CN108355139B - 一种仿生酸敏感纳米药物及其制备与应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种仿生酸敏感纳米药物及其制备与应用方法，本发明仿生酸敏感纳米药物包括内核和外壳，其中外壳包括靶向修饰的血红细胞膜，使得本发明仿生酸敏感纳米药物具有无免疫的天然生物特性，能大大延长纳米药物的体内循环的时间；内核包括侧链含有敏感键的载体，能够高效释放药物，达到对肿瘤的靶向治疗的目的。本发明仿生酸敏感纳米药物制备方法简单，适于大规模生产，适用于制备靶向治疗药物，优选适用于制备肿瘤靶向治疗药物，尤其适用于制备人脑胶质瘤靶向治疗药物，有效解决了目前纳米药物面临的体内循环时间短、难以跨越BBB、被肿瘤细胞摄取量低和药物在病灶处释放缓慢等诸多关键问题。

Description

一种仿生酸敏感纳米药物及其制备与应用方法
技术领域
本发明涉及靶向药物技术领域，具体而言，涉及一种仿生酸敏感纳米药物及其制备与应用方法。
背景技术
目前恶性肿瘤已经超过心脑血管疾病成为我国居民的头号杀手，占死亡比例的25％以上。随着其发病率及死亡率的急速增长，寻求高效、安全的治疗方式刻不容缓。
脑干肿瘤(脑干胶质瘤)占颅内肿瘤的1.4％。主要为神经胶质瘤，其中以星形细胞瘤和极性成胶质细胞瘤较为多见，其次是少枝胶质细胞瘤、室管膜胶质瘤、髓母细胞瘤，此外还可见到血管瘤、囊肿、畸胎瘤、结核瘤、转移性肿瘤等。儿童及青少年好发，特别是5-9岁儿童发病率最高。儿童病人常以分化较差的极性成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤和室管膜瘤为多，成年病人则以星形细胞瘤为多。儿童患者病程短、进展快；常在较短时间内即引起严重的脑干症状；成年患者病程长、进展慢，可数月甚至1年以上始出现严重的脑干症状。
胶质瘤系浸润性生长物，它和正常脑组织没有明显界限，难以完全切除，对放疗化疗不甚敏感，非常容易复发，生长在大脑等重要部位的良、恶性肿瘤，手术难以切除或根本不能手术。
除此以外，采用化学药物用于肿瘤的治疗还面临着其他挑战。本领域技术人员熟知的血脑屏障(blood brain barrier,BBB)使得人脑胶质瘤成为癌症治疗中最棘手的肿瘤之一。BBB，其为脑补的自我平衡防御机制，一方面，它保证中枢神经系统免受外来物质侵扰，维持高效的稳态，同时为脑内输入营养物质；另一方面，BBB的致密结构也阻碍了治疗药物通过非入侵性给药进入脑内。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种仿生酸敏感纳米药物，所述的仿生酸敏感纳米药物具有无免疫的天然生物特性，能大大延长纳米药物的体内循环的时间，能够高效释放药物，达到对肿瘤的靶向治疗的目的，解决了目前纳米药物面临的体内循环时间短、难以跨越BBB、被肿瘤细胞摄取量低和药物在病灶处释放缓慢等诸多关键问题。
本发明的第二目的在于提供一种所述的仿生酸敏感纳米药物的制备方法，该方法工艺简单，适于大规模生产。
本发明的第三目的在于提供一种所述的仿生酸敏感纳米药物的应用方法，所述的仿生酸敏感纳米药物适用于制备靶向治疗药物，优选适用于制备肿瘤靶向治疗药物，尤其适用于制备人脑胶质瘤靶向治疗药物，能够有效解决目前纳米药物面临的体内循环时间短、难以跨越BBB、被肿瘤细胞摄取量低和药物在病灶处释放缓慢等诸多关键问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种仿生酸敏感纳米药物，所述仿生酸敏感纳米药物包括内核和外壳，所述内核包覆在外壳内部；
所述内核包括侧链含有敏感键的载体，所述侧链含有敏感键的载体上负载药物；
所述外壳包括靶向修饰的血红细胞膜。
本发明仿生酸敏感纳米药物包括内核和外壳，其中外壳包括靶向修饰的血红细胞膜，使得本发明仿生酸敏感纳米药物具有无免疫的天然生物特性，能大大延长纳米药物的体内循环的时间；内核包括侧链含有敏感键的载体，能够高效释放药物，达到对肿瘤的靶向治疗的目的。本发明仿生酸敏感纳米药物有效解决了目前纳米药物面临的体内循环时间短、难以跨越 BBB、被肿瘤细胞摄取量低和药物在病灶处释放缓慢等诸多关键问题。
可选地，所述敏感键包括缩醛键、腙键和酰胺键中的一种或多种，优选包括缩醛键。
可选地，所述侧链含有敏感键的载体包括缩醛接枝葡聚糖。
可选地，所述药物包括阿霉素和/或瑞加德松。
上述的一种仿生酸敏感纳米药物的制备方法，包括：将内核和外壳按比例混合后，用脂质体挤出仪在滤膜下反复挤压多次，得到一种仿生酸敏感纳米药物。
本发明仿生酸敏感纳米药物的制备方法工艺简单，适于大规模生产。
可选地，100μL小鼠血液所得到的红细胞膜采用0.5mg以下药物，优选对应0.5mg药物。
可选地，所述滤膜的孔径为200nm以下，优选为200nm。
可选地，所述内核的制备方法包括：
将侧链含有敏感键的载体溶于溶剂中，加入药物，透析除去游离药物，得到内核。
可选地，所述缩醛接枝葡聚糖的制备方法包括：
在保护气氛下，将葡聚糖与乙氧基丙烯在溶剂中反应,反应结束后，用三乙胺终止反应，在碱性水中沉淀、洗涤，所得沉淀冷冻干燥后得到缩醛接枝葡聚糖。
可选地，所述乙氧基丙烯的摩尔量为葡聚糖摩尔量的370倍以上，优选为370倍。
可选地，所述碱性水溶液的pH为7.5-8.5，优选为8。
可选地，所述反应的反应温度为10-40℃，优选为常温。
可选地，所述反应的反应时间为0.5h以上，优选为0.5h。
可选地，所述反应所采用的催化剂包括对甲苯磺酸吡啶盐中的一种或多种。
可选地，所述催化剂的用量为每1g葡聚糖使用15.6mg对甲苯磺酸吡啶盐。
可选地，所述催化剂的用量为每1g葡聚糖使用15.6mg以上催化剂，优选使用15.6mg催化剂。
可选地，所述外壳的制备方法包括：
提取血红细胞膜并进行靶向修饰。
可选地，所述提取血红细胞膜包括：
采集血液后，离心取下层血红细胞，生理盐水洗涤后，将红细胞分散于生理盐水中冰浴，离心除去血红蛋白；用生理盐水洗涤后超声，然后经过滤膜得到血红细胞膜。
可选地，所述冰浴的时间为30min以上，优选为30min。
可选地，所述经过滤膜包括依次经过400nm和200nm孔径滤膜。
可选地，所述进行靶向修饰包括：
将制备好的靶向分子和红细胞膜在摇床上孵育。
可选地，药物的摩尔量为靶向分子的摩尔量的5倍以上，优选为5倍。
可选地，所述靶向分子包括靶向多肽分子中的一种或多种，优选包括磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-巯基靶向多肽分子中的一种或多种。
可选地，所述磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-巯基靶向多肽分子通过磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺与巯基靶向多肽分子进行迈克尔加成反应制备得到。
可选地，所述巯基靶向多肽分子的摩尔量为磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇- 马来酰亚胺的摩尔量的3倍以上，优选为3倍。
可选地，所述迈克尔加成反应的时间为12h以上，优选为12h。
可选地，所述迈克尔加成反应结束后，透析并冷冻干燥得到磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-巯基靶向多肽分子。
上述的一种仿生酸敏感纳米药物的应用方法，所述仿生酸敏感纳米药物用于制备靶向治疗药物，优选用于制备肿瘤靶向治疗药物，进一步优选用于制备人脑胶质瘤靶向治疗药物。
本发明仿生酸敏感纳米药物适用于制备靶向治疗药物，优选适用于制备肿瘤靶向治疗药物，尤其适用于制备人脑胶质瘤靶向治疗药物，能够有效解决目前纳米药物面临的体内循环时间短、难以跨越BBB、被肿瘤细胞摄取量低和药物在病灶处释放缓慢等诸多关键问题。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明仿生酸敏感纳米药物包括内核和外壳，其中外壳包括靶向修饰的血红细胞膜，使得本发明仿生酸敏感纳米药物具有无免疫的天然生物特性，能大大延长纳米药物的体内循环的时间；内核包括侧链含有敏感键的载体，能够高效释放药物，达到对肿瘤的靶向治疗的目的。本发明仿生酸敏感纳米药物制备方法简单，适于大规模生产，适用于制备靶向治疗药物，优选适用于制备肿瘤靶向治疗药物，尤其适用于制备人脑胶质瘤靶向治疗药物，有效解决了目前纳米药物面临的体内循环时间短、难以跨越BBB、被肿瘤细胞摄取量低和药物在病灶处释放缓慢等诸多关键问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1中a为本发明实施例1所得m-dextran的合成1H-NMR(CDCl3)，b 为本发明实施例1所得m-dextran的分解1H-NMR(D2O)。
图2中a为本发明实施例1所得NM、RBCm@NM、Ang-RBCm@NM的粒径和 Zeta电位，b为Dox在模拟生理环境下不同pH的体外释放曲线，c、d、e、 f分别为不同药物细胞实验图。
图3中a、c、d为不同药物体内实验药代动力学和生物分布图，b为载DiR的不同药物在不同时间点的荧光强度图。
图4中a为U87MG-Luc的生物荧光图，b为不同纳米粒子的相对光子量， c为小鼠治疗过程的体重变化图，d为小鼠治疗过程的存活率图，e为小鼠主要器官H&E染色对比图。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明具体实施方式提供了一种仿生酸敏感纳米药物(Ang-RBCm@NM)，所述仿生酸敏感纳米药物包括内核和外壳，所述内核包覆在外壳内部；
所述内核包括侧链含有敏感键的载体，所述侧链含有敏感键的载体上负载药物；
所述外壳包括靶向修饰的血红细胞膜。
本发明仿生酸敏感纳米药物包括内核和外壳，其中外壳包括靶向修饰的血红细胞膜，使得本发明仿生酸敏感纳米药物具有无免疫的天然生物特性，能大大延长纳米药物的体内循环的时间；内核包括侧链含有敏感键的载体，能够高效释放药物，达到对肿瘤的靶向治疗的目的。本发明仿生酸敏感纳米药物有效解决了目前纳米药物面临的体内循环时间短、难以跨越 BBB、被肿瘤细胞摄取量低和药物在病灶处释放缓慢等诸多关键问题。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述敏感键包括缩醛键、腙键和酰胺键中的一种或多种，优选包括缩醛键。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述侧链含有敏感键的载体包括缩醛接枝葡聚糖(m-dextran)。
采用特定敏感键和载体，有助于促进药物的高效释放，促进对肿瘤细胞的治疗。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述药物包括抗肿瘤药物中的一种或多种，优选包括阿霉素(Dox)和/或瑞加德松(Lex)。
本发明一种优选的具体实施方式中，上述的一种仿生酸敏感纳米药物的制备方法，包括：将内核和外壳按比例混合后，用Avanti脂质体挤出仪在聚碳酸酯膜下反复挤压7次，得到一种仿生酸敏感纳米药物。
本发明仿生酸敏感纳米药物的制备方法工艺简单，适于大规模生产。
本发明一种优选的具体实施方式中，100μL小鼠血液所得到的红细胞膜采用0.5mg以下药物，优选对应0.5mg药物。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述滤膜的孔径为200nm以下，优选为200nm。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述内核的制备方法包括：
将侧链含有敏感键的载体溶于溶剂中，加入药物，透析除去游离药物，得到内核(酸敏感载药纳米粒子NM)。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述缩醛接枝葡聚糖的制备方法包括：
在保护气氛下，将葡聚糖(dextran)与乙氧基丙烯在溶剂中反应, 反应结束后，用三乙胺终止反应，在碱性水中沉淀、洗涤，所得沉淀冷冻干燥后得到缩醛接枝葡聚糖。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述乙氧基丙烯的摩尔量为葡聚糖摩尔量的370倍以上，优选为370倍。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述碱性水溶液的pH为7.5-8.5，优选为8。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述反应的反应温度为10-40℃，优选为常温。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述反应的反应时间为0.5h以上，优选为0.5h。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述反应所采用的催化剂包括对甲苯磺酸吡啶盐中的一种或多种。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述催化剂的用量为每1g葡聚糖使用15.6mg以上催化剂，优选使用15.6mg催化剂。
采用特定反应条件，有助于促进葡聚糖与乙氧基丙烯充分反应，得到缩醛接枝葡聚糖。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述外壳的制备方法包括：
提取血红细胞膜(RBCm，可采用小鼠和大鼠等不易引起人体免疫的动物血红细胞膜)并进行靶向修饰。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述提取血红细胞膜包括：
采集血液后，离心取下层血红细胞，生理盐水(PBS)洗涤后，将红细胞分散于生理盐水中冰浴，离心除去血红蛋白；用生理盐水洗涤后超声，然后经过滤膜得到血红细胞膜。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述冰浴的时间为30min以上，优选为30min。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述经过滤膜包括依次经过 400nm和200nm孔径滤膜。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述进行靶向修饰包括：
将制备好的靶向分子(DSPE-PEG-Ang)和红细胞膜在摇床上(37℃， 200rpm)孵育30min。
本发明一种优选的具体实施方式中，药物的摩尔量为靶向分子的摩尔量的5倍以上，优选为5倍。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述靶向分子包括靶向多肽分子中的一种或多种，优选包括磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-巯基靶向多肽分子 (DSPE-PEG-Ang)中的一种或多种。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇- 巯基靶向多肽分子通过磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺 (DSPE-PEG-MAL)与巯基靶向多肽分子(Ang-SH)进行迈克尔加成反应制备得到。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述巯基靶向多肽分子的摩尔量为磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺的摩尔量的3倍以上，优选为3倍。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述迈克尔加成反应的温度为室温。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述迈克尔加成反应的时间为 12h以上，优选为12h。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述迈克尔加成反应结束后，透析并冷冻干燥得到磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-巯基靶向多肽分子。
采用特定反应条件，有助于促进迈克尔加成反应的充分进行，得到磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-巯基靶向多肽分子。
上述的一种仿生酸敏感纳米药物的应用方法，所述仿生酸敏感纳米药物用于制备靶向治疗药物，优选用于制备肿瘤靶向治疗药物，进一步优选用于制备人脑胶质瘤靶向治疗药物。
本发明仿生酸敏感纳米药物适用于制备靶向治疗药物，优选适用于制备肿瘤靶向治疗药物，尤其适用于制备人脑胶质瘤靶向治疗药物，能够有效解决目前纳米药物面临的体内循环时间短、难以跨越BBB、被肿瘤细胞摄取量低和药物在病灶处释放缓慢等诸多关键问题。
实施例1
一种仿生酸敏感纳米药物的制备方法，包括：
(1)合成缩醛接枝葡聚糖(m-dextran)：
一步反应即可得到目标产物m-dextran。具体步骤如下：
在氮气保护条件下，将干燥除水后的葡聚糖(dextran,10kDa,0.5g)与乙氧基丙烯(2.08mL,18.5mmol)在无水二甲亚砜(DMSO,5mL)溶剂中常温反应0.5h,并加入催化剂对甲苯磺酸吡啶盐(7.8mg)。反应结束后，用三乙胺 (0.5mL)终止反应，在pH为8的去离子水中沉淀、洗涤3次阻止缩醛键降解，最终产物m-dextran由离心后的沉淀-80℃冷冻干燥得到。合成过程中使用的dextran、乙氧基丙烯和甲苯磺酸吡啶盐等主要原料均可购买直接得到。
Figure BDA0001611249330000111
(2)制备血红细胞膜伪装的酸敏感仿生靶向纳米药物Ang-RBCm@NM-(Dox/Lex)：
①酸敏感纳米粒子的形成及药物装载：将0.5mg m-dextran溶于200uL 四氢呋喃中，加入0.125mg的阿霉素(Dox)及0.02mg的瑞加德松(Lex), 透析除去游离药物，最终得到酸敏感载药纳米粒子。通过荧光光谱(FM)、高效液相色谱(HPLC)及多功能酶标仪来检测Dox及Lex的载药效率(DLE) 和载药量(DLC)。
②DSPE-PEG-Ang的合成：磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺 (DSPE-PEG-MAL)与巯基靶向多肽Angiopep-2(Ang-SH)溶于PBS,在室温下搅拌12h后，透析除去未反应上的游离多肽并冷冻干燥得到产物 DSPE-PEG-Ang，DSPE-PEG-MAL与Ang-SH的摩尔比为1：3。
