CN113004536A - 一种金属-氨基酸/肽配位聚合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种金属‑氨基酸/肽配位聚合物，配位中心离子选自Zn2+和/或Cu2+中的一种，配位体选自9‑芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸和/或末端为9‑芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸的肽，所述肽的氨基酸序列包含RGD序列。本发明还提供了负载各种底物的金属‑氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒，该纳米颗粒具有较高的稳定性及生物相容性，能够通过RGD序列主动靶向肿瘤，在肿瘤微环境及肿瘤细胞内低pH响应下，释放药物，实现肿瘤的高效、低毒、协同治疗。

Description

一种金属-氨基酸/肽配位聚合物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术和纳米科技领域，具体涉及一种金属-氨基酸/肽配位化合物及其自组装形成的聚合物以及应用。
背景技术
肝细胞癌是全球癌症相关死亡的第二大原因，每年新增病例约85万例。随着发病率和死亡率的不断上升，肝癌在我国已成为一个重大的公共卫生问题，目前是我国男性第五大常见癌症和女性第七大常见癌症。临床上广泛认可的肝癌治疗方法包括手术切除、肝移植、局部消融、经动脉化疗栓塞和索拉非尼的靶向分子治疗等。切除和移植是肝癌的有效治疗方法，但由于诊断较晚，器官供体太少，仅适用于极少数患者，而其他治疗方法尚不足以提高肝癌患者的总体存活率。化疗，作为临床上最常见的治疗策略，主要通过化学药物对肿瘤细胞产生细胞毒性作用并诱导其凋亡。但一般的化疗药物在人体内特异性分布较差，在肿瘤部位蓄积不明显，治疗效率较低，而在正常组织的药物因其较强的细胞毒性会对人体产生强烈的副作用。并且，在长期化疗后，肿瘤细胞往往会产生耐药性，这使得化疗策略难以产生始终如一的治疗效果。
作为最典型的化疗药物，阿霉素(doxorubicin，Dox)常用作乳腺癌、肝癌等多种癌症的一线用药。阿霉素作用于DNA相关酶，导致DNA损伤，进而抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。但阿霉素没有肿瘤选择性，在抑制肿瘤增殖、杀伤肿瘤的同时，对正常细胞也有较强的毒性作用。在全身给药的条件下，阿霉素会引起明显的心脏毒性和肝毒性，因此，目前迫切地需要开发出一种更加安全、高效、稳定的阿霉素给药策略。
随着纳米科技的飞速发展，纳米技术和纳米材料被广泛应用于疾病的诊疗。其中，纳米药物兼具药物和纳米材料的双重身份，与传统药物相比有其独特的优点，如能提高药物的稳定性；高比表面积，能够负载大量的药物；具有高效的实体瘤高通透性和滞留效应(Enhanced Permeability and Retention Effect，EPR)，能够被动靶向肿瘤；可通过调控纳米材料的光信号、温度、磁场或利用肿瘤微环境响应等，实现在肿瘤部位药物的可控释放等。
由短于5个氨基酸甚至单个氨基酸组成的肽自组装而形成的纳米材料因其合成便捷、成本较低而引起了人们的极大兴趣。由于组成成分为人体必需的20种氨基酸，相比于大部分纳米材料，多肽具有生物相容性好，代谢途径明确，不易蓄积残留等优势。同时，天然存在的一些多肽序列本身具备特定的生物功能，它们可能作为细胞膜表面受体的特异性配体，或者能够参与生化反应调控细胞、组织甚至器官的生命活动。譬如，整合素家族的每个成员都是由α和β两条链通过非共价键连接而成的跨膜异二聚体糖蛋白，是细胞表面兼具粘附和信号转导功能的重要受体。整合素在成熟血管内皮细胞和正常器官中不表达或低表达，但在多种肿瘤细胞表面(如人肝癌HepG2细胞、人肺腺癌A549细胞)和肿瘤组织中的新生血管内皮细胞中高表达。它与配体的识别位点是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列，具有RGD序列的外源性多肽可以竞争性拮抗整合素与其内源性配体的结合，因此，向纳米药物中掺杂RGD序列可以实现纳米药物对肿瘤细胞的主动靶向。
