CN111671923A - 一种肽功能化载金属卟啉相变纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，涉及纳米粒及其制备方法和应用，具体涉及一种肽功能化载金属卟啉相变纳米粒及其制备方法和应用。所述纳米粒包括脂质体形成的壳膜和壳膜内包裹的液态氟碳，所述壳膜上共价连接有肿瘤归巢穿膜肽，所述脂质体的脂质双分层内包载有造影剂。该纳米粒子具有穿透肿瘤血管屏障和肿瘤间质屏障的功能，可以深入肿瘤组织内部，更有效地实现对肿瘤的诊断和治疗。本方案的纳米粒可以应用在肿瘤诊断或治疗的药物的开发和制备中。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及纳米粒及其制备方法和应用，具体涉及一种肽功能化载金属卟啉相变纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
癌症诊疗一体化是集癌症诊断和治疗于一体的新技术，该技术将具有肿瘤诊断和治疗功能的物质同时整合到一个纳米平台(纳米粒)上,获得同时具有诊断和治疗功能的纳米制剂。该纳米制剂可以实现癌症的早期诊断、肿瘤的精确定位、肿瘤的原位治疗,还可以实现在治疗过程中的实时监测。
中国专利CN104826140A(一种载药硅脂质超声造影剂的制备方法和应用)公开了一种超声造影剂，包括有机载体脂质体和包裹于脂质体内核中的有机液气相变介质液态氟碳化合物。该纳米诊疗剂可在近红外光诱导下，同时作为超声成像造影剂和光热治疗剂。但是上述技术方案存在如下缺陷：该试剂不能实现超声/核磁共振双模态成像的效果，降低了肿瘤诊疗的效果；液态氟碳化合物通过微爆破作用产生的肿瘤细胞杀伤作用有限，不能实现有效的肿瘤治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肽功能化载金属卟啉相变纳米粒，该纳米粒子具有超声/核磁共振双模态成像的效果，以及增强的肿瘤细胞杀伤能力。
为解决上述技术问题，本发明技术方案提供了一种肽功能化载金属卟啉相变纳米粒,所述纳米粒包括脂质体形成的壳膜和壳膜内包裹的液态氟碳，所述脂质体的脂质双分层内包载有血卟啉单甲醚-钆。
采用上述技术方案，技术原理为：利用血卟啉单甲醚-钆(HMME-Gd)的声、磁特性，实现超声分子成像、光声分子成像、MRI分子成像和荧光分子成像等多模态分子成像；还可以利用HMME-Gd对肿瘤进行声动力治疗。低强度聚焦超声(LIFU)使液态氟碳发生相变，是该纳米粒相变成为含气微泡，加强超声成像。而脂质双分层内包载的造影剂也同时加强了超声成像效果。在超声成像的指导下，再通过超声靶向微泡破坏技术(UTMD)，在低强度聚焦超声(US)的作用下，使纳米粒内部的液态氟碳发生相变，产生“爆破效应”对肿瘤产生杀伤作用。在本技术方案中，脂质体是指由脂质双分子层形成的空心囊泡。
有益效果：
血卟啉对癌细胞有较好的靶向性且具有荧光性质，可以作为肿瘤的荧光诊断药物。在血卟啉中掺入具有顺磁性的金属，可以使得血卟啉作为磁共振成像(MRI)造影剂。钆离子(Gd3+)的核外电子排布比较特殊，其4f轨道有7个未成对电子，这样的分布是一种半满壳层，具有很强的顺磁性，能极大提高核磁共振成像。并且钆离子相对于现有技术中经常使用的锰离子的毒性更小，不会对人体中枢神经系统产生副作用。血卟啉单甲醚-钆由血卟啉单甲醚和钆离子鳌合形成。
脂质双分层内包载血卟啉单甲醚-钆，可实现声动力疗法和多模态分子成像的结合，对肿瘤进行精准治疗。声动力疗法是指利用超声波对生物组织有较强的穿透能力，尤其是聚焦超声能无创伤地将声能聚焦于深部组织，并激活声敏药物产生抗肿瘤效应。而卟啉单甲醚-钆可以作为一种声敏药物，具有肿瘤治疗的效果。
本方案采用亲和性较强的血卟啉单甲醚(HMME)螯合钆离子(Gd3+)，可以将钆离子包载在脂质体的疏水双分子层内，使得钆离子稳固的附着在纳米粒子上，而单独将钆离子固定在脂质体上是非常难的。采用卟啉单甲醚-钆可以解决将钆离子稳定附着在脂质纳米粒上的技术问题。
除此之外，纳米粒的壳膜中包载了液态氟碳，液态氟碳和血卟啉单甲醚-钆之间具有协同增效作用，增强纳米粒子的超声成像功能，也同时增强了纳米粒子的肿瘤杀伤功能。将血卟啉单甲醚-钆包载在磷脂双分子层中，将液态氟碳设置在脂质体内部，可有效避免纳米粒子在运送到病灶之前两种物质相互接触，从而避免了药物之间相互影响导致的药物提前失效等现象。除此之外，液态氟碳的微爆破作用，可以推动位于壳膜内的血卟啉单甲醚-钆，促进药物向癌症细胞深层运动，更有效的穿透细胞间质、细胞膜等，达到更好的治疗作用。经LIFU辐照后在乏氧环境中本方案的纳米粒对乳腺癌治疗效果明显好于未装载液态氟碳的纳米粒，其治疗效果亦好于未装载液态氟碳的纳米粒在正常氧肿瘤的治疗效果(实验例10)。
脂质体的生物安全性良好，制备成纳米粒之后，由于粒径较小，比表面积增大，可显著增加细胞对其的摄取，同时保证纳米粒在体内不会对正常组织造成损害。血卟啉单甲醚-钆包载在脂质双分层内可以避免造影剂和生物体直接接触，减小血卟啉单甲醚-钆对生物体的毒性，避免血卟啉单甲醚-钆被生物体代谢和降解，增加血卟啉单甲醚-钆的半衰期。
进一步，所述液态氟碳为全氟戊烷。
采用上述技术方案，全氟戊烷为一种常用的液态氟碳，性质稳定且易于获取。PFP的沸点(29℃)相对较低更易发生相变，超声成像效果好。在LIFU辐照下，由于超声的机械效应和热效应，纳米粒子内部包裹的PFP发生液气相变，从而增强了B模式和造影模式下的成像效果。
进一步，所述壳膜上共价连接有肿瘤归巢穿膜肽。
采用上述技术方案，纳米粒利用肿瘤归巢穿膜肽(tLyP-1，CGNKRTR)肿瘤靶向及穿膜特性，引导该纳米粒进入深层肿瘤组织细胞，实现肿瘤细胞水平精准定位。
在纳米粒子的壳膜上共价连接tLyP-1解决了纳米粒子难以突破肿瘤组织屏障深入肿瘤组织内部的技术问题，tLyP-1同时具有穿透双层肿瘤组织屏障(肿瘤血管屏障和肿瘤间质屏障)的能力，使得纳米粒子深入肿瘤组织内部，实现真正意义上的分子成像与治疗。
进一步，所述纳米粒的粒径为260.93±5.28nm。
采用上述技术方案，上述粒径的纳米粒，能够较为高效的穿过血管壁抵达目的组织。
进一步，所述纳米粒的电位为-15.7±2.646mV。
采用上述技术方案，上述电位的纳米粒，有较好的生物利用率和稳定性。
进一步，一种肽功能化载金属卟啉相变纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)：使用肿瘤归巢穿膜肽修饰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400-马来酰亚胺，获得二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400-肿瘤归巢穿膜肽；
步骤(2)：将二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400-肿瘤归巢穿膜肽、二棕榈酰磷脂酰甘油、胆固醇和血卟啉单甲醚-钆溶解于三氯甲烷中，获得成膜体系；真空旋转蒸发所述成膜体系，获得薄膜；将所述薄膜水化后，得水化体系；在水化体系中加入全氟戊烷，并超声处理所述含有全氟戊烷的水化体系，获得纳米粒。
采用上述技术方案，将二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400-肿瘤归巢穿膜肽(DSPE-PEG3400-tLyP-1)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、胆固醇(CH)和血卟啉单甲醚-钆(HMME-Gd)溶解于三氯甲烷中，再通过真空旋转蒸发，可以使HMME-Gd交联在脂质体疏水双分子层中。利用脂质体对肿瘤细胞的亲和力，使HMME-Gd在肿瘤区域大量积聚，促进HMME-Gd在体内发挥作用，其对肿瘤的诊疗作用。
