CN109675032A - 光热材料和外泌体介导的化疗药组成的药物及其用途 - Google Patents

光热材料和外泌体介导的化疗药组成的药物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种药物组合物，包括：光热材料和外泌体介导的化疗药，所述外泌体介导的化疗药的制备方法为：制备载有化疗药的含药载体，将肿瘤细胞原代培养，提取培养液中的外泌体，分离所述外泌体的脂质膜，将所述脂质膜包裹所述载有化疗药的含药载体。本发明肿瘤细胞来源的外泌体介导载体化疗与光热治疗联合能够充分发挥空间协同、时相协同作用，无术后并发症、低毒副反应、低免疫原性、癌症转移组织特异靶向性、抑制肿瘤转移、增强免疫效应的特性，从而进行肿瘤的复发与转移。

Description

光热材料和外泌体介导的化疗药组成的药物及其用途
技术领域
本发明涉及肿瘤的复发与转移治疗领域。更具体地说，本发明涉及一种光热材料和外泌体介导的化疗药组成的药物及其用途。
背景技术
化疗作为一种全身治疗的手段，对一些有全身播撒倾向的肿瘤及已经转移的中晚期肿瘤，都是主要的治疗手段。然而使用传统化疗药物进行全身化疗往往会出现很多阻碍。大多数化疗药物都存在骨髓抑制、胃肠道不良反应并且晚期癌症患者本身受到肿瘤的慢性消耗，身体素质很难耐受长时间高剂量的化疗，这些负面作用常导致临床终止化疗。合理治疗能够改善患者的生存质量，延长患者的存活期。选择最佳的一线治疗，以全身治疗为主，结合合理的局部治疗。基于此，联合疗法治疗成为一种治疗趋势。目前临床上手术切除复发实体瘤联合放疗、化疗、内分泌治疗、基因治疗、靶向治疗或中医治疗。但这些现有的联合疗法都存在创伤后并发症、毒副反应、肿瘤转移、耐药性、安全可控性、价格昂贵、血清学超敏反应、机制尚未清晰等问题。
纳米技术的发展和肿瘤靶向治疗的兴起，纳米载体开始被用作化疗药物载体以改善上述情况，它们通常具有基于肿瘤血管的增强渗透性和保留效应的被动靶向肿瘤的能力。外泌体是可由多种类型细胞分泌的直径在30-120nm的纳米囊泡。外泌体表面存在多个蛋白质家族，内部还含有腔内蛋白质，作为旁分泌信号传导的方式在细胞间共享。癌细胞衍生的外泌体具有纳米丝状网络以促进与细胞膜的相互作用并增加细胞对外泌体的摄取，同时外泌体表面的四跨膜蛋白(CD63、CD81、CD9)反映了外泌体的起源和靶细胞选择，这些都表明外泌体靶向递送药物至肿瘤细胞能力。另外，肿瘤细胞分泌的外泌体中含有肿瘤抗原，可以刺激树突状细胞(DCs)，进而增强了DCs的抗原递呈和免疫刺激作用。
热疗指利用正常组织和肿瘤组织对温度耐受的差异，通过热效应达到既杀灭肿瘤又不损伤正常组织方法。高热尤其是局部热疗，还可以刺激机体的免疫系统，提高机体的免疫功能，起到限制肿瘤细胞扩散的作用。由其衍生而来的光热疗法是采用外部光源(因较强的机体组织穿透性、非侵入性、微创性一般为近红外光)作为能量源，使富集在患处的纳米光热材料在近红外光的照射下将光能转化为热能来杀死癌细胞的治疗方法。基于光热纳米材料的肿瘤光热治疗技术相比于传统的手术切除手段表现出微创、高效、特异性强、不良反应小的优点同时促进DCs成熟分泌IL-6、TNF-α、IL-12细胞因子调节体液、细胞免疫应答抑制肿瘤转移以及能够改善患者的生活质量，减轻癌症病人的疼痛和发热。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种光热材料和外泌体介导的化疗药组成的药物及其用途，其具有生物相容性好、肿瘤转移病灶靶向性、有效激活免疫系统抑制肿瘤转移的特性，能充分发挥化疗与光热治疗消除肿瘤、刺激DCs成熟激活免疫系统、抑制复发肿瘤增长的功效。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种药物组合物，包括：光热材料和外泌体介导的化疗药，所述外泌体介导的化疗药的制备方法为：制备载有化疗药的含药载体，将肿瘤细胞原代培养，提取培养液中的外泌体，分离所述外泌体的脂质膜，将所述脂质膜包裹所述载有化疗药的含药载体。
