CN110772645A - 功能化穿膜肽修饰的药物递送系统 - Google Patents

功能化穿膜肽修饰的药物递送系统 Download PDF

Info

Publication number
CN110772645A
CN110772645A CN201810868804.1A CN201810868804A CN110772645A CN 110772645 A CN110772645 A CN 110772645A CN 201810868804 A CN201810868804 A CN 201810868804A CN 110772645 A CN110772645 A CN 110772645A
Authority
CN
China
Prior art keywords
penetrating peptide
drug delivery
cell
delivery system
functionalized cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810868804.1A
Other languages
English (en)
Inventor
魏刚
张燕宇
张利
林耀忠
陆伟跃
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fudan University
Celtek Bioscience LLC
Original Assignee
Fudan University
Celtek Bioscience LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fudan University, Celtek Bioscience LLC filed Critical Fudan University
Priority to CN201810868804.1A priority Critical patent/CN110772645A/zh
Publication of CN110772645A publication Critical patent/CN110772645A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/17—Amides, e.g. hydroxamic acids having the group >N—C(O)—N< or >N—C(S)—N<, e.g. urea, thiourea, carmustine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明属药物制剂领域，涉及功能化穿膜肽修饰的药物递送系统，该药物递送系统，将功能化穿膜肽修饰在脂质体、脂质圆盘、纳米粒、固态脂质纳米粒、纳米结构的脂质载体、纳米复合物、胶束等纳米药物递送载体表面，利用穿膜肽的穿膜功能帮助纳米药物递送载体穿透体内的吸收屏障，并渗入到肿瘤组织深部，进而将药物递送至肿瘤细胞内部；同时，所述穿膜肽还能够阻断NF‑κB通路，并具有细胞核定位功能，能够将其携载的化疗药物递送至细胞核内，发挥协同抗肿瘤作用；本发明所述功能化穿膜肽修饰的靶向药物递送系统具有良好的生物安全性，作为化疗药物的递送载体，可以增加药物在肿瘤部位的蓄积，显著改善化疗药物的抗肿瘤治疗效果。

