CN104558117B - 一种乙酰胆碱受体介导靶向的d构型多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属药学领域，涉及一种高度稳定且可介导靶向乙酰胆碱受体高表达细胞，并跨越相对应屏障膜的D构型多肽及其纳米递药系统，以及体内外脑靶向性和在治疗脑部等疾病中的应用。经试验结果显示：^DCDX与乙酰胆碱受体结合IC₅₀为84.5nM，在血清中稳定并耐受蛋白酶的水解；^DCDX所携带模型药物被表达乙酰胆碱受体的阳性细胞特异性摄取，具有跨越该类细胞所构成屏障的能力；^DCDX修饰的高分子载体材料所构建的纳米递药系统可将所包载模型药物递送至靶组织，并显著提高药物效果。本发明的D构型多肽^DCDX可介导药物或纳米递药系统主动寻靶，在多种疾病的诊治中具备良好的应用前景。

Description

一种乙酰胆碱受体介导靶向的D构型多肽及其应用

技术领域

本发明属药学领域，涉及一种高度稳定且可介导靶向乙酰胆碱受体高表达细胞，并跨越相对应屏障膜（如血脑屏障）的D构型多肽及其纳米递药系统，具体涉及多肽^DCDX（氨基酸序列为G^DR^DE^DI^DR^DTG^DR^DA^DE^DR^DW^DS^DE^DK^DF）及其修饰的高分子载体材料所构建的脂质体和聚合物胶束等纳米递药系统，以及体内外脑靶向性和在治疗脑部等疾病中的应用。

背景技术

脑部疾病是一类危害人类生命和健康的重大疾病。由于血脑屏障的存在，大约98%的小分子药物和几乎100%的大分子药物包括蛋白和基因等难以入脑，严重影响了脑部疾病的治疗。本领域公知，血脑屏障（BBB）是一个由脑毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞和紧密连接蛋白等共同构成的结构和功能屏障，它能够选择性地输送营养物质和必需的内源性物质入脑，并排出脑内毒性代谢物以及进入脑内的外源性物质，维持大脑内环境的稳定。血脑屏障也是阻碍药物进入脑部组织的主要障碍，然而脑毛细血管内皮细胞上存在多种特异性的受体，如转铁蛋白受体、低密度脂蛋白受体和乙酰胆碱受体等，以上述受体的配体或抗体作为靶向分子对纳米递药系统进行修饰或与药物形成复合物，通过受体介导的胞吞转运（receptor mediated transcytosis，RMT）将药物递送入脑是目前最成熟的脑靶向递药策略之一。因此，研究和开发可穿透血脑屏障的靶向分子，介导药物或递药系统穿透血脑屏障而实现药物的脑内传输，具有重要的现实意义。研究表明，肿瘤细胞也高表达各种相关受体，利用受体对应的配体作为靶向分子介导靶向递药是临床肿瘤治疗及诊断实践中最常用的策略。

烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）是在脑组织包括组成血脑屏障的脑毛细血管内皮细胞、部分肿瘤细胞（如肺癌细胞）表达的一种门控型离子通道受体。本发明的申请人前期研究表明，一种起源于短神经毒素Candoxin的LoopⅡ区域、氨基酸序列为FKESWREARGTRIERG的L构型多肽^LCDX，与nAChR_s具有高亲和力，可携带递药系统穿透血脑屏障入脑。但因其稳定性较差，在血液中易被降解，降低了其体内脑靶向效果，而D构型多肽是解决其不足的最佳方案之一。多肽逆序合成被广泛用于设计与L构型多肽具有类似生物活性的高度稳定D构型多肽的制备方法。

针对上述问题，本申请的发明人拟提供一种D构型多肽靶向分子^DCDX（氨基酸序列为G^DR^DE^DI^DR^DTG^DR^DA^DE^DR^DW^DS^DE^DK^DF），旨在提高靶向分子的稳定性，从而改善其所修饰的纳米递药系统跨越血脑屏障或靶向肿瘤细胞的能力，实现对脑部疾病和肿瘤靶向诊治的目标。