优选的是，光热材料的制备方法为双表面活性剂种子生长法、模板辅助法、电化学法、光化学还原法、晶种法、模板法、超声化学法或湿化学法。
优选的是，光热材料为金、银、铂、石墨烯、碳纳米棒、硫化铜、硫化锌、吲哚菁绿或普鲁士蓝。
优选的是，载有化疗药的含药载体的制备方法为薄膜分散法、逆相挥发法、复乳法、注入法、溶剂化学交联法、透析法、乳化-化学交联法或溶剂吸附法。
优选的是，化疗药为阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、多烯紫杉醇、卡培他滨、吉西他滨、长春瑞滨、长春地辛、长春新碱、长春花碱、环磷酰胺、氮芥、噻替哌、环已亚硝脲、白消安、氮烯咪胺、甲基苄肼、5-氟尿嘧啶、三苯氧胺或铂类药物。
优选的是，载有化疗药的含药载体为载有化疗药的脂质体、白蛋白、壳聚糖或介孔二氧化硅。
优选的是，外泌体的提取方法为超速离心法、超滤离心法、磁珠免疫法、PEG-base沉淀法或试剂盒提取法。
优选的是，脂质膜的分离方法为反复冻融法、超声粉碎法或蔗糖梯度离心法。
优选的是，脂质膜包裹载有化疗药的含药载体的方法为：恒温孵育、电穿孔、超声结合挤出进行膜融合，实现包裹。
所述的药物组合物在制备抑制肿瘤生长的药物的用途。
本发明至少包括以下有益效果：
肿瘤细胞来源的外泌体介导载体化疗与光热治疗联合能够充分发挥空间协同、时相协同作用，无术后并发症、低毒副反应、低免疫原性、癌症转移组织特异靶向性、抑制肿瘤转移、增强免疫效应的特性，从而进行肿瘤的复发与转移。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为实例1的多种物质的扫描电镜图；
图2为实例1的不同浓度Lips和TEX-Lips对HUVEC的增殖影响图；
图3为实例1的不同浓度GNRs、GNRs-PEG对HUVEC的增殖影响图；
图4为实例1的不同浓度TAX、Lips-TAX和TEX-Lips-TAX对肿瘤细胞活性的抑制作用图；
图5为实例1的不同时间GNRs-PEG的光热治疗对肿瘤细胞增殖影响图；
图6为实例1的药物抑制复发瘤增长效果图；
图7为实例1的小鼠肺部组织转移影响图；
图8为实例2的药物抑制复发瘤增长效果图；
图9为实例2的小鼠肺部组织转移影响图；
图10为实例3的药物抑制复发瘤增长效果图；
图11为实例3的小鼠肺部组织转移影响图。
具体实施方式
下面结合实例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
制备方法为：
①含药载体的制备：
通过薄膜分散法、逆相蒸发法、溶剂注入法、冻融法、French压力法、复乳法、超临界流体逆相挥发法、复乳-冻干法、膜接触器法、化学梯度法等制备脂质体载体；通过脂质膜形成或脂质分散于水性介质两个过程或通过pH梯度法、硫酸铵梯度法、醋酸钙梯度法主动过程将化疗药载入脂质体载体；或
通过Border法、反溶剂法、乳化法、热凝胶法、白蛋白纳米结合技术、自组装技术、纳米喷雾干燥、化学修饰法等制备白蛋白载体；在含药载体制备过程中通过与白蛋白表面活性基团偶联或静电、疏水等物理作用将化疗药载入白蛋白载体；或
通过喷雾干燥法、凝聚法、溶剂蒸发法、乳化交联法、离子交联法、悬浮交联法、乳液液滴凝聚法、壳聚糖微球乙酰化法、壳聚糖溶液包衣法、反相胶束法、筛分法等制备壳聚糖载体；通过在壳聚糖载体合成过程中化学基团偶联或物理作用将化疗药载入壳聚糖载体；或
通过双模板法、单模板法、表面活性剂自组装、水热合成法、溶胶-凝胶法、反相悬浮聚合法、反相胶束法、表面沉积法等制备介孔二氧化硅载体；通过孵育法或溶剂吸附法将化疗药载入介孔二氧化硅载体；或
通过直接溶解法、透析法、超临界流体法、溶剂挥发法、挤出法、超声法、外界条件诱导法、自组装法等制备聚合物胶束载体；通过透析法、水包油乳化溶剂蒸发法、共溶剂蒸发法、乙醇注入法、微相分离法、络合法、冷冻干燥法、直接溶解法、化学结合法、静电作用法将化疗药载入聚合物胶束载体。
②外泌体的提取：
对于自身肿瘤细胞来源的外泌体的提取，首先建立肿瘤原位模型，然后模拟临床手术切除肿瘤并进行原代培养。将自体肿瘤细胞或其他来源肿瘤细胞用无血清培养基培养一段时间后提取培养液中的外泌体。进一步通过超速离心法、超滤离心法、磁珠免疫法、PEG-base沉淀法、试剂盒提取法等提取外泌体。
