CN114870027A - 双芘作为制备超声触发声敏剂的应用、肽功能化复合物和制剂、其制备方法和应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肿瘤治疗领域，尤其涉及双芘作为制备超声触发声敏剂的应用、肽功能化复合物和制剂、其制备方法和应用方法。所述双芘作为制备超声触发声敏剂的应用中，双芘仍能保持其作为AIE型光敏剂的聚集增强荧光发射的特点，且在超声触发下也表现出了聚集增强活性氧产生的特性。

Description

双芘作为制备超声触发声敏剂的应用、肽功能化复合物和制 剂、其制备方法和应用方法

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗领域，尤其涉及双芘作为制备超声触发声敏剂的应用、肽功能化复合物和制剂、其制备方法和应用方法。

背景技术

据2018年国际癌症研究机构（IARC）调查的最新数据显示，乳腺癌在全球女性癌症中的发病率为24.2%，位居女性癌症的首位，其中52.9%发生在发展中国家。在我国，乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势，每年有30余万女性被诊断出乳腺癌。

对于乳腺癌的治疗，主要包括手术治疗，辅以化学治疗、放射治疗、内分泌治疗和生物治疗，也就是分子靶向治疗等。此外，近几十年还发展出了光热治疗、光动力治疗、声动力治疗等具有靶向特性的治疗方法。光动力治疗由光波激发发射荧光，并进而产生ROS；声动力治疗由超声波激发产生ROS，并也可能发射出少量荧光。超声波的穿透性能远远强于光波，可克服光动力治疗仅能触及浅表组织的不足，在治疗深部肿瘤方面，由于超声波可到达更深层组织，因此，声动力治疗对于深部肿瘤具有较好的杀伤力。

如公开号为CN112933227A的中国发明专利申请记载了一种可治疗乳腺癌的基于声动力/免疫联合治疗的新型复合纳米制剂，包括：声敏剂、免疫激活剂、活性氧增强药物和脂质体；声敏剂和活性氧增强药物包载于脂质体磷脂双分子层中，免疫激活剂嵌于脂质体磷脂双分子层上。由脂质体磷脂双分子层形成纳米颗粒。该制剂适用于声动力治疗和免疫疗法的联合治疗。其中的声敏剂是二氢卟吩e6及其衍生物，活性氧增强药物是肉桂醛衍生物，其作用是增强声敏剂产生活性氧的效果。

如公开号为CN112439065A的中国发明专利申请记载了一种用于治疗肺癌的兼具分子靶向/声动力治疗的携氧载药自组装纳米药物，包括壳聚糖、厄洛替尼、血卟啉和全氟辛溴，其中的厄洛替尼为治疗肺癌的靶向药物，使该纳米药物具有靶向性，血卟啉为声敏剂，全氟辛溴为携氧体，可增强血卟啉产生活性氧的效果。

以上两个方案中的声敏剂分别是二氢卟吩e6及其衍生物和血卟啉，都属于聚集导致淬灭（Aggregation-caused Quenching，即ACQ）型光敏剂，它们大多具有刚性结构，分散于溶液后，随着浓度的升高而聚集，导致自身荧光发射逐渐衰弱。以ACQ型光敏剂用作声敏剂进行声动力治疗时，尤其在应用其荧光发射性进行成像引导治疗时，也会发生聚集导致淬灭的效应。

为增强声敏剂产生活性氧的效果，都添加了增氧剂，例如：肉桂醛衍生物或全氟辛溴。肉桂醛的主要作用有抗菌抗病毒、抗癌、扩张血管和降压、壮阳以及外用，且肉桂醛本身具有行为毒性（嗜睡、昏迷、共济失调）、胃肠道毒性（过度运动、腹泻）、呼吸道毒性（刺激呼吸道）、肝毒性（肝重量发生变化、肝功能下降）、生化毒性（抑制或诱导肝微粒体混合功能氧化酶），以及生殖毒性（颅骨和面部发育异常、肌肉骨骼系统发育异常）。对于肉桂醛衍生物，根据《肉桂醛基衍生物结构与抑菌性能构效关系》一书的记载，主要具有抑菌活性。所以，肉桂醛衍生物作为活性氧增强药物的作用得不到理论支持，其在专利申请说明书中也未提及其增强活性氧产生的机理。全氟辛溴，也叫全氟辛基溴或全氟溴辛烷，是强氧化剂，对氧气和二氧化碳的溶解度是空气的两倍，但其蒸汽或喷雾对眼睛、粘膜、上呼吸道均有刺激性，属于6.1类有毒物质，虽然已用于组织携氧，但由于其对二氧化碳的溶解度同样高于空气，所以，如果不能及时排出已吸收饱和的全氟辛溴并补充新鲜的全氟辛溴，都无法充分发挥其携氧剂的功能，所以，对于全氟辛溴的应用也应谨慎。

现有技术也有用AIE光敏剂用作声敏剂的报道，例如TTMN、DCYy等，可以克服ACQ类光敏剂作声敏剂时聚集导致效果减弱的问题。但AIE声敏剂存在疏水、靶向性不足等问题。为解决该问题，通常把声敏剂嵌入脂质双分子层中或内部，或者制成用微囊包裹的结构，其制备工艺较复杂，且单个结构中各成分的比例可能不一致，比如单个结构中可能有多个或没有声敏剂，而且脂质双分子层或微囊的结构可能不够稳定，使嵌合其上或内部的成分可能脱离该结构。

发明内容

对于现有技术中的AIE型声敏剂种类少的问题，本发明提供了双芘作为制备超声触发声敏剂的应用。有益效果：BP作为AIE型光敏剂具有聚集增强荧光发射的特性，但没有将其用作声敏剂的报道，发明人发现BP也可以用作声敏剂，在超声触发下能产生活性氧ROS，包括单线态氧。

本发明还提供了双芘作为制备聚集性增强超声触发声敏剂的应用。有益效果：BP作为光敏剂具有聚集增强荧光发射的特性，发明人发现，BP作为声敏剂也具有聚集或浓度升高时增强活性氧ROS产生的效果，从而可以增强声动力治疗的作用。