2016年发表于Chemical Society Reviews杂志题为Fmoc-modified amino acidsand short peptides simple bio-inspired building blocks for the fabrication offunctional materials的文献综述了含有9-芴基甲基氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，Fmoc)修饰的氨基酸或短肽的自组装特点。这些氨基酸、短肽、药物-耦联物的自组装往往是通过高温、酶、金属离子催化而驱动的，但配体与药物分子主要以共价键的方式连接，制备过程复杂，成本较高，对桥联结构具有较高的要求，限制了可递送的药物分子的范围。在面对复杂、多发病机制的癌症时，单一的治疗模式往往达不到理想的效果。因此，上述问题限制了氨基酸、短肽自组装纳米颗粒作为抗肿瘤药物的进一步研发及临床应用。
发明内容
基于上述研究背景，本发明利用金属离子与咪唑基团的较强配位能力，发现在较温和的条件下金属离子能与9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸中的咪唑基团形成配位化合物，并能够进一步发生自组装形成聚合物纳米粒子。本发明利用这一特性，将9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸作为肽的末端(N端或C端)，所述肽包含RGD序列，使形成的聚合物纳米粒子具有靶向肿瘤细胞的能力。本发明进一步将9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸和末端为9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸的肽共同与金属离子进行配位反应，调节纳米颗粒的靶向性和生物相容性，构建了能够靶向肝癌细胞表面整合素ανβ3的复合聚合物纳米颗粒。该聚合物纳米粒展现出了对不同性质底物的广谱负载能力，并能依赖其主动靶向功能在肿瘤组织部位累积，实现肿瘤微环境与肿瘤细胞内低pH响应的抗肿瘤靶向化学治疗。
本发明具体技术方案如下：
一种金属-氨基酸/肽配位化合物，所述配位化合物的配位中心离子选自Zn2+和/或Cu2+中的一种，配位体选自9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸(Fmoc-H)和/或末端为9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸的肽，所述肽包含RGD序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或者天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸)。
9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸可以在肽的N端也可以在肽的C端，所述肽示例如下：Fmoc-H……DGR……、Fmoc-H……RGD……、……DGR……H-Fmoc或……RGD……H-Fmoc。本发明一个具体的示例，9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸在肽的N端。
优选的，所述肽的氨基酸数量为4-10。
除了RGD序列，目前已报道应用的含有RGD序列的短肽，还有苯丙氨酸连接的RGD肽(F-RGD)、丝氨酸连接的RGD肽(RGD-S)、谷氨酸连接的RGD肽(G-RGD)或RGD序列组成的环肽(cRGD)。
进一步优选的，所述末端为9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸的肽可以为Fmoc-HDGR、Fmoc-HRGD、DGRH-Fmoc、RGDH-Fmoc、Fmoc-HSDGR、Fmoc-HRGDS、SDGRH-Fmoc、RGDSH-Fmoc、Fmoc-HDGRG、Fmoc-HGRGD、DGRGH-Fmoc、GRGDH-Fmoc、Fmoc-HDGRF、Fmoc-HFRGD、DGRFH-Fmoc、FRGDH-Fmoc或(c Fmoc-HRGD)中的一种或几种。本发明一个具体的示例，末端为9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸的肽为9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸。