③外泌体脂质膜的分离：
将肿瘤细胞来源的外泌体反复冻融后破膜，再采用超声粉碎法或蔗糖梯度离心法分离出外泌体脂质膜。
④脂质膜包裹含药载体或小分子化疗药：
通过恒温箱孵育、转染、电穿孔同时结合挤出器进行外泌体脂质膜与含药载体膜融合、外泌体脂质膜包裹含药载体或小分子化疗药从而制备外泌体介导的化疗药。
⑤光热材料的制备：
通过柠檬酸钠氧化还原法、晶种生长法、模板法、电化学合成法、光化学合成法、超声化学法、湿化学法、相转移法、胶束与反胶束法等制备金纳米材料；或
通过化学还原法、光还原法、微乳液法、电化学法、超临界流体法、超声波法、化学气相沉积法、化学电镀法、水热法、模板法、晶种法、多元醇法、水热-溶剂法、机械研磨法、辐射化学还原法、激光气相法、激光烧蚀法等制备银纳米材料；或
通过电弧放电法、激光烧蚀法、化学气相沉积法(碳氢气体热解法)、固相热解法、辉光放电法、气体燃烧法、聚合反应合成法等制备碳纳米管材料；或
通过机械剥离法、氧化还原法、化学气相沉积法、外延生长法、电化学法、电弧法、有机合成法、Brodie法、Staudenmaier法、Hummers法等制备石墨烯类材料；或
通过水热/溶剂热法、微乳液法、模板法、气相法、固相法、湿化学合成法、微波法等制备硫化铜纳米材料；或
通过化学合成法、自组装法等制备吲哚菁绿(ICG)、IR825、IR820、普鲁士蓝(PB)、噻二唑衍生物、卟啉环、聚苯胺、聚吡咯、聚噻吩、聚多巴胺、BPDI/(CB[7])2等有机光热材料。
<实例1>
药物组合物，包括：光热材料和外泌体介导的化疗药，所述外泌体介导的化疗药的制备方法为：制备载有化疗药的含药载体，将肿瘤细胞原代培养，提取培养液中的外泌体，分离所述外泌体的脂质膜，将所述脂质膜包裹所述载有化疗药的含药载体即外泌体脂质膜与含药载体膜融合。制备方法具体为：
①化疗药载体的制备：通过薄膜分散法制备脂质体载体，具体步骤为：称取100mg大豆卵磷脂、5mg胆固醇于圆底烧瓶中并用5mL氯仿完全溶解，超声、震荡使其分散均匀；用旋转蒸发仪将圆底烧瓶内的氯仿蒸干形成脂质膜，将圆底烧瓶放入真空干燥器中干燥过夜；在圆底烧瓶中加入10mL PH＝7.4的PBS溶液，超声、震荡使脂质膜完全溶解后，于室温下缓慢搅拌水合2h；将脂质溶液取出置于10mL离心管中冰浴条件下用探头超声机超声15min(工作3s，间歇7s，5min共3次)，溶液逐渐由乳白色变澄清，得到的脂质体粗制品通过挤出器反复挤出得到最终产物脂质体。
②化疗药的载入：在脂质体制备的过程中，将化疗药紫杉醇载入载体，具体步骤为：称取100mg大豆卵磷脂、5mg胆固醇、10mg紫杉醇于圆底烧瓶中并用5mL氯仿完全溶解，超声、震荡使其分散均匀，继续通过薄膜分散法进行正常脂质体制备。
③外泌体的提取：首先建立乳腺癌肿瘤原位模型，然后模拟临床手术切除治疗，并将手术切除的乳腺癌肿瘤细胞进行原代培养。当细胞密度达到70％～80％时换无血清培养基，饥饿培养48h后，取上清培养液进行差速离心。具体步骤如下：在4℃下300g离心10min，弃沉淀，去除细胞取上清液，2000g离心10min，弃沉淀，去除死细胞取上清，10000g离心30min，弃沉淀，去除细胞碎片取上清，100000g离心70min，所得沉淀即为外泌体弃上清，用适量的PBS悬浮沉淀物，100000g离心70min弃上清，用适量的PBS悬浮沉淀物，将提纯的外泌体溶液装入EP管内，置于-80℃冰箱内保存备用。
④外泌体脂质膜的分离：将提取得到的外泌体通过反复冻融的方法破膜，具体步骤：-80℃冻结1h37℃下解冻15min重复此步骤4次，最终得到破膜后的外泌体。
⑤脂质膜包裹含药载体或小分子化疗药：取3个1.5mLEP管，分别吸取0.5mL(10mg磷脂量/mL)紫杉醇脂质体加入到EP管中，之后分别加入50μg、250μg、1250μg肿瘤外泌体膜，并将混合液用PBS补齐至1mL，之后放在37℃恒温箱内孵育12h形成不同质量比的(mLips/mTEX＝100/1，20/1，5/1)肿瘤外泌体融合的脂质体(TEX-Lips)(优选mLips/mTEX＝20/1)。