Description

功能化穿膜肽修饰的药物递送系统
技术领域
本发明属药物制剂领域，涉及功能化穿膜肽修饰的药物递送系统；该药物递送系统为，将功能化穿膜肽修饰在脂质体、脂质圆盘、纳米粒、固态脂质纳米粒、纳米结构的脂质载体、纳米复合物、胶束等纳米药物递送载体表面，利用穿膜肽的穿膜功能帮助纳米药物递送载体穿透体内的吸收屏障，并渗入到肿瘤组织深部，进而将药物递送至肿瘤细胞内部；同时，所述功能化穿膜肽还能阻断NF-κB通路，并具有细胞核定位功能，能将其携载的化疗药物递送至细胞核内，发挥协同抗肿瘤作用；所述功能化穿膜肽修饰的靶向药物递送系统具有良好的生物安全性，作为化疗药物的递送载体，可增加药物在肿瘤部位的蓄积，显著改善化疗药物的抗肿瘤治疗效果。
背景技术
恶性肿瘤是引起死亡的主要原因之一，严重影响人类生命健康。在多数肿瘤中存在NF-κB常态过表达现象，NF-κB在肿瘤发生发展过程中激活的关联基因涉及细胞凋亡、炎症反应、细胞增殖、血管形成、肿瘤转移等。所述纳米药物递送载体如：脂质体、脂质圆盘、纳米粒、固态脂质纳米粒、纳米结构的脂质载体、纳米复合物、胶束等，为肿瘤治疗提供有效策略，具有提高生物利用度、延长药物在体内的循环时间、降低毒副作用等优势，但缺点是组织穿透能力差、药物无法在病灶部位有效富集。
当前研究的热点为在纳米药物递送载体表面修饰功能性靶头，其中有一些研究是关于细胞穿膜肽(cell-penetrating peptiides，CPPs)的研究；所述CPPs是一类序列中富含碱性氨基酸的短肽，能够携带分子量较大的外源性分子进入细胞；该优势使得CPPs修饰成为具有前景的药物递送手段；但传统的CPPs存在以下缺陷：(1)因带有大量的正电荷，易被血浆中的蛋白清除，导致药物的体内循环时间缩短；(2)缺乏组织选择性，使药物难以富集在肿瘤部位，治疗效果并不理想；因此，所述CPPs在临床上的应用非常受限。目前文献中报道用于修饰递药系统的CPPs主要有：天然来源的CPPs，如TAT、Penetratin等；人工合成的CPPs，如寡聚精氨酸等。有研究将TAT连接AAN(丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺)修饰在阿霉素脂质体表面(AAN-TAT-Lipo)用于治疗乳腺癌，AAN-TAT-Lipo能够显著增强对肿瘤的杀伤作用，同时减少阿霉素的毒副作用(Nat Commun，2014，5：4280)；另外一类穿膜肽是以一类序列中富含疏水氨基酸的短肽，比如SN50。SN50是一个NF-κB蛋白抑制剂，其结构中包含两部分序列，即穿膜序列与入核序列，其中穿膜序列是源白天然信号肽(signal peptide)的疏水氨基酸段(h-region)，而入核序列由NF-κB蛋白的p50亚基衍化而来，使得SN50可进入细胞并且竞争抑制NF-κB蛋白进入细胞核内发挥作用(J Biol Chem，1995，270：14255-14258)。
本发明采用更加优化的功能化多肽CB5005修饰纳米药物递送载体；所述CB5005的氨基酸序列为KLKLALALALAVQRKRQKLMP，可分为两部分：穿膜序列(KLKLALALALA)与入核序列(VQRKRQKLMP)(中国专利CN101090730B，United States Patent 7，408，022)。已有研究证实CB5005能够穿透细胞膜和肿瘤球，并分布于肿瘤组织中(Acta Biomater，2016，42：90-101)。CB5005的穿膜序列仅含两个碱性氨基酸，因此在血浆中的稳定性较高，有利于延长药物在体内的循环时间，同时其亲水性也得到了显著提高；其入核序列可阻断NF-κB通路，并能将药物带入到细胞核内发挥作用。
本发明将CB5005修饰在脂质体、脂质圆盘、纳米粒、固态脂质纳米粒、纳米结构的脂质载体、纳米复合物、胶束等纳米药物递送载体表面，利用CB5005的穿膜序列帮助纳米药物递送载体穿透体内的吸收屏障，并渗入到肿瘤组织深部，进而将药物递送至肿瘤细胞内部；同时，CB5005修饰的纳米药物递送系统还能通过其入核序列阻断NF-κB通路，并具有细胞核定位功能，能将其携载的化疗药物递送至细胞核内，发挥协同抗肿瘤作用，获得更好的抗肿瘤治疗效果。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷或不足，提供一类功能化穿膜肽修饰的药物递送系统。
本药物递送系统由表面修饰的功能化穿膜肽、药物递送载体和抗肿瘤的化疗药物构成，特点是能穿透体内的吸收屏障，并能渗入到肿瘤组织深部，进而将药物递送至肿瘤细胞内部；同时，该药物递送系统还能阻断NF-κB通路，并具有细胞核定位功能，能将其携载的化疗药物递送至细胞核内，发挥协同抗肿瘤作用；所述功能化穿膜肽修饰的纳米药物递送系统具有良好的生物安全性，作为化疗药物的递送载体，可增加药物在肿瘤部位的蓄积，显著改善化疗药物的抗肿瘤治疗效果。
本发明中，所述的功能化穿膜肽(CB5005)的氨基酸序列为：
KLKLALALALAVQRKRQKLMP
其结构可分为两部分：穿膜序列(KLKLALALALA)与入核序列(VQRKRQKLMP)；专门设计的穿膜序列仅含两个碱性氨基酸，因此在血浆中的稳定性较高，有利于延长药物在体内的循环时间；其入核序列可竞争和抑制NF-κB蛋白进入细胞核，进而阻断NF-κB通路，并能将药物带入到细胞核内发挥作用。
本发明中，所述药物递送载体，包括脂质体、脂质圆盘、纳米粒、固态脂质纳米粒、纳米结构的脂质载体、纳米复合物、胶束等，该所述药物载体的粒径介于10～1000nm之间，优选介于10～500nm之间，进一步优选介于20～300nm之间。
本发明中，所述的功能化穿膜肽可通过双功能连接基团修饰在纳米药物递送载体表面；所述双功能连接基团如一端带有马来酰亚胺另一端带有琥珀酰亚胺的双功能聚乙二醇(MAL-PEG-NHS)；其中，马来酰亚胺可与末端带有半胱氨酸(Cys)的功能化穿膜肽(CB5005-Cys)相连，琥珀酰亚胺可与纳米药物载体表面的氨基发生反应，进而将功能化穿膜肽修饰在纳米药物载体表面；
所述聚乙二醇的分子量介于40～20000之间，优选介于100～10000之间，进一步优选介于200～5000之间；
所述功能化穿膜肽修饰的纳米药物载体制备材料占全部纳米药物载体制备材料的0.1％～30％(摩尔比)，优选0.5％～20％(摩尔比)，进一步优选1.0％～10％(摩尔比)。
本发明所述的功能化穿膜肽修饰的药物递送系统，可用于包载肿瘤诊断试剂或治疗剂量的抗肿瘤药物；所述治疗剂量的抗肿瘤药物选自但不局限于下列细胞毒类药物中的一种或其复方：
(1)作用于DNA化学结构的药物
①烷化剂和氮芥类(如：氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑等)、塞替派类(如：塞替派等)、亚硝尿类(如：卡莫司汀、司莫司汀等)和甲基磺酸酯类(如：白消安等)；
②铂类化合物(如：顺铂、卡铂、奥沙利铂等)；
③丝裂霉素(如：丝裂霉素等)；
(2)影响核酸合成的药物
①二氢叶酸还原酶抑制剂(如：甲氨蝶呤、培美曲塞等)；
②胸腺核苷合成酶抑制剂(如：5-氟尿嘧啶、呋喃氟脲嘧啶、卡培他滨等)；
③嘌呤核苷酸合成酶抑制剂(如：6-巯基嘌呤等)；
④核苷酸还原酶抑制剂(如：羟基脲等)；
⑤DNA多聚酶抑制剂(如：阿糖胞苷、吉西他滨等)；
(3)作用于核酸转录的药物(如：放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等)；
(4)作用于DNA复制的拓扑异构酶I抑制剂(如：伊立替康、拓扑替康、羟基喜树碱等)；
(5)作用于有丝分裂M期干扰微管蛋白合成的药物(如：紫杉醇、多西他赛、长春新碱、去甲长春新碱、鬼臼碱类、高三尖杉酯碱等)；
(6)其他细胞毒药物(如：门冬酰胺酶)。