优选的，所述配位体中9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸和末端为9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸的肽的摩尔比为9：0～1，优选9：1。
本发明另一目的在于提供一种金属-氨基酸/肽配位聚合物，由本发明所述的配位化合物自组装聚合而成。进一步的，所述配位聚合物为纳米颗粒。
本发明另一目的在于提供本发明所述的金属-氨基酸/肽配位聚合物的制备方法，将9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸和/或末端为9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸的肽和Zn2+和/或Cu2+在酸性条件下(优选pH为1-4，更优选pH为2)混合后，调节反应体系的pH值至中性偏弱碱性(优选pH范围为7～8)，生成金属-氨基酸/肽配位化合物，搅拌至金属-氨基酸/肽配位化合物自组装形成聚合物纳米颗粒。
优选的，所述9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸和末端为9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸的肽的摩尔比为10：0～9：1，更优选为9：1；配位体与Zn2+的摩尔比为4-6：1，更优选为5.2：1。
一个具体的示例如下：
(1)将有机配体Fmoc-H、Fmoc-HDGR以摩尔比9：1的比例混合，再以有机配体-锌离子为5.2：1的摩尔比向体系中加入硝酸锌溶液；
(2)根据所需要的功能向体系中加入不同类型的底物(如Dox·HCl、FITC-OVA、GNPs或GNRs)，在剧烈搅拌下调节溶液pH值至中性偏弱碱性(优选pH范围为7～8)，诱导纳米颗粒的形成，直至颗粒生长完成。通过离心、洗涤得到负载底物的金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒。
本发明另一目的在于提供本发明所述金属-氨基酸/肽配位聚合物在制备医药载体中的应用。本发明所述聚合物纳米颗粒可以作为载体运载药物、探针、纳米材料可用于疾病的治疗与诊断。
具体的，所述药物为小分子化合物、蛋白、多肽、多糖、核酸、细胞中的一种或几种。
本发明所述的聚合物纳米颗粒具有多孔性，适合运载多种形式的药物分子。
本发明的具体实施方式中将本发明所述聚合物与适量盐酸阿霉素(Doxorubicinhydrochloride，Dox·HCl)、异硫氰酸荧光素标记的鸡卵白蛋白(Fluoresceinisothiocyanate-labeled ovalbumin，FITC-OVA)、金纳米颗粒(Gold nanoparticles，GNPs)或金纳米棒(Gold nanorods，GNRs)共孵育，得到负载不同底物的配位聚合物纳米颗粒。
本发明所述配位聚合物可以在中性至弱碱性条件下形成聚合纳米颗粒，粒径为50.0～65.2nm。在酸性条件下发生解聚，释放药物。所述配位聚合物纳米颗粒的水溶性、稳定性、生物相容性均适合作为药物载体用于疾病，特别是肿瘤的治疗。本发明研究证明，负载阿霉素的金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒能够以主动靶向的方式于肿瘤区域富集，实现肿瘤微环境与肿瘤细胞内低pH响应的抗肿瘤靶向化学治疗。
本发明的另一目的在于提供一种药物制剂，含有本发明所述的负载阿霉素的金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒。
本发明优点：
(1)本发明所述的金属-氨基酸/肽配位聚合物通过RGD序列对癌细胞表面高表达的整合素ανβ3的高亲和力主动靶向肿瘤。
(2)本发明所述的负载药物的金属-氨基酸/肽配位聚合物能够在肿瘤微环境与肿瘤细胞内低pH响应下，释放药物，实现肿瘤的高效、低毒治疗。
(3)本发明研究发现，本发明所述金属-氨基酸/肽配位聚合物具有对于不同性质底物的广谱负载能力，可以有效地负载小分子药物、蛋白、以及纳米材料，负载不同底物的纳米颗粒均具有较高的水溶性和稳定性，该发明对于抗肿瘤联合治疗具有重要的启示作用。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒的TEM图。