⑥光热材料的制备：通过晶种生长法制备金纳米棒，具体步骤为：9.75mL 0.1M的CTAB与0.25mL 10mM的HAuCl4，28℃下20mL容量圆底烧瓶内匀速搅拌至均匀。加入用冰水现配的0.01M的NaBH4并取0.8mL迅速加入到剧烈搅拌中的HAuCl4-CTAB体系中，持续剧烈搅拌2min停止搅拌，静置稳定30min后得到金种子溶液。1000mL锥形瓶中加入250mL三蒸水，预热至50℃。称取7.0g的CTAB、1.234g的NaOL，先后加入到锥形瓶中搅拌至溶解完全。将体系降温至30℃后加入18mL的4mM硝酸银，搅拌混匀后静置15min，之后加入250mL的1mM HAuCl4溶液，搅拌均匀后静置60min，期间溶液由黄色转变为无色。随后加入2.1mL HCl，缓慢搅拌15min，加入1.25mL 0.064MAA剧烈搅拌30s，接着加入0.8mL的种子溶液，剧烈搅拌后静置过夜。离心，水洗得到GNRs，产物分散在10mL H2O中备用。将得到的10mL GNRs加三蒸水稀释至100mL置于圆底烧瓶中并将圆底烧瓶架在水浴锅中，水浴加热至50℃，之后向圆底烧瓶中逐滴滴加5mL(2mg/mL)PEG水溶液，之后维持50℃并快速搅拌4h。得到的产物离心后用水洗一次，乙醇洗一次，最后分散在乙醇中。
<实例2>
药物组合物，包括：光热材料和外泌体介导的化疗药，所述外泌体介导的化疗药的制备方法为：制备载有化疗药的含药载体，将肿瘤细胞原代培养，提取培养液中的外泌体，分离所述外泌体的脂质膜，将所述脂质膜包裹所述载有化疗药的含药载体即外泌体脂质膜与含药载体膜融合。制备方法具体为：
①化疗药载体的制备：通过改良的Border方法制备阳离子白蛋白(CBSA)，具体步骤为：将67mL乙二胺溶于500mL的蒸馏水中，再加入6mol/L盐酸350mL，将溶液pH调至4.75，冷却至25℃，在不断搅拌条件下加入牛血清白蛋白5g(溶于25mL蒸馏水)中，再加入1.8g碳化二亚胺盐酸盐，25℃条件下不断搅拌反应2h，加入4mol/L醋酸缓冲液(pH＝7.45)30mL终止反应，将溶液装入透析袋中，2～8℃透析72h(2～5h换水一次)，然后将透析液冷冻干燥以备用。
②化疗药的载入：通过去溶剂化-固化交联法制备载入阿霉素的阳离子白蛋白(DOX-CBSA)，具体步骤为：5mg阿霉素与50mg阳离子白蛋白溶解到1mL的蒸馏水中，在室温下搅拌2h，调节pH值至9。以0.5mL·min-1的速度将4mL乙醇滴至已经孵化好的药物与白蛋白混合溶液中，继续搅拌，去溶剂化至纳米粒形成。向纳米粒溶液中滴加10μL 8％戊二醛溶液，25℃磁力搅拌18h使纳米粒交联固化得到固化纳米粒的溶液。将纳米粒溶液以15000r·min-1的转速离心后倾去上清液，加水至原体积超声分散。洗涤3次去除制备中加入的有机溶剂。
③外泌体的提取：将体外获得的肝癌细胞正常培养一段时间后，当细胞密度达到70％～80％时换无血清培养基，饥饿培养48h后，取培养液通过提取试剂盒抽提外泌体。具体步骤如下：收集细胞培养上清液；4℃，3000g离心10min；4℃，10000g离心20min除去细胞碎片；将离心后的上清与外泌体抽提试剂混合，4℃静置过夜，10000g离心60min；弃上清，用适量的PBS悬浮沉淀物，将提纯的外泌体溶液装入EP管内，置于-80℃冰箱内保存备用。
④外泌体脂质膜的分离：将提取得到的外泌体通过反复冻融的方法破膜，-80℃冻1h之后37℃下解冻15min，重复4次。然后通过蔗糖梯度离心法得到脂质膜，具体步骤如下：将反复冻融后的外泌体样品与1M的蔗糖溶液及0.25M的蔗糖溶液混合；4℃，2000g离心10min，收集上清；4℃，3000g离心30min，收集外泌体脂质膜；用含0.25M蔗糖溶液的TM-Buffer在4℃下3000g离心30min洗去杂质；最后用适量的PBS悬浮。
⑤脂质膜包裹含药载体或小分子化疗药：将提取的外泌体膜与DOX-CBSA在37℃摇床上孵育1h后使载体转染入脂质膜内通过膜挤出器分离出外泌体膜包裹的载体即为(exosome@DOX-CBSA)。