进一步，在步骤(2)中，二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400-肿瘤归巢穿膜肽、二棕榈酰磷脂酰甘油、胆固醇、血卟啉单甲醚-钆溶和三氯甲烷的用量比为10mg：4mg：3mg：3mg：2mg：10ml。
采用上述技术方案，上述的用量比可以使HMME-Gd稳定的交联在脂质体疏水双分子层中。
进一步，在步骤(2)中，50℃水浴条件下，真空旋转蒸发所述成膜体系1h获得薄膜；使用磷酸盐缓冲液将所述薄膜水化后，得水化体系。
采用上述技术方案，磷酸盐缓冲液(PBS)为常用缓冲液，性质稳定、安全且易于获取；在50℃水浴条件下，进行真空旋转蒸发，可以有效的将溶剂蒸发，并且不会破坏体系中的各种原料成分。
进一步，在步骤(2)中，在冰浴的条件下，在水化体系中加入全氟戊烷；超声处理的功率为100W，超声时间为6min。
采用上述技术方案，上述超声功率和超声时间可以保证纳米粒粒径均一，且粒径大小适合于进行体内药物传递。并且在并与条件下进行超声处理，液态氟碳不会出现提前气化的现象，保证了制备获得的纳米粒的品质。
进一步，一种肽功能化载金属卟啉相变纳米粒在肿瘤诊断制剂或肿瘤治疗药物中的应用。
采用上述技术方案，实验数据证明，本方案的肽功能化载金属卟啉相变纳米粒对肿瘤细胞具有较强的杀伤作用，也具有超声分子成像、光声分子成像、MRI分子成像和荧光分子成像等多模态分子成像作用，可以作为肿瘤诊断和治疗药物进行临床应用。
附图说明
图1为实验例1的PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)的透射电镜图。
图2为实验例1的各组纳米粒的粒径图。
图3为实验例1的各组纳米粒的电位图。
图4为实验例2的HMME-Gd的标准曲线。
图5为实验例2的HMME-Gd不同浓度的紫外吸收光谱。
图6为实验例2的不同组分的紫外吸收光谱。
图7为实验例3的流式细胞术检测结果图。
图8为实验例4的CCK-8法检测体外安全性检测结果图。
图9为实验例4的Balb/c小鼠血常规血生化检测结果。
图10为实验例5的体外超声图像超声模式的定量分析。
图11为实验例5的体外超声造影模式的定量分析。
图12为实验例5的PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)在LIFU(1.6W/cm2,脉冲模式)辐照后的光镜图(×100)。
图13为实验例5的体内超声成像图像。
图14为实验例5的体内超声图像超声模式的定量分析。
图15为实验例5的体内超声造影模式的定量分析。
图16为实验例6的体外光声成像结果。
图17为实验例6的体内光声成像定量分析。
图18为实验例6的体内光声成像结果。
图19为实验例7的体外荧光成像结果。
图20为实验例7的体内荧光成像肿瘤部位荧光值定量分析。
图21为实验例7的离体组织荧光值定量分析。
图22为实验例7的体内荧光成像图和离体组织荧光成像图。
图23为实验例8的体外MRI成像结果。
图24为实验例8的体内MRI成像结果。
图25为实验例8的体内MRI成像定量分析。
图26为实验例9的SOSG检测纳米粒产生ROS情况(LIFU辐照(1.6W/cm2,脉冲模式)不同浓度的PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd))。
图27为实验例9的SOSG检测纳米粒产生ROS情况(LIFU辐照一定浓度PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)不同时间)。
图28为实验例9的DCFH-DA检测细胞水平各组ROS产生情况。
图29为实验例10的CCK-8法检测在正常氧和乏氧条件下经LIFU处理后对MDA-MB-231的治疗作用。
图30为实验例10的活死细胞双染法检测在正常氧和乏氧条件下经LIFU处理后对MDA-MB-231的治疗作用。
图31为实验例11的不同组小鼠肿瘤生长曲线。
图32为实验例11的不同组小鼠肿瘤抑瘤率。
图33为实验例11的不同组小鼠体重变化曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例1-实施例4为纳米粒的制备过程，其中主要使用到的试剂和仪器如下：
Olympus IX71光学显微镜，Nikon AIR激光共聚焦显微镜，Zeta SIZER 3000HS马尔文粒径分析仪，Hitachi H-7600透射电子显微镜，SHIMADZU UV-2550紫外分光光度计，Sonics&Materials声振仪，Mylab 90超声诊断仪(LA523线阵探头，频率4～10MHz),Verio-40690西门子3.0T磁共振仪。二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC，Avanti公司)，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG，Avanti公司),二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE，Avanti公司),胆固醇(CH，Sigma公司),血卟啉单甲醚-钆(HMME-Gd,麦迪鑫生物科技有限公司)，全氟戊烷(PFP，StremChemicals公司),三氯甲烷(重庆川东化工有限公司),二甲亚砜(DMSO,重庆川东化工有限公司)，肿瘤归巢穿膜肽(tLyP-1，上海强耀生物技术有限公司)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400-马来酰亚胺(DSPE-PEG3400-mal，Avanti公司)
实施例1：肽功能化载金属卟啉相变纳米粒(PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd))的制备
步骤(1)：使用tLyP-1修饰的DSPE-PEG3400-mal。采用马来酰亚胺法连接tLyP-1与DSPE-PEG3400-mal，获得DSPE-PEG3400-tLyP-1，并分析提纯。其中，tLyP-1由上海强耀生物技术有限公司采用固相法合成，tLyP-1修饰的DSPE由重庆市浦诺维生物科技有限公司完成。
步骤(2)：PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)的制备。
称取10mgDPPC、4mgDSPE-PEG3400-tLyP-1、3mgDPPG、3mgCH、2mgHMME-Gd，将上述原料溶解于10ml三氯甲烷中，获得成膜体系。在50℃水浴条件下，真空旋转蒸发成膜体系1h形成薄膜，并用4ml PBS水化薄膜，得到水化体系。冰浴条件下，在水化体系中加入400μL的PFP，采用功率为100W的超声波破碎仪脉冲模式(ON 5s,OFF 5s)声振含有全氟戊烷的水化体系6min，获得含有PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)的体系。对获得的纳米粒子进行低温离心(8000r/min,5min)，再使用PBS对固相部分进行清洗，重复3次，最后用4mlPBS重悬，获得PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)。制备过程全程避光。
实施例2：载金属卟啉相变纳米粒(PFP@LIP-H(Gd))的制备