图2为本发明实施例1制备的金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒粒径电位仪检测结果。图2A为流体力学直径(DLS)，图2B为Zeta电位图。
图3为本发明实施例1制备的金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒的FT-IR图。
图4为本发明实施例1制备的金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒的XRD图。
图5为本发明实施例2制备的负载不同底物的金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒的TEM图。
图6为本发明实施例2制备的金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒FL光谱图。图6A为ZFH-DGR/Dox的FL光谱图，图6B为ZFH-DGR/FITC-OVA的FL光谱图。
图7为本发明实施例2制备的负载不同底物的金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒UV-vis光谱图。图7A为ZFH-DGR/GNPs的UV-vis光谱图，图7B为ZFH-DGR/GNRs的UV-vis光谱图。
图8为本发明实施例2制备的负载不同底物的金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒的DLS-时间相关曲线图。
图9为本发明实施例2制备的负载不同底物的金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒的药物释放结果图。
图10为本发明实施例2制备的负载不同底物的金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒的生物相容性实验结果图。
图11为本发明实施例2、4制备的金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒的细胞内激光共聚焦成像图。图11A为HepG2细胞内激光共聚焦成像图，图11B为L02细胞内激光共聚焦成像图。
图12为本发明实施例1、2制备的金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒的药效学结果。图12A为小鼠体重，图12B为生存率。
具体实施方式
本发明构建了一种金属-氨基酸/肽配位聚合物，其具有较高的水溶性、稳定性及生物相容性，并表现出了对于不同性质底物的广谱负载能力。负载阿霉素的金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒适合应用于体内抗肿瘤治疗。本发明通过体外表征，药物释放与稳定性研究，细胞摄取研究，以及体内药效学及病理组织学研究等方式论证该金属-氨基酸/肽配位聚合物的抗肿瘤治疗潜力。
实施例1金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒ZFH-DGR(Fmoc-H·Fmoc-HDGR)-Zn2+的构建
首先，根据计算结果精密称定所需的Fmoc-H溶解于0.1M的盐酸中制得0.026M的Fmoc-H溶液，并配制0.026M的Fmoc-HDGR水溶液、1M的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)水溶液、0.01M的六水合硝酸锌水溶液。在磁力搅拌的条件下，向玻璃瓶中加入850μL水、90μL Fmoc-H溶液与10μL Fmoc-HDGR溶液。混合搅拌5分钟后，向玻璃瓶中加入50μL六水合硝酸锌溶液。随后，向反应体系中逐滴加入1M Tris溶液使得溶液pH到达7.0。合成完毕，收集玻璃瓶中的溶液，于10000rpm/10min的条件下离心，弃去上清液，用适量水洗涤，于相同条件下再次离心。最后，将精制得到的(Fmoc-H90％·Fmoc-HDGR10％)-Zn2+(简写为ZFH-DGR)烘干、或重悬至1mL，4℃冰箱中贮存，以备后续实验用。