⑥光热材料的制备：通过Hummers法制备氧化石墨烯，具体步骤为：称取1.0g天然石墨粉、0.5g亚硝酸钠固体加入到250mL圆底烧瓶中，然后缓慢加入23mL的浓硫酸。圆底烧瓶置于冰水浴中，保持温度在6℃以下。在磁力搅拌的过程中慢慢加入3.0g高锰酸钾，整个加入过程控制在30分钟左右，之后在20℃以下温度持续搅拌6天。搅拌时间结束后，混合液在40℃条件下搅拌30min，然后升温至80℃搅拌1h，再升温至100℃搅拌2h。搅拌条件下加入40mL蒸馏水，搅拌30min。最后往混合溶液中加入12mL的30％的H2O2和140mL蒸馏水终止反应。混合液冷却至室温用超声机低温超声至少4h。混合液经过离心得到固体，然后用5％的HCl和蒸馏水洗涤至中性得到氧化石墨烯(GO)。
<实例3>
药物组合物，包括：光热材料和外泌体介导的化疗药，所述外泌体介导的化疗药的制备方法为：制备载有化疗药的含药载体，将肿瘤细胞原代培养，提取培养液中的外泌体，分离所述外泌体的脂质膜，将所述脂质膜包裹所述载有化疗药的含药载体即外泌体脂质膜与含药载体膜融合。制备方法具体为：
①化疗药载体的制备：通过化学修饰法制备壳聚糖载体，具体步骤为：在室温搅拌条件下将1g壳聚糖溶于100mL 1％乙酸中，然后加入1.02g辛醛。4小时后，将0.1g/mL的硼氢化钠中逐滴加入该溶液中。将反应混合物搅拌过夜，并用2M氢氧化钠中和。过滤得沉淀物并用乙醇和水反复洗涤。将产物N-辛基-壳聚糖(OC)在60℃下真空干燥过夜。在室温搅拌条件下将1g OC溶于4.8％乳酸(20mL)和甲醇(80mL)中，然后加入琥珀酸酐(3g)丙酮中溶液。连续搅拌48小时后，将反应溶液用5％氢氧化钠中和至pH 7，并用乙醇沉淀产物。将沉淀物溶于50mL蒸馏水中，将溶液用蒸馏水透析(MWCO 14000)，然后冻干，得到N-琥珀酰基-N-辛基壳聚糖(SOC)粉末。
②化疗药的载入：通过透析法制备表阿霉素壳聚糖胶束，具体步骤为：50℃条件下20mg SOC溶解在4mL水中搅拌2小时。然后逐滴加入1mL含有15mg DOX和1.3倍摩尔的三乙胺的DMF溶液并在冰浴条件下超声处理10分钟。将胶束溶液置于透析袋中(截留分子量为14000)用蒸馏水透析12h。将胶束溶液以3000r·min-1离心10分钟，然后通过0.45μm孔径的微滤膜过滤备用。
③外泌体的提取：将体外获得的宫颈癌细胞正常培养一段时间后，当细胞密度达到70％～80％时换无血清培养基，饥饿培养48h后，取培养液通过超滤法提取外泌体。具体步骤如下：收集细胞培养上清液；通过正常的粗滤除去细胞和细胞碎片；样品通过0.22μm滤器过滤的滤液；将滤液加到装有超滤膜的离心管中，4℃，4000g离心30min直至上清液超滤完毕；用缓冲液悬浮超滤膜上的外泌体，将提纯的外泌体溶液装入EP管内，置于-80℃冰箱内保存备用。
④外泌体脂质膜的分离：将提取得到的外泌体通过反复冻融的方法破膜，-80℃冻1h之后37℃下解冻15min，重复4次。然后将反复冻融的外泌体样品，然后通过超声粉碎分离出外泌体膜，最后用适量的PBS悬浮。
⑤脂质膜包裹含药载体：将提取的宫颈癌细胞外泌体脂质膜与表阿霉素壳聚糖载体在37℃摇床孵育1h后过膜挤出器分离出脂质膜包裹的表阿霉素壳聚糖。
⑥光热材料的制备：通过化学还原法制备银纳米粒，具体步骤为：将氯化钠溶于蒸馏水中配制成5mol·L-1的溶液。向100mL蒸馏水中加入PVP、硝酸银磁力搅拌至完全溶解后，再继续搅拌15分钟，后向其加入1mL之前配制好的5mol·L-1的氯化钠溶液室温下磁力搅拌避光反应半小时后即可得到白色的氯化银溶胶。将维生素C溶于水中配制成50mmol·L-1的溶液，氢氧化钠溶于水中配制得到1mol·L-1的溶液。量取80mL Vc溶液加入250mL烧杯中，搅拌条件下滴加1mol·L-1的氢氧化钠溶液调节其pH值至9。然后加入氯化银溶胶，磁力搅拌避光反应3个小时得到的产物分别用蒸馏水和乙醇清洗两次，离心得到最终产物银纳米粒。
<肿瘤试验>
1.1抑制乳腺肿瘤生长的试验：
小鼠原位肿瘤切除术后复发转移模型的建立：购置5周龄、体重20g左右雌性BALB/c小鼠，饲养1周后进行造模实验，实验步骤具体如下：①原位瘤模型的建立。将在体外传代培养一周以上的4T1乳腺癌肿瘤细胞用胰酶细胞消化液消化并离心分离，用无菌的PBS洗1次，最后通过细胞计数法用PBS将细胞悬液的细胞浓度调整为1000万细胞/mL，吸取到2mL离心管内，插在冰上暂时保存；用无菌枪头和移液枪吹打混匀细胞悬液，用一次性无菌注射器吸取细胞悬液，按每只小鼠200μL的剂量皮下注射于小鼠的右侧腋下。②晚期转移复发瘤模型的建立。待小鼠原位瘤长至直径达到5-7mm(5-7天)，手术切除小鼠右腋下的原位瘤，并于手术24h后在左侧腋下接种皮下瘤作为肿瘤复发瘤，于尾静脉注射肿瘤细胞作为全身性转移瘤，4T1乳腺癌肿瘤细胞浓度均与之前一致，皮下瘤剂量为200μL，但尾静脉注射用100μL。
采用实例1制备的药物组合物治疗晚期癌症复发转移模型小鼠：18只术后复发转移模型BALB/c小鼠，分为6组，每组3只，以手术切除第一个移植瘤为第-1天，尾静脉注射肿瘤细胞记为第0天，第7天，复发肿瘤直径达到5-7cm，开始对复发肿瘤进行光热治疗。其中以第1组作为对照组，不进行任何治疗处理。用异氟烷持续麻醉小鼠，根据肿瘤的大小，将15-20mL实例1制备的光热材料纳米金棒-聚乙二醇的磷酸缓冲盐溶液(GNR-PEG的PBS溶液)注射到第2、4、5、6组小鼠瘤内，5min后，用808nm近红外激光(NIR)照射肿瘤区域，通过微调激光发射器的电流强弱，使肿瘤区域表面温度维持在45-46℃，光照持续10min。光热治疗后24h，分别对第3、4、5、6组小鼠进行尾静脉注射肿瘤外泌体融合的紫杉醇脂质体的磷酸缓冲盐溶液(TEX-Lips-TAX的PBS溶液)、紫杉醇小分子药(Free-TAX)、紫杉醇脂质体的磷酸缓冲盐溶液(Lips-TAX的PBS溶液)、肿瘤外泌体融合的紫杉醇脂质体的磷酸缓冲盐溶液(TEX-Lips-TAX的PBS溶液)200μL/只，紫衫醇(TAX)按小鼠体重给药剂量为10mg/kg，之后每隔1天注射一次，共计给药7次，记录小鼠肿瘤体积，记录一直维持到第21天，期间死亡的小鼠解剖并取其肺部和复发肿瘤拍照记录肺转移和肿瘤生长情况。30天后处死依然存活的小鼠，取其肺部和肿瘤拍照记录肺转移和肿瘤生长情况。
如表1所示，粒度仪测试本方案涉及的TEX-Lips-TAX(T-L-T)化疗药纳米粒的粒径范围在120nm左右，Zeta电位测试结果显示载体的电位大约-35mv左右。如图1所示，从透射电镜扫描结果看，TEX(图1A)呈现圆球形，分散性较好，Lips(图1B)分散均匀，可观察到明显但是囊泡结构，TEX-Lips(图1C)呈不规则形，分散性较好，可观察到明显单室囊泡结构，GNRs-PEG(图1D)金棒的形态呈两头弧形的棒状，粒径分布较为均匀。如图2所示，不同浓度Lips和TEX-Lips(mLips/mTEX＝100/1，20/1，5/1)对HUVEC的增殖影响的MTT实验(n＝3)显示Lips表面融合TEX之后对Lips的生物相容性没有显著影响并且该纳米载体的作用下细胞存活率基本在80％以上，证明该纳米载体具有较好的生物相容性。如图3所示，不同浓度GNRs、GNRs-PEG对HUVEC的增殖影响的MTT实验显示PEG的修饰能够显著增加GNRs的生物相容性。如图4所示，不同浓度TAX、Lips-TAX和TEX-Lips-TAX对肿瘤细胞活性的抑制作用的MTT实验显示mLips/mTEX＝20/1的TEX-Lips具有较好的治疗效果。如图5所示，不同时间GNRs-PEG的光热治疗对肿瘤细胞增殖影响的MTT实验显示GNRs-PEG的光热效应介导的热疗效果显著。如图6所示，光热治疗与化疗组合或单独的对尾静脉注射肿瘤细胞小鼠治疗后复发瘤体积变化显示联合治疗能有效抑制复发瘤增长。如图7所示，在处死所有存活小鼠后解剖取其复发肿瘤和肺显示联合治疗能有效抑制复发瘤增长及肺部组织转移。
表1
流体动力学直径(nm) 多分散系数 ZETA电位(mV)
TEX-Lips-TAX(1/100) 125.74±3.95 0.231±0.007 -31.38±1.87
