CN109776788B - 叶酸受体靶向多臂偶联物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多臂的、由水溶性聚合物修饰的叶酸受体靶向药物偶联物及其盐。该药物偶联物具有如下结构式：

Description

叶酸受体靶向多臂偶联物

技术领域

本发明总体上涉及多臂靶向偶联物。具体地，本发明涉及多臂PEG修饰的靶向抗癌偶联物，更具体地说，本发明为将靶向分子通过多臂PEG与抗癌药物连接成的偶联物。

背景技术

多年来，已经提出了用于改进生物活性剂的稳定性和递送的多种方法。与药用试剂的配制以及投递相关联的挑战可以包括：该药用试剂的差的水溶性、毒性、低的生物利用率、不稳定性、以及迅速的体内降解。尽管已经设计了许多办法来改进药用试剂的递送，但是没有一种单独的方法是没有其缺点的。例如，通常采用的药物递送方法的目标在于解决或至少改善一个或多个以下问题，包括如在一种脂质体、聚合物基质、或单分子胶束中的药物胶囊化、共价附接至一种水溶性聚合物如聚乙二醇上、基因靶向剂的使用、盐类的结构、等等。

WO2005028539、WO2010019233、WO2011063156、WO2011063158公开了一种处于临床三期的药物nktr 102，该药物主要用于转移性乳腺癌，由Nektar Therapeutics研发。该药物是一种水溶性的多支链聚合物药物前体，以提高药物的负载，结构如下：

该化合物是使用多臂PEG与伊立替康连接，以提高水溶性，增加载药量，在抗癌作用不变的情况下，降低副作用。但该药物仍具有缺点，比如，靶向性较差，不能作用于特定的癌细胞，在杀死癌细胞的同时，也会影响正常细胞的性能，而使不良反应发生率仍然比较高。

传统的治疗肿瘤的药物普遍存在对肿瘤组织选择性差，毒副作用大等缺点，如何设计出良好的药物传递系统成为近年来的研究热点。

叶酸受体(folate receptor，FR)是一种糖基化磷脂酰肌醇连接的膜糖蛋白，分子量为38～40kD，已鉴定出三种叶酸受体异构体：α-FR、β-FR和γ-FR。。FR很少在正常细胞上表达，在脉络丛、胎盘中有一定表达，在肺、胸腺、肾中呈低水平表达，相反的是，它却在许多肿瘤组织呈高水平表达。α-FR在一些上皮细胞系肿瘤，如卵巢癌、肾癌、子宫癌、睾丸癌、脑瘤、结肠癌、肺腺癌等高水平表达；β-FR在其他许多肿瘤，如乳腺癌、脑瘤、睾丸癌、头颈部肿瘤、粒系白血病等高水平表达；γ-FR则在许多组织中难以检测到。转移瘤比原位、恶性程度低的肿瘤表达更多叶酸受体。

叶酸(folate，FA)可以和叶酸受体发生特异性结合。在复合物中加入叶酸使叶酸和肿瘤细胞上的叶酸受体结合，这样复合物就可以通过细胞受体介导的内吞作用被细胞吸收进入细胞内部。这样就为叶酸受体阳性的肿瘤细胞提供了一条特异的靶向药物投递途径。由于叶酸与叶酸受体的这种稳定结合，现在叶酸被广泛地用来作为各种靶向药物投递的靶向系统。

发明内容

本发明公开了一种全新的具有靶向性的多臂药物偶联物，该偶联物如式(I)所示：

为进一步说明本发明的发明构思，上述偶联物可表述为式(Ⅱ)：

其中，R为有机中心，即偶联物结构中的

代表原子的连接处。从有机中心的中心碳原子出发，发出四条支链，每一条支链都是相同的。每一条支链由聚合物POLY、多价接头L、靶向分子T、活性剂D构成。

聚合物POLY为聚乙二醇，在本发明中，其具体为：

n为113，

代表原子的连接处，标“&”号的氧原子为与有机中心“R”连接的原子。

本领域技术人员应该知晓，在高分子领域，n代表所述的聚合物的聚合度，即聚合物大分子链上所含重复单元数目的平均值，其取决于所述的聚合物的分子量，例如，当n为113时，是指平均值为113。