在此基础上，通过调整Fmoc与Fmoc-HDGR的投料比，构建Fmoc-H-Zn2+(简写为ZFH)进行参照，具体实施如下。在磁力搅拌的条件下，向玻璃瓶中加入850μL水与100μL Fmoc-H溶液。混合搅拌5分钟后，向玻璃瓶中加入50μL六水合硝酸锌溶液。随后，向反应体系中逐滴加入1M Tris溶液使得溶液pH到达7。后处理方式同上。
TEM表征：
取实施例1新鲜制备的ZFH与ZFH-DGR，稀释一定倍数后滴到铜网上，待自然风干后，于透射电子显微镜上表征材料的形貌、尺寸(TEM)。
TEM图像(图1)显示，ZFH与ZFH-DGR具有良好的球形形貌。ZFH的粒径为48.4～69.4nm，ZFH-DGR的粒径为50.0～65.2nm。
DLS&Zeta表征：
取实施例1新鲜制备的ZFH与ZFH-DGR各1mL，在粒径电位仪上对其进行其流体力学直径(DLS)与Zeta电位的测定。
DLS的测试结果(图2A)进一步显示ZFH与ZFH-DGR在溶液中保持着均匀的球形形貌。ZFH的流体力学直径为123.9～132.3nm，ZFH-DGR的流体力学直径为124.8～128.8nm。Zeta的测试结果(图2B)显示，ZFH-DGR的表面电位(-24.1～-23.5mV)比ZFH(-28.5～-27.1mV)更高，这是由于RGD序列带有正电荷。
FT-IR测定：
取原料Fmoc-H、Fmoc-HDGR以及实施例1新鲜制备的ZFH与ZFH-DGR各2mg，与适量KBr研磨后，以压片法进行傅里叶变化红外吸收测量(FT-IR)。
FT-IR(图3)证明了ZFH与ZFH-DGR是由Fmoc-H和/或Fmoc-HDGR制备得到，纳米粒的图谱中显示了与原料一致的峰，譬如咪唑环(3150cm-1)、芳香环(1610cm-1)与羰基(1700cm-1)。此外，ZFH-DGR的谱图中1670cm-1处透光率的下降证明了Fmoc-HDGR的引入。
XRD表征：
取实施例1新鲜制备的ZFH与ZFH-DGR各50mg，干燥后进行X射线衍射测量(XRD)。
XRD(图4)显示出纳米颗粒为无定形结构。
实施例2负载不同底物的金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒的构建
首先，根据计算结果精密称定所需的Fmoc-H溶解于0.1M的盐酸中制得0.026M的Fmoc-H溶液，并配制0.026M的Fmoc-HDGR水溶液、1M的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)水溶液、0.01M的六水合硝酸锌水溶液、3mM的Dox·HCl水溶液、2mg/mL的FITC-OVA水溶液、1mg/mL的GNPs水溶液与1mg/mL的GNRs水溶液。在磁力搅拌的条件下，向四个玻璃瓶中平行加入840μL水、90μL Fmoc-H溶液与10μL Fmoc-HDGR溶液。混合搅拌5分钟后，向玻璃瓶中平行加入50μL六水合硝酸锌溶液，并分别加入10μL的Dox·HCl、FITC-OVA、GNPs或GNRs水溶液。随后，向反应体系中逐滴加入1M Tris溶液使得溶液pH到达7。合成完毕，收集各个玻璃瓶中的溶液，于10000rpm/10min的条件下离心，弃去上清液，用适量水洗涤，于相同条件下再次离心。最后，将精制得到的产物(分别记为ZFH-DGR/Dox、ZFH-DGR/FITC-OVA、ZFH-DGR/GNPs、ZFH-DGR/GNRs)烘干、或重悬至1mL，4℃冰箱中贮存，以备后续实验用。
TEM表征：
取实施例2新鲜制备的ZFH-DGR/Dox、ZFH-DGR/FITC-OVA、ZFH-DGR/GNPs与ZFH-DGR/GNRs，稀释一定倍数后滴到铜网上，待自然风干后，于透射电子显微镜上表征材料的形貌、尺寸(TEM)。
TEM图像(图5)显示，ZFH-DGR/Dox与ZFH-DGR/FITC-OVA均具有良好的球形形貌，且尺寸与ZFH-DGR差异不大，这证明了Dox与FITC-OVA主要吸附于纳米颗粒的孔隙之中。而ZFH-DGR/GNPs与ZFH-DGR/GNRs的图像中可见一个球形纳米粒中只含有一个金纳米颗粒或金纳米棒，这是由于金纳米材料的尺寸较大，ZFH-DGR主要以包裹的形式负载金纳米材料。
FL测定：
取实施例2新鲜制备的ZFH-DGR/Dox与ZFH-DGR/FITC-OVA重悬液各1mL。ZFH-DGR/Dox溶液于480nm激发波长处测量发射光谱；ZFH-DGR/FITC-OVA溶液于490nm激发波长处测量发射光谱。