目前，未见可跨越血脑屏障的D构型多肽或^DCDX修饰的纳米递药系统的研究报道。

多肽逆序合成法制备

发明内容

本发明的目的是制备一种具有高稳定性的D构型多肽靶向分子，并用其修饰高分子载体材料，构建包载药物的纳米递药系统，以提高对脑组织和肿瘤的靶向递药效果。

本发明采用多肽逆序合成技术，设计并制备了具有高稳定性并与烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）具有更高亲和力的D构型多肽^DCDX（氨基酸序列为G^DR^DE^DI^DR^DTG^DR^DA^DE^DR^DW^DS^DE^DK^DF）。

本发明制备的^DCDX在连接半胱氨酸后，可利用其分子中巯基与马来酰亚胺功能化的荧光物质反应形成复合物，所述的荧光物质选自FAM、近红外染料Cy5.5、IR820、DiR等。

本发明制备的^DCDX经上述巯基化后，可修饰在聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（PEG-DSPE）、聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA）、聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物（PEG-PLGA）、聚乙二醇-聚己内酯（PEG-PCL）等高分子载体材料上，用于构建^DCDX修饰的脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、纳米粒等纳米递药系统。

本发明中，^DCDX修饰的纳米递药系统可包载紫杉醇、多烯紫杉醇，阿霉素、表阿霉素，喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱，长春新碱，硼替唑米，^DPMI-theta等抗肿瘤药物；也可包载治疗神经退行性疾病的药物，如银杏内酯、神经营养因子等药物；还可包载荧光物质，如FAM、近红外染料Cy5.5、IR820、DiR等。

本发明的^DCDX可介导纳米递药系统靶向烟碱型乙酰胆碱受体高表达的细胞及其组织，可用于跨越血脑屏障递药治疗脑部疾病，或针对外周肿瘤的靶向诊治。

本发明提供了^DCDX制备方法和性质考察以及上述所修饰的纳米递药系统用于脑部疾病或肿瘤治疗的物质基础。

本发明尽进行了下述制备以及评价试验：

1.^DCDX、^DCDX-Cys及其荧光标记物（^DCDX-Fluorescein）的合成

根据逆序多肽合成技术，采用固相合成的方法制备^DCDX和^DCDX-Cys；通过马来酰亚胺基团与巯基的Michael加成反应合成^DCDX-Fluorescein。HPLC、MS表征结构。

2.^DCDX稳定性和受体亲和性评价

从血清稳定性、氨肽酶稳定性、与烟碱型乙酰胆碱受体蛋白结合能力和与高表达烟碱型乙酰胆碱受体的肿瘤细胞摄取能力等方面进行^DCDX性质的考察，将^DCDX、^LCDX分别与大鼠血清和氨肽酶M在37℃进行孵育，在不同时间点检测^DCDX、^LCDX的浓度以进行稳定性的比较，采用放射竞争结合法评价^DCDX、^LCDX与烟碱型乙酰胆碱受体蛋白的结合能力，比较^DCDX-Fluorescein、^LCDX-Fluorescein对烟碱型乙酰胆碱受体蛋白高表达的脑毛细血管内皮细胞（如：脑毛细血管内皮细胞bEnd.3）和模型肿瘤细胞（如：小细胞肺癌细胞NCI-H82）的体外靶向性，比较烟碱型乙酰胆碱受体蛋白高表达的血脑屏障模型对^DCDX-Fluorescein、^LCDX-Fluorescein的转运能力。

3.^DCDX修饰的纳米递药系统的构建与表征

（1）^DCDX-PEG-脂质体递药系统的构建与表征

首先合成靶向分子修饰的高分子材料^DCDX-PEG-DSPE和^LCDX-PEG-DSPE。将^DCDX-Cys与Mal-PEG-DSPE在pH7.2的PBS和DMF的混合溶液中反应得到^DCDX-PEG-DSPE。将^LCDX-Cys与Mal-PEG-DSPE按上述方法反应得到^LCDX-PEG-DSPE。

