr-102给药制剂配制

每次给药前，准确称量101.5mg的nktr-102，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

3.4.3化合物a、化合物A、化合物b、化合物B、化合物c、化合物C、化合物d、化合物D给药制剂配制：分别准确称量，加入2.5mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

3.5动物分组及给药

动物分组及给药方案见表7。于分组当天开始第一次给药，21天后结束实验，给药体积均为10mL·kg^-1。第1组为溶剂对照组，尾静脉注射给予空白溶剂，每4天1次，共给药3次(Q4D×3)。第2-11组分别尾静脉注射给予受试样品伊立替康、nktr-102、受试化合物，给药剂量均为40mg·kg^-1(以伊立替康含量计算)，Q4D×3。

表7.裸鼠移植瘤模型药效实验给药方案

3.6实验结束

实验结束后，称量体重、测量瘤径后动物安乐死(CO₂)。剥取肿瘤组织并称重，计算瘤重抑瘤率。肿瘤组织称重后转移至低于-70℃冰箱中保存，以供后续分析。

4.数据记录、计算公式

相对肿瘤体积(RTV)的计算公式为：

RTV＝TV_t/TV_initial

相对肿瘤增殖率(％T/C)的计算公式为：

％T/C＝100％×(RTV_T/RTV_C)

其中，RTV_T表示治疗组RTV；RTV_C表示溶剂对照组RTV。

肿瘤生长抑制率TGI(％)的计算公式为：

TGI＝100％×[1－(TV_t(T)－TV_initial(T))/(TV_t(C)－TV_initial(C))]

动物体重下降率的计算公式为：

动物体重下降率＝100％×(BW_initial－BW_t)/BW_initial

瘤重抑瘤率IR(％)的计算公式为：

IR(％)＝100％×(W_C－W_T)/W_C

其中，W_C表示对照组瘤重；W_T表示治疗组瘤重。

5.统计分析方法

试验数据用Microsoft Office Excel 2007软件进行计算和相关统计学处理。数据除特别说明外，用均数±标准误(Mean±SE)表示，两组间比较采用t-检验。

6.实验观察

7.结果

针对人癌异体移植瘤模型，推荐采用相对肿瘤增殖率T/C(％)作为试验评价指标，增殖率越低，说明抑制肿瘤效果越良好，见表8。

表8对肿瘤增殖率T/C(％)

*与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的RTV相比，P＜0.05

#与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的％T/C相比，P＜0.05

实验结果显示，本发明化合物对人胃癌NCI-N87细胞株裸鼠移植瘤模型肿瘤生长有良好抑制作用，且优于伊立替康和nktr-102。

实施例15对U87MG裸鼠脑原位模型生存率的影响。

1.实验目的

评价受试药化合物a、化合物A、化合物b、化合物B、化合物c、化合物C、化合物d、化合物D对U87MG裸鼠脑原位模型生存率的影响。

2.实验材料

2.1供试品

2.2试剂

RPMI-1640培养液，胰蛋白酶，青-链双抗，生理盐水。

2.3实验动物

雌性BALB/c裸小鼠(只数：150只；周龄：6～8周)从北京维通利华实验动物技术有限公司购买，饲养于SPF动物房，温度20～25℃，相对湿度40％～70％，明暗照明各12小时；动物自由饮水及采食。正常喂养约1周后，经兽医检验，体征状况良好小鼠可入选本实验。分组前使用记号笔于动物尾根部进行标识，分组后每只动物均用耳部剪缺方式标识。

2.4移植性肿瘤瘤株

脑胶质瘤细胞U87MG，来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(CAS，本实验室液氮冻存)。

3.实验方法

NCI-N87细胞培养

在5％CO₂、37℃培养条件下，NCI-N87细胞在RPMI-1640培养液中进行常规细胞培养；以0.25％胰酶消化传代；根据细胞生长情况，每周传代1到2次，传代比例为1:2到1:6。

3.1动物模型制备

收取对数生长期NCI-N87细胞，细胞计数后重悬于无血清的RPMI-1640培养基中，调整细胞浓度至1×10⁸细胞/mL；用移液器吹打细胞使其分散均匀后装入50mL离心管中，将离心管置于冰盒中；用1mL注射器吸取细胞悬液，借助动物立体定向仪的引导，采用微注射方法将体外培养人脑胶质瘤细胞U87MG细胞1μL(1×10⁵细胞/只)，建立U87MG脑胶质瘤原位模型，接种后定期观察动物状态。接种后第12天，挑选动物66只，采用随机区组法分为11组(n＝6)。

3.2给药制剂配制

3.2.1伊立替康给药制剂配制

3.2.2nktr-102给药制剂配制

3.2.3化合物a、化合物A、化合物b、化合物B、化合物c、化合物C、化合物d、化合物D给药制剂配制：分别准确称量，加入2.5mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

3.3动物分组及给药

动物分组及给药方案见表9。于分组当天开始第一次给药，21天后结束实验，给药体积均为10mL·kg^-1。第1组为溶剂对照组，尾静脉注射给予空白溶剂，每4天1次，共给药3次(Q4D×3)。第2-11组分别尾静脉注射给予受试样品伊立替康、nktr-102、受试化合物，给药剂量均为40mg·kg^-1(以伊立替康含量计算)，Q4D×3。

表9.裸鼠移植瘤模型药效实验给药方案

4.数据记录、计算公式

记录动物生存时间。

5.统计分析方法

试验数据用Microsoft Office Excel 2007软件进行计算和相关统计学处理。两组间比较采用t检验。

6.结果

见表10

表10动物生存时间(天)

*与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的中位生存时间相比，P＜0.05

实验结果显示，本发明化合物对脑胶质瘤有良好抑制作用，且优于伊立替康和nktr-102。

Claims

1.具有如下结构式（Ⅰ）的多支链药物偶联物或其药学上可接受的盐：

（Ⅰ）

符号“*”代表多价接头L与靶向分子T的连接点，“#”代表多价接头L与活性剂D的连接点，“%”代表多价接头L与POLY的连接点，其中，l为2-20之间的任一整数，m、n分别为0-10之间的任一整数；

T为含有“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”序列的RGD肽、tLyp-1、Lyp-1或RPARPAR；

D为如式（Ⅱ）所示的喜树碱类药物：

（Ⅱ）

R₁-R₅相互独立地选自于以下基团：氢、卤素、酰基、烷基、取代烷基、烷氧基、取代烷氧基、烯基、炔基、环烷基、羟基、氰基、硝基、叠氮基、酰胺基、肼、胺基、取代胺基、羟基羰基、烷氧羰基、烷氧羰氧基、氨基甲酰氧基、芳基磺酰氧基、烷基磺酰氧基；R₆为H或OR₈，R₈为烷基、烯基、环烷基、卤代烷基或羟烷基；R₇为羟基；

“R”选自：