为了直观地展示本发明中所述的功能化穿膜肽修饰的药物递送系统在穿透吸收屏障、改善细胞摄取、增加药物在肿瘤部位的蓄积以及协同抑制肿瘤等方面的效果，本发明中分别以阿霉素(DOX)、伊立替康(IRI)和卡莫司汀(BCNU)为模型药物，制备了表面修饰功能化穿膜肽CB5005的脂质体与脂质圆盘，并进行了一系列体内外评价，结果表明，与未经修饰的纳米药物递送载体相比，功能化穿膜肽CB5005修饰的纳米药物递送系统显著增加了药物在肿瘤组织中的分布，并进而显著改善了抗肿瘤药物的治疗效果。
附图说明
图1：Mal-PEG-DSPE和CB5005-PEG-DSPE的HPLC与1H-NMR图谱。
图2：脑胶质瘤细胞对功能化穿膜肽修饰的脂质体的摄取，
A：CB5005-LS/FAM、LS/FAM和游离FAM的细胞摄取，B：(1)FAM阳性细胞百分率，(2)细胞摄取平均值。
图3：肺癌细胞对功能化穿膜肽修饰的脂质体的摄取，
A：CB5005-LS/FAM、LS/FAM和游离FAM的细胞摄取，B：(1)流式细胞分析图谱，(2)细胞摄取平均值。
图4：脑胶质瘤细胞对功能化穿膜肽修饰的脂质圆盘的摄取，
A：CB5005-Disk/FITC、Disk/FITC和游离FITC的细胞摄取，B：(1)流式细胞分析图谱，(2)细胞摄取平均值。
图5：功能化穿膜肽修饰的阿霉素脂质体对脑胶质瘤细胞的毒性。
图6：功能化穿膜肽修饰的伊立替康脂质体对肺癌细胞的毒性。
图7功能化穿膜肽修饰的卡莫司汀脂质圆盘对脑胶质瘤细胞的毒性。
图8功能化穿膜肽修饰的脂质体在正常动物体内分布，
A(a)：全身影像，(b)脑部影像，(c)离体器官，由上至下依次为心肝脾肺肾，(d)离体脑组织；B：离体脑组织荧光强度定量比较。
图9功能化穿膜肽修饰的脂质体在荷移植脑胶质瘤动物体内分布，
A(a)：全身影像，(b)肿瘤部位影像，(c)离体器官，由上至下依次为心肝脾肺肾，(d)离体肿瘤组织；B：离体肿瘤组织荧光强度定量比较。
图10功能化穿膜肽修饰的脂质体在荷原位脑胶质瘤动物体内分布，
A(a)：全身影像，(b)脑部影像，(c)离体脑组织，(d)离体器官，由上至下依次为心肝脾肺肾，(d)离体脑肿瘤组织；B：离体脑肿瘤组织荧光强度定量比较。
图11功能化穿膜肽修饰的脂质体在荷移植肺癌动物体内分布，
A：不同时间点的全身影像；B：不同时间点的肿瘤部位荧光强度定量比较；C：离体器官，由左至右依次为心肝脾肺肾脑和肿瘤，最下一行为离体肿瘤组织单独比较；D：离体肿瘤组织荧光强度定量比较。
图12功能化穿膜肽修饰的脂质圆盘在荷原位脑胶质瘤动物体内分布，
A：(1)不同时间点的脑部影像，(2)离体脑肿瘤组织；B：不同时间点的肿瘤部位荧光强度定量比较；C：离体器官，由左至右依次为心肝脾肺肾和脑，最下一行为离体脑组织单独比较；D：离体脑肿瘤组织荧光强度定量比较。
图13用功能化穿膜肽修饰的阿霉素脂质体治疗荷原位脑胶质瘤动物的生存曲线。
图14用功能化穿膜肽修饰的伊立替康脂质体治疗荷移植肺癌动物的药效
A：肿瘤体积随时间变化曲线；B：体重增长曲线；C：离体肿瘤；D：抑瘤率比较。
图15用功能化穿膜肽修饰的卡莫司汀脂质圆盘治疗荷原位脑胶质瘤动物的生存曲线。
具体实施方式
以下结合本发明的具体实施例进一步阐明本发明，但并不限制其保护范围。
实施例1功能化穿膜肽-聚乙二醇-磷脂(CB5005-PEG-DSPE)的合成与鉴定
将适量C-末端连接半胱氨酸的CB5005(CB5005-Cys)溶于0.1M PBS溶液中(pH7.2)，取适量马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂(MaI-PEG-DSPE)溶于二甲基甲酰胺(DMF)，CB5005-Cys与Mal-PEG-DSPE投料摩尔比为1.2∶1.0，两者混合后室温磁力搅拌反应2h，过量的CB5005-Cys和DMF用截留分子量为3.5kDa的透析袋透析除去，冷冻干燥得CB5005-PEG-DSPE。采用HPLC和1H-NMR表征反应所得产物。
实施例2功能化穿膜肽修饰的纳米药物递送系统的制备
制备包载荧光探针5-羧基荧光素(FAM)的脂质体：将磷脂(HSPC)、胆固醇(Chol)和聚乙二醇-磷脂(mPEG2000-DSPE)按摩尔比为52∶43∶5制备包载5-羧基荧光素(FAM)的脂质体(LS/FAM)，同时将HSPC、Chol、mPEG2000-DSPE和CB5005-PEG-DSPE按摩尔比为52∶43∶3∶2制备CB5005-LS/FAM。分别称取上述膜材料于茄形瓶中，加入适量的氯仿使膜材完全溶解，减压旋转蒸发除去氯仿，得均匀的脂质膜，再将脂质膜置于真空干燥箱中干燥24h以除去残留的氯仿。用5-FAM溶液(将5-FAM粉末溶于生理盐水并加入适量的氢氧化钠溶液使5-FAM完全溶解)水化脂质膜，60℃水浴震荡直至脂质膜完全水化下来，然后使用微型挤出器依次将脂质体挤压过400、200、100和50nm核孔膜。以生理盐水为洗脱液，将脂质体用葡聚糖凝胶G-50层析柱分离除去未包封的FAM，得LS/FAM和CB5005-LS/FAM。
制备包载荧光探针DiR的脂质体：包载荧光探针DiR的脂质体(LS/DiR)及CB5005-LS/DiR的膜材料处方同上。将上述膜材料及DiR溶于适量氯仿中，用旋转蒸发仪减压旋转蒸发除去氯仿，得均匀的脂质膜，再将脂质膜置于真空干燥箱中干燥24h以除去残留的氯仿。加入适量生理盐水水化，60℃水浴震荡直至脂质膜完全水化下来，得脂质体混悬液。依次将脂质体挤压过400、200、100和50nm核孔膜，使粒径减小。再用生理盐水为洗脱液，过G-50柱分离除去未包封的DiR，得LS/DiR和CB5005-LS/DiR。
制备包载阿霉素(DOX)的脂质体：包载阿霉素的脂质体(LS/DOX)及CB5005-LS/DOX的膜材料处方同上。分别称取上述膜材料，加入一定量的氯仿使膜材完全溶解，减压旋转蒸发除去氯仿，得均匀的脂质膜，再将脂质膜置于真空干燥箱中干燥24h以除去残留的氯仿。用0.32M硫酸铵溶液水化脂质膜，60℃水浴震荡直至脂质膜完全水化下来，得脂质体混悬液，再使用微型挤出器依次将脂质体挤压过400、200、100和50nm核孔膜，得空白脂质体。然后采用硫酸铵梯度法将模型药物阿霉素主动载入空白脂质体内，即上述空白脂质体用生理盐水洗脱通过G-50凝胶柱，使脂质体外水相由硫酸铵更换为生理盐水。按照药脂比为1∶10(w/w)加入浓度为5mg/mL的阿霉素生理盐水溶液，60℃水浴振荡30min。用生理盐水洗脱通过葡聚糖凝胶G-50凝胶柱，除去游离阿霉素，得LS/DOX和CB5005-LS/DOX。
薄膜水化法制备包载伊立替康(IRI)的脂质体：采用mPEG2000-DSPE、HSPC和Chol按摩尔比为5∶52∶43的处方制备LS/IRI，mPEG2000-DSPE、CB5005-PEG3400-DSPE、HSPC和Chol按摩尔比为3∶2∶52∶43的处方制备CB5005-LS/IRI。称取膜材料于50mL茄形瓶中，加入适量的氯仿使膜材完全溶解，随后置于旋转蒸发仪除去氯仿，待氯仿完全去除停止旋蒸，得均匀的干燥脂质膜。用2mg/mL的IRI溶液水化脂质膜，60℃水浴震荡2h直至脂质膜完全水化，随后使用微型挤出器依次将脂质体挤压过200、100和50nm核孔膜。将所制得的脂质体以生理盐水为洗脱液，通过Sephadex G-50凝胶柱，对样品进行纯化，将未包封的IRI除去，得LS/IRI和CB5005-LS/IRI。
乙醇注入法制备包载伊立替康(IRI)的脂质体：取mPEG2000-DSPE、HSPC和Chol按摩尔比5∶52∶43制备LS/IRI，同时取mPEG2000-DSPE、CB5005-PEG3400-DSPE、HSPC和Chol按摩尔比3∶2∶52∶43制备CB5005-LS/IRI。分别称取上述膜材料溶于无水乙醇，与2mg/mL的IRI溶液一起置于60℃、100rpm水浴摇床中20min，待磷脂全部溶解后，在搅拌的条件下将磷脂加入IRI溶液，随后在60℃水浴摇床中混合30min，得到包载IRI的脂质体混悬液。利用微型挤出器挤压脂质体依次通过孔径为200、100和50nm的核孔膜。将所制得的脂质体以生理盐水为洗脱液，通过Sephadex G-50凝胶柱，对样品进行纯化，将未包封的IRI除去，得LS/IRI和CB5005-LS/IRI。