然后分别制备^DCDX、^LCDX修饰的脂质体（^DCDX-PEG-脂质体和^LCDX-PEG-脂质体）。以一定比例的HSPC/Chol/mPEG₂₀₀₀-DSPE/^DCDX-PEG-DSPE或^LCDX-PEG-DSPE为膜材料，采用成膜水化法制备^DCDX-PEG-脂质体和^LCDX-PEG-脂质体，用挤压过膜的方法减小脂质体粒径，并分别包载DiR、FAM、阿霉素（DOX），构建平均粒径在90nm的脂质体。动态光散射法测定粒径分布，负染色电镜法观察脂质体形态；

（2）^DCDX-PEG-DSPE胶束递药系统的构建与表征

以一定比例的mPEG₂₀₀₀-DSPE/^DCDX-PEG-DSPE为膜材料，分别以DiR和紫杉醇（PTX）为模型药物，采用成膜水化法制备^DCDX-PEG-DSPE胶束，构建平均粒径为10nm的胶束；

4.^DCDX-PEG-DSPE胶束递药系统的体内脑靶向性评价

对正常ICR小鼠静脉注射^DCDX-PEG-DSPE胶束/DiR、^LCDX-PEG-DSPE胶束/DiR和PEG-DSPE胶束/DiR，比较不同递药系统的脑内分布；

5.^DCDX-PEG-脂质体递药系统的体内外脑靶向性评价

考察bEnd.3细胞对^DCDX-PEG-脂质体/FAM、^LCDX-PEG-脂质体/FAM和PEG-脂质体/FAM的摄取情况，比较两种递药系统对脑毛细血管内皮细胞的体外亲合能力；

对正常ICR小鼠静脉注射^DCDX-PEG-脂质体/DiR、^LCDX-PEG-脂质体/DiR和PEG-脂质体/DiR，比较不同递药系统在各时间点的脑内分布；

6.^DCDX-PEG-脂质体递药系统的体内抗肿瘤效果评价

对荷原位脑胶质瘤动物模型静脉注射^DCDX-PEG-脂质体/DOX、^LCDX-PEG-脂质体/DOX、PEG-脂质体/DOX、游离阿霉素和生理盐水，以生存时间为指标评价不同载阿霉素递药系统的体内抗肿瘤效果。

结果表明：^DCDX比^LCDX在血清中具有更高的稳定性，且具有更强的nAChRs及其高表达nAChRs的模型细胞亲和活性；与^LCDX修饰的纳米递药系统相比，本^DCDX修饰的纳米递药系统显示出了更好的脑靶向性和更强的抗脑胶质瘤效果。

本发明的具有高稳定性且与乙酰胆碱受体具有高结合活性的D构型多肽^DCDX及其及其构建的主动靶向纳米递药系统，具有如下优点：

^DCDX与乙酰胆碱受体结合IC₅₀为84.5nM，在血清中稳定并耐受蛋白酶的水解；^DCDX所携带模型药物（如FAM等）被表达乙酰胆碱受体的阳性细胞（如脑毛细血管内皮细胞等）特异性摄取，具有跨越该类细胞所构成屏障（如血脑屏障BBB）的能力；^DCDX修饰的高分子载体材料所构建的纳米递药系统（如脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、纳米粒等）可将所包载模型药物递送至靶组织（如体外跨BBB、体内进入脑组织等），并显著提高药物效果（如包载阿霉素可延长脑胶质瘤模型动物的生存期）。所述的D构型多肽^DCDX可介导药物或纳米递药系统主动寻靶，在多种疾病的诊治中具备良好的应用前景。

附图说明

图1、^DCDX的HPLC和ESI-MS图谱，其中，

色谱方法：色谱柱（YMC，C18）：150×4.6mm；流动相A：水（含0.1%三氟乙酸），流动相B：乙腈（含0.1%三氟乙酸）；洗脱程序：0-45min5%B-65%B；流速：0.7mL/min；柱温：40℃；检测：UV214nm，保留时间：12.7min。ESI-MS：1978.2，与理论分子量相符合。