称取10mgDPPC、4mgDSPE、3mgDPPG、3mgCH、2mgHMME-Gd，充分溶解于10ml三氯甲烷中，50℃水浴条件下，真空旋转蒸发1h形成脂质薄膜，并用4ml去离子水水化。冰浴条件下，加入400μL的PFP，采用功率为100W的声振仪(ON 5s,OFF 5s)声振6min，获得含有PFP@LIP-H(Gd)s的体系。对获得的纳米粒子进行低温离心(8000r/min,5min)，再使用PBS对固相部分进行清洗，重复3次，最后用4mlPBS重悬，获得PFP@LIP-H(Gd)。制备过程全程避光。本方案制备的纳米粒子的粒径为(262.53±1.98)nm，电位为(29.17±0.929)mV，分散系数PDI(0.0143±0.00208)(结果见图3、图4和图5)。
实施例3：DiI标记的纳米粒(DiI-PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd))的制备
称取10mgDPPC、4mgDSPE-PEG3400-tLyP-1、3mgDPPG、3mgCH、2mgHMME-Gd和0.1mgDiI溶解于10ml三氯甲烷中，全程避光操作，成膜、水化、声振步骤同实施例1，即制得DiI荧光标记的PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)(DiI-PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd))。
实施例4：DiI标记的纳米粒(DiI-PFP@LIP-H(Gd))的制备
称取10mgDPPC、4mgDSPE-PEG3400、3mgDPPG、3mgCH、2mgHMME-Gd和0.1mgDiI溶解于10ml三氯甲烷中，全程避光操作，成膜、水化、声振步骤同实施例1，即制得DiI荧光标记的PFP@LIP-H(Gd)(DiI-PFP@LIP-H(Gd))。
对比例1：仅含PFP的纳米粒的制备(PFP@LIP)
称取10mgDPPC、4mgDSPE、3mgDPPG、3mgCH充分溶解于10ml三氯甲烷中，50℃水浴条件下，真空旋转蒸发1h形成脂质薄膜，并用4ml去离子水水化。冰浴条件下，加入400μL的PFP，采用功率为100W的声振仪(ON 5s,OFF 5s)声振6min，获得含有PFP NPs的体系。对获得的纳米粒子进行低温离心(8000r/min,5min)，再使用PBS对固相部分进行清洗，重复3次，最后用4mlPBS重悬，获得PFP NPs。制备过程全程避光。
对比例2：不加入PFP制备tLyP-1-LIP-H(Gd)
本对比例基本同实施例1，不同点在于，制备过程中不加入PFP，直接通过声震步骤形成纳米粒tLyP-1-LIP-H(Gd)。
实验例1：纳米粒的基本表征
①粒径及电位检测：将PFP@LIP、PFP@LIP-H(Gd)、PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)用双蒸水稀释数倍，用马尔文粒径电位分析仪检测粒径及电位。
②透射电子显微镜检测：将PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)用双蒸水稀释数倍后，送至重庆医科大学生命科学院电镜室进行观察其大小及表面形态。
透射电子显微镜可见PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)为球形(图1)，粒径约250nm。马尔文粒径分析仪测得PFP@LIP、PFP@LIP-H(Gd)及PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)的粒径分别为(245.27±7.69)nm，(262.53±1.98)nm，(260.93±5.28)nm(图2)；电位为(-29±0.781)mV，(-29.17±0.929)mV，(-15.7±2.646)mV(图3)。
实验例2：包封率检测
①将HMME-Gd用二甲亚砜稀释成不同浓度(6.25，12.5，25，50，75μg/mL)，用紫外分光光度计检测各浓度在波长300～800nm之间的紫外吸收光谱，用HMME-Gd在411nm处的吸光度(OD值)绘制标准曲线。
②用紫外分光光度计测量不同组纳米粒(HMME-Gd、PFP@LIP、PFP@LIP H(Gd)、PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd))在波长300～800nm之间的紫外吸收光谱。
③用紫外分光光度计检测PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)中HMME-Gd的包封率。包封率(％)＝(HMME-Gd的投入量-上清液中HMME-Gd的量)/HMME-Gd的投入量×100％。
紫外分光光度计测得PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)保留了HMME-Gd在411nm处的特异性吸收峰(图6)；通过不同HMME-Gd浓度波长在411nm的特异性吸收峰绘制HMME-Gd的标准曲线为Y＝0.01339X+0.3645，R2＝0.9990(图4和图5)。并通过标准曲线测得PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)中HMME-Gd的包封率约为93.33％。
实验例3：体内外靶向性检测
(1)体外靶向性检测
①细胞培养
a.MDA-MB-231细胞(人乳腺癌MDA-MB-231细胞株)在含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素溶液的DMEM溶液内培养，培养条件(37℃，5％CO2)，2～3天传一次代。
b.HUVEC细胞(人脐静脉血管内皮细胞株)在含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素溶液的DMEM溶液内培养，培养条件(37℃，5％CO2)，2～3天传一次代。
②实验分组：a.MDA-MB-231细胞+PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)；b.MDA-MB-231细胞+PFP@LIP-H(Gd)；c.HUVEC细胞+PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)。
③激光共聚焦检测体外靶向性
a.将MDA-MB-231细胞和HUVEC细胞分别以1×105个/皿的细胞浓度接种到共聚焦培养皿孵育24h。
b.24h后去除旧培养液，分别加入250μg/mL DiI标记的纳米粒无血清培养液溶液，每组分别设置孵育时长(0.5，1，2，4h)。
c.到相应孵育时间后，去除旧培养液，用PBS冲洗三次(目的：洗净未被细胞吞噬的纳米粒)。
d.往培养皿中加入4％多聚甲醛，固定15min。
e.15min后去除4％多聚甲醛，并用PBS冲洗三次。
f.加入DAPI细胞核染料100μL，共孵育10min。
g.最后再用PBS将多余的DAPI染料冲洗干净，并在每个培养皿内留100μLPBS。
h.以上步骤全程避光处理，送激光共聚焦显微镜进行检测。
④流式细胞仪检测体外靶向性
a.将MDA-MB-231细胞和HUVEC细胞分别以1×105个/孔的细胞浓度接种到6孔板孵育24h。
b.24h后去除旧培养液，分别加入250μg/mL DiI标记的纳米粒无血清培养液溶液，每组分别设置孵育时长(0，0.5，1，2，4h)。
c.到相应孵育时间后，去除旧培养液，用PBS冲洗三次(目的：洗净未被细胞吞噬的纳米粒)。
d.用0.25％胰酶将细胞消化下来，用低速离心机离心洗涤3次(1000rmp，5min)。
e.最后用300μL重悬，进行流式细胞仪检测。
激光共聚焦显微镜结果显示，DiI标记的PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)可靶向聚集到MDA-MB-231细胞膜周围，且随着时间的延长进入到细胞质内越多，而HUVEC细胞周围未见明显的聚集；同时DiI标记的PFP@LIP-H(Gd)在MDA-MB-231细胞周围未见明显的聚集。流式细胞仪结果显示，DiI标记的PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)与MDA-MB-231细胞共孵育不同时间后，发现荧光强度随时间增强(P<0.05)，而与HUVEC细胞共孵育后，荧光强度未见明显变化(P>0.05)；同时DiI标记的PFP@LIP-H(Gd)与MDA-MB-231细胞共孵育后也未见明显荧光变化(P>0.05)(图7)。
(2)体内靶向性检测
①建立裸鼠荷瘤模型：收集呈对数生长的MDA-MB-231人乳腺癌细胞株，用生理盐水重悬成1×106个/mL注射到裸鼠皮下。待肿瘤长至1cm3进行后续实验。
②实验分组：对照组：注射生理盐水；靶向组：注射PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)；非靶向组：注射PFP@LIP-H(Gd)。对照组注射生理盐水24h后、靶向组和非靶向组分别注射DiI标记的纳米粒后不同时间点(1，2，6，12，24h)后处死裸鼠，收集肿瘤组织进行荧光染色检测。
荧光显微镜结果显示，靶向组在注射纳米粒1h后可在肿瘤区域观测到大量红色荧光聚集，随着时间的延长，红色荧光增多，与对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；而非靶向组在注射纳米粒后肿瘤区域的荧光强度与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。
实验例4：体内外安全性检测
(1)体外安全性检测：①实验分组：a.PFP@LIP；b.PFP@LIP-H(Gd)；c.PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)。
②实验步骤
a.将呈对数生长的的MDA-MB-231细胞以1×104个/孔的浓度接种到96孔板中孵育24h。
b.去除旧培养液，加入分别含有不同浓度纳米粒的无血清培养液(0，0.375，0.75，1.5，3mg/mL)，共孵育24h。
c.去除b中的旧培养液，用PBS冲洗3次(将未被吞噬的纳米粒洗净)。
d.将CCK-8按每孔10μL的量用无血清培养液稀释10倍后，按每孔100μL加入96孔板中，孵育1-2h。
e.用酶标仪检测波长在450nm处的OD值，并计算各组细胞活性：
A＝实验组OD值；B＝空白组OD值；C＝对照组OD值；细胞活性(％)＝(A-B)/(C-B)
CCK-8法检测显示不同浓度的PFP@LIP、PFP@LIP-H(Gd)和PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)对MDA-MB-231细胞均无明显细胞毒性(P>0.05)(图8)。
(2)体内安全性检测
①将Balb/c小鼠随机分为对照组(注射生理盐水14d后处死小鼠)和实验组(注射PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)后1，5，7，14d后处死小鼠)(n＝3)。
②分别对各组进行处理：对照组尾静脉注射生理盐水14d后处死小鼠，实验组尾静脉注射PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)(1，5，7，14d)后处死小鼠采集血液样本，进行血常规及血生化指标检测。
血常规血生化检测结果显示实验组的各项血常规和血生化指标均在正常范围内，与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)(图9)。
综合分析实验例1-实验例4的结果：
本方案制备了一种肽功能化载HMME-Gd相变纳米粒，即PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)，TEM可观察到该纳米粒为典型的核壳结构，以脂质/HMME-Gd为壳，PFP为核，tLyP-1表面修饰为靶向成分，实现了主动靶向和深穿透。体内外靶向实验结果均表明，tLyP-1修饰纳米粒后可对MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231荷瘤小鼠具有靶向作用，为精准治疗提供新思路。
为探究纳米粒安全性为后续的体内实验做准备，体外CCK-8法及体内血液分析法均表明纳米粒在体内外都具有较高的安全性，可进行后续的体内实验。本部分成功制备了肽功能化载HMME-Gd相变纳米粒，即PFP@tLyP-1-LIPH(Gd)，其大小均一，分散性较好，在体内外均表现出良好的靶向性和较高的生物安全性，为后续的成像和治疗研究奠定了基础。
实验例5：体内外超声成像
体外超声成像
①制备琼脂凝胶模型：将琼脂凝胶配置成3％的水溶液，通过微波炉加热至粘稠状(加热过程中用玻璃棒不断搅拌)后，倒入1mL枪头盒，再插上1mL枪头，直至冷却至凝固状即可。
②取1mL稀释好的PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)加入凝胶模型中，先采集未经低强度聚焦超声(LIFU)处理前的超声图像，然后再采集经LIFU不同功率(0.6，1.8，3.2W/cm2；脉冲模式)辐照(辐照前，1，2，3，4min)后的超声图像；以不含PFP的tLyP-1-LIP-H(Gd)为对照组。
③用重庆医科大学超声分子影像学研究所自主研发的DFY型超声图像定量软件对各组超声图像的超声模式(US-mode)和造影模式(CEUS-mode)进行定量分析。
④将以LIFU(1.6W/cm2，脉冲模式)辐照(辐照前，1，2，3，4min)后的纳米粒溶液置于载玻片上，用倒置显微镜观察纳米粒的变化。
LIFU辐照前，各实验组超声图像的超声模式和造影模式均呈低回声。经LIFU辐照后，发现纳米粒在LIFU功率为0.8-3.2W/cm2之间，随着辐照时间的延长，各组超声图像的US-mode和CEUS-mode的回声呈上升趋势，而对照组超声图像在LIFU辐照先后未见明显变化。其中实验组以1.6W/cm2辐照2min的回声增强最明显(P<0.05)。值得注意的是，当功率为3.2W/cm2辐照1min后回声信号达到最强随后呈下降趋势。DFY定量分析软件结果显示与超声图像表现一致(图10和图11)。倒置光学显微镜显示纳米粒随LIFU辐照时间的延长体积逐渐增大(图12)。
体内超声成像
①实验分组：a.对照组：注射PFP@LIP-H(Gd)；b.实验组：注射PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)。
②实验步骤
a.将荷瘤小鼠用1％的戊巴比妥麻醉后，采集小鼠肿瘤部位的注射前超声图像。
b.通过尾静脉注射各组纳米粒，并在注射2h后采集小鼠肿瘤部位的超声图像。
c.用LIFU(1.6W/cm2,脉冲模式)辐照2min后再次采集小鼠肿瘤部位的超声图像。
d.用DFY型超声图像定量软件对各组超声图像的US-mode和CEUS-mode进行定量分析。
注射纳米粒之前，对照组和实验组肿瘤部位的超声图像均为低回声，同样在注射纳米粒2h后仍为低回声，而在LIFU辐照后实验组超声图像US-mode和CEUS-mode的回声信号及灰阶值均明显增强(P<0.05)，而对照组在LIFU辐照前后超声图像的US-mode和CEUS-mode的回声信号及灰阶值无明显变化(P>0.05)(图13-15)。
实验例6：体内外光声成像
体外光声成像
①制备琼脂凝胶模型
将琼脂凝胶配置成3％的水溶液，通过微波炉加热至粘稠状(加热过程中用玻璃棒不断搅拌)后，倒入200μL枪头盒，再插上200μL枪头，直至冷却至凝固状即可。
②选取激发波长，取PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)溶液200μL放置凝胶模型中，对样品进行全波长(680nm-900nm)激发处理，选取光声信号最强的激发波长进行后续实验。
③将PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)配置成不同浓度(0.15625，0.3125，0.625，1.25，2.5，5mg/mL)，然后分别将各浓度取200μL放置凝胶模型中，用②选取的激发波长进行光声成像，并对目标区域进行光声信号定量分析。
通过对PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)纳米粒进行全波长(680nm-900nm)激发处理，发现PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)纳米粒在690nm激发后光声信号最明显。光声仪结果显示，经690nm激发后PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)的光声信号与其浓度呈线性关系，其回归方程为Y＝0.3512X+0.2363，R2＝0.9940(图16)。
体内光声成像
①实验分组：a.对照组：注射PFP@LIP-H(Gd)；b.实验组：注射PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)。
②实验步骤
a.将荷瘤小鼠用1％的戊巴比妥麻醉后，采集小鼠肿瘤部位的注射前光声图像。
b.通过尾静脉注射各组纳米粒，并在注射(2，6，24h)后采集小鼠肿瘤部位的光声图像。
c.对肿瘤部位进行光声信号定量分析。
注射纳米粒之前，对照组和实验组肿瘤部位均未探及光声信号。实验组在注射纳米粒2h后可见明显的光声信号，并且可持续24h；而对照组在注射纳米粒不同时间均未探及光声信号增强。光声信号定量分析同样表明对照组在注射纳米粒不同时间肿瘤部位的光声值与注射前相比，差异无统计学意义(P>0.05)；而实验组在注射纳米粒不同时间肿瘤部位的光声值与注射前相比，差异有统计学意义(P<0.05)(图17和图18)。
实验例7：体内外荧光成像
体外荧光成像
①将DiR标记的PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)稀释成不同浓度(0.009765625，0.01953125，0.0390625，0.078125，0.15625，0.3125，0.625，1.25，2.5，5mg/mL)。
②将稀释好的纳米粒加入96孔板中，每孔100μL，每个浓度3个复孔，用小动物活体荧光成像仪观察各浓度荧光分布。
③用小动物活体荧光成像软件对各组的荧光信号进行定量分析。
小动物活体荧光成像系统显示，DiR标记的PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)荧光强度在一定范围内随PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)的浓度增多而增强，但到一定浓度后荧光强度不在增强(图19)。
体内荧光成像
①实验分组：a.对照组：注射PFP@LIP-H(Gd)；b.实验组：注射PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)。
②实验步骤
a.将荷瘤小鼠用异氟烷麻醉后，采集小鼠的注射前活体荧光图像。
b.通过尾静脉注射各组纳米粒，并在注射(2，6，8，12，24h)后采集小鼠的活体荧光图像。
c.24h后处死各组小鼠，分离肿瘤组织和主要脏器(心肝脾肺肾脑)，采集其荧光图像。
d.对目标区域及离体组织的荧光信号进行定量分析。
小动物活体荧光成像系统显示，在注射纳米粒之前，对照组和实验组小鼠的肿瘤区域及主要脏器未探及荧光信号，其中实验组注射纳米粒2h后在小鼠肿瘤部位及肝脾可见明显的荧光信号，6h达到最强并且可持续24h；而对照组注射纳米粒2h后直至24h只在小鼠的肝脾探及很强荧光信号，而在肿瘤部位未探及荧光信号。对两组肿瘤部位荧光信号定量分析可得，对照组在注射纳米粒不同时间肿瘤部位的荧光值与注射前相比，差异无没有统计学意义(P>0.05)；而实验组在注射纳米粒不同时间肿瘤部位的荧光值与注射前相比，差异有统计学意义(P<0.05)。24h后，处死小鼠取主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)进行荧光成像，其中两组的肝脾信号较高，这与肝脾含有大量内皮网状细胞会吞噬大量纳米粒有关。比较两组肿瘤部位的荧光成像，实验组的荧光值明显高于对照组(P<0.05)(图20-22)。
实验例8：体内外MRI成像
体外MRI成像
①将PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)按Gd3+的剂量配置成一定浓度(0.015，0.025，0.04，0.05，0.06，0.1mM)。
②并将各浓度纳米粒加入2mL离心管后置于核磁共振仪中进行T1加权成像。
③用MRI定量分析软件进行MRI信号定量分析。
核磁共振仪T1加权图像显示，PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)弛豫率与PFP@tLyP-1-体内MRI成像LIP-H(Gd)中Gd3+的剂量呈线性关系，其回归方程为Y＝21.29X+0.2048，R2＝0.9958(图23)。
①实验分组：a.对照组：注射PFP@tLyP-1-LIP；b.实验组：注射PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)。
②实验步骤
a.将荷瘤小鼠用1％的戊巴比妥麻醉后，采集小鼠的注射前T1加权图像。
b.通过尾静脉注射各组纳米粒，并在注射(2，6，12，24h)后采集小鼠的T1加权图像。
c.用MRI定量分析软件对目标区域进行MRI信号定量分析。
核磁共振仪T1加权图像显示，在注射纳米粒之前，对照组和实验组小鼠的肿瘤部位呈低信号，其中实验组注射纳米粒2h后在小鼠肿瘤部位可见明显的信号增强，6h达到最强，而在12h MRI信号呈下降趋势；而对照组注射纳米粒不同时间肿瘤部位均未见MRI信号增强。对两组肿瘤部位MRI信号定量分析可得，对照组在注射纳米粒不同时间肿瘤部位的荧光值与注射前相比，差异无统计学意义(P>0.05)；而实验组注射纳米粒不同时间肿瘤部位的荧光值与注射前相比，差异有统计学意义(P<0.05)(图24和图25)。
综合分析实验例5-实验例8的结果：
上述实验例进行了肽功能化相变纳米粒PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)多模态成像的实验研究，即体内外超声/光声/荧光/MRI成像情况。超声诊断仪可观察到纳米粒增强超声成像的能力具有LIFU功率和辐照时间依赖性，其中以功率为1.6W/cm2，辐照2min效果最佳；有趣的是当LIFU功率过高时，超声图像US-mode和CEUS-mode模式的回声信号迅速增强，之后随着辐照时间延长回声信号逐渐下降。在LIFU照射下，PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)可增强超声成像。然后对体内超声成像的US-mode和CEUS-mode进行评价，结果显示，PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)注射后2h图像有轻微增强，表明纳米发生轻微的相变。然而，LIFU照射后回声信号明显增强，表明PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)可有效地积聚到肿瘤区域，并通声致相变(ADV)增强超声成像，而对照组却无明显变化。因此，PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)作为超声造影剂可以实现超声成像，并显示出较好的增强效果，而tLyP-1的修饰可以扩大成像和治疗效果，为进一步的应用奠定基础。
活体荧光成像系统表明随着纳米粒的浓度增加其荧光强度逐渐增强，但由于DiR的自猝灭效应，荧光强度达到一定范围后就保持不变，表明PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)作为成像应用的近红外对比剂的有效性。体内荧光成像表明，以DiR标记的PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)为对比剂，评价其在全身的生物分布。静脉注射PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)和PFP@LIP-H(Gd)后，注射PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)2h可见明显荧光，24h观察肿瘤部位荧光稳定。此外，PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)组的肿瘤离体荧光信号也明显增强，同时观察到肝脏聚集减少，这进一步支持了修饰tLyP-1用于肿瘤特异性聚集的可行性。光声仪结果表明PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)的光声信号随其浓度呈线性增加。体内光声成像可观察到PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)注射后肿瘤部位的光声信号强度高于注射前。PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)可有效地在肿瘤部位选择性聚集，实现光声成像。MRI成像仪可观察到MRI信号强度与PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)中Gd3+的剂量呈线性增加，弛豫时间为21.29mM-1s-1。与PA成像相似，静脉注射PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)后24h，肿瘤部位的MRI信号强度明显增加。而作为对照组，注射PFP@tLyP-1-LIP后，MR成像的增强可以忽略不计；说明PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)可有效增强核磁的T1加权成像。
综上结果显示PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)具有成为超声/光声/荧光/MRI四模态成像对比剂的潜力，为乳腺癌提供全面提供多层次、多属性信息，实现无误诊断和实时监测。
实验例9：声动力效果检测
纳米粒水平ROS检测
①将单线态氧荧光探针(singlet oxygen sensor green,SOSG)溶液配置成5×10-5M。
②用SOSG溶液将PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)稀释成不同浓度(0,0.1875,0.375,0.75,1.5,3mg/mL)。
③将不同浓度含SOSG的PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)溶液取3mL于EP管中，用LIFU进行辐照(1.6W/cm2，120s，脉冲模式)后用荧光分光光度计检测ROS的产生情况。
④浓度为0.75mg/mL的含SOSG的PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)溶液用LIFU(1.6W/cm2，脉冲模式)辐照不同时间(0，30，60，90，120，150，180s)后，荧光分光光度计检测ROS的产生情况。
通过单线态氧荧光探针(Singlet oxygen sensor green,SOSG)检测细胞外ROS产生，发现LIFU辐照(1.6W/cm2，2min，脉冲模式)PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)后产生ROS的能力具有浓度依赖性，即产生ROS的量随PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)浓度的增加而增加。同时当PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)浓度一定时，纳米粒产生ROS的能力具有LIFU辐照时间依赖性，即产生ROS的量随LIFU辐照时间的延长而增加(图26和图27)。
细胞水平ROS检测
①实验分组：a.Control组，b.tLyP-1-LIP(hypoxia)组，c.tLyP-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)组，d.tLyP-1-LIP-H(Gd)(normoxia)组，e.PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)组，f.Control+LIFU组，g.tLyP-1-LIP(hypoxia)+LIFU组，h.tLyP-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)+LIFU组，i.tLyP-1-LIP-H(Gd)(normoxia)+LIFU组，j.PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)+LIFU组。
②将呈对数生长的MDA-MB-231细胞以1×105个/皿接种到共聚焦皿内孵育24h。
③分别往相应的共聚焦皿中加入对应的纳米粒，Control组加等量无菌PBS，孵育4h。
④配置DCFH-DA溶液：按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μM。
⑤4h后丢弃旧培养液，并用无血清培养液冲洗三次(目的：洗掉未被吞噬的纳米粒)，加入1mLDCFH-DA溶液孵育30min。
⑥丢弃DCFH-DA溶液，用无血清培养液冲洗三次(目的：洗掉未被吞噬的DCFH-DA)，再加入1mL无血清培养液。
⑦乏氧组，除了用GENbox厌氧袋处理外，其他条件相同，在GENbox厌氧袋中，指示剂的颜色从粉色变为无色，表明环境变为乏氧。
⑧将g、h、i、j组用LIFU进行辐照(1.6W/cm2，2min，脉冲模式)后，通过激光共聚焦显微镜观察ROS的产生情况。
通过DCFH-DA检测细胞内ROS产生，发现在乏氧条件下，tLyP-1-LIP-H(Gd)+LIFU组的绿色荧光明显多于tLyP-1-LIP+LIFU组，但也明显低于常氧条件下的tLyP-1-LIP-H(Gd)+LIFU组；而乏氧条件下PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)+LIFU组的绿色荧光明显多于乏氧条件下的tLyP-1-LIP-H(Gd)+LIFU组，与常氧条件下tLyP-1-LIP-H(Gd)+LIFU组相似；未经LIFU辐照的各组均未见明显的绿色荧光。
实验例10：体外治疗
CCK-8法
①实验分组：i.a.PFP@LIP+LIFU组，b.PFP@LIP-H(Gd)+LIFU组，c.PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)+LIFU组；ii.a.tLyP-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)+LIFU组、b.tLyP-1-LIP-H(Gd)(normoxia)+LIFU组、c.PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)+LIFU组
②将呈对数生长的MDA-MB-231细胞接种于96孔板(1×104个/孔)孵育24h。
③去除旧培养液，加入分别含有不同纳米粒的的无血清培养液(0，0.375，0.75，1.5，3mg/mL)，共孵育4h。
④孵育4h后，分别用LIFU(1.6W/cm2，2min，脉冲模式)进行辐照后，再孵育8h。
⑤孵育8h后用无PBS冲洗三次，然后按每孔10μL CCK8的量用无血清培养液稀释10倍后，按每孔100μL加入96孔板中，孵育1-2h。
⑥用酶标仪检测波长在450nm处的OD值，并计算各组细胞活性：
A＝实验组OD值；B＝空白组OD值；C＝对照组OD值；细胞活性(％)＝(A-B)/(C-B)。
⑦对于乏氧组，除了用GENbox罐处理外，其他条件相同，在GENbox罐中，指示剂的颜色从粉色变为无色，表明环境变为乏氧。
通过CCK-8检测可见，首先各组纳米粒对MDA-MB-231细胞的细胞活性经LIFU辐照后均随纳米粒浓度的增加而降低，其中以PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)+LIFU组的细胞活性最低；其次在常氧和乏氧条件下分别比较tLyP-1-LIP-H(Gd)对肿瘤细胞的治疗效果，结果显示乏氧条件下tLyP-1-LIP-H(Gd)的治疗效果明显减弱；为了进一步研究PFP在乏氧肿瘤治疗过程的作用，我们制备了装载PFP的纳米粒PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)，结果显示，经LIFU辐照后在乏氧环境中PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)对乳腺癌治疗效果明显好于未装载PFP的tLyP-1-LIP-H(Gd)，其治疗效果亦好于tLyP-1-LIP-H(Gd)在正常氧肿瘤的治疗效果(图28和图29)。
活死细胞双染法
①实验分组：a.Control组，b.tLyP-1-LIP(hypoxia)组，c.tLyP-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)组，d.tLyP-1-LIP-H(Gd)(normoxia)组，e.PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)组，f.Control+LIFU组，g.tLyP-1-LIP(hypoxia)+LIFU组，h.tLyP-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)+LIFU组，i.tLyP-1-LIP-H(Gd)(normoxia)+LIFU组，j.PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)+LIFU组。
②将呈对数生长的MDA-MB-231细胞以1×105个/皿接种到共聚焦皿，孵育24h。
③分别往相应的共聚焦皿中加入对应的纳米粒，Control组加等量无菌PBS，孵育4h。
④孵育4h后，用无菌PBS洗3次，并加入1mL新鲜的无血清培养液，用LIFU进行辐照(1.6W/cm2，2min，脉冲模式)后，再孵育6h。
⑤配置活死细胞双染染料溶液，取5μLCalcein-AM溶液(2mM)和15μLPI溶液(1.5mM)加入5mL无菌PBS中，充分混匀，全程避光。
⑥孵育6h后，丢弃旧培养液，加入活死细胞双染染料溶液染色15min，通过激光共聚焦显微镜观察细胞的生存情况。
⑦对于乏氧组，除了用GENbox罐处理外，其他条件相同，在GENbox罐中，指示剂的颜色从粉色变为无色，表明环境变为乏氧。
激光共聚焦显微镜观察到，在乏氧条件下，tLyP-1-LIP-H(Gd)+LIFU组的死细胞数量(红色荧光)明显多于tLyP-1-LIP+LIFU组，但也明显低于常氧条件下的tLyP-1-LIP-H(Gd)+LIFU组，而PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)+LIFU组死细胞数量明显多于乏氧条件下tLyP-1-LIP-H(Gd)+LIFU组，与常氧情况下tLyP-1-LIP-H(Gd)+LIFU组相似。未经LIFU辐照的各组均未见明显的细胞死亡。
实验例11：体内治疗
①将荷瘤小鼠随机分为6组(n＝6)：a.Control，b.单纯LIFU组，c.tLyP-1-LIP+LIFU组，d.tLyP-1-LIP-H(Gd)组，e.PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)，f.PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)+LIFU组。
②记录小鼠体重和肿瘤大小后，尾静脉注射相应的纳米粒，Control注射等量的生理盐水，注射纳米粒6h后用LIFU进行辐照(1.6W/cm2，2min，脉冲模式)，每3天治疗一次，每2天记录老鼠体重和肿瘤大小。
③每组治疗后24h处死具有代表性的小鼠，收集主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)及肿瘤组织。对肿瘤进行H&E和PCNA染色，评价其治疗效果。主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)进行H&E染色评价其生物相容性。
体内治疗结果显示：与对照组相比，单纯LIFU组、PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)组和tLyP-1-LIP+LIFU组仅观察到轻微肿瘤抑制。而tLyP-1-LIP-H(Gd)+LIFU组的疗效较tLyP-1-LIP+LIFU组明显增强。此外，PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)+LIFU在治疗过程结束时显示最大的抑瘤作用。同时，在治疗过程中没有观察到体重的明显变化。此外，还观察到所有治疗组主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)的H&E染色均未发现明显的组织损伤(图31-32)。通过肿瘤切片的苏木素-伊红(H&E)和增殖细胞核抗原(PCNA)染色观察到肿瘤细胞形态和增殖水平的变化。PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)+LIFU组H&E染色可见大量细胞凋亡和坏死，PCNA染色观察到肿瘤细胞增殖过程中表现出较强的抑制作用。
综合分析实验例9-实验例11的结果：