制备包载卡莫司汀(BCNU)的脂质圆盘：取磷脂(POPC)、Chol、mPEG2000-DSPE、CB5005-PEG-DSPE按摩尔比35∶40∶23∶2的比例与1mg的BCNU制备CB5005-Disk/BCNU，同时POPC、Chol、mPEG2000-DSPE按摩尔比为35∶40∶25的比例与1mg的BCNU制备Disk/BCNU。具体步骤如下：分别称取上述膜材料与BCNU置于25mL茄形瓶中，加入4mL的二氯甲烷使膜材与药物完全溶解，减压蒸发除去二氯甲烷，得均匀的磷脂膜，30min后再将1mL的PBS加入茄形瓶中，置于37℃、转速为100rpm的空气摇床中直至磷脂膜完全水化，最后于冰浴中在探头超声的作用下超声45min(功率为66W，超声1s间隔2s)，最后分别用0.2μm、0.1μm滤膜过滤除去金属碎屑。以生理盐水为洗脱液，通过Sephadex G-50凝胶柱进行纯化，得载BCNU的脂质圆盘Disk/BCNU和CB5005-Disk/BCNU。
实施例3功能化穿膜肽修饰的纳米药物递送系统的表征
用激光散射粒度仪测定功能化穿膜肽修饰的纳米药物递送系统的粒径大小及分布。结果显示，挤压过膜前CB5005修饰的脂质体粒径约500～800nm，经过挤压过膜后，CB5005修饰的脂质体粒径减小至100～150nm，形态规整，多分散系数小于0.2，表面带负电荷或呈近中性。
CB5005修饰的脂质圆盘粒径约为60nm，冰冻电镜观察呈圆盘形，多分散系数小于0.3，表面带负电荷。
表1.阿霉素脂质体的表征
Figure BSA0000168132760000081
表2.伊立替康脂质体的表征
Figure BSA0000168132760000082
表3.卡莫司汀脂质圆盘的表征
Figure BSA0000168132760000083
实施例4肿瘤细胞对功能化穿膜肽修饰的纳米药物递送系统的摄取
脑胶质瘤细胞对功能化穿膜肽修饰的脂质体的摄取：取对数生长期且状态良好的U87细胞，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，用含10％FBS的DMEM培养液配成单细胞悬液。以每孔2×105个细胞接种于共聚焦皿上，每孔体积1.5mL，将共聚焦皿移入二氧化碳培养箱中，37℃、5％二氧化碳及饱和湿度条件下培养24h，使细胞贴壁。用含10％FBS的DMEM培养液配制FAM浓度为1μM的CB5005-LS/FAM、LS/FAM及游离FAM溶液。将共聚焦皿中的培养液吸出，加入上述溶液，并重新置于培养箱内37℃孵育4h。吸出脂质体溶液，用PBS溶液洗皿三次，用甲醛固定并DAPI染核。利用共聚焦显微镜观察脑胶质瘤细胞对脂质体的摄取情况。
为定量分析脑胶质瘤细胞对脂质体的摄取情况，采用流式细胞仪测定浓度分别为1μM、0.1μM及0.01μM的FAM脂质体被U87细胞摄取的阳性百分率和摄取荧光强度。摄取实验方法同上，用PBS溶液洗板三次，加入胰蛋白酶消化细胞，用培养液分散细胞后以1000rpm转速离心5min，弃去上清，再用PBS洗涤一次，最后将细胞分散于400μL PBS中，用流式细胞仪测定U87细胞对脂质体的摄取情况。每个样品计数10000个细胞，未给药孔的细胞作为对照组。
CB5005-LS/FAM，LS/FAM和FAM于37℃分别与U87细胞孵育4h后的共聚焦显微照片和流式结果如图2所示。如图2A所示，U87细胞能有效摄取CB5005-LS/FAM，而LS/FAM和游离FAM几乎不被U87细胞所摄取；定量摄取结果如图2B所示，从阳性细胞百分比来看，1μM、0.1μM及0.01μM浓度下的CB5005-LS/FAM在U87细胞中的荧光阳性百分比接近100％。LS/FAM在浓度为1μM条件下荧光阳性细胞占63.15％，浓度为0.1μM时，荧光阳性细胞低于10％，而浓度为0.01μM时，荧光阳性细胞低于1％。游离FAM在三个浓度条件下的荧光阳性百分比均低于1％(图2B(1))。由摄取荧光强度来看，1μM、0.1μM及0.01μM浓度下的CB5005-LS/FAM被U87细胞摄取的荧光强度均显著性高于LS/FAM和游离FAM(p＜0.001)。结果表明CB5005的修饰能明显增加脂质体被U87细胞摄取的量(图2B(2))。
肺癌细胞对功能化穿膜肽修饰的脂质体的摄取：取生长状态良好且处于对数生长期的A549细胞，用胰蛋白酶消化细胞，用含10％FBS的DMEM培养液配成单细胞悬液。以每孔10,000个细胞的密度将细胞接种于共聚焦皿上，每孔体积0.5mL，将共聚焦皿移入二氧化碳培养箱中培养24h，使细胞贴壁。用含10％FBS的DMEM培养液配制FAM浓度为5μM的CB5005-LS/FAM、LS/FAM及游离FAM溶液。将共聚焦皿中的培养液吸出，加入上述溶液，并重新置于培养箱内37℃孵育4h。弃去培养液，用含0.2％肝素钠的PBS溶液洗三次，用含4％多聚甲醛的PBS溶液固定10min，再用含0.2％肝素钠的PBS溶液洗三次，用1μg/mL DAPI染核2min，用含0.2％肝素钠的PBS溶液洗三次，加200μL的PBS浸润。利用共聚焦显微镜观察A549细胞对脂质体的摄取情况。
为定量分析脂质体被A549细胞的摄取情况，采用流式细胞仪测定了浓度为5μM的FAM脂质体被A549细胞摄取的阳性百分率和摄取荧光强度。将A549细胞以每孔100,000个的密度接种于12孔板中，同定性摄取实验处理方法一样，用含0.2％肝素钠的PBS溶液洗涤，消化细胞，用培养液终止消化，离心(1000rpm，5min)，弃上清，加入350μLPBS分散细胞，用流式细胞仪测定A549细胞对LS/FAM、CB5005-LS/FAM及FAM溶液的摄取情况。
图3为肺癌细胞对脂质体的摄取结果，从共聚焦显微镜所拍摄的图片(图3A)可以观察到，与CB5005-LS/FAM共孵育后A549细胞浆与细胞核内均有荧光分布，而FAM及LS/FAM组不管是细胞膜或细胞核几乎未观察到荧光。流式实验(图3B)结果显示，A549细胞对FAM、LS/FAM、CB5005-LS/FAM摄取平均荧光强度分别为3.7±0.06、6.9±0.27、753.7±35.03。与LS/FAM组相比，CB5005-LS/FAM组细胞平均荧光强度值增加了近10倍。实验结果表明A549细胞对LS/FAM摄取极低，对游离FAM几乎不摄取。然而，A549细胞能够有效摄取CB5005-LS/FAM，该实验结果与共聚焦所观察到的一致，表明包载荧光探针的脂质体不仅能借助CB5005穿膜序列进入细胞质，而且能通过入核序列进入细胞核中，从而显著增加肺癌细胞对脂质体的摄取。该结果也为CB5005具有穿膜及入核特性提供了直观的证据。
脑胶质瘤细胞对功能化穿膜肽修饰的脂质圆盘的摄取：取对数生长期的U87细胞，以每孔1×104个细胞接种于共聚焦皿中，每孔体积0.5mL，将皿移入细胞培养箱。24h后，用细胞培养液配制一定浓度的FITC、Disk/FITC和CB5005-Disk/FITC溶液，将共聚焦皿中的培养液吸出，加入上述配好的药物溶液，37℃孵育4h，弃药液，以含0.2％肝素钠的PBS溶液洗板三次，4％的多聚甲醛溶液固定15min，再以含0.2％肝素钠的PBS溶液洗涤，加入1μg/mL的DAPI溶液染色2min；再用含0.2％肝素钠的PBS溶液洗涤，加入等体积的PBS缓冲液(200μL)，采用共聚焦显微镜观察细胞。
采用流式细胞仪定量分析U87细胞对脂质圆盘的摄取情况。取生长状态良好且处于对数生长期的U87细胞，以每孔1×105个细胞接种于12孔板中，继续培养24h后，用细胞培养液配制一定浓度的FITC、Disk/FITC和CB5005-Disk/FITC溶液，将12孔板中培养液吸出，加入上述配好的药物溶液，37℃孵育4h，吸弃药液，用含0.2％肝素钠的PBS溶液洗板三次，加入胰蛋白酶消化细胞，用培养液分散细胞后转移至1.5mL的EP管中，离心(1000rpm，5min)，再用PBS缓冲液洗涤细胞一次，最后将细胞重悬于350μL PBS，采用流式细胞仪测定。