图2、^DCDX-Cys的HPLC和ESI-MS图谱，其中。

色谱方法同图1所述，保留时间：13.3min。ESI-MS：2081.6，与理论分子量相符合。

图3、^DCDX-Fluorescein的HPLC和ESI-MS图谱，

色谱方法同图1所述，保留时间：16.4min。ESI-MS：2508.7，与理论分子量相符合。

图4、^DCDX-PEG₃₄₀₀-DSPE的¹H-NMR图谱，

图中显示，Mal-PEG-DSPE的核磁图谱于6.7ppm显示出马来酰亚胺峰，而^DCDX-PEG-DSPE的核磁图谱中该峰消失，显示Mal-PEG-DSPE中的马来酰亚胺基团已与^DCDX反应。

图5、^DCDX对α-Bungarotoxin与乙酰胆碱受体结合的竞争抑制曲线，

其中，CDX的浓度为10^-5～10^-11M时，对α-Bungarotoxin与乙酰胆碱受体结合竞争抑制效果，^DCDX的IC₅₀值为84.5nM，其与乙酰胆碱受体的结合活性约为^LCDX（IC₅₀值为441.6nM）的5倍。

图6、^DCDX的血清稳定性，

显示CDX在25%大鼠血清中的稳定性，A和B分别为^LCDX和^DCDX在15min和24h的液相HPLC；C为各时间点残留的完整多肽百分比，^DCDX具有比^LCDX更高的血清稳定性。

图7、^DCDX的氨肽酶稳定性，

显示CDX在10mg/mL的氨肽酶M溶液中的稳定性，A和B分别为^LCDX和^DCDX在0min和4h的液相HPLC；C为各时间点残留的完整多肽百分比，^DCDX具有比^LCDX更高的氨肽酶M稳定性。

图8、脑毛细血管内皮细胞bEnd.3对Fluorescein标记CDX的摄取，

其中，A和B分别为Fluorescein标记的CDX多肽于37℃分别与bEnd.3细胞作用2h后的激光共聚焦照片和流式结果，bEnd.3细胞对DCDX的摄取明显高于LCDX以及游离的FITC。

图9、小细胞肺癌NCI-H82对Fluorescein标记的CDX的摄取，

显示了Fluorescein标记的CDX多肽于37℃分别与NCI-H82细胞作用12h后的流式结果，NCI-H82细胞对DCDX的摄取明显高于LCDX。

图10、DCDX的BBB体外转运实验，

显示了Fluorescein标记的CDX多肽的体外BBB模型转运结果，图A说明37℃DCDX于各时间点转运至下室的量均大于LCDX，而4℃时各时间点下室两者的量均很少且无明显差别，图B说明经过烟碱型乙酰胆碱天然配体α-Bgt抑制后，各时间点下室两者的量均减少。

图11、脑毛细血管内皮细胞对包载5-FAM脂质体的摄取，

其中图A和B分别为包载5-FAM的各处方脂质体于37℃分别与bEnd.3细胞作用2h后的激光共聚焦照片和流式结果，bEnd.3细胞对DCDX修饰脂质体的摄取明显高于LCDX修饰脂质体以及无靶头脂质体。

图12、载近红外染料的PEG-脂质体的脑内分布，

显示正常老鼠分别注射PEG-脂质体/DiR（LS）、LCDX-PEG-脂质体/DiR（LCDX-LS）和DCDX-PEG-脂质体/DiR（DCDX-LS）后1h和4h的脑和各组织离体成像分布结果，与无靶头脂质体相比，DCDX可以通过乙酰胆碱受体介导递药系统穿透血脑屏障，且效果优于LCDX。

图13、载近红外染料的PEG-DSPE胶束的脑内分布，

显示正常裸鼠分别注射包载DiR的DCDX-PEG-DSPE胶束（DCDX-micelle）和PEG-DSPE胶束（M-micelle）的活体及离体成像分布结果，与无靶头胶束相比，DCDX-PEG-DSPE胶束在4h时脑部有明显荧光分布，说明DCDX-PEG-DSPE可以通过乙酰胆碱受体介导递药系统穿透血脑屏障。