本部分进行了肽功能化载HMME-Gd相变纳米粒，即PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)，治疗乳腺癌的体内外实验研究。通过SOSG检测，我们发现LIFU辐照PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)后产生ROS的能力具有纳米粒浓度依赖性和LIFU辐照时间依赖性；声动力治疗过程主要为超声辐照声敏剂，在氧气存在的情况下生成活性氧(ROS)从而治疗肿瘤。因此，氧气的存在及含量对声动力治疗过程中ROS的产生至关重要。由于恶性肿瘤生长速度快，肿瘤细胞及其生存的肿瘤微环境经常处于乏氧状态。为了评估乏氧环境下声动力治疗疗效，我们首先检测了声动力治疗过程中细胞水平的ROS的生成情况，结果表明乏氧条件下tLyP-1-LIP-H(Gd)和tLyP-1-LIP相比，tLyP-1-LIP-H(Gd)在LIFU辐照下可见绿色荧光，说明声敏剂HMME-Gd可引发声动力(SDT)治疗；但与常氧条件下的tLyP-1-LIP-H(Gd)+LIFU组相比，其绿色荧光明显减弱，说明HMME-Gd的SDT效果具有氧依赖性，在乏氧情况下tLyP-1-LIP-H(Gd)的声动力治疗效果受到明显抑制，从而影响其对肿瘤细胞的杀伤效果。为了解决这个难题，我们制备了载PFP的相变型纳米粒PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)，如前所述，该纳米粒可在LIFU辐照下由声致相变现象产生微泡，实现超声成像；考虑到污水处理过程中气泡的空化效应对还原性工业废物的剧烈氧化作用，本研究在乏氧条件下将PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)与乳腺癌细胞共孵育，探索其在乏氧肿瘤细胞中的活性氧产生情况，结果显示在乏氧条件下PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)经LIFU辐照后的绿色荧光较tLyP-1-LIP-H(Gd)明显增多，提示装载PFP后PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)产生的ROS增多。这一现象可归因于PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)相变后，所产生微泡的空化效应可增强乏氧肿瘤中活性氧的产生，从而有望增强对乏氧肿瘤的治疗作用。同时，未经IFU辐照的各组均未见明显的绿色荧光，提示本纳米粒产生的活性氧是由声动力效应及液气相变后所产生气泡的超声空化效应产生的，有望为乏氧肿瘤的治疗提供新的思路。
为了评价经LIFU辐照后PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)对正常氧和乏氧肿瘤细胞的杀伤作用，我们通过CCK-8法分别检测正常氧和乏氧肿瘤细胞的细胞活性。发现在常氧条件下各组纳米粒对MDA-MB-231细胞的杀伤作用经LIFU辐照后均随纳米粒浓度的增加而增加；在各处理条件下，PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)+LIFU组效果最佳，这是由于SDT联合空化效应叠加的治疗效果；与前文活性氧产生情况一致，tLyP-1-LIP-H(Gd)经LIFU处理后正常氧环境的细胞活性低于乏氧环境，表明声动力治疗效应具有氧依赖性；在装载PFP后，PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)对乏氧肿瘤的治疗效果显著增强，这表明PFP相变后，LIFU辐照引发的空化效应特性可有效改善乏氧环境下声动力效果不佳的问题。为了评估乏氧环境下纳米粒对肿瘤细胞的治疗作用，我们通过活死细胞双染法可观察到本纳米粒经LIFU辐照相变后发生的空化效应对乏氧肿瘤具有可观的治疗作用，同时未经LIFU辐照的各组均未见明显的细胞死亡，表明我们制备的纳米粒有较高的安全性。
由于肿瘤组织天然的乏氧特性，我们在荷瘤小鼠模型中进一步评估PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)在体内的治疗效果。在治疗过程中小鼠体重的没有明显变化，表明我们研究中的治疗剂量和LIFU强度是可以耐受的。此外，还观察到心、肝、脾、肺、肾和脑的病理形态学分析，所有治疗组均未发现明显的组织损伤。为了进一步验证空化效应和声动力的协同治疗效果，在第一次治疗后24h，从不同组小鼠身上采集肿瘤切片。发现PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)+LIFU组H&E染色可见大量细胞凋亡和坏死。其余各组对治疗肿瘤均无明显疗效。PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)，在LIFU辐照后具有良好的声动力治疗效果，结合相变纳米粒的空化效应在体外可显著抑制乏氧肿瘤细胞生长，在体内可显著抑制荷瘤裸鼠的肿瘤生长，为解决传统纳米粒声动力治疗对乏氧肿瘤疗效欠佳的难题提供新思路。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种肽功能化载金属卟啉相变纳米粒，其特征在于，所述纳米粒包括脂质体形成的壳膜和壳膜内包裹的液态氟碳，所述脂质体的脂质双分层内包载有血卟啉单甲醚-钆。
2.根据权利要求1所述的一种肽功能化载金属卟啉相变纳米粒，其特征在于，所述液态氟碳为全氟戊烷。
3.根据权利要求2所述的一种肽功能化载金属卟啉相变纳米粒，其特征在于，所述壳膜上共价连接有肿瘤归巢穿膜肽。
4.根据权利要求3所述的一种肽功能化载金属卟啉相变纳米粒，其特征在于，所述纳米粒的粒径为260.93±5.28nm。
5.根据权利要求4所述的一种肽功能化载金属卟啉相变纳米粒，其特征在于，所述纳米粒的电位为-15.7±2.646mV。
6.根据权利要求1-5中任一项权利要求所述的一种肽功能化载金属卟啉相变纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：使用肿瘤归巢穿膜肽修饰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400-马来酰亚胺，获得二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400-肿瘤归巢穿膜肽；
步骤(2)：将二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400-肿瘤归巢穿膜肽、二棕榈酰磷脂酰甘油、胆固醇和血卟啉单甲醚-钆溶解于三氯甲烷中，获得成膜体系；真空旋转蒸发所述成膜体系，获得薄膜；将所述薄膜水化后，得水化体系；在水化体系中加入全氟戊烷，并超声处理所述含有全氟戊烷的水化体系，获得纳米粒。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400-肿瘤归巢穿膜肽、二棕榈酰磷脂酰甘油、胆固醇、血卟啉单甲醚-钆溶和三氯甲烷的用量比为10mg：4mg：3mg：3mg：2mg：10ml。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，50℃水浴条件下，真空旋转蒸发所述成膜体系1h获得薄膜；使用磷酸盐缓冲液将所述薄膜水化后，得水化体系。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，在冰浴的条件下，在水化体系中加入全氟戊烷；超声处理的功率为100W，超声时间为6min。
10.根据权利要求1-5中任一项权利要求所述的一种肽功能化载金属卟啉相变纳米粒在肿瘤诊断制剂或肿瘤治疗药物中的应用。
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