FL光谱(图6)的结果显示，ZFH-DGR/Dox具有与Dox的类似的荧光发射性质，但波长出现了红移，而ZFH-DGR/FITC-OVA保持着与FITC-OVA较为一致的荧光发射性质。
UV-vis测定：
取实施例2新鲜制备的ZFH-DGR/GNPs与ZFH-DGR/GNRs重悬液各1mL，使用紫外-可见分光光度发(UV-vis)测量其吸收光谱。
UV-vis光谱(图7)的结果显示，ZFH-DGR/GNPs含有金纳米颗粒(520nm)的特征吸收峰，ZFH-DGR/GNRs含有金纳米棒(520、730nm)的特征吸收峰。
综合上述三种测试结果，证实了金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒可成功负载各种类型底物。
实施例3负载阿霉素的金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒的稳定性、药物释放能力及生物相容性评价
稳定性：
取实施例2新鲜制备的ZFH-DGR/Dox 2mg，分四份分别重悬于总体积为1mL的0.03MPBS(pH＝7.4)、0.03M PBS(pH＝5.5)、0.2M PBS(pH＝7.4)、以及含10％热灭活胎牛血清的RPMI-1640细胞培养基中，分别于0，0.5，1，2，4，6，8，10h处测定其流体力学直径。
DLS-时间相关曲线(图8)显示，ZFH-DGR/Dox在0.03M PBS(pH＝7.4)、0.2M PBS(pH＝7.4)、含10％热灭活胎牛血清的RPMI-1640细胞培养基三种溶液中保持了良好的粒径稳定性。但是，ZFH-DGR/Dox在0.03M PBS(pH＝5.5)中表现出流体力学直径的显著增大，这是由于在弱酸性环境下，咪唑基团发生质子化，失去了与Zn2+配位的能力，导致配位聚合物崩解，进一步发生碎片的不规则粘连。
药物释放：
取实施例2新鲜制备的ZFH-DGR/Dox 2.01mg，分三份分别重悬于总体积为20mL的PBS(pH＝7.4，6.8，5.5)中。在磁力搅拌的条件下，分别于0，0.5，1，2，4，8，12，24h处取上清液，于10000rpm/10min的条件下离心，取上清液于激发波长为480nm的条件下测量593nm处的荧光发射强度。
药物释放结果(图9)显示，由于ZFH-DGR/Dox在弱酸性条件下会解聚、破坏，导致负载的Dox大量释放，其释放量(78.1％)较pH＝6.8(48.9％)与pH＝7.4(35.7％)的溶液中更高，说明ZFH-DGR/Dox具有在肿瘤微环境与肿瘤细胞内低pH条件下响应释放药物的潜力。
生物相容性：
取实施例2新鲜制备的ZFH-DGR/Dox适量，分别配置浓度为20，50，80，100，200，500μg/mL的溶液，与小鼠血红细胞共孵育3h后，使用紫外-可见分光光度发(UV-vis)于570nm处测量其吸光度值。
生物相容性实验结果(图10)显示该纳米颗粒在较高浓度下仍保持着较低的溶血系数(＜1％)，证明该纳米颗粒具有良好的血液相容性。
实施例4金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒的细胞摄取研究
负载FITC的金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒的制备：
照实施例2进行，仅仅将底物换成投料10μL FITC(1mM)。负载FITC的纳米颗粒记为(ZFH-DGR/FITC)
细胞摄取成像：
将L02、HepG2细胞接种于共聚焦培养皿内，接种密度为1×105个/孔，并在5％CO2无菌培养箱(37℃，饱和湿度)内孵育过夜。24h后，将原培养液吸出，加入含有5μM ZFH-DGR/FITC、ZFH/FITC或游离FITC的RPMI-1640培养基，于培养箱中培育4h。将RPMI-1640培养基弃掉，用PBS溶液洗涤3次，加入10μg/mL DAPI进行核染。15min后，将激光共聚焦小皿置于激光共聚焦显微镜(CLSM)下成像观察。
CLSM图像显示孵育了ZFH-DGR/FITC的HepG2细胞中观测到了最多的绿色荧光(图11A)，而L02细胞中几乎观测不到绿色荧光(图11B)，证实RGD序列介导的主动靶向使得金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒对肝癌肿瘤细胞具有良好的选择性。