图14、载阿霉素脂质体的粒径和电镜照片，

其中图A、D分别为PEG-脂质体/DOX的粒径和电镜照片，B、E分别为LCDX-PEG-脂质体/DOX的粒径和电镜照片，C、F分别为DCDX-PEG-脂质体/DOX的粒径和电镜照片，三者大小和形态均无显著差异。

图15、脑胶质瘤原位肿瘤模型裸鼠的生存曲线，

其中，生理盐水组、游离阿霉素组、PEG-脂质体/DOX组、LCDX-PEG-脂质体/DOX组和DCDX-PEG-脂质体/DOX组平均生存时间为24、26.5、27、28和33.5天，结果表明，与生理盐水组相比，LCDX-PEG-脂质体/DOX和DCDX-PEG-脂质体/DOX显著延长荷瘤裸鼠的生存时间，且DCDX-PEG-脂质体/DOX的效果优于LCDX-PEG-脂质体/DOX。

具体实施方式

通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但本发明不局限于如下描述范围。

实施例1

^DCDX、^DCDX-Fluorescein、^DCDX-PEG-DSPE的合成与表征

1.^DCDX以及^DCDX-Cys的合成与表征

采用逆序固相多肽合成法，设计并合成了由非天然D构型氨基酸所构成的^DCDX（序列为G^DR^DE^DI^DR^DTG^DR^DA^DE^DR^DW^DS^DE^DK^DF^D）和^DCDX-Cys（序列为G^DR^DE^DI^DR^DTG^DR^DA^DE^DR^DW^DS^DE^DK^DF^DC^D）。HPLC和ESI-MS表征^DCDX及^DCDX-Cys的纯度和分子量（Mw）。HPLC图谱、质谱图如图1、图2所示。

2.^DCDX-Fluorescein的合成与表征

将上述步骤得到的^DCDX-Cys溶于0.1M的PBS溶液中（pH7.2），取Fluorescein-5-maleimide溶于DMF，两者混合后磁力搅拌反应，HPLC监测，待^DCDX-Cys反应完全后停止反应，制备液相纯化，冷冻干燥得^DCDX-Fluorescein纯品。HPLC图谱、质谱图如图3所示。

3.^DCDX-PEG-DSPE的合成与表征

将^DCDX-Cys溶于0.1M的PBS溶液中（pH7.2），取Mal-PEG-DSPE溶于DMF，两者混合后磁力搅拌反应，HPLC监测，待Mal-PEG-DSPE反应完全后停止反应，过量的^DCDX-Cys和DMF透析（截留分子量3.5kDa）除去，冷冻干燥得^DCDX-PEG-DSPE，NMR表征其结构（如图4所示）。

实施例2

^DCDX竞争结合烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）的亲和性试验

1.大鼠海马nAChRs膜蛋白的提取

Wister大鼠（220～260g）断头处死后迅速分离出海马，称重后加入10倍体积的Tris-HCl缓冲液（50mM Tris-HCl，5mM MgCl₂·6H₂O，1mM EDTA，0.5%(W/V)BSA，0.1%NaN₃，0.32M sucrose，pH7.4），用匀浆器10000转/分钟进行匀浆，每次30sec，共3次。匀浆液经1000×g离心10min，取上清液再于4℃12000转/分钟离心30min，收集沉淀，用原重量10倍体积Tris-HCl缓冲液（pH7.4）重新悬液，离心10min，取沉淀再用相同缓冲液洗涤，12000转/分钟离心10min，将沉淀用以上缓冲液悬浮即得nAChRs，分装后-80℃保存备用。BCA法测定蛋白质含量。

2.^DCDX竞争结合nAChRs的亲和性试验

在37℃反应器所有管中均加入50μgnAChRs蛋白。测试管中依次加入20μL一定浓度的^DCDX或^LCDX，非特异结合管中加入50μL非标记配体α-Bungarotoxin（α-Bgt），终浓度为10μM，预先反应50min。全部管依次加入30μL¹²⁵I-α-Bgt，终浓度为2nM，并用Tris-HCl缓冲液pH7.4补足体积至200μL，37℃孵育2h。点样于49型玻璃纤维滤膜上，负压抽滤，再用冰冷的缓冲液洗涤3次，每次2ml，抽干滤膜，γ计数器测量。^DCDX和^LCDX在不同浓度时对nAChRs与¹²⁵I-α-Bgt结合的竞争性抑制作用结果（如图5所示）表明，^DCDX具有竞争抑制α-Bgt对nAChRs结合的活性，其IC₅₀值为84.5nM，对nAChRs的亲和活性是^LCDX（IC₅₀=441.6nM）的5倍。

实施例3^DCDX的稳定性考察

1.^DCDX的血清稳定性考察

将^DCDX或^LCDX配成1mg/mL水溶液，取0.1mL加入0.9mL的25%大鼠血清中，37℃孵育，分别于0.25、0.5、1、2、4、8、12和24h取出100μL反应液，加入20μL乙腈沉淀血清中蛋白，4℃静置20min，12000转/分钟离心10min，取上清液20μL进行HPLC分析。^DCDX的血清稳定性结果（如图6所示）表明，^DCDX具有比^LCDX更高的血清稳定性。

2.^DCDX的氨肽酶稳定性考察

将^DCDX或^LCDX多肽溶于50mM的Tris-HCl缓冲液（pH7.4），与0.01mg/mL的氨肽酶M于37℃孵育，分别于0、0.5、1、2和4h取样100μL，加入20μL冰醋酸终止反应后，进行HPLC分析。^DCDX和^LCDX的氨肽酶M稳定性结果（如图7所示）表明，^DCDX具有比^LCDX更高的氨肽酶M稳定性。

实施例4^DCDX的体外细胞靶向性验证

DCDX对脑毛细血管内皮细胞的体外靶向性验证

取对数生长期的单层培养的脑毛细血管内皮细胞（bEnd.3细胞），用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1×105个细胞接种于12孔培养板中，每孔体积1mL，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃，5%CO2及饱和湿度条件下培养24h后，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制浓度为5μM的FITC、LCDX-Fluorescein及DCDX-Fluorescein溶液。将培养板中的培养液吸出，加入5μM的FITC、LCDX-Fluorescein和DCDX-Fluorescein溶液，37℃孵育2h，吸弃上清液。用PBS溶液洗三次，甲醛固定液固定细胞，DAPI进行细胞核染色后，激光共聚焦观察，细胞内化照片如图8A所示，另用PBS洗三次后，进行流式细胞仪分析，结果如图8B所示。

DCDX对小细胞肺癌细胞的体外靶向性验证

取对数生长期的悬浮NCI-H82细胞，分别与含10%胎牛血清的DMEM培养液配制浓度为5μM的LCDX-Fluorescein及DCDX-Fluorescein溶液在37℃，5%CO2及饱和湿度条件下孵育12h后，离心，用PBS洗三次后，进行流式细胞仪分析，结果如图9所示。

实施例5^DCDX的体外血脑屏障模型（BBB）转运试验

1．原代脑毛细血管的提取及体外BBB模型的建立

4周龄SD大鼠断头后取脑，于冰冷的D-Hanks溶液中迅速分离得到大脑皮层，除去脑膜和脑部大血管后剪碎，加入胶原酶和DNA酶37℃消化90min后，1000转/分钟离心8min，弃去上清，转移至20%的BSA中，1000g/分钟4℃离心20min，弃去中上层液体，将底部微血管转移至培液中，1000转/分钟离心5min，用含20%胎牛血清的DMEM培养液配成微血管段悬液，接种于预先铺有鼠尾胶原的24孔transwell中，将transwell移入二氧化碳培养箱中，37℃，5%CO₂及饱和湿度条件下培养24h，换成含有嘌呤霉素的内皮专用培养液继续培养72h后，再换成含有细胞生长因子的内皮专用培养液培养72h，测得电阻超过200Ω/cm²，即体外BBB模型成功建立。

2．体外BBB转运试验

用含10%胎牛血清的无酚红DMEM培养液配制浓度为50μM的^LCDX-Fluorescein及^DCDX-Fluorescein溶液。将transwell上室的培养液吸出，加入50μM的^LCDX-Fluorescein和^DCDX-Fluorescein溶液，下室加入500μl的PBS，于4℃和37℃孵育，分别于30min、1h、1.5h、2h取出下室液体100μl进行HPLC分析，并补加100μL新鲜的PBS。结果（如图10A所示）表明，37℃^DCDX于各时间点转运至下室的量均大于^LCDX，而4℃时各时间点下室两者的量均很少且无明显差别。体外BBB转运抑制实验时，预先加入150μM的α-Bgt孵育1h后进行如上实验。结果（如图10B所示）表明，经过烟碱型乙酰胆碱天然配体α-Bgt抑制后，各时间点下室两者的量均减少。

实施例6^DCDX-PEG-脂质体的体外细胞靶向性验证

1.^DCDX-PEG-脂质体/FAM的制备

PEG-脂质体膜材料处方组成为HSPC/Chol/mPEG₂₀₀₀-DSPE(52:43:5,mol/mol)，CDX修饰的PEG脂质体膜材料处方为HSPC/Chol/mPEG₂₀₀₀-DSPE/CDX-PEG-DSPE(52:43:3:2,mol/mol)。称取上述膜材料溶于氯仿，减压旋转蒸发除去有机溶媒，得均匀脂质膜，真空干燥24h。加入5-FAM水溶液水化，60℃水浴震荡2h，得脂质体混悬液。在60℃水浴中，使用高压均质机（若脂质体体积少于10mL则改用微型挤出器）依次将脂质体挤压过400、200、100和50nm核孔膜，使其粒径减小。然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶G-50柱分离除去未包封的5-FAM，得到包载5-FAM的脂质体。

2.^DCDX-PEG-脂质体对脑毛细血管内皮细胞的体外靶向性验证

取对数生长期的单层培养的脑毛细血管内皮细胞bEnd.3，用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1×10⁵个细胞接种于12孔培养板中，每孔体积1mL，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃，5%CO₂及饱和湿度条件下培养24h后，将培养板中的培养液吸出，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液配制的荧光浓度为5μM的PEG-脂质体/FAM、^LCDX-PEG-脂质体/FAM和^DCDX-PEG-脂质体/FAM溶液，37℃孵育2h，吸弃上清液。用PBS溶液洗三次，甲醛固定液固定细胞，DAPI进行细胞核染色后，激光共聚焦观察，细胞内化照片如图11A所示，另用PBS洗三次后，进行流式细胞仪分析，结果如图11B所示。

实施例7^DCDX-PEG-脂质体的体内靶向性验证

1.^DCDX-PEG-脂质体/DiR的制备

脂质体膜材料处方同上，将上述膜材料及DiR溶于氯仿，减压旋转蒸发除去有机溶媒，得均匀脂质膜，真空干燥24h。加入生理盐水溶液水化，60℃水浴震荡2h，得脂质体混悬液。在60℃水浴中，使用高压均质机（若脂质体体积少于10mL则改用微型挤出器）依次将脂质体挤压过400、200、100和50nm核孔膜，使其粒径减小。然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶G-50柱分离除去未包封的DiR，得脂质体。

2.^DCDX-PEG-脂质体的体内靶向性验证

将ICR小鼠（约25g）分别尾静脉注射100μL PEG-脂质体/DiR、^LCDX-PEG-脂质体/DiR和^DCDX-PEG-脂质体/DiR。分别在1h、和4h水合氯醛麻醉，用生理盐水心脏灌流，分别收集心、肝、脾、肺、肾和脑等主要器官，用活体成像仪检测各个脏器的荧光分布，结果如图12所示，与无靶头脂质体相比，^DCDX可以通过乙酰胆碱受体介导递药系统穿透血脑屏障，且效果优于^LCDX。