U87对FITC、Disk/FITC和CB5005/Disk/FITC的摄取情况如图4A所示，游离FITC几乎没有进入U87细胞，U87细胞对Disk/FITC的摄取也极少，而CB5005-Disk/FITC可被U87细胞大量摄取且观察到部分脂质圆盘进入细胞核，细胞荧光强度CB5005-Disk/FITC组明显高于Disk/FITC组。图4B为流式细胞仪分析结果，显示CB5005-Disk/FITC组细胞平均荧光强度(203.65±5.14)显著高于Disk/FITC组(65.66±2.29)，CB5005-Disk/FITC组的荧光强度比Disk/FITC组增加了2倍。此结果与共聚焦显微镜拍摄结果一致。上述实验结果表明CB5005修饰的脂质圆盘具有良好的穿透细胞膜能力，能够被肿瘤细胞摄取进入细胞内。
实施例5功能化穿膜肽修饰的纳米药物递送系统对肿瘤细胞的毒性
功能化穿膜肽修饰的阿霉素脂质体对脑胶质瘤细胞的毒性：采用MTT法测定阿霉素脂质体对脑胶质瘤细胞的体外生长抑制作用。取对数生长期的U87细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，细胞悬浮在含细胞培养液中，计数。以每孔3000个细胞的密度接种于96孔细胞培养板中，每孔体积200μL，留出三孔加不含细胞的培养液作为空白孔，二氧化碳培养箱内培养24h。用细胞培养液配制CB5005-LS/DOX和LS/DOX浓度为409.6μM，用培养液按4倍梯度依次稀释成9个浓度。弃去96孔板内细胞培养液，各孔加入200μL上述系列浓度的脂质体药液，每个浓度均设三复孔，留出三个仅加入培养液的孔作为对照孔，置于细胞培养箱内37℃培养4h。弃去脂质体溶液，用PBS润洗后加入200μL细胞培养液继续培养72h。在实验孔、对照孔和空白孔中加入MTT试剂(5mg/mL)20μL并37℃孵育4h。弃去孔内溶液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡使生成的蓝紫色结晶充分溶解后，用酶标仪测定各孔在490nm处的吸光度，并计算细胞存活率。
CB5005-LS/DOX和LS/DOX对U87细胞的毒性评价结果如图5所示，CB5005-LS/DOX的IC50值为0.3415μM，而LS/DOX的IC50值为2.006μM，LS/DOX的IC50值是CB5005-LS/DOX的6倍，表明CB5005修饰的脂质体能增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤能力。
功能化穿膜肽修饰的伊立替康脂质体对肺癌细胞的毒性：取生长状态良好且处于对数生长期的A549细胞，消化并计数，以每孔4000个接种于96孔板中，空白孔加入不含细胞的培养液，置于细胞培养箱。24h后，分别加入倍比稀释的IRI、LS/IRI和CB5005-LS/IRI样品，每个浓度均设三复孔，对照孔加入不含样品的培养液。将96孔板置于细胞培养箱中孵育72h，每孔加入20μL MTT溶液(浓度为：5mg/mL)，孵育4h后，弃去孔内培液，每孔加入150μLDMSO，37℃空气摇床低速振荡15min，酶标仪测定吸光度A(λ＝490nm)，并计算细胞存活率。
采用MTT法评价CB5005-LS/IRI、LS/IRI和游离IRI对A549细胞的毒性，实验结果如图6所示。A549细胞给药72h后，IRI、LS/IRI和CB5005-LS/IRI的IC50值分别为12.5、10.5、7.9μM。IRI的IC50值是CB5005-LS/IRI的1.6倍，LS/IRI的IC50值是CB5005-LS/IRI的1.3倍，表明CB5005能够将更多的脂质体携带进入细胞质甚至带到细胞核内发挥作用，增强药物对细胞的杀伤作用。
功能化穿膜肽修饰的卡莫司汀脂质圆盘对脑胶质瘤细胞的毒性：取对数生长期的U87细胞，消化并计数，以每孔4000个接种于96孔板中，空白孔加入不含细胞的培养液，置于细胞培养箱。24h后，分别加入倍比稀释的BCNU、Disk/BCNU和CB5005-Disk/BCNU样品，每个浓度均设三复孔，对照孔加入不含样品的培养液。将96孔板置于细胞培养箱中孵育72h后，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，孵育4h后，弃去孔内培液，每孔加入150μL DMSO，37℃空气摇床低速振荡15min，酶标仪测定各孔的吸光度A(λ＝490nm)，并计算细胞存活率。
脂质圆盘对U87细胞的毒性如图7所示，BCNU、Disk/BCNU、CB5005-Disk/BCNU的IC50值分别为128.98、67.69、45.76μM。结果显示：BCNU的IC50值是CB5005-Disk/BCNU的2.8倍，Disk/BCNU的IC50值是CB5005-Disk/BCNU的1.5倍，与Disk/BCNU、BCNU相比，CB5005-Disk/BCNU对U87细胞具有更强的抑制作用。
实施例6功能化穿膜肽修饰的纳米药物递送系统在动物体内的分布
将正常裸鼠尾静脉注射100μL浓度为0.01μM(DiR)的CB5005-LS/DiR和LS/DiR，同时注射等体积生理盐水作为空白对照组(n＝3)。在4h时将裸鼠用异氟烷气体麻醉，用小动物活体成相系统(IVIS Spectrum)观察脂质体在裸鼠体内的分布情况。之后将裸鼠用水合氯醛麻醉，生理盐水灌流和多聚甲醛固定后，分别收集心、肝、脾、肺、肾和脑等主要器官，用活体成像仪检测各个脏器的荧光分布。
CB5005-LS/DiR、LS/DiR和生理盐水在裸鼠体内分布的荧光成像结果如图8A所示，与LS/DiR组和生理盐水组相比，CB5005-LS/DiR在脑内分布较多。除脑组织外，CB5005-LS/DiR和LS/DiR在心、肝、脾、肺、肾中的分布均无明显差异，说明CB5005的修饰并未显著改变脂质体在正常组织器官中的分布。将脑部荧光进行半定量，结果如8B所示，CB5005-LS/DiR在脑组织中的荧光强度显著高于LS/DiR组(p＜0.05)。结果表明CB5005能介导脂质体递药系统进入脑组织中。
实施例7功能化穿膜肽修饰的纳米药物递送系统在荷瘤动物体内的分布
功能化穿膜肽修饰的脂质体在荷移植脑胶质瘤动物体内的分布：取对数生长期的U87细胞，用胰蛋白酶消化细胞并计数，将细胞用1000rpm转速离心5min，弃去上清液，再用适量的PBS缓冲液悬浮细胞。每只裸鼠右腋窝下接种2×106个细胞(分散于100μL PBS缓冲液中)。两周后，挑选皮下瘤形状较好的裸鼠，尾静脉注射100μL浓度为0.01μM的CB5005-LS/DiR和LS/DiR，同时注射等体积生理盐水作为空白对照组(n＝3)。在4h时将裸鼠用异氟烷气体麻醉，用小动物活体成相系统观察脂质体在皮下瘤中的分布情况。之后将裸鼠用水合氯醛麻醉，生理盐水灌流和多聚甲醛固定后，分别收集心、肝、脾、肺、肾和皮下瘤等主要组织，用活体成像仪检测各个组织中的荧光分布。
CB5005-LS/DiR、LS/DiR和生理盐水在荷皮下瘤裸鼠体内分布的成像结果如图9所示，由图可见，CB5005-LS/DiR于在体及离体皮下瘤中的蓄积量均明显高于LS/DiR。此外，CB5005-LS/DiR和LS/DiR在心、肝、脾、肺、肾中的分布均无明显差异，且主要蓄积于肝内。将肿瘤部位荧光进行半定量，结果如图9B所示，CB5005-LS/DiR在肿瘤组织中的荧光强度显著高于LS/DiR组(p＜0.05)。结果表明CB5005能介导脂质体递药系统有效地蓄积于肿瘤部位。CB5005-LS/DiR和LS/DiR在体循环过程中均可通过EPR效应进入肿瘤部位，然而LS/DiR并不能穿透肿瘤进入其内部，与之相反的是，CB5005介导的脂质体能穿透肿瘤进入其内部。