实施例5金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒的药效学研究
对健康ICR小鼠进行腋下植瘤，每只小鼠注射Heps瘤溶液(1×107个/mL)100μL，当瘤体积至约100～200mm3时，将移植瘤小鼠随机分成5组(n＝5)，将第一次给药的前一天设为第0天，则分别于第1、3、5、7、9、11天注射生理盐水、ZFH-DGR、Dox·HCl、ZFH/Dox和ZFH-DGR/Dox制剂，剂量均为5mg/kg。同时隔天记录小鼠的体重和肿瘤的大小，最后一次给药后，将小鼠处死，剥离肿瘤，并称重。瘤体积的计算方法采用以下公式：Volume＝(W2×L)/2其中W为肿瘤最短的半径，L为肿瘤最长半径。将各制剂组的肿瘤按照标准流程进行切片，并按照H&E与TUNEL染色试剂盒说明书进行染色，进行组织病理检查。
药效学结果如图12和表1所示。结果显示ZFH-DGR/Dox最显著地抑制了小鼠体内的肝癌肿瘤(相对体积为3.84～7.60，肿瘤质量为0.54～1.14g)，抑瘤率为84.92％。在12天的治疗周期内(图12A)，小鼠体重持续上升。此外，在为期16天的生存率测试中(图12B)，ZFH-DGR/Dox给药后的小鼠保持了最高的生存率(80％)。
表1
Figure BDA0002985181170000091
Figure BDA0002985181170000101
本发明合成的负载阿霉素的金属-氨基酸/肽配位聚合物纳米颗粒在小鼠体内的抗肿瘤治疗效果明显优于其他制剂组，且没有明显的毒副作用。

Claims (10)

1.一种金属-氨基酸/肽配位化合物，其特征在于所述配位化合物的配位中心离子选自Zn2+和/或Cu2+，配位体选自9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸和/或末端为9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸的肽，所述肽包含RGD序列。
2.如权利要求1所述的配位化合物，其特征在于所述肽的氨基酸数量为4-10。
3.如权利要求1所述的配位化合物，其特征在于所述配位体选自Fmoc-HDGR、Fmoc-HRGD、DGRH-Fmoc、RGDH-Fmoc、Fmoc-HSDGR、Fmoc-HRGDS、SDGRH-Fmoc、RGDSH-Fmoc、Fmoc-HDGRG、Fmoc-HGRGD、DGRGH-Fmoc、GRGDH-Fmoc、Fmoc-HDGRF、Fmoc-HFRGD、DGRFH-Fmoc、FRGDH-Fmoc或(c Fmoc-HRGD)中的一种或几种。
4.如权利要求1所述的配位化合物，其特征在于所述9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸和末端为9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸的肽，两者摩尔比为9：0～1。
5.一种金属-氨基酸/肽配位聚合物，其特征在于由权利要求1-4任一项所述的配位化合物自组装聚合而成。
6.如权利要求5所述的金属-氨基酸/肽配位聚合物，其特征在于所述配位聚合物为纳米颗粒。
7.如权利要求5或6所述的金属-氨基酸/肽配位聚合物的制备方法，其特征在于将9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸和/或末端为9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸的肽和Zn2+和/或Cu2+在酸性条件下混合后，调节反应体系的pH值至中性偏弱碱性，生成金属-氨基酸/肽配位化合物，搅拌至金属-氨基酸/肽配位化合物自组装形成聚合物纳米颗粒。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸和末端为9-芴基甲基氧羰基修饰的组氨酸的肽的摩尔比为9：0～1，配位体与Zn2+的摩尔比为4～6：1。
9.如权利要求5或6所述的金属-氨基酸/肽配位聚合物在制备医药载体中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述医药载体可以运载药物、探针。
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