实施例8^DCDX-PEG-DSPE胶束的体内靶向性验证

将制备的^DCDX-PEG-DSPE胶束材料，按照重量为5%的比例与mPEG₂₀₀₀-DSPE共溶在氯仿中，加入DiR，成膜水化，制备包埋近红外染料DiR的^DCDX-PEG-DSPE胶束，同法制备载DiR的mPEG-DSPE胶束（M-micelle），裸鼠尾静脉注射100μL。于4h进行水合氯醛麻醉，进行活体成像后，用生理盐水心脏灌流，分别收集心、肝、脾、肺、肾和脑等主要器官，用活体成像仪检测各个脏器的荧光分布，结果如图13所示，与无靶头胶束相比，^DCDX-PEG-DSPE胶束在4h时脑部有明显荧光分布，说明^DCDX-PEG-DSPE可以通过乙酰胆碱受体介导递药系统穿透血脑屏障。

实施例9载阿霉素的^DCDX-PEG-脂质体体内药效学试验

脂质体膜材料处方同上，采用硫酸铵梯度法制备包载阿霉素（DOX）的各脂质体。动态光散射法测定粒径分布，负染色电镜法观察脂质体形态（如图14所示），脑胶质瘤原位肿瘤模型裸鼠尾静脉分别注射生理盐水、游离阿霉素、PEG-脂质体/DOX、^LCDX-PEG-脂质体/DOX和^DCDX-PEG-脂质体/DOX各100μL。给药剂量为8mg/Kg，分别在肿瘤种植后第6、9、12和15天给药，记录裸鼠的生存时间，裸鼠生存曲线如图15所示，与其它组相比，^DCDX-PEG-脂质体/DOX显著延长原位肿瘤裸鼠生存时间。

Claims (10)

1.乙酰胆碱受体介导靶向的D构型多肽^DCDX在制备脑靶药物分子或纳米递药系统中的用途；所述的D构型多肽^DCDX其氨基酸序列为G^DR^DE^DI^DR^DTG^DR^DA^DE^DR^DW^DS^DE^DK^DF。

2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的D构型多肽^DCDX巯基化后与含有马来酰亚胺基团的物质反应获得^DCDX-X复合物，复合物中X是荧光物质FAM和近红外染料cy5.5、IR820或DiR。

3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的D构型多肽^DCDX巯基化后与马来酰亚胺化的聚乙二醇-Y复合物连接获得^DCDX-聚乙二醇-Y复合物，复合物中Y选自磷脂、聚乳酸(PLA)、乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)或聚己内酯(PCL) 。

4.按权利要求1的用途，其特征在于所述的D构型多肽^DCDX介导乙酰胆碱受体将药物分子或纳米递药系统实现肿瘤靶向递送。

5.按权利要求2的用途，其特征在于，所述的^DCDX-复合物用于制备用作脑部疾病的影像诊断和示踪制剂。

6.按权利要求3的用途，其特征在于，所述的^DCDX-聚乙二醇-磷脂复合物用于制备脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统或聚合物圆盘递药系统。

7.按权利要求3的用途，其特征在于，其中的^DCDX-聚乙二醇-聚乳酸复合物、 ^DCDX-聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物复合物、^DCDX-聚乙二醇-聚己内酯复合物用于制备聚合物胶束递药系统或纳米粒递药系统。

8.按权利要求6或7所述的用途，其中所述的脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、聚合物圆盘递药系统或纳米粒递药系统用于包载诊断药物，所述的包载药物选自异硫氰荧光素FITC或近红外染料Cy5.5、IR820或DiR，所述的诊断药物用于脑部疾病和乙酰胆碱受体高表达的外周肿瘤的影像诊断和示踪。

9.按权利要求6或7所述的用途，所述的脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、聚合物圆盘递药系统或纳米粒递药系统包载抗肿瘤药物，所包载药物选自阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基 喜树碱、长春新碱、硼替唑米或^DPMI-δ，所述的抗肿瘤药物用于脑肿瘤和高表达乙酰胆碱受体外周肿瘤的靶向治疗。

10.按权利要求6或7所述的用途，其中所述的脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、聚合物圆盘递药系统或纳米粒递药系统包载治疗神经退行性疾病药物，所包载药物是银杏内酯或神经营养因子，用于神经退行性疾病的靶向治疗。