功能化穿膜肽修饰的脂质体在荷原位脑胶质瘤动物体内的分布：取对数生长期的U87细胞，用胰蛋白酶消化细胞并计数，离心使细胞沉淀并弃去上清液，再用适量的PBS缓冲液悬浮。实验前将裸鼠用7％水合氯醛麻醉，将裸鼠固定于脑立体定位仪上，再将悬浮细胞接种于裸鼠脑内纹状体部位(即前囟向前0.6mm，向右1.8mm，纵深3mm)，每只裸鼠接种8×105个细胞(分散于5μL PBS缓冲液中)。定期观察手术后裸鼠的身体状态。两周后，尾静脉注射100μL浓度为0.01μM的CB5005-LS/DiR和LS/DiR，同时注射等体积生理盐水作为空白对照组(n＝3)。在4h时将裸鼠用异氟烷气体麻醉，用小动物活体成相系统观察脂质体在脑及原位瘤中的分布情况。之后将裸鼠用水合氯醛麻醉，生理盐水灌流和多聚甲醛固定后，分别收集心、肝、脾、肺、肾、脑和原位瘤等主要组织，用活体成像仪检测各个组织的荧光分布。
进一步考察CB5005修饰的脂质体包载荧光素在荷原位瘤裸鼠体内的分布情况，其结果如图10所示，CB5005-LS/DiR在原位瘤处的荧光强度显著高于LS/DiR组和生理盐水组(p＜0.05)。除脑组织及脑胶质瘤外，CB5005-LS/DiR和LS/DiR在心、肝、脾、肺、肾中的分布均无明显差异。该结果提示CB5005修饰的脂质体递药系统能有效地将化疗药物递送入脑组织中，因而可用于脑胶质瘤的治疗。
功能化穿膜肽修饰的脂质体在荷移植肺癌动物体内的分布：取生长状态良好且处于对数生长期的A549细胞，用胰蛋白酶消化细胞，离心(1000rpm，5min)，弃上清液，用适量的PBS缓冲液轻吹悬浮，以同样的转速再次离心，用PBS缓冲液定容，每只裸鼠右腋窝下接种7×106个细胞。20天后，尾静脉注射CB5005-LS/DiR和LS/DiR(注射体积为100μL，DiR浓度为0.01μM)，同时空白对照组注射等体积生理盐水(n＝3)。分别在第1、4、6、8h时间点，将裸鼠用异氟烷气体麻醉，用小动物活体成相系统观察脂质体在体内各脏器的分布情况。8h后将动物安乐死，经灌流、固定后，分别收集主要脏器，检测各脏器荧光分布。
荷皮下瘤裸鼠尾静脉注射CB5005-LS/DiR和LS/DiR，于不同时间点用小动物活体成像仪对裸鼠进行拍照，见图11A。可以看出CB5005修饰的脂质体在肿瘤部位的蓄积量高于未修饰的脂质体。对各时间点肿瘤部位的荧光强度进行半定量测定，结果如图11B所示，可以看出CB5005-LS/DiR组小鼠肿瘤部位整体荧光强度均高于LS/DiR组。特别是在第1h与第4h，CB5005-LS/DiR组的肿瘤部位荧光强度显著高于LS/DiR。给药8h后，将裸鼠处死、解剖、心脏灌流后，取各主要脏器用活体成像拍照，比较离体各脏器及肿瘤的荧光强度见图11C，结果显示，CB5005-LS/DiR和LS/DiR在肝脏、脾脏及肺部有较多的蓄积。对离体肿瘤的荧光强度进行半定量分析，结果见图11D。LS/DiR、CB5005-LS/DiR组离体肿瘤的平均荧光强度分别为7.82±4.13、56.68±13.62，CB5005-LS/DiR组肿瘤部位的蓄积量比LS/DiR组增加了近7倍，表明CB5005修饰的脂质体可以在肿瘤部位有效蓄积。
功能化穿膜肽修饰的脂质圆盘在荷原位脑胶质瘤动物体内的分布：取生长状态良好且对数生长期的U87细胞，消化并计数，离心，弃上清液，加PBS缓冲液悬浮。将裸鼠麻醉，固定后，每只裸鼠脑部接种5×105个细胞。定期观察手术后裸鼠的身体状态。14天后，经尾静脉注射CB5005-Disk/DiR和Disk/DiR(体积：100μL，DiR浓度：0.01μM)，同时空白对照组注射等体积生理盐水(n＝4)。在不同时间点将裸鼠用异氟烷气体麻醉，用小动物活体成相系统观察CB5005-Disk/DiR和Disk/DiR在裸鼠体内的分布情况。8h后将裸鼠安乐死，经灌流和固定后，分别收集各主要脏器，用小动物活体成像仪观察离体脏器的荧光分布。
荷原位脑胶质瘤裸鼠经尾静脉注射CB5005-Disk/DiR、Disk/DiR和生理盐水，其体内分布如图12所示。在不同的时间点，裸鼠脑内荧光强度CB5005-Disk/DiR组明显高于Disk/DiR和生理盐水组(图12B)。在8h后将裸鼠安乐死，取主要脏器，Disk/DiR与CB5005-Disk/DiR组在心、肝、脾、肺、肾中荧光分布无显著性差异(图12C)，在离体脑组织及脑胶质瘤中，CB5005-Disk/DiR组的荧光强度高于Disk/DiR组和生理盐水组。对脑部荧光强度进行半定量分析，CB5005-Disk/DiR组的荧光强度(1001.70±260.20)显著高于Disk/DiR组(427.35±16.95)(图12D)，提示CB5005修饰的脂质圆盘能够将药物递送至脑组织中。
实施例8功能化穿膜肽修饰的纳米药物递送系统在模型动物体内对肿瘤的治疗效果
功能化穿膜肽修饰的阿霉素脂质体在荷原位脑胶质瘤动物体内的药效：建立荷原位脑胶质瘤裸鼠模型。将荷原位脑胶质瘤模型裸鼠随机分成3组(n＝8)，分别在建模后的第10、13、16、19和22天尾静脉注射100μLCB5005-LS/DOX，LS/DOX和生理盐水，单次DOX的注射剂量为2mg/kg，记录模型裸鼠的生存时间。
抗原位脑胶质瘤的药效实验结果如图13所示，CB5005-LS/DOX组、LS/DOX组和生理盐水组荷瘤裸鼠的中位生存期分别为24、21和20天。与生理盐水相比，无靶头修饰的阿霉素脂质体对荷脑原位瘤裸鼠的治疗效果并不明显，CB5005修饰的阿霉素脂质体可显著延长荷原位脑胶质瘤模型动物的生存时间。与无靶头修饰的阿霉素脂质体相比，CB5005修饰的阿霉素脂质体仍可显著延长荷原位脑胶质瘤模型动物的生存时间。
功能化穿膜肽修饰的伊立替康脂质体在荷移植肺癌动物体内的药效：建立肺癌皮下瘤裸鼠模型。将裸鼠随机分成5组(n＝6)，分别在建模后的第22天尾静脉注射100μLCB5005-LS/IRI、LS/IRI、CB5005-LS、IRI和生理盐水，隔两天给药一次，每次5mg/mL，总共给5次，总给药剂量25mg/kg。观察裸鼠的生存状况并隔天记录体重及瘤体积变化。在给药结束后第10天，将所有的受试动物安乐死，以生理盐水进行心脏灌流后取肿瘤组织，称瘤重。
如图14A所示，生理盐水组裸鼠的肿瘤体积增长最快，CB5005-LS、IRI、LS/IRI这三个组别的裸鼠肿瘤增长较生理盐水组慢。与CB5005-LS、IRI、LS/IRI、生理盐水组这四个组别相比，CB5005-LS/IRI组裸鼠的肿瘤体积明显受到抑制。裸鼠体重变化如图14B所示，与CB5005-LS/IRI组相比，生理盐水组的体重增长更快，CB5005-LS、IRI、LS/IRI、CB5005-LS/IRI组裸鼠体重变化一致，随着肿瘤的增长，体重均有所增加。在给完药后第10天将老鼠进行安乐死，解剖，取出肿瘤如图14C所示。称瘤重，计算抑瘤率，结果如图14D。与CB5005-LS、LS/IRI、IRI及生理盐水组相比，CB5005-LS/IRI对肿瘤的抑制效果显著增强。
功能化穿膜肽修饰的卡莫司汀脂质圆盘在荷原位脑胶质瘤动物体内的药效：建立原位脑胶质瘤裸鼠模型。荷原位脑胶质瘤的裸鼠于一周后随机分为5组(n＝9)，分别是CB5005-Disk/BCNU、Disk/BCNU、CB5005-Disk、BCNU、生理盐水，隔两天给药一次，给5次，总给药5mg/kg，观察记录裸鼠的生存时间。
脂质圆盘对荷原位脑胶质瘤裸鼠的药效结果如图15所示。生理盐水组荷瘤裸鼠的中位生存期为42天，与之相比，Disk/BCNU和CB5005-Disk/BCNU组荷瘤裸鼠的中位生存期分别延长7天和14天。与对照组相比，Disk/BCNU、CB5005-Disk/BCNU均能显著延长荷脑胶质瘤裸鼠的中位生存期。与Disk/BCNU相比，CB5005-Disk/BCNU可进一步延长荷原位脑胶质瘤模型动物的生存时间。药效结果表明，CB5005修饰的脂质圆盘能够将药物递送至脑部肿瘤，获得更好的肿瘤治疗效果。