多价接头L为：

符号“*”代表多价接头L通过半胱氨酸与靶向分子T的连接点，“#”代表多价接头L与活性剂D的连接点，“％”代表多价接头L与POLY的连接点。

靶向分子T为叶酸，活性剂D为伊立替康，叶酸结构如下：

伊立替康结构如下：

本发明为一个多臂聚合物修饰的靶向抗癌偶联物，其中，水溶性的聚合物修饰可增强该偶联物的水溶性，从而提高载药量。

本发明中的靶向分子为叶酸，叶酸作为靶向分子，主动靶向于叶酸受体表达丰富的肿瘤细胞，更好地发挥抗肿瘤功效，增加靶向性，这样就使得偶联物在目标组织的浓度更高。

L为任意的连接接头，其作用是首先将靶向分子与抗癌药物连接起来，再将“靶向分子、抗癌药物与聚合物臂连接起来，使得整个偶联物形成一个有机的整体。本发明偶联物是典型的药物前体，通过水解作用或酶解作用，活性剂D被释放出来，与母体分离，发挥生理活性。

本发明偶联物呈现出高载荷能力，这样就可以降低总剂量来治疗一种特殊的疾病，例如癌症等。也就是说，本发明偶联物活性剂载体能够有效地和活性剂分子以共价键结合，允许每一定的偶联物量可以服用更多量的治疗剂型(也就是活性剂部分)。本发明偶联物通过水溶性聚合物的修饰，本质上是偶联物也是亲水的，特别是活性剂为水难溶药物时，提高偶联物的生物利用度。

相比未偶联的药物，本发明偶联物能够表现出更强的作用，在人体或其他动物体内组织更加富集。

本发明中偶联物药物前体含有许多独特的性质，尤其是在活性剂为一个抗癌化合物的情况下。这种药物前体能以较高效率来抑制肿瘤的生长。我们使用的这种小分子是一种已知具有抗癌特性的小分子。然而，通过如上所述与多支链聚合物结合，其疗效和药物代谢动力学与该小分子(例如，抗癌化合物本身)相比，有了很大的改进。

本发明偶联物，药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐，典型的盐包括硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐、氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、甲酸盐、乳酸盐、苯甲酸盐、醋酸盐、三氟乙酸盐、二氯乙酸盐、三氯乙酸盐、混合的氯氟乙酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、磺酸盐、甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、庚烷磺酸盐等，其中优选三氟乙酸盐和庚烷磺酸盐。

典型的三氟乙酸盐包括一至十二分子的三氟乙酸盐，优选每个支链分别结合三分子三氟乙酸盐的偶联物，该优选的偶联物为十二分子三氟乙酸盐：

典型的庚烷磺酸盐包括一至十二分子的庚烷磺酸盐。优选每个支链分别结合三分子庚烷磺酸盐的偶联物，该优选的偶联物为十二分子庚烷磺酸盐：

本发明偶联物适用的实体肿瘤类型包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜癌、脑瘤、间皮组织癌、肾癌、胃癌、头颈部肿瘤、肺癌、结肠直肠癌、睾丸癌，尤其适用于卵巢癌、乳腺癌和肺癌。

具体实施例

在下面将对本发明进行详细描述。然而，本发明可能具体体现为许多不同的形式，而且它不应该被局限于此处所描述的实施例中，提供这些实施例中的目的是使所披露内容更完整与全面。所用试剂和原料，除了提供制备方法的除外，其余均为市售。4armPEG20K-SCM购自北京键凯科技有限公司，分子量约为20kDa左右。