TEX-Lips-TAX(1/20) 121.61±0.56 0.297±0.018 -35.45±1.29
TEX-Lips-TAX(1/5) 123.87±3.48 0.222±0.023 -32.31±3.24
1.2抑制肝癌肿瘤生长的试验：
小鼠原位肿瘤切除术后复发转移模型的建立：购置5周龄、体重20g左右雌性BALB/c小鼠，饲养1周后进行造模实验，实验步骤具体如下：①原位瘤模型的建立。将在体外传代培养一周以上的H22肝癌肿瘤细胞用胰酶细胞消化液消化并离心分离，用无菌的PBS洗1次，最后通过细胞计数法用PBS将细胞悬液的细胞浓度调整为1000万细胞/mL，吸取到2mL离心管内，插在冰上暂时保存；用无菌枪头和移液枪吹打混匀细胞悬液，用一次性无菌注射器吸取细胞悬液，按每只小鼠200μL的剂量皮下注射于小鼠的右侧腋下。②晚期转移复发瘤模型的建立。待小鼠原位瘤长至直径达到5-7mm(5-7天)，手术切除小鼠右腋下的原位瘤，并于手术24h后在左侧腋下接种皮下瘤作为肿瘤复发瘤，于尾静脉注射肿瘤细胞作为全身性转移瘤，H22肝癌肿瘤细胞浓度均与之前一致，皮下瘤剂量为200μL，但尾静脉注射用100μL。
采用实例2制备的药物组合物治疗晚期癌症复发转移模型小鼠：18只术后复发转移模型BALB/c小鼠，分为6组，每组3只，以手术切除第一个移植瘤为第-1天，尾静脉注射肿瘤细胞记为第0天，第7天，复发肿瘤直径达到5-7cm，开始对复发肿瘤进行光热治疗。其中以第1组作为对照组，不进行任何治疗处理。用异氟烷持续麻醉小鼠，根据肿瘤的大小，将15-20mL实例2制备的光热材料氧化石墨烯的磷酸缓冲盐溶液(GO的PBS溶液)注射到第2、4、5、6组小鼠瘤内，5min后，用808nm近红外激光(NIR)照射肿瘤区域，通过微调激光发射器的电流强弱，使肿瘤区域表面温度维持在45-46℃，光照持续10min。光热治疗后24h，分别对第3、4、5、6组组小鼠进行尾静脉注射肿瘤外泌体包裹的阿霉素阳离子白蛋白的磷酸缓冲盐溶液(TEX-CBSA-DOX的PBS溶液)、阿霉素小分子药(Free-DOX)、阿霉素阳离子白蛋白的磷酸缓冲盐溶液(CBSA-DOX的PBS溶液)、肿瘤外泌体包裹的阿霉素阳离子白蛋白的磷酸缓冲盐溶液(TEX-CBSA-DOX的PBS溶液)200μL/只，阿霉素(DOX)按小鼠体重给药剂量为10mg/kg，之后每隔1天注射一次，共计给药7次，记录小鼠肿瘤体积，记录一直维持到第21天，期间死亡的小鼠解剖并取其肺部和复发肿瘤记录肺转移和肿瘤生长情况。30天后处死依然存活的小鼠，取其肺部和肿瘤记录肺转移和肿瘤生长情况。
如图8所示，光热治疗与化疗组合或单独的对尾静脉注射肿瘤细胞小鼠治疗后复发瘤体积变化显示联合治疗能有效抑制复发瘤增长。如图9所示，在处死所有存活小鼠后解剖取其复发肿瘤和肺显示联合治疗能有效抑制复发瘤增长及肺部组织转移。
1.3抑制宫颈癌肿瘤生长的试验：
小鼠原位肿瘤切除术后复发转移模型的建立：购置5周龄、体重20g左右雌性BALB/c小鼠，饲养1周后进行造模实验，实验步骤具体如下：①原位瘤模型的建立。将在体外传代培养一周以上的U14宫颈癌肿瘤细胞用胰酶细胞消化液消化并离心分离，用无菌的PBS洗1次，最后通过细胞计数法用PBS将细胞悬液的细胞浓度调整为1000万细胞/mL，吸取到2mL离心管内，插在冰上暂时保存；用无菌枪头和移液枪吹打混匀细胞悬液，用一次性无菌注射器吸取细胞悬液，按每只小鼠200μL的剂量皮下注射于小鼠的右侧腋下。②晚期转移复发瘤模型的建立。待小鼠原位瘤长至直径达到5-7mm(5-7天)，手术切除小鼠右腋下的原位瘤，并于手术24h后在左侧腋下接种皮下瘤作为肿瘤复发瘤，于尾静脉注射肿瘤细胞作为全身性转移瘤，U14宫颈癌肿瘤细胞浓度均与之前一致，皮下瘤剂量为200μL，但尾静脉注射用100μL。