Claims (13)

1.功能化穿膜肽修饰的药物递送系统，其特征在于，由表面修饰的功能化穿膜肽、药物递送载体和抗肿瘤化疗药物构成；其中，所述功能化穿膜肽通过双功能连接基团修饰在所述药物递送载体表面，所述功能化穿膜肽的氨基酸序列为KLKLALALALAVQRKRQKLMP。
2.根据权利要求1所述的功能化穿膜肽修饰的药物递送系统，其特征在于，所述药物递送载体选自脂质体、脂质圆盘、纳米粒、固态脂质纳米粒、纳米结构的脂质载体、纳米复合物或胶束。
3.根据权利要求2所述的功能化穿膜肽修饰的药物递送系统，其特征在于，所述药物递送载体的粒径为10～1000nm。
4.根据权利要求2所述的功能化穿膜肽修饰的药物递送系统，其特征在于，所述药物递送载体的粒径为10～500nm。
5.根据权利要求2所述的功能化穿膜肽修饰的药物递送系统，其特征在于，所述药物递送载体的粒径为20～300nm。
6.根据权利要求1所述的功能化穿膜肽修饰的药物递送系统，其特征在于，所述双功能连接基团为一端带有马来酰亚胺、另一端带有琥珀酰亚胺的双功能聚乙二醇(MAL-PEG-NHS)。
7.根据权利要求6所述的功能化穿膜肽修饰的药物递送系统，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为40～20000。
8.根据权利要求6所述的功能化穿膜肽修饰的药物递送系统，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为100～10000。
9.根据权利要求6所述的功能化穿膜肽修饰的药物递送系统，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为200～5000。
10.根据权利要求1所述的功能化穿膜肽修饰的药物递送系统，其特征在于，所述功能化穿膜肽修饰的药物载体制备材料占全部药物载体制备材料的摩尔比为0.1％～30％。
11.根据权利要求1所述的功能化穿膜肽修饰的药物递送系统，其特征在于，所述功能化穿膜肽修饰的药物载体制备材料占全部药物载体制备材料的摩尔比为0.5％～20％。
12.根据权利要求1所述的功能化穿膜肽修饰的药物递送系统，其特征在于，所述功能化穿膜肽修饰的药物载体制备材料占全部药物载体制备材料的摩尔比为1.0％～10％。
13.根据权利要求1所述的功能化穿膜肽修饰的药物递送系统，其特征在于，所述抗肿瘤化疗药物选自细胞毒类药物，包括氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、塞替派、卡莫司汀、司莫司汀、白消安、顺铂、卡铂、奥沙利铂、丝裂霉素，甲氨蝶呤、培美曲塞、5-氟尿嘧啶、呋喃氟脲嘧啶、卡培他滨、6-巯基嘌呤、羟基脲、阿糖胞苷、吉西他滨，放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素，伊立替康、拓扑替康、羟基喜树碱，紫杉醇、多西他赛、长春新碱、去甲长春新碱、鬼臼碱、高三尖杉酯碱，或门冬酰胺酶，及其组合物。
CN201810868804.1A 2018-07-31 2018-07-31 功能化穿膜肽修饰的药物递送系统 Pending CN110772645A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810868804.1A CN110772645A (zh) 2018-07-31 2018-07-31 功能化穿膜肽修饰的药物递送系统