本发明还提供了用于超声触发抗肿瘤治疗的肽功能化复合物，含有上述作为制备声敏剂应用的双芘，和与双芘结合的多肽，所述多肽含有肿瘤归巢穿膜序列、caspase-3响应性序列和靶向线粒体序列。有益效果：多肽中的三个序列具有不同功能，使BP具有肿瘤归巢穿膜、靶向线粒体和响应caspase-3酶的功能，caspase-3响应性序列在环境中存在caspase-3酶时可水解，使该肽功能化复合物的疏水性升高，从而促进其因疏水性而在水性环境中聚集的效果，进而可增强其产生ROS的作用。

进一步地，所述靶向线粒体序列为CFFFVLKLAKLAK，caspase-3响应性序列为DEVD，肿瘤归巢穿膜序列为AKRGARSTA，双芘BP的-R基团为-(CH₂)₅-COOH；所述多肽的N端为靶向线粒体序列的C氨基，靶向线粒体序列的K氨基连接caspase-3响应性序列的DE的D氨基，肿瘤归巢穿膜序列的AK的A氨基连接caspase-3响应性序列的VD的D氨基，双芘BP通过羧基与多肽N端的氨基形成酰胺键而共价结合于多肽。有益效果：肿瘤归巢穿膜序列为亲水性，caspase-3响应性序列、靶向线粒体序列和BP均具有疏水性，且该靶向线粒体序列有较多的β折叠，可以提高多肽分子间疏水作用和氢键等非共价键的相互作用，从而可自发有序地形成复杂、稳定的分子聚集体，促进多肽-BP的自组装。BP连接于多肽的疏水端的末段，在形成自组装复合物时可以包裹在疏水部内。

本发明还提供了用于超声触发抗肿瘤治疗的肽功能化制剂，其原料包括：上述肽功能化复合物、二甲基亚砜DMSO和超纯水。有益效果：DMSO作为疏水的初溶剂，可溶解所述肽功能化复合物，在超纯水中可使肽功能化复合物的亲水序列在自组装时位于自组装物的外侧，使其接触水分子，疏水部分则被包裹在内部，从而使所述自组装物可分散于超纯水中。

进一步地，肽功能化复合物以自组装物的形式存在，自组装物包括亲水部和疏水部，肿瘤归巢穿膜序列为亲水部，靶向线粒体序列和双芘BP为疏水部，caspase-3响应性序列位于亲水部和疏水部之间。有益效果：设置亲水部和疏水部可便于自组装物的形成，使亲水部趋向于接触水分子，疏水部趋向于接触DMSO分子，从而使自组装物可分散于水溶液中。

本发明还提供了上述肽功能化复合物的制备方法，其步骤包括：Step 1：合成多肽；Step 2：加入摩尔过量的双芘BP分子，避光缩合反应；Step 3：切下多肽，抽滤，得所述肽功能化复合物的溶液；Step 4：把step 3中的溶液吹干，沉淀，离心，冲洗，得到所述肽功能化复合物。有益效果：使BP共价结合于多肽的N端，共价结合可使BP更稳定地连接于多肽上，在自组装和在体内流动的过程中也更易于保持其结构。

本发明还提供了上述肽功能化制剂的制备方法，其步骤包括：Step 5：取肽功能化复合物溶解到二甲基亚砜DMSO中；Step 6：把step 5中的二甲基亚砜DMSO溶液加入超纯水，涡旋后得到肽功能化制剂。有益效果：以DMSO作为疏水的初溶剂，以超纯水作为制剂的终溶剂，由于DMSO可溶于水，在DMSO和水分子之间的分子间作用力平衡后形成的界面处，亲水序列朝向水分子一侧，疏水序列朝向DMSO一侧，并借助分子间作用力和非共价键等的作用形成疏水部，使自组装物可分散于水中。

本发明还提供了上述肽功能化制剂作为制备用于超声触发抗肿瘤治疗物的应用。有益效果：上述肽功能化制剂可用于声动力治疗，并且可靶向肿瘤组织、靶向线粒体和响应于caspase-3酶而水解，从而促进自组装物的聚集，增强BP产生ROS的作用。

本发明还提供了上述肽功能化制剂作为制备用于超声触发抗肿瘤治疗物的应用方法，使用时，用超声波装置触发双芘BP。有益效果：由超声波触发BP可产生ROS，进而可用于声动力的抗肿瘤治疗。

附图说明

图1示出了本发明实施例的PsaN-1的透射电镜图。

图2示出了本发明实施例的PsaN-1的紫外光谱图。

图3示出了本发明实施例的PsaN-1的荧光光谱图。

图4示出了本发明实施例的PsaN-1在超纯水中的时间稳定性的折线图。

图5示出了本发明实施例的PsaN-1在不同溶液内的稳定性的曲线图。

图6示出了本发明实施例的BP、PsaN-1和PsaN-2在细胞内的共聚焦荧光显微镜图。

图7示出了本发明实施例的BP、PsaN-1和PsaN-2的流式细胞仪图。

图8示出了本发明实施例的BP、PsaN-1和PsaN-2的细胞内荧光强度对比曲线图。

图9示出了本发明实施例的BP、PsaN-1和PsaN-2用于三维肿瘤球模型的激光共聚焦显微镜图。

图10示出了本发明实施例的PsaN-1和PsaN-3用JC-1染色的激光共聚焦显微镜图。

图11示出了本发明实施例的PsaN-1和PsaN-3用JC-1染色的流式细胞仪图。

图12示出了本发明实施例的BP、PsaN-1和PsaN-3影响细胞乏氧情况的激光共聚焦显微镜图。

图13示出了本发明实施例的PsaN-1和加超声影响线粒体形态的生物透射电镜图。

图14示出了本发明实施例的PsaN-1和PsaN-3都加超声影响细胞内的细胞色素C含量的WB检测图。

图15示出了本发明实施例的梯度浓度的PsaN-1与caspase-3反应后单线态氧产生率的SOSG探针检测图。

图16示出了本发明实施例的BP、PsaN-1及其与caspase-3反应后在梯度时间单线态氧产生率的SOSG探针检测图。

图17示出了本发明实施例的BP和PsaN-1在超声触发下与梯度浓度caspase-3反应后单线态氧产生率的SOSG探针检测图。

图18示出了本发明实施例的PsaN-1与caspase-3反应后聚集的透射电镜图。

图19示出了本发明实施例的BP和PsaN-1在有或无超声激发下显示ROS产量的激光共聚焦显微镜图。

图20示出了本发明实施例的BP和PsaN-1在有或无超声激发下显示ROS强度的流式细胞仪图。

图21示出了本发明实施例的BP和肽功能化自组装物加超声触发后用CCK-8法检测抗肿瘤细胞增殖率的柱状图。

图22示出了本发明实施例的BP和肽功能化自组装物加超声触发后用细胞流式凋亡法检测抗肿瘤细胞增殖率的流式细胞仪图。

图23示出了本发明实施例的BP和肽功能化自组装物加超声触发后用活死双染色法检测抗肿瘤细胞增殖率的激光共聚焦显微镜图。

具体实施方式

应理解的是，本说明书中记载的“上”、“中”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”，以及类似的指示方位的字词均旨在便于理解本申请的实施方式，而不是对本申请所要求的保护范围的限制。例如：“上方”可以是直接接触的上方，也可以是非直接接触的上方，其间也可有其他结构。本说明书中记载的“若干”包括数量为“一”的含义。

以下结合附图详细说明本发明的具体实施方式。

本发明提出了双芘（bis（pyrene），BP）作为制备超声触发声敏剂的应用。BP为聚集诱导发光（aggregation-induced emission，即AIE）型光敏剂，能克服ACQ型光敏剂的聚集导致自身荧光发射逐渐衰弱的缺陷。BP在现有技术中用作光动力治疗中的光敏剂，没有把BP用作超声触发的声敏剂的报道。本发明通过实验研究发现，BP不仅可在超声触发下产生活性氧ROS而具有声敏剂的特性，还具有活性基团，通过活性基团可以共价结合于多肽，而多肽可以具有不同的生理功能，从而改善BP的疏水性和靶向性不足的问题，并可赋予BP更多功能，同时保证BP与多肽结合的稳定性，使之不会脱离多肽而成为游离的形态。

本发明还提出了BP作为制备聚集性增强超声触发声敏剂的应用。BP作为AIE类光敏剂，不仅在光波激发下具有聚集可增强荧光发射的特性，发明人发现BP作为声敏剂也具有在超声触发下，聚集或浓度升高后可增强ROS产生效果的特性。由此，可以在一定范围内增大BP的浓度，或者在与BP连接的多肽中加入具有促进BP聚集功能的多肽序列，从而可以在满足一定条件时促使BP聚集，进而增强BP产生ROS的效果。

本发明还提出了用于超声触发抗肿瘤治疗的肽功能化复合物，包括作为声敏剂的BP和与BP结合的多功能多肽。所述肽功能化复合物在一定的溶液环境下可进行自组装，即通过分子间疏水作用和非共价键的相互作用，如氢键、离子键、π-π堆叠、范德华力等，自发有序地形成复杂、稳定的聚集体分子，不仅具备良好的生物相容性及生物可降解性，还可以保留多肽独特的生物活性。

多功能多肽可以有三种形式：多肽1含有肿瘤归巢穿膜序列、caspase-3响应性序列和靶向线粒体序列；多肽2含有非肿瘤归巢穿膜序列、caspase-3响应性序列和靶向线粒体序列；多肽3含有肿瘤归巢穿膜序列、caspase-3响应性序列和非靶向线粒体序列。其中，多肽1具有肿瘤归巢穿膜、靶向线粒体和响应caspase-3而水解的功能，多肽2具有靶向线粒体和响应caspase-3而水解的功能，多肽3具有肿瘤归巢穿膜和响应caspase-3而水解的功能。以上三种多肽和BP结合后分别形成肽1功能化复合物、肽2 功能化复合物、肽3功能化复合物。以上三种肽功能化复合物在溶剂中自组装形成肽1功能化自组装物PsaN-1、肽2功能化自组装物PsaN-2、肽3功能化自组装物PsaN-3。

PsaN-1的靶向线粒体序列为CFFFVLKLAKLAK，caspase-3响应性序列为DEVD，肿瘤归巢穿膜序列为AKRGARSTA，双芘BP的-R基团为-(CH₂)₅-COOH；所述多肽的N端为靶向线粒体序列的C氨基，靶向线粒体序列的K氨基连接caspase-3响应性序列的DE的D氨基，肿瘤归巢穿膜序列的AK的A氨基连接caspase-3响应性序列的VD的D氨基，双芘BP通过羧基与多肽N端的氨基形成酰胺键而共价结合于多肽。PsaN-2的非肿瘤归巢穿膜序列为AKDGAESHH，其不具有肿瘤归巢穿膜的活性，各部分的连接方式同PsaN-1。PsaN-3的非靶向线粒体序列为CFFFVLKKK，其不具有靶向线粒体的活性，各部分的连接方式同PsaN-1。

上述各肽功能化复合物的制备方法为：Step 1：合成多肽；Step 2：加入摩尔过量的双芘BP分子，避光缩合反应；Step 3：切下多肽，抽滤，得所述肽功能化复合物的溶液；Step 4：把step 3中的溶液吹干，沉淀，离心，冲洗，得到所述肽功能化复合物。

其具体步骤可以是：

Step 1：称取2.0 g 空白Wang树脂于洁净干燥的反应管中，加入15 mL N,N-二甲基甲酰胺DMF，室温活化30 min；

Step 2：室温下，通过沙芯抽滤掉上步溶剂，加入摩尔过量的 C端第一个氨基酸、摩尔过量的4-二甲氨基吡啶DMAP、摩尔过量的N, N'-二异丙基碳二亚胺DIC，用N,N-二甲基甲酰胺DMF做溶剂室温反应3 h；

Step 3：加入体积比为1:1的吡啶和乙酸酐，反应30 min；

Step 4：抽滤去掉上步溶剂，将10 mL 含20%的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺DMF溶液加入到树脂中，N₂搅拌10 min后滤出溶液，再加入10 mL 含20%的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺DMF溶液，N₂吹动搅拌5 min再滤去溶液，重复该步骤两次；

Step 5：取出树脂，用甲醇洗3次，加入茚三酮，氰化钾KCN，苯酚溶液各一滴，105℃–110℃加热5 min，变深蓝色为阳性反应，说明脱除完全；

Step 6：称取摩尔过量的C端第二个氨基酸、摩尔过量的 O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐HBTU和摩尔过量的1-羟基苯并三唑HOBT于反应管中，加入N,N-二甲基甲酰胺DMF溶液使其完全溶解后，再加入摩尔过量的纯N,N-二异丙基乙胺DIEA，室温反应40 min；取树脂用茚三酮检测试剂检测，显无色，然后加入10 mL 20%的哌啶DMF溶液脱Fmoc；

Step 7：重复step 6，直到合成到N端最后一个氨基酸，去掉Fmoc保护基，然后抽干；

Step 8：加入摩尔过量的双芘BP分子，避光缩合反应2 h；

Step 9：最后用含95%三氟乙酸TFA、2%三异丙基硅烷TIS、2%乙二硫醇EDT和1% H₂O的三氟乙酸切割液切割2 h，抽滤反应液，得所述肽功能化复合物的三氟乙酸溶液；

Step 10：将step 8中的三氟乙酸溶液用N₂尽量吹干，再用乙醚沉淀，离心，然后用乙醚洗3~5次，得到所述肽功能化复合物。

优选地，在上述step 2/3/4/6完成后均可用DMF洗4~6次，每次5-6 mL，step 4还可以用甲醇洗2次，每次5-6mL。

本发明还提供了用于超声触发抗肿瘤治疗的肽功能化制剂，其原料包括：上述肽功能化复合物、二甲基亚砜DMSO和超纯水。上述肽功能化复合物在肽功能化制剂中以自组装物的形式存在，其结构包括亲水部和疏水部，肿瘤归巢穿膜序列和非肿瘤归巢穿膜序列为亲水部，BP、靶向线粒体序列和非靶向线粒体序列为疏水部，caspase-3响应性序列位于亲水部和疏水部之间。

在形成自组装物的过程中，具有亲水性的肿瘤归巢穿膜序列位于外侧，形成亲水部，但其仅有9个氨基酸，具有疏水性的靶向线粒体序列有13个氨基酸，尽管其可通过β折叠而减小长度，但仍需占据一定空间，再加上BP，其连接于多肽N端，即疏水序列末端。在BP的结构中，两个芘环通过羰基连接于一个苯环的两个间位上，苯环的另一个间位还连接有-OR，因此，BP属于一类分子，根据R基团的不同可具有不同结构。优选地，R基团为-(CH₂)₅-COOH，便于由羧基与多肽N端的氨基形成酰胺键。由此可见，靶向线粒体序列加上BP在自组装后形成的疏水部可能不能被肿瘤归巢穿膜序列完全包裹，而是caspase-3响应性序列也可能包裹了该疏水部的部分。由于自组装物的形成过程可能不是完全相同的，也就是说生产出的同一批自组装物之间可能不具有完全相同的空间结构。但由于促使其自组装的亲水作用和疏水作用是相同的，只是作用力的方向可能不同，所以，其在整体结构上都具有亲水部和疏水部。而且，通过对亲水部长度、疏水部体积的分析，以及caspase-3响应性序列需要响应于caspase-3酶而进行水解反应才能发挥其功能的需要，可以认为，caspase-3响应性序列部分或全部位于自组装物的外侧。

上述各肽功能化制剂的制备方法包括如下步骤：

Step 5：取肽功能化复合物溶解到二甲基亚砜DMSO中；Step 6：把step 5中的二甲基亚砜DMSO溶液加入超纯水，涡旋后得到肽功能化制剂。

上述步骤也可以具体如下：

Step 11：取1mg肽功能化复合物溶解到10 ul 二甲基亚砜DMSO中；

Step 12：把step 11中的二甲基亚砜DMSO溶液滴入1 ml超纯水，涡旋10秒后得到肽功能化制剂。

本发明还提供了上述肽功能化制剂作为制备用于超声触发抗肿瘤治疗物的应用。所述应用的方法为：使用时，采用超声波装置触发BP。超声的激发功率可以为1-3 W/cm²，低强度的超声波不仅可有效触发声敏剂产生ROS，还可减少对细胞和组织的副作用。超声的频率可以为20 KHz-1000 KHz范围内的低频，从而可调节超声到达的组织深度。

关于各肽功能化复合物相关的理化性质的说明详见如下所述。

质谱结果显示，制备得到的肽1功能化复合物的分子量为3531.38 kDa，肽2功能化复合物的分子量为3565.31 kDa，肽3功能化复合物的分子量为3162.90 kDa，均与产物理论分子量接近。高效液相色谱结果显示制备得到的肽功能化复合物的纯度为96.63%，说明制备得到的肽1功能化复合物的纯度较高。马尔文粒径电位仪测得PsaN-1的粒径约13.05 nm，电位约12.87 mv。如图1所示，透射电镜结果显示，溶液中的PsaN-1呈近似球形，分散均匀，均一性较好。

如图2所示，使用紫外分光光度计检测了PsaN-1的紫外吸收情况。图中，位于450nm波长处的各曲线无重叠，从上至下依次代表BP、PsaN-3、PsaN-1、PsaN-2。由于BP在波长300-440 nm处有一广谱的特异性吸收峰，而上述三种多肽与BP共价结合后发现也出现了近似的特征峰，说明多肽和BP成功共价连接。

如图3所示，使用荧光分光光度计检测PsaN-1的荧光光谱。图中，曲线所对应的超纯水浓度和向上箭头右侧各直线指示的浓度一致。由于BP是AIE型光敏剂，当其处于脂溶性环境时会分散，荧光强度降低，而当其处于水溶性环境时则会聚集，使荧光增强。把PsaN-1充分溶解在40μl DMSO中，然后取5μl 溶液溶解在995 μl DMSO+超纯水的混合液中（混合液中超纯水的比例分别为0，20，40，60，80，90，98，99%）并检测最终得到的溶液的荧光情况。发明人发现，随着溶液中超纯水比例增高，PsaN-1的荧光强度逐渐提高，这也说明PsaN-1保留了BP的AIE特性，有助于下一步研究，例如，可借助其辐射荧光的特性来显示其作用强度，也有助于在成像引导声动力治疗和影像学检查中的应用。

如图4所示，把PsaN-1置于超纯水中保存14天，并观察这期间的粒径变化，发现粒径改变无统计学差异，说明PsaN-1在水溶液中可长期保持稳定的粒径。

如图5所示，用去离子水、含胎牛血清的1640培养基、磷酸缓冲盐溶液PBS及生理盐水重悬PsaN-1并观察其粒径改变，发现粒径无明显变化，说明PsaN-1的稳定性较好。图中的纵轴代表体积百分比，即相应粒径的粒子占全部粒子体积的百分比，其中代表去离子水和PBS的曲线基本重合，峰形较窄；代表上述培养基和生理盐水的曲线基本重合，峰形较宽；峰高的比较：去离子水＞PBS＞培养基＞生理盐水。由此可见，在去离子水和PBS中，粒子的粒径变化更小，最大基本不超过20 nm，即粒子之间的聚集趋向更小；在培养基和生理盐水中，粒子的粒径变化更大，最大基本不超过30 nm，即粒子之间的聚集趋向更大。由于以上4条曲线的峰值都在10-20 nm之间，且最大粒径均不超过30 nm，因此，仍都属于纳米级。

关于BP和各肽功能化自组装物应用于声动力治疗的体外试验和体内试验的说明，详见如下所述。

细胞吞噬量：把游离的BP、PsaN-1和PsaN-2（其中BP的含量均为40 μg/ml）与乳腺癌4T1细胞共孵育0.5，2，4小时。如图6所示，经共聚焦荧光显微镜检测，PsaN-1能大量被细胞吞噬，而游离的BP和PsaN-2则较少被细胞吞噬。如图7所示，流式细胞仪通过定量检测细胞内的荧光强度，也可得出以上结论。

具体地看，如图8所示，在三个时间点上，以上三组的细胞内荧光强度百分比均呈上升趋势，且PsaN-1组的值均最高。而BP组和PsaN-2组在三个时间点上的值不尽相同：0.5h时，BP组超出PsaN-2组3.36%；2h时，PsaN-2组以0.25%反超BP组，也就是说PsaN-2的该值上升更快，但此时仅大于BP组0.25%，可以看出，该两组该值相等的点位于即将到2h的时间点处；4h时，PsaN-2组超出BP组10.31%。由此可见，PsaN-1之所以在三个时间点上均能被细胞吞噬更多，是因为其具有肿瘤归巢穿膜序列，即能靶向乳腺癌4T1细胞；而BP和PsaN-2均不具有肿瘤归巢穿膜序列，其之所以表现出这样的细胞吞噬现象，其原因可能为：BP比PsaN-2的分子量和体积都更小，在短时间内可更快被细胞吞噬，但在细胞内的浓度升高到一定程度后，由于内外浓度差的增大，而会减缓进入细胞的速度；而PsaN-2具有靶向线粒体序列，其进入细胞后由于靶向线粒体而与线粒体结合，使细胞质内的浓度上升较慢，也就不会因为细胞质内浓度过快升高而显著减缓其进入细胞。

从2h和4h时间点相对于前一个时间点的百分比的上升率来看，BP组为169.8%和49.8%，PsaN-2组为340.5%和91.1%，PsaN-1组为142.2%和33.8%。由于时间点为0的时候细胞内荧光强度的百分比为0，所以0.5h时刻相对于0时刻的上升率可以理解为无限大，而在2h和4h这两个时间点上的上升率均为：PsaN-2＞BP＞PsaN-1。从图12中的曲线变化趋势来看，BP和PsaN-1均呈上凸形，类似抛物线，PsaN-1在0.5h的前段呈近似直线形，该两条曲线的3-4h段均呈近似直线形；PsaN-2在0-0.5h段呈轻微下凹形，在0.5-4h段呈轻微上凸形，整体近似直线形。具体地，PsaN-1上升减缓最明显，但由于其曲线的初始斜率更大，所以其总体的上升速度仍最快，说明由于其具有肿瘤归巢穿膜序列，使其细胞内荧光强度百分比在0.5h内即可达到上升加速度的最大值；PsaN-2的曲线呈先加速再减速的上升趋势，且加速和减速均不明显，说明在靶向线粒体序列的拉动作用下，可使该值呈近似线性的上升；BP组的变化趋势类似于PsaN-1，无靶向线粒体的拉动效应，各时间段的该值接近PsaN-2，在0-2h段位于PsaN-2上方，之后位于其下方，总体上升速度最慢。对于3-4h段出现的类似直线形，其可能原因为：在细胞内聚集后，细胞外浓度降低，基于BP的AIE效应，尽管细胞内聚集的上升速率在减缓，但随着其浓度的升高，AIE效应越来越显著，即由荧光增强弥补细胞吞噬速率的减缓；该段的斜率比较：PsaN-2＞PsaN-1＞BP，说明，PsaN-1由于已有较高的细胞内浓度而明显减缓被细胞吞噬，但细胞内的大量聚集使其该值显示为线性上升，且在2h即达到48.82%，细胞内荧光增强效果显著；BP不具有靶向功能而被吞噬最慢，AIE效应的显现也更平缓，到4h时还未达到40%；PsaN-2借助其靶向线粒体的拉动效应在此阶段仍保持该值的最快增长，说明尽管有细胞吞噬速度的减慢，即加速度为负数，但由于靶向线粒体的作用可把PsaN-2进一步聚集到线粒体，使其局部浓度可大于细胞质内的浓度，从而进一步增强BP的AIE效应，使AIE效应增强的加速度为正数，抵消前面的负数后使该值呈现出了类似于持续的线性增长，但4h时仍未达到50%，说明肿瘤归巢穿膜序列在细胞吞噬中具有显著的促进作用。

从三组间的上升率来看，2h处：PsaN-2组是BP组的2倍，BP组是PsaN-1组的1.2倍；4h处，PsaN-2组是BP组的1.8倍，BP组是PsaN-1组的1.5倍。由于BP组的曲线曲率变化较小，且仅具备基础功能，所以，适合以BP组为基准。PsaN-2组相对于BP组的倍数从2倍降低到1.8倍，这与两者在0-2h段变化趋势相反而2-4h段的趋势相似有关，因为PsaN-2在0-2h为加速上升，之后减速上升使倍数不能继续维持在2倍；PsaN-1组相对于BP组的百分比从83.3%降到66.7%，反应在图中即该两条曲线的斜率趋于接近。

比较2h处和4h处的上升率可知，前者均成倍大于后者，其大小关系为：BP为3.4倍，PsaN-2为3.7倍，PsaN-1为4.2倍。说明2h时已到达较高的细胞内荧光强度百分比，所以，当用该时间点的上升率作为基准时，就会出现这样的倍数情况。具体来看，对于PsaN-1组，由于2-4h段的曲率相对于前一时间段的曲率具有显著变化，所以，其倍数最大，为4.2倍。对于PsaN-2组，由于其在0.5-4h段的细胞内荧光强度百分比相差较大，而在2-4h段仍然保持了90%以上的上升率，使其分子和分母均最大，加之其曲率仅有轻微变化，致使其倍数居中，即3.7倍。对于BP组，其0.5h和4h处的细胞内荧光强度百分比相差最小，两端的上升率均居中，即分子和分母最接近，曲线也逐渐趋于平缓，使其细胞吞噬的过程没有显示出另两组的显著变化性，使其倍数位于第三位，即3.4倍。这说明上述多肽的加入确实对BP的细胞吞噬过程产生了显著影响。

如图9所示，把BP、PsaN-1和PsaN-2用于三维肿瘤球模型后，用激光共聚焦显微镜观察，可见PsaN-1在肿瘤球最外层可被绝大部分细胞吞噬，显示出的荧光面积最大，从外向内，各层上的荧光强度递减，到达24μm层时仍在各组间保留了最大的荧光强度，说明PsaN-1的细胞吞噬性最优。

靶向线粒体序列对线粒体靶向、膜电位及相关蛋白等表达的影响：把PsaN-1和PsaN-3（其中的BP含量均为40 μg/ml）与4T1细胞分别共孵育6小时后发明人发现，PsaN-1与细胞内线粒体重合度更高，平均共定位系数为0.68，而PsaN-3与线粒体的平均共定位系数为0.46。

发明人通过线粒体膜电位染料JC-1评估了声动力治疗对4T1细胞线粒体膜电位的影响。把PsaN-1和PsaN-3（其中的BP含量均为40 μg/ml）与4T1细胞共孵育4小时后，使用超声触发声动力治疗（超声功率为3 W，频率为1000 KHz，激发持续时间为4 min），超声激发后将原有的含肽功能化自组装物的培养基替换为无血清培养基，放入孵箱再次孵育2.5小时。然后把细胞与JC-1染料共孵育并送激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测，如图10和图11所示。图10中，JC-1聚合项的显色部分代表线粒体膜电位正常；JC-1单体项的显色部分代表线粒体膜电位异常。图11中，上方聚集的点代表线粒体膜电位正常，下方聚集的点代表线粒体膜电位异常。可见，具有线粒体靶向性的PsaN-1造成线粒体膜电位的下降最明显，PsaN-3在超声触发下造成线粒体膜电位下降的细胞比例大致为一半。

缓解细胞乏氧：线粒体是细胞有氧呼吸的重要场所。破坏线粒体可以阻断细胞的有氧呼吸，缓解肿瘤细胞乏氧的微环境。如图12所示，当4T1细胞与BP、PsaN-1和PsaN-3共孵育后，发明人发现PsaN-1组的HIF-1α（一种乏氧探针）的荧光强度下降最明显，说明细胞乏氧得到缓解，其原因可能在于，含有靶向线粒体序列的PsaN-1影响了肿瘤细胞的呼吸链反应，减少了细胞的有氧呼吸对氧气的消耗。

如图13所示，生物透射电镜也显示，经超声激发后，PsaN-1组中细胞内的线粒体发生明显肿胀，说明PsaN-1的靶向线粒体功能导致线粒体发生了形态改变，而线粒体的工作需要氧，其功能受损后可减少对氧的需要，从而改善细胞乏氧。

如图14所示，发明人发现，通过Western bolt检测，当PsaN-1、PsaN-3（其中BP的浓度均为40 μg/ml）以及对照组与4T1细胞共孵育4小时并使用超声触发声动力治疗后（超声功率为3W，频率为1000 KHz，激发持续时间为4 min），相比于对照组，PsaN-1组和PsaN-3组的细胞内都检测到了细胞色素C，前组中细胞色素C的含量高于后组中的含量，从图中可直观看出，后组代表细胞色素C的条带更窄、颜色也更浅。细胞色素C是线粒体呼吸链中传递电子的载体，由核基因编码的多肽和线粒体编码的亚铁血红素组成，表面带正电荷，松散地结合在富含不饱和脂肪酸的线粒体内膜外侧的心磷脂上，不能自由通过线粒体外膜。在细胞凋亡过程中，线粒体对细胞色素C的释放起重要作用。所以，在细胞质中检测到大量细胞色素C说明线粒体受损，或启动了细胞凋亡过程。由此可验证，在超声触发下，PsaN-1和PsaN-3都可破坏线粒体的正常结构，致使释放外膜上的细胞色素C进入细胞质。在此情况下，失去正常结构的线粒体无法利用氧，从而，细胞色素C作为细胞呼吸激活酶，可改善细胞乏氧情况。PsaN-3虽然没有靶向线粒体序列，但其通过肿瘤归巢穿膜序列进入细胞质后在超声触发下可从外部影响线粒体，使之释放部分细胞色素C，而从外部影响的效果不及靶向线粒体序列带来的效果直接和显著，即PsaN-1在超声触发下对线粒体的破坏性更强。

BP聚集或不同浓度的影响：Caspase-3是细胞凋亡程序中的一种关键酶。当细胞内的氧化应激水平失去平衡时就可能会启动细胞的凋亡程序，导致caspase-3的表达升高。上述各多肽序列均含有一段caspase-3酶的响应性序列DEVD，这段序列可在含有caspase-3酶的环境中被水解。经caspase-3酶水解后的PsaN-1的疏水性会进一步提高，加速其在细胞内发生聚集。聚集后的PsaN-1可以增强BP的AIE特性，产生更多ROS，从而增强细胞的SDT效率。

如图15和图16所示，采用SOSG探针检测了不同浓度梯度（BP浓度为0，5，10，20，40，80 μg/ml，超声激发功率3 W，频率为1000 KHz，激发时间240 s）和时间梯度（0，30，60，120，180，240 s，BP和PsaN-1含BP的浓度为20 μg/ml, 超声激发功率3 W，频率为1000 KHz）的BP、PsaN-1及PsaN-1+caspase-3（caspase-3浓度为125 ng/ml）经超声激发后的单线态氧产生率。图中的三条曲线从下至上依次代表BP组、PsaN-1组及PsaN-1+caspase-3组。发现PsaN-1+caspase-3的单线态氧产率上升趋势最明显。

如图17所示，用超声激发BP和PsaN-1与不同浓度的caspase-3（酶与底物比为0，0.375，0.75，1.5，3和6，超声激发功率3 W，频率为1000 KHz，激发时间240 s）反应后的溶液。图中，代表PsaN-1组的曲线呈上升趋势，且在酶与底物比为0-1.5之间时上升缓慢，1.5-3之间开始加速上升，3-6之间快速上升，而代表BP组的曲线则无明显改变；且代表PsaN-1组的曲线始终位于BP组曲线上方，说明PsaN-1的单线态氧产率随着caspase-3浓度的升高而升高，且均高于BP。

如图18所示，透射电镜也观察到PsaN-1与caspase-3（125ng/ml）反应6小时后，发生了明显的聚集。

如图19和图20所示，由于PsaN-1对caspase-3的响应性能够增强其单线态氧产率，因此，发明人使用ROS探针检测了对照、BP和PsaN-1（BP的浓度均为40 μg/ml，超声激发功率3 W，频率为1000 KHz，激发时间4 min）在超声激发前后的ROS产率。

图19的激光共聚焦显微镜图显示，PsaN-1在超声激发下产生的ROS最多，明显多于BP和对照组，且亮度和聚集度均更高；而BP在超声激发下产生的ROS明显多于对照组，亮度和聚集度虽不及PsaN-1，但仍明显高于没有超声激发的情况。

图20的流式细胞仪检测图显示，关于细胞内产生的ROS强度，BP+US比BP的百分比增大了3.4倍，PsaN-1+US比PsaN-1的百分比增大了7.2倍，说明超声对PsaN-1产生ROS的增强效果尤为显著，且超过对BP增强效果的两倍。

关于BP和各肽功能化自组装物的生物安全性和抗肿瘤细胞增殖能力：发明人首先检测了超声激发前不同浓度的各肽功能化自组装物的生物安全性，发现无论是与正常细胞（脐静脉血管内皮细胞）还是乳腺癌4T1细胞共孵育24小时后，正常细胞的存活率均高于86%，4T1细胞的存活率均高于80%。

如图21、图22和图23所示，使用CCK-8法、细胞流式凋亡法和活死双染色法检测了各肽功能化自组装物声在动力治疗中的抗肿瘤效率，发现PsaN-1的抗肿瘤细胞增殖率明显高于其他各组。（除CCK8有BP的浓度梯度外，凋亡和活死的肽功能化自组装物中BP的含量均为80 μg/ml，超声激发功率为3W，频率为1000 KHz，激发时间为240 s）。

图21显示了用CCK-8法检测的结果：图中，从左向右的各组立柱依次代表Control组、Control加超声组、BP加超声组、PsaN-2加超声组、PsaN-3加超声组、PsaN-1加超声组。BP和各肽功能化自组装物的抗肿瘤效率都随浓度升高而增强，BP的效率虽低于后者，但其高浓度的效率高于PsaN-2中浓度的效率，PsaN-2的低、中浓度的效率均高于PsaN-3的相应浓度，但PsaN-2高浓度的效率低于PsaN-3，且PsaN-3高浓度的效率已接近于PsaN-1中浓度的效率。说明PsaN-3虽然因没有靶向线粒体功能而不具备线粒体拉动效应，但其肿瘤归巢穿膜序列和caspase-3响应性序列使其在高浓度的条件下可显著提升抗肿瘤效率，其原因可能为，在80 μg/ml的浓度下，细胞质内的高浓度比借助线粒体拉动进入细胞后分散于细胞质和线粒体对肿瘤细胞的损伤性更大。PsaN-1高浓度的抗肿瘤效率显著高于其他各组，使细胞活力降低到约13%。

图22显示了用细胞流式凋亡法检测的结果：下方的百分数表示早期凋亡率，上方的百分数表示晚期凋亡率。从图中可直观地看出，超声可显著增大BP、PsaN-3和PsaN-1的晚期凋亡率，PsaN-2的早期和晚期凋亡率几乎相同，仅相差0.03%；早期凋亡率的比较：PsaN-3＞PsaN-2＞PsaN-1＞BP，晚期凋亡率的比较：PsaN-1＞PsaN-3＞PsaN-2＞BP，PsaN-1的晚期凋亡率是PsaN-3的1.8倍。此外，PsaN-1的早期和晚期凋亡率的差别最大，晚期凋亡率是早期凋亡率的3.7倍，相应地，BP为2.7倍，PsaN-3为1.3倍，PsaN-2为1倍，而对照组均为早期凋亡率大于晚期凋亡率。这可能是因为在对照组中，细胞可逐渐适应而在晚期减少凋亡，而BP、PsaN-1和PsaN-3均可显著抑制细胞的适应性，使其在晚期凋亡更快，而PsaN-2未显示出明显的抑制作用，其原因可能是，在细胞内的总浓度不高的情况下，分散于细胞质和线粒体的较低浓度可以使细胞逐渐适应。从两个凋亡率来看，PsaN-3优于PsaN-2和BP；从整体凋亡率看，PsaN-1达到了63.96%，PsaN-3为48.49%，接近一半，PsaN-2为38.37%，BP为20.69%，调换PsaN-2和PsaN-3的顺序后，4个试验组的总百分比呈近似线性增长的关系。这也体现了在80 μg/ml的浓度下，PsaN-3优于PsaN-2的效果。

图23显示了用活死双染色法检测的结果：从PsaN-2和PsaN-3的对比可验证上述PsaN-3的高浓度（即80 μg/ml）的抗肿瘤效率比PsaN-2更高的发现，因为PsaN-3在此浓度下可大量进入细胞质，进而使细胞受损，所以，CAM项的显色面积比PsaN-2更小，即存活的细胞更少，PsaN-3组的细胞死亡率稍高于PsaN-2组，而PsaN-1组的效果则显著优于其他组；BP组的CAM项的显色面积与对照组无明显差异，但其PI项的显色面积显著大于对照组，说明BP加超声组显著优于对照加超声组。

PsaN-1在体内的长、中、短期的生物安全性：在第1、15、22、26、28天把200 μl的PsaN-1溶液（BP含量为160 μg/ml，溶剂为生理盐水）经尾静脉注射入5只健康昆明鼠体内，并在第29天处死全部昆明鼠加5只在当天注射了生理盐水的昆明鼠，最后取其血液做血常规和血生化检查，取其各主要脏器（心，肝，脾，肺，肾）做HE染色切片。与注射了生理盐水的小鼠相比，各组注射了PsaN-1的昆明鼠的血液指标及脏器切片均无明显异常。

关于BP、各肽功能化自组装物、去离子水和PBS的溶血性：把上述各成分与血液孵育后检测血液溶血情况，发现除去离子水外，其余各组均未出现溶血的情况，说明去离子水不适于作为PsaN-1的溶剂用于体内试验，PBS可作为PsaN-1体内试验的可选溶剂。上述细胞试验的对照组均使用PBS，体内试验的对照组均使用生理盐水。

本发明所述的BP和肽功能化自组装物不仅适用于乳腺癌细胞和组织，也适用于肾癌和前列腺癌等，因为上述多肽对这些恶性肿瘤都具有靶向性。

以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明并不限于上述实施方式。应指出的是，对所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明的发明构思的前提下，在所属技术领域的技术人员具备的知识范围内，还可以作出各种变化和改进。这些也应视为落入了本发明的保护范围，这些都不会影响本发明的可专利性和实施效果。本发明省略描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

<110> 重庆医科大学附属第二医院

<120> 双芘作为制备超声触发声敏剂的应用、肽功能化复合物和制剂、其制备方法和应用方法

<160> 1

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> BINDING

<222> (1)

<220>

<221> TRANSIT

<222> (1)...(13)

<220>

<221> ACT_SITE

<222> (14)...(17)

<400> 1

Cys Phe Phe Phe Val Leu Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Asp Glu Val

1 5 10 15

Asp Ala Lys Arg Gly Ala Arg Ser Thr Ala

20 25

Claims (10)

1.双芘作为制备超声触发声敏剂的应用。

2.双芘作为制备聚集性增强超声触发声敏剂的应用。

3.用于超声触发抗肿瘤治疗的肽功能化复合物，其特征在于，含有如权利要求1或2所述作为制备声敏剂应用的双芘BP，和与双芘BP结合的多肽，所述多肽含有肿瘤归巢穿膜序列、caspase-3响应性序列和靶向线粒体序列。

4.根据权利要求3所述的肽功能化复合物，其特征在于，所述靶向线粒体序列为CFFFVLKLAKLAK，caspase-3响应性序列为DEVD，肿瘤归巢穿膜序列为AKRGARSTA，双芘BP的-R基团为-(CH₂)₅-COOH；

所述多肽的N端为靶向线粒体序列的C氨基，靶向线粒体序列的K氨基连接caspase-3响应性序列的DE的D氨基，肿瘤归巢穿膜序列的AK的A氨基连接caspase-3响应性序列的VD的D氨基，双芘BP通过羧基与多肽N端的氨基形成酰胺键而共价结合于多肽。

5.用于超声触发抗肿瘤治疗的肽功能化制剂，其特征在于，其原料包括：如权利要求3或4所述的肽功能化复合物、二甲基亚砜DMSO和超纯水。

6.根据权利要求5所述的肽功能化制剂，其特征在于，肽功能化复合物以自组装物的形式存在，自组装物包括亲水部和疏水部，肿瘤归巢穿膜序列为亲水部，靶向线粒体序列和双芘BP为疏水部，caspase-3响应性序列位于亲水部和疏水部之间。

7.权利要求3或4所述肽功能化复合物的制备方法，其特征在于，其步骤包括：

Step 1：合成多肽；

Step 2：加入摩尔过量的双芘BP分子，避光缩合反应；

Step 3：切下多肽，抽滤，得所述肽功能化复合物的溶液；

Step 4：把step 3中的溶液吹干，沉淀，离心，冲洗，得到所述肽功能化复合物。

8.权利要求5或6所述肽功能化制剂的制备方法，其特征在于，其步骤还包括：

Step 5：取肽功能化复合物溶解到二甲基亚砜DMSO中；

Step 6：把step 5中的二甲基亚砜DMSO溶液加入超纯水，涡旋后得到肽功能化制剂。

9.权利要求5或6所述肽功能化制剂作为制备用于超声触发抗肿瘤治疗物的应用。

10.权利要求9所述肽功能化制剂作为制备用于超声触发抗肿瘤治疗物的应用方法，其特征在于，使用时，用超声波装置触发双芘BP。

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