除非另有定义，否则本文中所有科技术语具有的含义与权利要求主题所属技术领域人员通常理解的含义相同。

除非另有说明，本文中所用的术语具有如下的含义：

DMF：N,N-二甲基甲酰胺

DCM：二氯甲烷

Boc-Gly-OH：

DMAP：4-二甲氨基吡啶

DCC：二环己基碳二亚胺

IPA：异丙醇

TFA：三氟乙酸

TBME：叔丁基甲醚

EA：乙酸乙酯

DME：乙二醇二甲醚

HOSU：N-琥珀酰亚胺碳酸酯

THF：四氢呋喃

DIEA：N,N-二异丙基乙胺

DEPC：氰基磷酸二乙酯

DMSO：二甲基亚砜

HOBT：1-羟基苯并三唑

DIC：N,N-二异丙基碳二亚胺

TIS：三异丙基硅烷

PBS：磷酸盐缓冲液

EDC·HCl：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐4armPEG20K-SCM：

实施例1

化合物2的制备

向250mL圆底烧瓶中加入3.50g化合物1(1.0eq)，52.5mlDMF，加热至60℃溶解，5-10min后减压蒸去DMF，加入300ml正庚烷减压蒸馏，重复三次，旋干后加入105mlDCM，1.08gBoc-Gly-OH(1.2eq)，63mg DMAP(0.1eq)，滴加1.59gDCC(1.5eq)溶于10ml DCM的溶液，20℃反应4小时，TLC监控反应完毕后，过滤，浓缩至剩余25％体积时加入120ml IPA，蒸去75％的溶剂，加入150ml正庚烷，室温搅拌1小时，过滤，正庚烷洗涤2次，干燥得淡黄色固体4.02g化合物2。

化合物3的制备

向100mL三口瓶中加入4.02g化合物2，50ml DCM，搅拌溶解后滴加11.6mlTFA，室温反应2h，TLC监控反应完毕后加入150ml乙腈，减压蒸馏120ml溶剂后倒入320ml TBME溶液中，搅拌30min，过滤，滤饼用TBME洗涤得淡黄色固体化合物3 4.00g。

化合物4的制备

采用本专业人员熟知的Fmoc法固相合成，利用2-Cl-Trt Resin、采用20％的哌啶/DMF脱除Fmoc，偶联试剂采用HOBT/DIC，DMF为反应溶剂，反应监控采用茚三酮检测法，依次将下列保护氨基酸连接到树脂上：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-PGE3-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Glu-OtBu、三氟乙酰基蝶酸，DMF洗涤后用水合肼脱除三氟乙酰基后，DMF洗涤、甲醇洗涤、DCM洗涤后干燥，加入裂解试剂(TFA：苯甲硫醚：苯酚：TIS＝85：5：5：5)，反应2小时后用冰TBME沉淀、离心，得到粗品，经HPLC制备纯化后冻干得化合物4纯品。

化合物5的制备

向100mL三口烧瓶中加入4g化合物13(1.0eq)，2.32g化合物3(1.0eq)，56ml DMF，搅拌溶清后降温至0℃后加入1.19g DIEA(3.0eq)，1.47g TBTU(1.5eq),升至室温反应2小时后HPLC反应完毕，将反应液倒入TBME中固体析出，抽滤、干燥得7.67g黄色固体5。

化合物6的制备

向100mL三口烧瓶中加入7.05g化合物14，加入裂解试剂(TFA：苯甲硫醚：苯酚：TIS＝85：5：5：5)，反应2小时后用冰TBME沉淀、离心，得到粗品，经HPLC制备纯化后冻干得1.36g纯品6。

化合物7的制备

向10mL圆底烧瓶中加入0.58g化合物6(4.0eq)，1.31g 4arm-PEG20K-SCM(1.0eq)，13ml DMF、84mgDIEA，HPLC反应无进展后，倒入TBME中，固体析出，得化合物7粗品1.82g。

化合物8的制备

化合物7，甲醇溶解粗品，加入TFA调节pH＝5-6，浓缩，加入TBME中，固体析出，离心，干燥得黄色固体化合物8。

化合物9的制备

化合物7经反向HPLC纯化(硅胶：C18，300A；流动相：庚烷磺酸钠/水，乙腈)后，收集纯品后调节pH＝4～5，再经反向HPLC脱盐(硅胶：C18，300A；流动相：醋酸/水，乙腈)，收集纯品后浓缩除去有机溶剂，冻干得类白色粉末化合物9。