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810868804.1A CN110772645A (zh) 2018-07-31 2018-07-31 功能化穿膜肽修饰的药物递送系统

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110772645A true CN110772645A (zh) 2020-02-11

Family

ID=69382866

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810868804.1A Pending CN110772645A (zh) 2018-07-31 2018-07-31 功能化穿膜肽修饰的药物递送系统

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110772645A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111671923A (zh) * 2020-08-05 2020-09-18 重庆医科大学 一种肽功能化载金属卟啉相变纳米粒及其制备方法和应用
WO2020224475A1 (zh) * 2019-05-05 2020-11-12 复旦大学 药物递送载体以及使用其的药物制剂
CN114404429A (zh) * 2021-11-30 2022-04-29 重庆医科大学附属第二医院 一种纳米银修饰的单宁酸-铁网络的载药纳米复合物及其制备方法和逆转肿瘤耐药应用
WO2023001245A1 (zh) * 2021-07-21 2023-01-26 奥朗生物医药有限公司 穿膜肽与美法仑的偶联物以及包含该偶联物的制剂

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020131995A1 (en) * 1999-12-03 2002-09-19 Szoka Francis C. Targeted drug delivery with a cd44 receptor ligand
CN102688495A (zh) * 2012-06-25 2012-09-26 南开大学 具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体及制备
CN103417480A (zh) * 2013-07-11 2013-12-04 四川大学 一种靶向整合素受体的新型多肽修饰的肿瘤靶向脂质体

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020131995A1 (en) * 1999-12-03 2002-09-19 Szoka Francis C. Targeted drug delivery with a cd44 receptor ligand
CN102688495A (zh) * 2012-06-25 2012-09-26 南开大学 具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体及制备
CN103417480A (zh) * 2013-07-11 2013-12-04 四川大学 一种靶向整合素受体的新型多肽修饰的肿瘤靶向脂质体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI ZHANG ET AL.: "Functionalized cell nucleus-penetrating peptide combined with doxorubicin for synergistic treatment of glioma", 《ACTA BIOMATERIALIA》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020224475A1 (zh) * 2019-05-05 2020-11-12 复旦大学 药物递送载体以及使用其的药物制剂
CN111671923A (zh) * 2020-08-05 2020-09-18 重庆医科大学 一种肽功能化载金属卟啉相变纳米粒及其制备方法和应用
WO2023001245A1 (zh) * 2021-07-21 2023-01-26 奥朗生物医药有限公司 穿膜肽与美法仑的偶联物以及包含该偶联物的制剂
CN114404429A (zh) * 2021-11-30 2022-04-29 重庆医科大学附属第二医院 一种纳米银修饰的单宁酸-铁网络的载药纳米复合物及其制备方法和逆转肿瘤耐药应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Inflammatory tumor microenvironment responsive neutrophil exosomes-based drug delivery system for targeted glioma therapy
Belhadj et al. Multifunctional targeted liposomal drug delivery for efficient glioblastoma treatment
US11260032B2 (en) Method for preparing biofilm-coated drug nanocrystal and application thereof
CN110522919B (zh) 甘露糖受体靶向的组合物、药物及其制备方法和应用
CN110772645A (zh) 功能化穿膜肽修饰的药物递送系统
CN104558117B (zh) 一种乙酰胆碱受体介导靶向的d构型多肽及其应用
CN106137967B (zh) 靶向脑胶质瘤的双重修饰脂质体给药系统的制备和应用
CN108578711B (zh) 一种乙酰化糖酯-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺共轭物及其制备方法与应用
US9371364B2 (en) Dual-targeted therapeutic peptide for nasopharyngeal carcinoma, nanoparticles carrying same and uses thereof
CN105534896B (zh) 一种多肽和化疗药物联合的载药胶束及其制备方法和应用
CN105287383A (zh) 新型米托蒽醌脂质体联合化疗药物在抗肿瘤治疗中的应用
CN105999299A (zh) 一种小分子胶束纳米载药系统及其制备方法与应用
Ye et al. Microenvironment-responsive chemotherapeutic nanogels for enhancing tumor therapy via DNA damage and glutathione consumption
CN110152012A (zh) 聚唾液酸与阳离子化合物形成的聚离子复合物及其制备方法和应用
CN110960688A (zh) 用于提高胰腺癌疗效的低毒仿生化纳米系统及制备方法
CN111450061A (zh) 一种杂化间充质干细胞外泌体药物递送系统及其制备方法和应用
CN111001006A (zh) 葫芦素b和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒
CN110898231B (zh) 一种功能化拉洛他赛脂质体及其制备方法与应用
CN107998081A (zh) 一种靶向还原响应囊泡纳米药物在制备脑肿瘤治疗药物中的应用
CN107028882B (zh) 一种物理包裹的肿瘤靶向纳米递药系统及制备方法和应用
CN103977434B (zh) 一种对羟基苯甲酸介导的脑靶向聚合物胶束递药系统
CN111298116B (zh) 多肽载药温敏脂质体及其制备方法和应用
WO2018214944A1 (zh) 用c(RGD-ACP-K)修饰的长循环脂质体
CN104174024A (zh) 一种肉豆蔻酸介导的脑靶向聚合物胶束递药系统及其制备方法和应用
CN110964086A (zh) 整合素β3受体高亲和力的多肽及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination