CN110179981B - 一种线性-树状给药系统及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种线性‑树状给药系统，所述线性‑树状给药系统是线性‑树状聚合物与光敏剂为原料制得的，其中，所述线性‑树状聚合物以2,2‑二羟甲基丙酸和聚乙二醇为原料反应得到的聚合物。研究表明，本发明的纳米药可以在水溶液中形成尺寸均一、单分散性良好和结构稳定的组装结构，具有高的摩尔消光系数、荧光量子产率和单线态氧量子产率，完全满足理想光敏剂的要求。体内外生物实验研究进一步表明，本发明的纳米药不仅具有优异的细胞摄取效率和优异的肿瘤渗漏能力，还具有很强的肿瘤滞留能力和很长的血液半衰期，最终表现出优异的体内抗肿瘤效果。所以，本发明提供的型线性‑树状共聚物给药系统在制备抗肿瘤药物上具有非常好的应用前景。

Description

一种线性-树状给药系统及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于高分子材料领域，具体涉及一种线性-树状给药系统及其制备方法和用途。

背景技术

光动力治疗(Photodynamic Therapy，PDT)是利用肿瘤细胞选择性吸收光敏剂，然后利用特定波长的非热激光照射病变部位，使肿瘤组织中的光敏剂发生剧烈的光化学反应，产生具有细胞毒性的活性氧物种(reactive oxygen species，ROS)，从而选择性地消灭肿瘤细胞。PDT的抗肿瘤效应的机制主要分为三类：1)产生单线态氧直接杀伤肿瘤细胞，诱导细胞凋亡或坏死；2)破坏肿瘤滋养血管，导致肿瘤缺血缺氧；3)增加炎症及免疫介质的释放，甚至启动特异性免疫机制识别并破坏远处转移病灶。目前，国内外已经有多个光敏剂上市，光动力疗法以微创、副作用小等优点在肿瘤治疗方面取得了较好的疗效，但目前临床上常用光敏剂存在水溶性差、细胞摄取量低、代谢缓慢、缺乏靶向性和滞后的光毒性等问题。比如，光敏剂焦脱镁叶绿酸a(Ppa)就具有优良的光动力学特性。但是，由于焦脱镁叶绿酸a水溶性较差，限制了其广泛应用。

为了提高光敏剂对肿瘤组织的靶向性及富集浓度，通常需要采用给药系统载体对光敏剂进行递送。但是，化学结构不同的载体材料和光敏剂之间的相互作用存在差异，这种相互作用差异会进一步影响到给药系统系统的生物学效应，进而影响给药系统的体内循环、生物分布和抗肿瘤活性。因此，寻找到一种合适的载体材料，非常重要。

中国专利CN105749280A公开了一种协同化疗与光动力治疗的肿瘤靶向纳米给药系统。该给药系统由羧甲基壳聚糖、叶酸、光敏剂二氢卟吩e6和阿霉素构成，先将二氢卟吩e6和叶酸通过酰胺键偶联到羧甲基壳聚糖链段上，再经离子交联法得到负载阿霉素的聚合物纳米粒，形成靶向抗肿瘤纳米给药体系。但是，该给药系统的制备过程复杂，靶向分子叶酸的偶联增加了制备的工艺；阿霉素和光敏剂联用，也进一步使药物体系更加复杂。

因此，提供一种结构简单、制备方便，并且对肿瘤的治疗效果显著的光动力给药系统具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结构简单、制备方便，并且对肿瘤的治疗效果显著的光动力给药系统。

本发明提供了一种线性-树状给药系统，所述线性-树状给药系统是以线性-树状聚合物与光敏剂为原料制得的，其中，所述线性-树状聚合物以2,2-二羟甲基丙酸和聚乙二醇为原料反应得到的聚合物。

进一步地，

所述光敏剂为焦脱镁叶绿酸a；

和/或，所述线性-树状聚合物选自Hyperbranched G3-PEG20k-OH、HyperbranchedG3-PEG10k-OH、Hyperbranched G2-PEG20k-OH或Hyperbranched G2-PEG10k-OH，优选为Hyperbranched G3-PEG20k-OH；

和/或，所述线性-树状聚合物与光敏剂的摩尔比为1：(1～20)，优选为1：(4～8)。

进一步地，

所述线性-树状给药系统中载有光敏剂，所述线性-树状给药系统的结构为式I或式II所示的结构：

其中，R₁～R₁₆、R_a～R_h各自独立地选自羟基或

且R₁～R₁₆不同时为羟基，R_a～R_h不同时为羟基；

n为聚合度，n选自222～444。

进一步地，式I或式II所示线性-树状给药系统中，光敏剂的载药量为4.8％～15.1％，优选为8.7％。

载药量表示被测体系中，(药物的质量/线性-树状给药系统总质量)×100％。本发明给药系统中，光敏剂的载药量＝(光敏剂的质量/线性-树状给药系统总质量)×100％，光敏剂优选为焦脱镁叶绿酸a。

进一步地，所述线性-树状给药系统的结构为式I或式II所示的结构，式I中，R₁～R₁₆中有4个基团为

其余为羟基；式II中，R_a～R_h中有2个基团为

其余为羟基；

n为聚合度，n选自222或444；

优选地，

所述线性-树状给药系统的结构为式I所示的结构：

其中，R₁～R₁₆中有4个基团为

其余为羟基；

n为聚合度，n为444。

本发明还提供了一种上述线性-树状给药系统的制备方法，所述方法为：让线性-树状聚合物与光敏剂发生偶联反应，然后提纯，即得；其中，所述线性-树状聚合物是以2,2-二羟甲基丙酸和聚乙二醇为原料反应得到的聚合物。

进一步地，所述线性-树状聚合物与光敏剂的摩尔比为1：(1～20)；所述反应是在缩合剂DCC和催化剂DMAP作用下进行的；所述反应条件为：氮气氛围下，室温避光反应；所述反应时间为36～60小时；所述光敏剂为焦脱镁叶绿酸a；所述反应溶剂为有机溶剂；所述线性-树状聚合物选自Hyperbranched G3-PEG20k-OH、Hyperbranched G3-PEG10k-OH、Hyperbranched G2-PEG20k-OH或Hyperbranched G2-PEG10k-OH；

和/或，所述提纯工艺为：将反应后所得体系在超纯水中透析，然后通过色谱柱提纯，再在超纯水中透析。

进一步地，所述线性-树状聚合物与光敏剂的摩尔比为1：(4～8)；所述DCC、DMAP、光敏剂的摩尔比为(1.34～1.67)：(0.09～1.11)：1；所述反应时间为48小时；所述反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；

和/或，所述线性-树状聚合物选自Hyperbranched G3-PEG20k-OH；

和/或，所述提纯工艺中，所述透析时间为2天，透析使用的透析袋的截留分子量为8000；所述色谱柱为尺寸排阻色谱柱。

本发明还提供了一种自组装体系，所述自组装体系是上述线性-树状给药系统加入水中制得的球形纳米颗粒。

本发明“球形”包括规则和不规则的球形；“纳米颗粒”是指纳米量级的实心或空心颗粒。

本发明还提供了上述线性-树状给药系统或自组装体系在制备抗肿瘤药物上的用途，优选地，所述肿瘤选自乳腺癌、膀胱癌、肺癌、食管癌、头颈部癌、皮肤癌。

实验结果表明，本发明以DLD型PEG-MPA线性-树状共聚物为载体，成功设计并构建了一系列不同代数和分子量的两亲性DLD型PEG-MPA线性-树状结构的光动力给药系统。研究表明，本发明的给药系统G320P和G210P的分子结构满足“long L,medium D”的特征，达到了亲疏水平衡，因此它们可以在水溶液中形成尺寸均一、单分散性良好和结构稳定的组装结构。其中，G320P具有更高的摩尔消光系数、荧光量子产率和单线态氧量子产率，完全满足理想光敏剂的要求。体内外生物实验研究进一步表明，G320P不仅具有最好的细胞摄取效率和优异的肿瘤渗漏能力，还具有最强的肿瘤滞留能力和最长的血液半衰期，最终表现出最佳的体内抗肿瘤效果。所以，本发明提供的DLD型线性-树状共聚物给药系统在制备抗肿瘤药物上具有非常好的应用前景。

本发明中，DLD型即dendritic-linear-dendritic，表示线性树状结构。

PEG-MPA线性-树状共聚物即以2,2-二羟甲基丙酸和聚乙二醇为原料反应得到的线性-树状聚合物，包括Hyperbranched G3-PEG20k-OH、Hyperbranched G3-PEG10k-OH、Hyperbranched G2-PEG20k-OH、Hyperbranched G2-PEG10k-OH。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实例的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为G320P/G310P的合成路线。

图2为G220P/G210P的合成路线。

图3为G320P/G310P的自组装示意图。

图4为G220P/G210P的自组装示意图。

图5为Hyperbranched G3-PEG20k-OH的核磁氢谱表征。

图6为G320P的核磁氢谱表征。

图7为Hyperbranched G3-PEG10k-OH的核磁氢谱表征。

图8为G310P的核磁氢谱表征。

图9为Hyperbranched G2-PEG20k-OH的核磁氢谱表征。

图10为G220P的核磁氢谱表征。

图11为Hyperbranched G2-PEG10k-OH的核磁氢谱表征。

图12为G210P的核磁氢谱表征。

图13为焦脱镁叶绿酸a在DMSO中的标准紫外吸收曲线。

图14为本发明四种给药系统在DMSO-d6和D2O中的核磁氢谱表征：G320P(A)、G310P(B)、G220P(C)和G210P(D)。

图15为给药系统G320P(A)、G310P(B)、G220P(C)和G210P(D)的TEM图片。

图16为给药系统G320P(A)、G310P(B)、G220P(C)和G210P(D)在纯水中的DLS表征结果。

图17为通过加入芘测定的给药系统G320P(A)、G310P(B)、G220P(C)和G210P(D)在水中的临界胶束浓度(CMC)，其中，线性拟合曲线和CMC值的计算通过SigmaPlot12.5软件完成。

图18通过DLS表征给药系统G320P(A)、G310P(B)、G220P(C)和G210P(D)分别在含10％FBS的纯水和含10％FBS的PBS缓冲液中随时间变化的粒径。

图19给药系统G320P、G310P、G220P和G210P和游离光敏剂Ppa分别在纯水、PBS和DMSO中的溶液颜色。

图20为给药系统G320P(A)、G310P(B)、G220P(C)和G210P(D)和游离光敏剂Ppa(E)经不同处理后的紫外-可见光吸收光谱。

图21为给药系统G320P、G310P、G220P)和G210P的荧光发射光谱(A～D)，以及经不同处理后的成像(E)。

图22为给药系统G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa分别在DMSO(A)、PBS(B)和纯水(C)中的光稳定性。

图23为给药系统G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa的DMA消耗曲线和转换拟合曲线。

图24为体外细胞毒性研究(n＝3)，具体为给药系统G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa经660nm激光照射后对4T1细胞(A)的细胞毒性，在避光条件下对4T1细胞(B)和L02正常细胞的毒性(C)，以及载体材料G320、G310、G220和G210对L02细胞的毒性(D)。

图25为通过流式细胞仪测试给药系统G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa在4T1细胞中孵育不同时间后的细胞摄取情况(A)；通过激光共聚焦显微镜(CLSM)测试给药系统G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa在4T1细胞中孵育不同时间后的细胞摄取(B)，其中比例尺代表25微米。

图26为通过激光共聚焦显微镜(CLSM)测试给药系统G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa在4T1细胞球中孵育相同时间后的渗透情况，其中，比例尺代表50微米。

图27为4T1细胞经DCFH-DA探针测定ROS产生的情况并由倒置荧光显微镜获取图片(A)；通过流式细胞仪测定4T1细胞经不同处理后的ROS产生的情况(B)；其中，PBS:不加探针和光照的阴性对照；DCFH-DA+H2O2:只加探针的对照；Ppa:加探针、1J/cm2 660nm光照和游离Ppa；G320P、G310P、G220P和G210P:加探针、1J/cm2 660nm光照的情况下，分别加入给药系统G320P、G310P、G220P和G210P；比例尺代表200微米。

图28为通过离体荧光成像实验比较各时间点下(12h,24h,72h)，给药系统G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa在4T1肿瘤模型小鼠中的组织分布和肿瘤靶向聚集情况(n＝3)，各组的剂量均为每只小鼠5mg Ppa/kg。

图29为通过对肿瘤的冰冻切片进行荧光染色，比较各时间点下(24h,72h)，给药系统G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa在4T1肿瘤模型小鼠中的肿瘤分布微观情况，其中，红色：光敏剂，绿色：血管，蓝色：细胞核；比例尺代表25微米。

图30为定量测定各时间点下，给药系统G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa在正常小鼠中的血液中的含量，各组的剂量均为每只小鼠5mg Ppa/kg。

图31为通过4T1体内肿瘤模型比较给药系统G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa的体内抗肿瘤效果，并以生理盐水组为对照(n＝5,每次给药剂量:5mg Ppa/kg每只)(A)；在治疗结束后，剖离肿瘤称重(B)；治疗过程中各组的体重变化(C)，计算抑瘤率TGI(D)；对所有的肿瘤进行拍照(E)。

图32为4T1各组模型小鼠(G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa)的组织病理分析(A)；以及通过肿瘤的TUNEL和CD-31染色，比较给药系统G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa的治疗后，对肿瘤细胞凋亡水平的影响和对血管生成的抑制情况(B)；其，中比例尺代表100微米。

图33为各组模型小鼠的心脏、肾脏和脾脏的H&E组织病理分析，比例尺代表200微米。

具体实施方式

本发明所以原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

其中，焦脱镁叶绿酸a(Ppa)，购买于上海先辉医药科技有限公司；HyperbranchedG3-PEG20k-OH、Hyperbranched G3-PEG10k-OH、Hyperbranched G2-PEG20k-OH、Hyperbranched G2-PEG10k-OH均购买于Sigma-Aldrich中国；9,10-二甲基蒽(9,10-dimethylanthracene，DMA)，购买于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；芘，购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

本发明所用SPF级小鼠均购于成都达硕生物科技有限公司实验动物，并饲养于四川大学华西临床药理实验动物中心级实验动物房。

实施例1、本发明线性-树状给药系统的制备

以DLD型PEG-MPA线性-树状共聚物为载体，设计并构建了一系列不同代数和分子量的两亲性DLD型线性-树状给药系统。如表1所示，按照图1、2所示的合成路线，合成本发明的线性-树状给药系统G320P、G310P、G220P、G210P，其中各给药系统的投料比、产率、载药量如表1所示。

表1给药系统320P、G310P、G220P和G210P的合成参数

(1)G320P的合成

在氮气保护下，将Hyperbranched G3-PEG20k-OH(200.0mg,9.2μmol)，Pyropheophorbide a(39.5mg,73.8μmol)，DCC(22.8mg,110.4μmol)和DMAP(0.9mg,7.4μmol)溶解到10mL的超干N,N-二甲基酰胺中，室温避光下反应48h。反应结束后，反应液用截留分子量为8000的透析袋在超纯水中透析2天，并通过尺寸排阻色谱柱(Superose 12HR/16/30column on an

FPLC system(GEHealthcare)column)进一步提纯。最后，在超纯水中再次透析并冷冻干燥，即可获得黑色固体G320P，质量为175.5mg，产率为73.9％。

如图5所示，我们在Hyperbranched G3-PEG20k-OH的¹H NMR(400MHz,DMSO)中发现其特征峰¹H NMR(400MHz,DMSO)δ4.62-4.13(m,56H,-CH₂-OCO-,(Bis-MPA)),3.50(m,1839H,CH₂-CH₂-O-,(PEG)),1.37-0.88(m,39H,-CH₃,(Bis-MPA))，说明该原料分子结构正确。如图6所示，与Hyperbranched G3-PEG20k-OH的氢谱相比，我们在G320P的¹H NMR(400MHz,DMSO)中发现了Ppa在10.0-4.0之间的特征峰δ9.73(s,1H),9.45(s,1H),8.90(s,1H),8.23(m,1H),6.39(d,J＝17.9Hz,1H),6.22(d,J＝11.7Hz,1H),5.18(m,2H),4.62-4.47(m,2H)，这表明了Ppa确实通过共价键偶联到Hyperbranched G3-PEG20k-OH分子上，我们成功获得了G320P目标分子。

(2)G310P的合成

在氮气保护下，将Hyperbranched G3-PEG10k-OH(200.0mg,17.2μmol)，Pyropheophorbide a(36.8mg,68.8μmol)，DCC(21.3mg,103.2μmol)和DMAP(0.8mg,6.9μmol)溶解到10mL的超干N,N-二甲基酰胺中，室温避光下反应48h。反应结束后，反应液用截留分子量为8000的透析袋在超纯水中透析2天，并通过尺寸排阻色谱柱(Superose 12HR/16/30column on an

FPLC system(GEHealthcare)column)进一步提纯。最后，在超纯水中再次透析并冷冻干燥，即可获得黑色固体G310P，质量为179.2mg，产率为76.0％。

如图7所示，我们在Hyperbranched G3-PEG10k-OH的¹H NMR(400MHz,DMSO)中发现其特征峰δ4.14-4.05(m,56H,-CH₂-OCO-,(Bis-MPA)),3.50(m,927H,CH₂-CH₂-O-,(PEG)),1.23-0.87(m,39H,-CH₃,(Bis-MPA))，说明该原料分子结构正确。如图8所示，与Hyperbranched G3-PEG10k-OH的氢谱相比，我们在G310P的¹H NMR(400MHz,DMSO)中发现了Ppa在10.0-4.0之间的特征峰δ9.74(s,1H),9.46(s,1H),8.90(s,1H),8.23(dd,J＝17.9,11.7Hz,1H),6.39(d,J＝17.8Hz,1H),6.21(d,J＝11.6Hz,1H),5.18(dd,J＝42.4,20.0Hz,2H),4.65-4.53(m,2H)，这表明了Ppa确实通过共价键偶联到Hyperbranched G3-PEG10k-OH分子上，我们成功合成了G310P目标分子。

(3)G220P的合成

在氮气保护下，将Hyperbranched G2-PEG20k-OH(200.0mg,9.6μmol)，Pyropheophorbide a(41.1mg,76.8μmol)，DCC(23.8mg,115.2μmol)和DMAP(0.9mg,7.7μmol)溶解到10mL的超干N,N-二甲基酰胺中，室温避光下反应48h。反应结束后，反应液用截留分子量为8000的透析袋在超纯水中透析2天，并通过尺寸排阻色谱柱(Superose 12HR/16/30column on an

FPLC system(GEHealthcare)column)进一步提纯。最后，在超纯水中再次透析并冷冻干燥，即可获得黑色固体G310P，质量为179.8mg，产率为75.2％。

如图9所示，我们在Hyperbranched G2-PEG20k-OH的¹H NMR(400MHz,DMSO)中发现其特征峰δ4.27-4.08(m,24H,-CH₂-OCO-,(Bis-MPA)),3.50(m,1828H,CH₂-CH₂-O-,(PEG)),1.23-0.87(m,18H,-CH₃,(Bis-MPA)).，说明该原料分子结构正确。如图10所示，与Hyperbranched G2-PEG20k-OH的氢谱相比，我们在G220P的¹H NMR(400MHz,DMSO)中发现了Ppa在10.0-4.0之间的特征峰δ9.72(s,1H),9.44(s,1H),8.89(s,1H),8.22(m,1H),7.78(d,J＝7.7Hz,1H),6.38(d,J＝17.7Hz,1H),6.21(d,J＝11.7Hz,1H),5.17(m,2H),4.47(m,4H)，这表明了Ppa确实通过共价键偶联到Hyperbranched G2-PEG20k-OH分子上，我们合成获得了G220P目标分子。

(4)G210P的合成

在氮气保护下，将Hyperbranched G2-PEG10k-OH(200.0mg,18.7μmol)，Pyropheophorbide a(40.0mg,74.8μmol)，DCC(23.2mg,112.2μmol)和DMAP(0.9mg,7.5μmol)溶解到10mL的超干N,N-二甲基酰胺中，室温避光下反应48h。反应结束后，反应液用截留分子量为8000的透析袋在超纯水中透析2天，并通过尺寸排阻色谱柱(Superose 12HR/16/30 column on an

FPLC system(GEHealthcare)column)进一步提纯。最后，在超纯水中再次透析并冷冻干燥，即可获得黑色固体310P，质量为154.5mg，产率为64.7％。

如图11所示，我们在Hyperbranched G2-PEG10k-OH的¹H NMR(400MHz,DMSO)中发现其特征峰δ4.20-4.08(m,24H,-CH₂-OCO-,(Bis-MPA)),3.50(m,916H,CH₂-CH₂-O-,(PEG)),1.24-0.87(m,18H,-CH₃,(Bis-MPA))，说明该原料分子结构正确。如图12所示，与Hyperbranched G2-PEG10k-OH的氢谱相比，我们在G210P的¹H NMR(400MHz,DMSO)中发现了Ppa在10.0-4.0之间的特征峰δ9.74(d,J＝2.2Hz,1H),9.46(d,J＝2.4Hz,1H),8.89(s,1H),8.37-8.19(m,2H),7.77(d,J＝7.9Hz,1H),6.39(d,J＝18.1Hz,2H),6.22(d,J＝11.6Hz,1H),5.18(m,2H),4.59(d,J＝17.4Hz,2H)，这表明了Ppa确实通过共价键偶联到Hyperbranched G2-PEG10k-OH分子上，成功合成了G210P目标分子。

实施例2、本发明自组装体系的制备

取上述实施例1中制得的4种给药系统1mg，溶解于1mL水中，得到本发明的自组装体系。

以下通过实验证明本发明的有益效果。

本发明采用的实验方法如下：

1、核磁共振光谱

称取样品5mg左右，以0.5mL的重水或氘代二甲基亚砜为溶剂将样品充分溶解，并在高分辨超导核磁共振波谱仪上进行测试。

2、载药量测试

如表2所示，按照设定的浓度梯度(40,25,12.5,6.25,3.125,1.563,0.781,0μg/mL)配制游离光敏剂Ppa的二甲基亚砜溶液，一共8个浓度，用紫外-可见光谱仪在667nm处测定其吸光度，并绘制标准曲线。然后，分别测定一定浓度给药系统G320P、G310P、G220P和G210P(100μg/mL)的吸光度，带入标准曲线(图13所示)计算材料中游离光敏剂Ppa的浓度，最后计算载药量。

表2不同浓度游离光敏剂Ppa的吸光度。

3、粒径分布、表面电荷及形貌

分别称取给药系统G320P、G310P、G220P和G210P样品1mg左右，用超纯水溶解并配制成浓度为200μg/mL溶液。在常温下，利用Zetasizer Nano ZS纳米粒度-电位检测仪检测给药系统G320P、G310P、G220P和G210PG320P、G310P、G220P和G210P在水溶液中纳米颗粒的粒径分布和表面电荷；将200μg/mL给药系统G320P、G310P、G220P和G210PG320P、G310P、G220P和G210P的水溶液滴加到铜网的碳膜上，待其自然风干后，用透射电子显微镜观察各个样品的形貌和尺寸。

4、紫外-可见光光谱和荧光光谱

配制浓度为1mg/mL的游离光敏剂Ppa二甲基亚砜溶液，及游离光敏剂Ppa浓度为1mg/mL的给药系统G320P、G310P、G220P和G210P二甲基亚砜溶液。然后，将这五种溶液分别用不同的溶液(DMSO,H₂O,PBS,DMSO+0.1％SDS,H₂O+0.1％SDS,PBS+0.1％SDS,DMSO+1％SDS,H₂O+1％SDS,PBS+1％SDS)稀释20倍，在室温下分别测定紫外-可见光光谱(波长范围：300～800nm)，以及荧光发射光谱(E_X：405nm,Em:600～750nm)。

为了评价给药系统G320P、G310P、G220P和G210P的荧光自淬灭和解淬灭效应，我们可根据上述测量的样品在有无表面活性剂的水溶液或有机溶剂中的荧光强度，计算其荧光猝灭效率。记录各组样品的峰值强度，淬灭百分比由下式求得：

式中，F₀为样品在水溶液中发生猝灭时的荧光强度，F₁为样品在有机溶剂中处于分散状态未猝灭时的荧光强度。

5、单线态氧量子产率、摩尔消光系数和荧光量子产率

(1)摩尔消光系数(Molar extinction coefficients,ε)

根据朗伯-比尔定律，测量计算给药系统G320P、G310P、G220P和G210P的摩尔消光系数。准确称量并配制含不同浓度光敏剂Ppa的给药系统G320P、G310P、G220P和G210P的DMSO溶液(0.01875,0.0375,0.075,0.15,0.3,0.6,1.2x 10^-6mol/L)。分别将各浓度的样品加入到96孔板中，并用酶标仪测定各孔在668nm处的吸光度。根据不同浓度给药系统G320P、G310P、G220P和G210P的吸光度A对其浓度C作图求得线性关系的斜率，即为摩尔消光系数(ε)。

(2)荧光量子产率(Fluorescent quantum yield,FQ)

配制浓度为6.0×10^-6mol/L的游离光敏剂Ppa甲苯溶液，及游离光敏剂Ppa浓度为6.0×10^-6mol/L的给药系统G320P、G310P、G220P和G210P甲苯溶液，测定其荧光发射光谱(EX：660nm,Em:600～750nm)。在室温下，同时测定荧光发射光谱的峰面积和样品在660nm的吸光度。采用下式求出给药系统G320P、G310P、G220P和G210P的荧光量子产率(Φ_Δ):

式中，A为660nm处的吸光度；P为荧光发射光谱的峰面积；S为样品，而R为Ppa参照；ref.Φ_Δ为游离光敏剂Ppa在甲苯中的单线态氧量子产率(0.30)。

(3)单线态氧量子产率(Singlet oxygen quantum yield,SOQ)

通过定量检测9,10-二甲基蒽(9,10-dimethylanthracene，DMA)捕获¹O₂后的荧光降低程度可定量测定给药系统G320P、G310P、G220P和G210P的单线态氧量子产率。分别在给药系统G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa的DMSO溶液中加入一定量的DMA使DMA的终浓度均为6μM。分别将样品加入到96孔板中，采用660nm的激光进行照射(80mW/cm²))，并用酶标仪在各时间点测定DMA的发射光强度(Ex:360nm；Em:440nm)。按照如下公式计算样品的单线态氧量子产率：

式中，A为660nm处的吸光度；K为DMA消耗速率的斜率；S为样品，而R为Ppa参照；ref.Φ_Δ为Ppa在DMSO中的单线态氧量子产率(0.50)。

6、临界胶束浓度

采用芘荧光法测量给药系统G320P、G310P、G220P和G210P在超纯水中的临界胶束浓度(CMC)。首先，配制浓度为1mg/mL的给药系统G320P、G310P、G220P和G210P的母液，并稀释成不同的浓度。其次，准确称取1mg的芘，用5mL丙酮溶解，转移至50mL容量瓶定容，得到浓度为1.0×10^-4mol/L的芘丙酮溶液。然后，用移液枪移取5μL芘/丙酮溶液加入到一系列5mL容量瓶中，通N₂将丙酮吹干，分别将上述不同浓度的给药系统G320P、G310P、G220P和G210P溶液移入容量瓶中，得到一系列含芘探针的胶束溶液，浓度分别为100,60,30,10,6,3,1,0.6,0.3,0.1,0.06,0.03μg/mL。最后，将上述胶束溶液置于37℃的恒温振荡器中振荡分散2h，测定芘的荧光激发光谱(Em:668nm,Ex:310.0～350.0nm)。

7、稳定性

(1)光稳定性

分别将100μL游离光敏剂Ppa的DMSO溶液、水溶液、PBS缓冲液，以及给药系统G320P、G310P、G220P和G210P的DMSO溶液、水溶液、PBS缓冲液加入到96孔板中，每组设置3个复孔，各组溶液浓度均设置为游离光敏剂Ppa浓度为10μg/mL。实验中，用660nm的激光照射所有溶液10分钟(5mW/cm²)，每照射1分钟，便用酶标仪测定一次各孔在667nm处的吸光度或光密度OD值。最后，计算照射后各时间点相对于初始时间点的吸光度或光密度下降的百分比。

(2)胶体稳定性

通过监测给药系统G320P、G310P、G220P和G210P在模拟生理条件下的尺寸变化来评价其胶体稳定性。将给药系统G320P、G310P、G220P和G210P分别加入到含有10％FBS的超纯水和含有10％FBS的PBS中，浓度均为200μg/mL溶液。在常温下，利用Zetasizer Nano ZS纳米粒度-电位检测仪检测不同时间点给药系统G320P、G310P、G220P和G210P在含有10％FBS的超纯水和含10％FBS的PBS中的粒径分布、表面电荷和分散度的变化情况。

8、细胞内ROS测定

将4T1细胞分于六孔板中，每孔分别加入同药物浓度(1μg/mL)的游离光敏剂Ppa和给药系统G320P、G310P、G220P和G210P进行处理，并设活性氧供氢体处理的阳性对照组和无任何处理的阴性对照组。避光孵育24h后，用PBS换液并用660nm激光照射(1J·cm²)，随后加入1μM荧光探针DCFH-DA(南京建成生物工程研究所)。37℃下孵育细胞30min后，再次用PBS换液，置于倒置荧光显微镜下观察。用于流式检测的细胞则用胰酶消化并离心收集，将收集好的细胞用PBS重悬，用流式细胞仪进行定量检测。波长设置：最佳激发波长500nm或485nm(500±15nm)，最佳发射波长525nm(530±20nm)。

9、细胞系及细胞毒性实验

本章研究工作中采用的细胞系为小鼠乳腺癌细胞4T1、非小细胞肺癌耐药株A549-R(购于南京凯基生物科技发展有限公司)，及人源正常肝细胞L02(购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，维持培养条件均为改良型1640培养基(Hyclone)，且处于37℃和5％CO₂环境中培养。培养细胞前，需在培养基中加入10％胎牛血清(FBS，Excell，北美洲)和1％双抗(青霉素和链霉素)。为考察给药系统G320P、G310P、G220P和G210P的细胞毒性，向处于生长对数期的4T1细胞中分别加入同浓度梯度的Ppa进行处理，所加入的制剂分别为游离光敏剂Ppa、G320P、G310P、G220P和G210P。每个浓度设置3个复孔，并设置无药处理的对照组、含有100μL培养基的培养孔则作为空白对照组。对于需要光照的实验组，需预先避光孵育24h，再按不同时间但相同的单位面积功率用660nm激光进行照射。随后，再经避光孵育24h，各孔用10mmol/L、pH为7.4的PBS清洗2遍，再加入100μL含10％CCK-8试剂的培养基孵育2h，随后用酶标仪(BioTek,USA)测定其在450nm处的光密度OD值。为了考察给药系统自身可能存在的毒性，采用上述方法将L02细胞接种并培养于96孔的培养板中，再在避光条件下用不同浓度的给药系统G320P、G310P、G220P、G210P和空白材料进行处理。最后，按相同方法得到不同实验孔的光密度OD值。细胞存活率(cell viability)均采用以下公式进行计算：

Cell viability(％)＝(OD_t-OD₀)/(OD_c-OD₀)×100％

式中，OD_t：实验组光密度；OD₀：空白组光密度；OD_C对照组光密度。

10、细胞摄取实验

通过激光共聚焦显微镜(CLSM)和流式细胞仪检测给药系统G320P、G310P、G220P、G210P的细胞摄取情况。

激光共聚焦测试：将处于生长对数期的4T1细胞消化后以2×10⁴个细胞/皿的数量接种到玻底培养皿中，经48小时的培养使之充分贴壁，加入同浓度(1μg/mL Ppa)游离光敏剂Ppa、G320P、G310P、G220P和G210P分别处理1h、3h和6h。移去旧培养基后，用PBS洗涤2次，再加入4％多聚甲醛缓冲液对细胞进行固定。10min后弃去缓冲液，用CLSM进行观察。激发波长：630nm，发射波长：660nm。

流式细胞仪测试：将处于生长对数期的4T1细胞消化后以2×10⁴个细胞/皿的数量接种到12孔板中，加入同药物浓度(1μg/mL)的游离光敏剂Ppa、G320P、G310P、G220P和G210P分别处理1h、2h和24h。按不同的时间点加入待测样品，最后用胰酶消化细胞，1000g离心3分钟收集细胞，用PBS洗涤2次后，离心收集细胞并用流式细胞仪进行荧光检测。波长设置：参照APC的荧光检测条件检测，激发波长：630nm，发射波长：660nm。

11、肿瘤渗透性实验

将处于生长对数期的4T1细胞消化后接种到预先铺满5％琼脂糖的培养皿中，经2周的培养至细胞成球形并生长至直径在100μm以上。此时加入同浓度(1μg/mL Ppa)的游离光敏剂Ppa、G320P、G310P、G220P和G210P分别处理12h。移去旧培养基后，用PBS洗涤2次后用CLSM进行断层扫描并观察。激发波长：630nm，发射波长：660nm。

12、药代动力学实验

选择体重为20g左右的健康雌性BALB/c小鼠(5-6周龄)为研究对象进行药代动力学实验。将小鼠随机分为五组，每组7只，一组小鼠尾静脉注射游离光敏剂Ppa，另四组小鼠分别尾静脉注射给药系统G320P、G310P、G220P和G210P，注射剂量为每只小鼠5mg/Kg的游离光敏剂Ppa。分别在注射后的5min,15min,30min,1h,2h,4h,8h,12h,24h,36h,48h,72h进行眼眶取血，并加入肝素管中，400W功率超声粉碎10分钟，1000g离心10分钟，取上层血浆清液。最后，利用酶标仪建立Ppa的标准曲线(667nm处的吸光度)，并再根据标准曲线计算每个血液样品中Ppa的含量。

13、生物分布实验

为考察给药系统G320P、G310P、G220P和G210P在4T1模型小鼠体内分布的情况，将模型小鼠按设置的时间点(12h,24h,72h)随机分组，每组3只，经尾静脉注射等剂量的游离光敏剂Ppa、给药系统G320P、G310P、G220P和G210P，注射剂量均为每只小鼠5mg/Kg的游离光敏剂Ppa，并设置注射生理盐水的小鼠为实验对照组。按照设置的时间点安乐处死小鼠，解剖取出主要脏器和肿瘤，进行离体荧光成像实验，并统计分析各时间点肿瘤的荧光强度。

14、体内抗肿瘤药效评价

本实验以4T1肿瘤模型为研究对象，选择6-8周龄的雌性BALB/c小鼠为接种对象建立小鼠乳腺癌皮下移植瘤模型。将培养的4T1细胞重悬到PBS缓冲液中，按5×10⁵/只的接种量注射到小鼠后肢及背部相交处的皮下。待肿瘤体积达到50mm³时，将模型小鼠随机分为6组，每组5只，分别为生理盐水对照、游离光敏剂Ppa治疗组、给药系统G320P、G310P、G220P和G210P治疗组。治疗方案为：从治疗开始的第1天起，每四天对小鼠进行尾静脉注射一次，每次剂量为每只小鼠6mg游离光敏剂Ppa/kg。在给药后的第2天按150J·cm²/只的剂量对小鼠的肿瘤部位进行660nm的激光照射(功率为0.26W/cm²,8min)，每4天一次，共治疗3次。在第一次给药后的第19天，安乐处死并解剖小鼠，收集其主要脏器(肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏)，用10％的中性甲醛缓冲液充分固定，并进行免疫组化分析。同时对剥离后的肿瘤进行拍照记录并称重，按照以下公式计算抑瘤率(Tumor growth inhibition,TGI)：

式中，

对照组的平均瘤重，

实验组的平均瘤重。

15、统计学分析

所有实验数据用SigmaPlot 12.5软件、GraphPad Prism 5软件和MicrosoftExcel 2010软件进行统计处理。所有结果以means±SEM表示，并采用Student’s t test分析各组数据差异，P＜0.05为统计具有显著性差异。

实验例1、本发明线性-树状给药系统的自组装表征

1、自组装体系的结构表征

为了验证四种给药系统水相溶液中是否真的存在的自组装行为，我们分别以D₂O或DMSO-d₆溶剂将样品充分溶解，并在高分辨超导核磁共振波谱仪上进行测试。

如图14所示，本发明实施例1制备的四种给药系统在以D₂O作为溶剂的氢谱中，光敏剂Ppa的特征峰均完全消失，这表明四种给药系统在水相溶液中均能通过自组装形成稳定的纳米结构，将光敏剂Ppa包裹在内部疏水区域，因此其特征峰被完全抑制。G320P、G310P、G220P、G210P的自组装示意图如图3、图4所示。

2、自组装体系的形貌表征

通过透射电子显微电镜(TEM)对给药系统G320P、G310P、G220P和G210P进行观测。结果如图15所示，给药系统G320P、G310P、G220P和G210P具有疏水效应、π-π堆叠等分子间的相互作用，均能在水溶液形成较为规整的球形纳米颗粒。G320P和G210P在水溶液中均形成稳定的球形纳米颗粒，中间的“黑色小点”即为疏水光敏剂Ppa，由于但G320P的“D”和“L”部分都比G210P大、载药量高，因此其尺寸也比G210P大；G310P虽然形成了球形纳米颗粒，但疏水光敏剂Ppa(“黑色小点”)则分散于整个球形颗粒；G220P的同样形成了球形纳米颗粒，但其尺寸最大，且整个球形颗粒内部的颜色非常浅，几乎看不到疏水光敏剂Ppa(“黑色小点”)。

3、自组装体系的粒径表征

我们利用动态光散射粒度仪(DLS)对它们的水相粒径进行了表征(如图16和表3所示)，G320P、G310P、G220P和G210P在纯水中的水相粒径分别为290.0±3.6nm、298.1±7.3nm、333.2±7.5nm和241.9±3.0nm，且PDI均小于0.1，单分散性均比较良好，其中G320P和G310P粒径差别不大，而G210P最小，G220P最大，同TEM的测试结果一致。Zeta电位的结果显示，G320P、G310P、G220P和G210P在水相中的电位分别为-16.0±0.7mV、-16.5±0.6mV、-15.0±0.8mV和-23.0±1.2mV，各个给药系统表面电荷均为弱的负电荷，不易和血液中带负电荷的蛋白分子发生静电吸附作用，完全满足静脉给药的要求。

表3给药系统320P、G310P、G220P和G210P的粒径、电荷和临界胶束浓度。

4、自组装体系的临界胶束浓度(CMC)表征

为了进一步考察给药系统的组装行为，我们对它们的临界胶束浓度进行测定。结果如图17和表3所示，通过对芘探针的荧光测定和线性拟合曲线公式的计算，测得G320P、G310P、G220P和G210P在水相的CMC值差异较小，分别为3.77μg·mL-1、6.41μg·mL-1、5.36μg·mL-1和6.75μg·mL-1，均低于实际应用中所需要的浓度，这表明给药系统G320P、G310P、G220P和G210P在水相环境中都容易通过自组装而聚集。

5、自组装体系在纯水和PBS中的胶体稳定性表征

为进一步研究本发明四种给药系统在体液环境下的稳定性差异，我们通过在纯水和PBS中加入10％的胎牛血清(FBS)来模拟体内的体液环境，并将G320P、G310P、G220P和G210P溶解于上述溶液中进行水相粒径的测定实验。

结果如图18所示，在两种溶液中，G320P和G210P均可在较长的时间内维持相对恒定的粒径大小。其中，在7天的时间内，G220P和G310P的粒径有相对较大的波动，稳定性略差于G320P和G210P。原因可能是G220P和G310P的“D”和“L”部分无法达到亲疏水平衡，二者形成的纳米组装结构也不太稳定。该结果表明，G320P和G210P在水相所形成的纳米结构在体液环境下均具有较好的稳定性，而G220P和G310P在水相所形成的纳米结构在体液环境下的稳定性较低。

综合上述的实验结果，虽然给药系统G320P、G310P、G220P和G210P能在水相环境中通过自组装形成尺寸均一、单分散性良好且带弱负电荷的纳米颗粒，但由于它们“D”和“L”部分的大小不一，因此满足“long L,medium D”特征的G320P和G220P，达到了亲疏水平衡，稳定性均较高，而不满足“long L,medium D”特征的G310P和G210则稳定性相对较低。

实验例2、本发明线性-树状给药系统的光稳定性表征

1、紫外-可见光吸收光谱和荧光发射光谱表征

为了考察以DLD型线性-树状PEG共聚物为载体偶联光敏剂Ppa对其光学性质的影响，我们测定了给药系统G320P、G310P、G220P和G210P在不同溶剂环境中的紫外-可见光吸收光谱和荧光发射光谱。首先，G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa溶解在不同待测溶液中(图19所示)有着明显的颜色变化，在水相和有机溶剂中的颜色均有着显著的差别。此外，G320P、G310P、G220P和G210P在水相中的的颜色基本一致，但和游离光敏剂Ppa有一定的差异；而在DMSO中的颜色则与游离光敏剂Ppa基本一致。这可能是给药系统在水相中的自组装行为对光敏剂Ppa产生了一定的影响。

光谱实验的结果则进一步探究了这种影响作用。结果如图20所示，四种给药系统在有机溶剂中处于完全分散的状态，共价偶联没有影响光敏剂Ppa的紫外-可见光光谱，它们特征吸收波长与游离光敏剂Ppa保持一致。而在纯水或PBS的水相环境中，一方面由于游离光敏剂Ppa水溶性差而给药系统G320P、G310P、G220P和G210P均易溶于水，因此游离光敏剂Ppa在水相的吸收强度更低；另一方面，给药系统G320P、G310P、G220P和G210P和游离光敏剂Ppa均发生了特征吸收波长(670nm)的红移。而在水溶液中加入表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)后，四种给药系统的聚集结构受到破坏，其特征吸收峰又发生了蓝移，且吸收峰的位置接近于其在有机溶剂中的位置。

荧光发射光谱和成像结果则显示(图21所示)，给药系统G320P、G310P、G220P和G210P在不同的溶液环境中均会发生不同程度的荧光淬灭效应。给药系统和游离光敏剂Ppa在有机溶剂中均处于完全分散的状态，因而它们的发射光谱基本一致。四种给药系统在纯水和PBS中的淬灭率均在99％以上(表4)。但在加入0.1％的SDS后，四种给药系统在PBS中的荧光可发生一定程度的恢复，但在纯水中的荧光却无法恢复。

表4给药系统G320P、G310P、G220P和G210P在不同溶剂环境中的荧光淬灭率

以上光谱实验的结果表明，四种给药系统均不会改变光敏剂Ppa的基本光学性质。

2、不同溶剂中的光稳定性实验表征

进一步地，我们通过光稳定性实验对游离光敏剂Ppa、给药系统G320P、G310P、G220P和G210P的光稳定性同时进行了考察。结果如图22所示，在DMSO中，游离光敏剂Ppa和四种给药系统的光吸收强度均有一定程度的减弱，但四种给药系统的减弱程度显著低于游离光敏剂Ppa，表明共价偶联光敏剂Ppa到DLD型线性-树状共聚物上对其有一定的保护作用。而在水相环境中，四种给药系统均显示出显著的光稳定性，没有明显的吸光强度下降趋势，而游离光敏剂Ppa仍有一定程度的下降。这可能是由于四种给药系统在水相中的自组装行为对其内部的共价偶联的光敏剂Ppa产生了保护作用。

光稳定性的实验表明，四种给药系统显著提高了游离光敏剂Ppa的光稳定性，且四种给药系统的光稳定性没有明显差异，在体内光动力治疗研究中具有潜在应用的前景。

实验例3、本发明线性-树状给药系统的单线态氧量子产率、摩尔消光系数和荧光量子产率测试

如图20和表5所示，四种给药系统的最大吸收峰刚好落在理想光敏剂应在的600～800nm波长范围内，G320P、G310P和G220P的摩尔消光系数和荧光量子产率均略低于游离光敏剂Ppa，满足理想光敏剂的要求，但G210P的摩尔消光系数和荧光量子产率明显比其他三种给药系统低，不满足理想光敏剂的要求。如图23所示，在660nm激光照射的过程中下，DMA溶液在空气中的荧光强度衰减速率较慢，因此可以忽略DMA自身氧化带来的干扰。同时，游离光敏剂Ppa和四种给药系统溶液在370nm的激发光激发下在440nm处均不产生荧光，故也可排除光敏剂本身产生荧光的干扰，且所测含游离光敏剂Ppa或四种给药系统的DMA溶液的荧光强度值与光照时间呈一级动力学关系。通过计算，四种给药系统的单线态氧量子产率均为在0.5左右，和游离光敏剂Ppa的单线态氧量子产率差异并不明显，表明四种给药系统均具有较强的光敏化作用。

以上研究表明，四种给药系统均具有较高的单线态氧量子产率，且除210P以外的三种给药系统均具有较高的摩尔消光系数和荧光量子产率，因此G320P、G310P和G220P满足理想光敏剂的对光物理性质的要求。

表5给药系统G320P、G310P、G220P和G210P的相关光学参数。

综上对四种给药系统的理化性质和稳定性的研究表明，G320P和G210P的分子结构满足“long L,medium D”的特征，达到了亲疏水平衡，因此其组装结构可以保持较好的稳定性。而G310P和G220因结构不满足“long L,medium D”的特征，虽然依然可以在水相溶液中发生自组装形成球形纳米颗粒，但却无法维持亲疏水平衡，其稳定性也较低。摩尔消光系数、荧光量子产率和单线态氧量子产率的测定结果显示，除了G210P之外的三种给药系统均满足理想光敏剂的要求。

因此，G320P是四种给药系统中最为理想的给药系统，不仅在水相环境中可以自组装形成尺寸均一、单分散性良好、稳定性高且带弱负电荷的纳米颗粒，还具有较高的摩尔消光系数、荧光量子产率和单线态氧量子产率。

实验例4、本发明线性-树状给药系统的体外细胞评价

1、细胞毒性试验

为考察给药系统对肿瘤细胞的光动力治疗效果，我们通过CCK-8法研究了G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa对4T1小鼠乳腺癌细胞的细胞毒性。结果如图24A所示，四种给药系统和游离光敏剂Ppa在激光照射下对4T1细胞均显示出较强的细胞毒性，且它们之间没有明显差异。其中，游离光敏剂Ppa的细胞毒性强于四种给药系统。一方面，小分子和大分子不同的入胞途径可能会导致入胞速率和入胞量的差异。另一方面，游离光敏剂Ppa自身对细胞也有着较强的毒性作用(图24B和图24C所示)，在避光条件下即光照射剂量为0J时，游离光敏剂Ppa对4T1细胞和L02人源正常细胞均表现出显著的细胞毒性。而给药系统G320P、G310P、G220P和G210P显著改善了光敏剂Ppa自身的毒性作用，在避光条件下对4T1细胞和L02细胞的毒性没有明显差异也均小于游离光敏剂Ppa，且四种给药系统对L02正常细胞的毒性均小于对4T1肿瘤细胞的毒性，表明其细胞毒性具有一定的选择性。

为进一步验证载体材料的安全性，我们还考察了未连接光敏剂Ppa的载体材料G320、G310、G220和G210对4T1细胞和L02细胞的毒性。实验的结果显示(图24D和图24E所示)，四种载体材料在各浓度下(为细胞毒性实验中给药系统在各浓度下所对应的载体材料的浓度)对L02细胞分别处理48小时后，均未引起明显的细胞毒性，细胞存活率均在90％以上。

这些结果证明了DLD型线性-树状共聚物作为载体材料对细胞具有良好的相容性，显著降低了光敏剂Ppa自身对细胞的毒性作用，且四种不同分子量和不同代数的线性-树状共聚物的细胞毒性并没有显著差异。由此可推测，四种给药系统在体内应用时均能有效地避免光敏剂Ppa自身的毒副作用。

2、细胞摄取实验

我们通过对光敏剂Ppa的荧光信号的检测来研究四种给药系统的入胞情况。为了考察四种给药系统的入胞效率，我们首先通过激光共聚焦显微镜(CLSM)观察给药系统G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa在胞内的荧光信号强度变化。结果显示(图25B)，给药系统G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa均能在孵育1h、3h和6h过程中，在胞内检测到较强的荧光信号。而游离光敏剂Ppa的入胞速率高于四种给药系统，在所测的三个时间点均有着更强的荧光信号。

为进一步比较给药系统G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa的入胞效率，我们通过流式细胞仪对胞内的荧光信号强度进行了定量测定。结果如图25A所示，在所测定的各时间点，游离光敏剂Ppa仍有着更高的入胞速率和入胞量。而在四种给药系统中，G320P有着最高的荧光信号；G310P与G220P没有明显差异，略弱于G320P；G210P的荧光信号强度则最低。

结合体外毒性实验的结果，我们发现尽管给药系统改变了光敏剂Ppa的入胞方式，但仍可有效且持续地入胞。此外，四种光敏剂中，G320P的细胞摄取效率最高，因此可以推测在激光照射下G320P更能有效杀死肿瘤细胞。

3、细胞球渗透测试

为了探究这四种给药系统对肿瘤组织的渗透能力，我们培养了4T1细胞的三维细胞球，分别与G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa进行孵育，通过激光共聚焦显微镜进行断层扫描Ppa的荧光信号，检测给药系统G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa对4T1细胞球的渗透情况。

结果如图26所示，四种给药系统中G220P的渗透深度最低，与游离光敏剂Ppa相比没有明显差异。而G320P、G310P和G210P的渗透深度均高于游离光敏剂Ppa，其中G320P、G310P的渗透深度略低于G210P。该实验结果表明，四种给药系统中，G210P的肿瘤渗透能力最强，显著强于游离光敏剂Ppa的肿瘤渗透能力，这可能是因为G210P的的结构稳定，且尺寸最小，更容易渗透到细胞球内部。

4、胞内ROS生成测试

通过荧光探针DCFH-DA对胞内的活性氧(ROS)进行检测，我们比较了不同条件下G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa在细胞内的ROS生成情况。首先，我们通过荧光显微镜的观测进行了定性比较。结果如图27A所示，所使用的探针浓度没有显著的背景信号，不会干扰阳性结果，且仅光照不会导致胞内ROS水平的提高；而活氢供体过氧化氢的阳性对照组则显示出了较强的绿色阳性荧光信号，表明所使用的探针浓度能有效监测出胞内增加的ROS。在无光照的条件下，细胞与G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa孵育后，仅有微弱的绿色荧光信号，和背景信号相当。而在经特定波长(660nm)的激光照射后，G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa均使细胞产生了显著的绿色荧光信号。

这些结果表明，光敏剂和特定波长激光的共同参与才能发挥光动力治疗的效果，并且所需激光照射的强度并不高，只光照并不会影响胞内ROS的变化。另一方面，四种给药系统没有改变光敏剂在细胞内产生毒性作用的方式，仍能在胞内经光照后产生大量的ROS杀灭肿瘤细胞。此外，流式细胞仪对胞内的荧光信号强度的半定量测定同样显示(图27B)，在经光照后，四种给药系统和游离光敏剂Ppa均能有效地在胞内产生ROS。游离光敏剂Ppa产生的ROS荧光强度略高于四种给药系统。在四种给药系统中，G210P由于入胞量最低，产生的ROS荧光信号最弱。

上述结果表明在相同的光敏剂浓度和光照强度下，四种给药系统仍能高效地在肿瘤细胞内产生具细胞毒性作用的ROS。

实验例5、本发明线性-树状给药系统的药动学和生物分布

为了研究不同结构的DLD型线性-树状结构的光动力给药系统在体内分布上是否存在差异，及是否会影响光敏剂Ppa的体内过程，我们通过离体荧光成像实验研究了G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa在荷瘤小鼠体内的分布情况。

如图28所示，在12h时，G320P、G310P、G220P和G210P检测到的肿瘤荧光信号与游离光敏剂Ppa没有显著性差异，但至24h时，G320P和G210P在肿瘤的荧光信号显著增强，超过了游离光敏剂Ppa的肿瘤荧光信号强度。而至72h时，游离光敏剂Ppa的肿瘤荧光信号强度出现了明显的下降，显著低于所有的给药系统，这表明四种给药系统在达到最大肿瘤荧光信号后仍能维持较长的时间。

另外，在三个时间点，G320P和G210P的肿瘤荧光信号没有明显差异，且高于G310P和G220P的肿瘤荧光信号，尤其在72h差异十分显著。这种差异性可能是由于G320P和G210P的分子结构满足“long L,medium D”的特征，它们在水相环境中形成的纳米颗粒不仅尺寸均一、单分散性良好且稳定性高，还具有较高细胞摄取效率和较强的肿瘤渗透能力。

此外，我们通过制作冰冻切片进行免疫荧光染色，比较了G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa在肿瘤部位分布的微观情况。结果如图29所示，与成像实验相符合，四种给药系统有着显著更长的肿瘤滞留时间，其荧光信号可持续至72h。同时，四种给药系统中G320P和G210P的荧光信号广泛分布于血管的近端和远端，表明有着较强的肿瘤组织渗透性，这与细胞球渗透实验的结果是一致的。

我们通过药动学研究进一步考察了G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa注射后在小鼠血液中的浓度变化情况。结果如图30和表6所示，游离光敏剂Ppa在血液会被快速清除，仅能在12h内检测到高于检测限的荧光信号。而G320P、G310P、G220P、G210P至72h仍能检测到荧光信号。四种给药系统的消除相半衰期均显著长于游离光敏剂Ppa，其中G320P有着最长的血液半衰期，为游离光敏剂Ppa的13倍。这些药动学的参数均表明四种给药系统显著延长了光敏剂Ppa的血液循环时间，为光敏剂的肿瘤滞留提供了重要基础。

表6给药系统G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa的主要药动学参数

a t_1/2:药物半衰期；b AUC:曲线下峰面积；c CL:清除率；d MRT:平均驻留时间；eVss:稳态表观分布容积。

上述的实验结果表明，给药系统显著改变了光敏剂Ppa在体内的分布，延长了光敏剂在体内乃至肿瘤部位的滞留时间。其中G320P和G210P均有着强的肿瘤组织渗透能力，G320P有着最长的血液半衰期，这为肿瘤高效的光动力治疗提供了保障。而给药系统具备的肿瘤长滞留这一特点，也使得治疗过程可通过对荧光信号的检测来监测肿瘤的实时变化情况，使得预后评估更加及时准确。

实验例6、本发明线性-树状给药系统的体内抗肿瘤评价

以4T1小鼠乳腺癌细胞细胞为研究对象，在雌性BALB/c小鼠皮下建立了小鼠乳腺癌移植瘤模型。以注射生理盐水(Saline)的小鼠为对照组，研究了G320P、G310P、G220P、G210P和游离光敏剂Ppa的抗肿瘤效果。

结果如图31所示，G320P、G310P、G220P和G210P均有着显著优于游离光敏剂Ppa的抗肿瘤效果，在平均肿瘤体积、平均瘤重、肿瘤大小和抑瘤率(TGI)的对比结果上均表现出显著的优势。其中，G320P有着最佳的抗肿瘤效果，显著优于其他治疗组。组织病理分析显示(图32A)，saline对照组和游离光敏剂Ppa均在肺部和肝脏出现显著的、多发的肿瘤转移病灶；而四种给药系统治疗组均未见肿瘤转移病灶，表明它们均有效地抑制了肿瘤的转移。

我们还研究了提示肿瘤组织中新生血管程度的免疫组化指标CD-31的阳性率和提示肿瘤组织中细胞凋亡水平的指标TUNEL的阳性率。实验结果显示(图32B)，与肿瘤生长抑制的情况相符，四种给药系统可显著提高肿瘤组织凋亡水平，并显著降低CD-31的表达水平，表明经过给药系统的光动力治疗，有效地抑制了肿瘤组织血管的生成并促进肿瘤细胞的凋亡。在四个给药系统中，G320P仍显示出最佳的结果。此外，对治疗过程中受试小鼠的体重进行检测，未见给药系统治疗组小鼠的体重有异常变化。而且，如图33所示，主要组织器官的病理分析也未见给药系统治疗组有明显病变的发生，这表明了四种给药系统具有良好的生物安全性。

综上，本发明以DLD型PEG-MPA线性-树状共聚物为载体，成功设计并构建了一系列不同代数和分子量的两亲性DLD型PEG-MPA线性-树状结构的光动力给药系统。研究表明，本发明的给药系统G320P和G210P的分子结构满足“long L,medium D”的特征，达到了亲疏水平衡，因此它们可以在水溶液中形成尺寸均一、单分散性良好和结构稳定的组装结构。其中，G320P具有更高的摩尔消光系数、荧光量子产率和单线态氧量子产率，完全满足理想光敏剂的要求。体内外生物实验研究进一步表明，G320P不仅具有最好的细胞摄取效率和优异的肿瘤渗漏能力，还具有最强的肿瘤滞留能力和最长的血液半衰期，最终表现出最佳的体内抗肿瘤效果。所以，本发明提供的DLD型线性-树状共聚物给药系统在制备抗肿瘤药物上具有非常好的应用前景。

Claims (13)

1.一种线性-树状给药系统，其特征在于：所述线性-树状给药系统是以线性-树状聚合物与光敏剂为原料制得的，其中，所述线性-树状聚合物以2,2-二羟甲基丙酸和聚乙二醇为原料反应得到的聚合物；

所述光敏剂为焦脱镁叶绿酸a；

所述线性-树状聚合物选自Hyperbranched G3-PEG20k-OH、Hyperbranched G3-PEG10k-OH、Hyperbranched G2-PEG20k-OH或Hyperbranched G2-PEG10k-OH；

所述线性-树状聚合物与光敏剂的摩尔比为1：（1~20）。

2.根据权利要求1所述的线性-树状给药系统，其特征在于：所述线性-树状聚合物为Hyperbranched G3-PEG20k-OH；

所述线性-树状聚合物与光敏剂的摩尔比为1：（4~8）。

3.根据权利要求1所述的线性-树状给药系统，所述线性-树状给药系统中载有光敏剂，其特征在于：所述线性-树状给药系统的结构为式I或式II所示的结构：

式I

式II

其中，R₁~R₁₆、R_a~R_h各自独立地选自羟基或

，且R₁~R₁₆不同时为羟基，R_a~R_h不同时为羟基；

n为聚合度，n选自222~444。

4.根据权利要求3所述的线性-树状给药系统，其特征在于：式I或式II所示线性-树状给药系统中，光敏剂的载药量为4.8%~15.1%，

光敏剂的载药量=（光敏剂的质量/线性-树状给药系统总质量）×100% 。

5.根据权利要求4所述的线性-树状给药系统，其特征在于：式I或式II所示线性-树状给药系统中，光敏剂的载药量为8.7% 。

6.根据权利要求3~5任一项所述的线性-树状给药系统，其特征在于：所述线性-树状给药系统的结构为式I或式II所示的结构，式I中， R₁~R₁₆中有4个基团为

，其余为羟基；式II中，R_a~R_h中有2个基团为

，其余为羟基；

n为聚合度，n选自222或444。

7.根据权利要求6所述的线性-树状给药系统，其特征在于：所述线性-树状给药系统的结构为式I所示的结构，其中， R₁~R₁₆中有4个基团为

，其余为羟基；

n为聚合度，n为444。

8.一种权利要求1-7任一项所述线性-树状给药系统的制备方法，其特征在于：所述方法为：让线性-树状聚合物与光敏剂发生偶联反应，然后提纯，即得；其中，所述线性-树状聚合物是以2,2-二羟甲基丙酸和聚乙二醇为原料反应得到的聚合物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述线性-树状聚合物与光敏剂的摩尔比为1：（1~20）；所述反应是在缩合剂DCC和催化剂DMAP作用下进行的；所述反应条件为：氮气氛围下，室温避光反应；所述反应时间为36~60小时；所述光敏剂为焦脱镁叶绿酸a；所述反应溶剂为有机溶剂；所述线性-树状聚合物选自Hyperbranched G3-PEG20k-OH、Hyperbranched G3-PEG10k-OH、Hyperbranched G2-PEG20k-OH或Hyperbranched G2-PEG10k-OH；

和/或，所述提纯工艺为：将反应后所得体系在超纯水中透析，然后通过色谱柱提纯，再在超纯水中透析。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述线性-树状聚合物与光敏剂的摩尔比为1：（4~8）；所述DCC、DMAP、光敏剂的摩尔比为（1.34~1.67）：（0.09~1.11）：1；所述反应时间为48小时；所述反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；

和/或，所述线性-树状聚合物选自Hyperbranched G3-PEG20k-OH；

和/或，所述提纯工艺中，所述透析时间为2天，透析使用的透析袋的截留分子量为8000；所述色谱柱为尺寸排阻色谱柱。

11.一种自组装体系，其特征在于：所述自组装体系是权利要求1-7任一项所述线性-树状给药系统加入水中制得的球形纳米颗粒。

12.权利要求1-7任一项所述线性-树状给药系统或权利要求11所述自组装体系在制备抗肿瘤药物上的用途。

13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于：所述肿瘤选自乳腺癌、膀胱癌、肺癌、食管癌、头颈部癌、皮肤癌。

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