化合物7MALDI-TOF检测分子量为27328.05。

化合物8MALDI-TOF检测分子量为27392.54。

化合物9MALDI-TOF检测分子量为27419.56。

实施例2对人卵巢癌SK-OV-3裸鼠异种移植瘤的抗肿瘤药效实验

1.实验目的

评价受试药化合物7对人卵巢癌SK-OV-3细胞株裸鼠移植瘤模型肿瘤体内生长的抑制作用。

2.实验材料

2.1供试品

伊立替康(原料药)系购买所得，nktr-102和化合物7均由博瑞生物医药(苏州)股份有限公司提供。

其中，nktr-102的制备方法参考CN102711837A所公开的方法，如下：

将实施例中的化合物7(829mg,4.5eq)添加到250mL的反应瓶中，加入DCM(50mL)，三乙胺(221mg,9.0eq)，溶解后加入4arm-PEG20K-SCM(5.00g,1.0eq)添加到该反应瓶中。HPLC监控反应没有明显进展后，减压蒸馏出去约20mL DCM，将溶液倒入300mL TBME中搅拌沉淀，过滤，得到5.4g粗品，粗品经HPLC制备纯化，脱盐，用稀盐酸调节pH至5-6，冻干得到2.71g淡绿色粉末nktr-102。2.2试剂

McCoy's 5A培养液，胎牛血清(FBS)，胰蛋白酶，青-链双抗，生理盐水。2.3实验动物

雌性BALB/c裸小鼠(只数：150只；周龄：6～8周)从北京维通利华实验动物技术有限公司购买，饲养于苏州圣苏新药开发有限公司SPF动物房，温度20～25℃，相对湿度40％～70％，明暗照明各12小时；动物自由饮水及采食。正常喂养约1周后，经兽医检验，体征状况良好小鼠可入选本实验。分组前使用记号笔于动物尾根部进行标识，分组后每只动物均用耳部剪缺方式标识。

2.4移植性肿瘤瘤株

人卵巢癌SK-OV-3，来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(CAS，本实验室液氮冻存)。

3实验方法

3.1细胞培养

SK-OV-3培养于McCoy's 5A培养基(GIBCO,美国)，含10％胎牛血清FBS(GIBCO，美国)，培养于含5％CO₂的37℃培养箱。

3.2动物模型制备

细胞接种法建立肿瘤裸鼠皮下移植模型：收集对数生长期的肿瘤细胞，计数后重悬于1×PBS，调整细胞悬液浓度至5×10⁷/ml并与Matrigel 1:1混匀。用1ml注射器(4号针头)在裸鼠右侧背部皮下接种肿瘤细胞，5×10⁶/小鼠，共接种50只动物。在肿瘤体积达到100-300mm³时，将动物按随机区组法进行随机分组。实验开始后每周测量2次瘤径，计算肿瘤体积，同时称量动物体重并记录。

肿瘤体积(TV)计算公式如下：

TV(mm³)＝l×w²/2

其中，l表示肿瘤长径(mm)；w表示肿瘤短径(mm)。

3.3溶剂配制

称取0.5g山梨糖醇装入50mL离心管中，在离心管中加入50mL注射用水，涡旋振荡使固体物质完全溶解，配制成浓度1％的山梨糖醇水溶液(w/v)，保存于4℃冰箱备用。

3.4给药制剂配制

3..4.1伊立替康给药制剂配制

称取12.0mg的伊立替康，加入0.15mL的1％乳酸，涡旋振荡使药物完全溶解，再分别加入2.85mL的1％山梨糖醇水溶液，涡旋振荡混合均匀，溶液中1％乳酸、1％山梨糖醇水溶液的比例约为5:95(v/v)。溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

3.4.2nktr-102给药制剂配制

每次给药前，准确称量101.5mg的nktr-102，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

3.4.3化合物7给药制剂配制：准确称量化合物7，加入一定体积的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

3.5动物分组及给药

动物分组及给药方案见表1。于分组当天开始第一次给药，21天后结束实验，给药体积均为10mL·kg^-1。第1组为溶剂对照组，尾静脉注射给予空白溶剂，每4天1次，共给药3次(Q7D×3)。第2-4组分别尾静脉注射给予受试样品伊立替康、nktr-102、化合物7，给药剂量均为40mg·kg^-1(以伊立替康含量计算)。

表1动物分组及给药方案

3.6实验结束

实验结束后，称量体重、测量瘤径后动物安乐死(CO₂)。剥取肿瘤组织并称重，计算瘤重抑瘤率。

4.数据记录、计算公式

相对肿瘤体积(RTV)的计算公式为：

RTV＝TV_t/TV_initial

其中，TV_initial为分组给药时测量到的肿瘤体积；TV_t为给药期间每一次测量时的肿瘤体积。

相对肿瘤增殖率(％T/C)的计算公式为：

％T/C＝100％×(RTV_T/RTV_C)

其中，RTV_T表示治疗组RTV；RTV_C表示溶剂对照组RTV。

5.统计分析方法

试验数据用Microsoft Office Excel 2007软件进行计算和相关统计学处理。数据除特别说明外，用均数±标准误(Mean±SE)表示，两组间比较采用t-检验。

6.结果

针对人癌异体移植瘤模型，推荐采用相对肿瘤增殖率T/C(％)作为试验评价指标，增殖率越低，说明抑制肿瘤效果越良好，见表2。

表2化合物对肿瘤增殖率T/C(％)

*与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的RTV相比，P＜0.05

#与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的％T/C相比，P＜0.05

实验结果显示，本发明化合物对人卵巢癌SK-OV-3细胞株裸鼠移植瘤模型肿瘤生长有良好抑制作用，且优于伊立替康和nktr-102。

实施例3对人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠异种移植瘤的抗肿瘤药效实验

1.实验目的

评价受试药化合物7对人乳腺癌MDA-MB-231细胞株裸鼠移植瘤模型肿瘤体内生长的抑制作用。

2.实验材料

2.1供试品

伊立替康(原料药)系购买所得，nktr-102和化合物7均由博瑞生物医药(苏州)股份有限公司提供。

2.2试剂

DMEM培养液，胎牛血清(FBS)，胰蛋白酶，青-链双抗，生理盐水。

2.3实验动物

雌性BALB/c裸小鼠(只数：150只；周龄：6～8周)从北京维通利华实验动物技术有限公司购买，饲养于苏州圣苏新药开发有限公司SPF动物房，温度20～25℃，相对湿度40％～70％，明暗照明各12小时；动物自由饮水及采食。正常喂养约1周后，经兽医检验，体征状况良好小鼠可入选本实验。分组前使用记号笔于动物尾根部进行标识，分组后每只动物均用耳部剪缺方式标识。

2.4移植性肿瘤瘤株

人乳腺癌MDA-MB-231，来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(CAS，本实验室液氮冻存)。

3实验方法

3.1细胞培养

MDA-MB-231培养于DMEM培养基(DMEM，美国)，含10％胎牛血清FBS(GIBCO，美国)，培养于含5％CO₂的37℃培养箱。

3.2动物模型制备

细胞接种法建立肿瘤裸鼠皮下移植模型：收集对数生长期的肿瘤细胞，计数后重悬于1×PBS，调整细胞悬液浓度至1×10⁷/ml。用1ml注射器(4号针头)在裸鼠右侧背部皮下接种肿瘤细胞，1×10⁶/小鼠，共接种50只动物。在肿瘤体积达到100-300mm³时，将动物按随机区组法进行随机分组。实验开始后每周测量2次瘤径，计算肿瘤体积，同时称量动物体重并记录。

肿瘤体积(TV)计算公式如下：

TV(mm³)＝l×w²/2

其中，l表示肿瘤长径(mm)；w表示肿瘤短径(mm)。

3.3溶剂配制

称取0.5g山梨糖醇装入50mL离心管中，在离心管中加入50mL注射用水，涡旋振荡使固体物质完全溶解，配制成浓度1％的山梨糖醇水溶液(w/v)，保存于4℃冰箱备用。

3.4给药制剂配制

3..4.1伊立替康给药制剂配制

称取12.0mg的伊立替康，加入0.15mL的1％乳酸，涡旋振荡使药物完全溶解，再分别加入2.85mL的1％山梨糖醇水溶液，涡旋振荡混合均匀，溶液中1％乳酸、1％山梨糖醇水溶液的比例约为5:95(v/v)。溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

3.4.2nktr-102给药制剂配制

每次给药前，准确称量101.5mg的nktr-102，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

3.4.3化合物7给药制剂配制：准确称量化合物7，加入一定体积的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

3.5动物分组及给药

动物分组及给药方案见表3。于分组当天开始第一次给药，21天后结束实验，给药体积均为10mL·kg^-1。第1组为溶剂对照组，尾静脉注射给予空白溶剂，每4天1次，共给药3次(Q7D×3)。第2-4组分别尾静脉注射给予受试样品伊立替康、nktr-102、化合物7，给药剂量均为40mg·kg^-1(以伊立替康含量计算)。

表3动物分组及给药方案

3.6实验结束

实验结束后，称量体重、测量瘤径后动物安乐死(CO₂)。剥取肿瘤组织并称重，计算瘤重抑瘤率。

4.数据记录、计算公式

相对肿瘤体积(RTV)的计算公式为：

RTV＝TV_t/TV_initial

其中，TV_initial为分组给药时测量到的肿瘤体积；TV_t为给药期间每一次测量时的肿瘤体积。

相对肿瘤增殖率(％T/C)的计算公式为：

％T/C＝100％×(RTV_T/RTV_C)

其中，RTV_T表示治疗组RTV；RTV_C表示溶剂对照组RTV。

5.统计分析方法

试验数据用Microsoft Office Excel 2007软件进行计算和相关统计学处理。数据除特别说明外，用均数±标准误(Mean±SE)表示，两组间比较采用t-检验。

6.结果

针对人癌异体移植瘤模型，推荐采用相对肿瘤增殖率T/C(％)作为试验评价指标，增殖率越低，说明抑制肿瘤效果越良好，见表4。

表4化合物对肿瘤增殖率T/C(％)

*与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的RTV相比，P＜0.05

#与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的％T/C相比，P＜0.05

实验结果显示，本发明化合物对人乳腺癌MDA-MB-231细胞株裸鼠移植瘤模型肿瘤生长有良好抑制作用，且优于伊立替康和nktr-102。

实施例4对人肺癌SPC-A-1裸鼠异种移植瘤的抗肿瘤药效实验

1.实验目的

评价受试药化合物7对人肺癌SPC-A-1细胞株裸鼠移植瘤模型肿瘤体内生长的抑制作用。

2.实验材料

2.1供试品

伊立替康(原料药)系购买所得，nktr-102和化合物7均由博瑞生物医药(苏州)股份有限公司提供。

2.2试剂

RPMI-1640培养液，胎牛血清(FBS)，胰蛋白酶，青-链双抗，生理盐水。2.3实验动物

雌性BALB/c裸小鼠(只数：150只；周龄：6～8周)从北京维通利华实验动物技术有限公司购买，饲养于苏州圣苏新药开发有限公司SPF动物房，温度20～25℃，相对湿度40％～70％，明暗照明各12小时；动物自由饮水及采食。正常喂养约1周后，经兽医检验，体征状况良好小鼠可入选本实验。分组前使用记号笔于动物尾根部进行标识，分组后每只动物均用耳部剪缺方式标识。

2.4移植性肿瘤瘤株

人肺癌SPC-A-1，来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(CAS，本实验室液氮冻存)。

3实验方法

3.1细胞培养

SPC-A-1培养于RPMI-1640培养液，含10％胎牛血清FBS(GIBCO，美国)，培养于含5％CO₂的37℃培养箱。。

3.2动物模型制备

细胞接种法建立肿瘤裸鼠皮下移植模型：收集对数生长期的肿瘤细胞，计数后重悬于1×PBS，调整细胞悬液浓度至2×10⁷/ml。用1ml注射器(4号针头)在裸鼠右侧背部皮下接种肿瘤细胞，2×10⁶/小鼠，共接种50只动物。在肿瘤体积达到100-300mm³时，将动物按随机区组法进行随机分组。实验开始后每周测量2次瘤径，计算肿瘤体积，同时称量动物体重并记录。

肿瘤体积(TV)计算公式如下：

TV(mm³)＝l×w²/2

其中，l表示肿瘤长径(mm)；w表示肿瘤短径(mm)。

3.3溶剂配制

称取0.5g山梨糖醇装入50mL离心管中，在离心管中加入50mL注射用水，涡旋振荡使固体物质完全溶解，配制成浓度1％的山梨糖醇水溶液(w/v)，保存于4℃冰箱备用。

3.4给药制剂配制

3..4.1伊立替康给药制剂配制

称取12.0mg的伊立替康，加入0.15mL的1％乳酸，涡旋振荡使药物完全溶解，再分别加入2.85mL的1％山梨糖醇水溶液，涡旋振荡混合均匀，溶液中1％乳酸、1％山梨糖醇水溶液的比例约为5:95(v/v)。溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

3.4.2nktr-102给药制剂配制

每次给药前，准确称量101.5mg的nktr-102，加入2.3mL的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

3.4.3化合物7给药制剂配制：准确称量化合物7，加入一定体积的生理盐水，涡旋振荡使药物完全溶解，溶液中伊立替康游离形式浓度为4.0mg·mL^-1。

3.5动物分组及给药

动物分组及给药方案见表5。于分组当天开始第一次给药，21天后结束实验，给药体积均为10mL·kg^-1。第1组为溶剂对照组，尾静脉注射给予空白溶剂，每4天1次，共给药3次(Q7D×3)。第2-4组分别尾静脉注射给予受试样品伊立替康、nktr-102、化合物7，给药剂量均为40mg·kg^-1(以伊立替康含量计算)。

表5动物分组及给药方案

3.6实验结束

实验结束后，称量体重、测量瘤径后动物安乐死(CO₂)。剥取肿瘤组织并称重，计算瘤重抑瘤率。

4.数据记录、计算公式

相对肿瘤体积(RTV)的计算公式为：

RTV＝TV_t/TV_initial

其中，TV_initial为分组给药时测量到的肿瘤体积；TV_t为给药期间每一次测量时的肿瘤体积。

相对肿瘤增殖率(％T/C)的计算公式为：

％T/C＝100％×(RTV_T/RTV_C)

其中，RTV_T表示治疗组RTV；RTV_C表示溶剂对照组RTV。

5.统计分析方法

试验数据用Microsoft Office Excel 2007软件进行计算和相关统计学处理。数据除特别说明外，用均数±标准误(Mean±SE)表示，两组间比较采用t-检验。

6.结果

针对人癌异体移植瘤模型，推荐采用相对肿瘤增殖率T/C(％)作为试验评价指标，增殖率越低，说明抑制肿瘤效果越良好，见表6。

表6化合物对肿瘤增殖率T/C(％)

*与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的RTV相比，P＜0.05

#与空白溶剂、伊立替康和nktr-102组的％T/C相比，P＜0.05

实验结果显示，本发明化合物对人肺癌SPC-A-1细胞株裸鼠移植瘤模型肿瘤生长有良好抑制作用，且优于伊立替康和nktr-102。

在这里需要说明的是，由于本发明偶联物进入人体或动物体内，实际起抗癌作用的是游离态偶联物，与本发明偶联物具体成哪一种盐无直接关系，故可以使用游离的偶联物的药理数据来证明偶联物及其盐的抗癌作用。

Claims (9)

1.具有如下结构式的多支链药物偶联物或其药学上可接受的盐：

。

2.如权利要求1所述的多支链药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于所述盐包括硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐、氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、甲酸盐、乳酸盐、苯甲酸盐、醋酸盐、三氟乙酸盐、二氯乙酸盐、三氯乙酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、庚烷磺酸盐。

3.如权利要求2所述的多支链药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于所述盐为每个支链分别结合三分子盐的十二分子三氟乙酸盐：

或每个支链分别结合三分子盐的十二分子庚烷磺酸盐：

。

4.如权利要求1所述的多支链药物偶联物的制备方法， 为：

。

5.如权利要求1-3任一所述的多支链药物偶联物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗癌症的药物中的应用。

6.如权利要求5所述的多支链药物偶联物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗癌症的药物中的应用，其特征在于所述癌症包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜癌、脑瘤、间皮组织癌、肾癌、胃癌、头颈部肿瘤、肺癌、结肠直肠癌、睾丸癌。

7.一种药学上可接受的组合物，其包含权利要求1-3任一所述的多支链药物偶联物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂。

8.如权利要求7所述的药学上可接受的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的应用。

9.如权利要求8所述的药学上可接受的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的应用，其特征在于所述癌症包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜癌、脑瘤、间皮组织癌、肾癌、胃癌、头颈部肿瘤、肺癌、结肠直肠癌、睾丸癌。