采用实例3制备的药物组合物治疗晚期癌症复发转移模型小鼠：18只术后复发转移模型BALB/c小鼠，分为6组，每组3只，以手术切除第一个移植瘤为第-1天，尾静脉注射肿瘤细胞记为第0天，第7天，复发肿瘤直径达到5-7cm，开始对复发肿瘤进行光热治疗。其中以第1组作为对照组，不进行任何治疗处理。用异氟烷持续麻醉小鼠，根据肿瘤的大小，将15-20mL实例3制备的光热材料银纳米粒子的磷酸缓冲盐溶液(Ag的PBS溶液)注射到第2、4、5、6组小鼠瘤内，5min后，用808nm近红外激光(NIR)照射肿瘤区域，通过微调激光发射器的电流强弱，使肿瘤区域表面温度维持在45-46℃，光照持续10min。光热治疗后24h，分别对第3、4、5、6组小鼠进行尾静脉注射肿瘤外泌体包裹的表阿霉素壳聚糖载体的磷酸缓冲盐溶液(TEX-SOC-EPI的PBS溶液)、表阿霉素小分子药(Free-EPI)、表阿霉素壳聚糖载体的磷酸缓冲盐溶液(SOC-EPI的PBS溶液)、肿瘤外泌体包裹的表阿霉素壳聚糖载体的磷酸缓冲盐溶液(TEX-SOC-EPI的PBS溶液)200μL/只，表阿霉素(EPI)按小鼠体重给药剂量为10mg/kg，之后每隔1天注射一次，共计给药7次，记录小鼠肿瘤体积，记录一直维持到第21天，期间死亡的小鼠解剖并取其肺部和复发肿瘤记录肺转移和肿瘤生长情况。30天后处死依然存活的小鼠，取其肺部和肿瘤记录肺转移和肿瘤生长情况。
如图10所示，光热治疗与化疗组合或单独的对尾静脉注射肿瘤细胞小鼠治疗后复发瘤体积变化显示联合治疗能有效抑制复发瘤增长。如图11所示，在处死所有存活小鼠后解剖取其复发肿瘤和肺显示联合治疗能有效抑制复发瘤增长及肺部组织转移。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。

Claims (10)

1.药物组合物，其特征在于，包括：光热材料和外泌体介导的化疗药，所述外泌体介导的化疗药的制备方法为：制备载有化疗药的含药载体，将肿瘤细胞原代培养，提取培养液中的外泌体，分离所述外泌体的脂质膜，将所述脂质膜包裹所述载有化疗药的含药载体。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，光热材料的制备方法为双表面活性剂种子生长法、模板辅助法、电化学法、光化学还原法、晶种法、模板法、超声化学法或湿化学法。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，光热材料为金、银、铂、石墨烯、碳纳米棒、硫化铜、硫化锌、吲哚菁绿或普鲁士蓝。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，载有化疗药的含药载体的制备方法为薄膜分散法、逆相挥发法、复乳法、注入法、溶剂化学交联法、透析法、乳化-化学交联法或溶剂吸附法。
5.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，化疗药为阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、多烯紫杉醇、卡培他滨、吉西他滨、长春瑞滨、长春地辛、长春新碱、长春花碱、环磷酰胺、氮芥、噻替哌、环已亚硝脲、白消安、氮烯咪胺、甲基苄肼、5-氟尿嘧啶、三苯氧胺或铂类药物。
6.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，载有化疗药的含药载体为载有化疗药的脂质体、白蛋白、壳聚糖或介孔二氧化硅。
7.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，外泌体的提取方法为超速离心法、超滤离心法、磁珠免疫法、PEG-base沉淀法或试剂盒提取法。
8.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，脂质膜的分离方法为反复冻融法、超声粉碎法或蔗糖梯度离心法。
9.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，脂质膜包裹载有化疗药的含药载体的方法为：恒温孵育、电穿孔、超声结合挤出进行膜融合，实现包裹。
10.如权利要求1-9任一项所述的药物组合物在制备抑制肿瘤生长的药物的用途。
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