③血红细胞膜(RBCm)的提取及靶向修饰:采集小鼠血液后，立即在4℃低速离心5分钟取下层血红细胞，用冰上预冷的生理盐水(PBS)洗涤三次后，将血红细胞分散于0.25×PBS冰浴30分钟，12000rpm离心5分钟除去血红蛋白。用1×PBS洗涤三次后超声5分钟，然后分别过400nm和200nm滤膜得到RBCm，随后，将制备好的靶向分子DSPE-PEG-Ang和红细胞膜在摇床上 (37℃，200rpm)孵育30min。得到Ang靶向修饰的RBCm(Ang-RBCm),膜的大小和结构可由DLS及TEM测定。DSPE-PEG-Ang和纳米药物的摩尔比为1： 5。
④仿生靶向纳米药物Ang-RBCm@NM-(Dox/Lex)的制备：将NM与Ang-RBCm按比例混合，100μL小鼠血液所得到的红细胞膜对应0.5mg纳米药物。用Avanti脂质体挤出仪在200nm聚碳酸酯膜下反复挤压7次，最终得到Ang-RBCm@NM-(Dox/Lex),其粒径、粒径分布和结构可由DLS、TEM测定。
对本发明实施例1所得仿生酸敏感纳米药物进行如下验证实验：
研究仿生酸敏感纳米药物的体外药物释放行为：
酸响应：三乙胺在DMSO中将Dox·HCl的盐酸盐脱去得到疏水抗癌模型药物阿霉素(Dox)。为了定量DOX的载药效率(DLE)和载药量(DLC)，将载药纳米粒冷冻干燥或是直接溶解在DMF中，然后由荧光光谱仪测定(激发 480nm，发射560nm)。基于已知浓度的Dox·HCl/DMF绘制的标准曲线、和如下公式可计算DLC和DLE：
DLC(wt.％)＝(药量/药和聚合物的总量)×100
DLE(％)＝(测量药量/理论投料量)×100
将纳米药物孵育在(模拟)肿瘤细胞内涵体(pH5-6.5)弱酸环境下，由DLS实时跟踪粒子的数量、粒径及粒径分布。体外释放实验在37℃避光条件下进行，将600微升的Ang-RBCm@NM-(Dox/Lex)在25mL的PBS或含有醋酸缓冲溶液中透析。在设定的时间点，取出5mL释放介质并补添相同量的新鲜介质。释放介质中Dox和Lex的量分别由荧光光度计和高效液相色谱测定。释放结果为三个平行样平均值。
细胞实验：
①细胞毒性实验：
选用低密度脂蛋白(LRP)受体高表达的人脑胶质瘤细胞U87MG为细胞模型。U87MG在含有10％FBS、1％青链霉素(100IU/mL)的100μL的DEME培养基中培养，铺在96孔板内(5×103细胞/孔)。24小时后，培养基吸走，换上100μL分别含有Ang-RBCm@NM和RBCm@NM的新鲜培养基，孵育48h后，加入10μL的3-(4，5-二甲基-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液(5mg/mL)孵育4小时后，除去培养基，加入150μL DMSO溶解活细胞产生的MTT-甲瓒。酶标仪测定各孔在492nm的吸收，以加了MTT的培养基孔为零点。每个实验数据平行做四组(n＝4)。
为了评估Ang-RBCm@NM-Dox的靶向性的抗肿瘤活性，将含不同Dox浓度的纳米粒子在5％CO2、37℃下和U87MG孵育48小时后，更换为新鲜培养基以除去没有内吞的纳米药物，并继续孵育48小时再加入MTT。市售阿霉素(Dox·HCl)为对照组。
②流式细胞仪及共聚焦显微镜表征细胞内吞和细胞内释放：
在流式细胞仪测试中，将U87MG细胞种在6孔细胞培养板内(1×106细胞/孔)在37℃培养24小时后，加入500μL的Ang-RBCm@NM-Dox、Free Ang +Ang-RBCm@NM-Dox、RBCm-NM@Dox、Free Dox的PBS溶液(Dox浓度为 10μg/mL)孵育2小时，吸走样品，用500μL胰酶消化细胞。得到的细胞悬浮液在1000×g离心3分钟，用PBS洗两次，再次分散在500μL PBS，1 小时内进行流式细胞仪(BD FACS Calibur，Becton Dickinson,USA)测试，用Cell Quest软件圈取10000个细胞获得。
细胞内吞及细胞内药物释放行为通过CLSM照片观察得到。将U87MG细胞铺于含显微镜载玻片的24孔细胞培养板里(1×105细胞/孔)培养24小时后，加入50μL的Ang-RBCm@NM-Dox、Free Ang+Ang-RBCm@NM-Dox、RBCm@NM-Dox、Free Dox的PBS溶液(Dox浓度为10μg/mL)。孵育4小时后，将培养基移除用PBS清洗两遍。用DAPI染细胞核15分钟后清洗两次。荧光图片由CLSM(TCS SP5)拍摄获得。在受体的封闭实验中，100μg/mL自由Angiopep-2提前孵育细胞2小时后并移除，换上新鲜培养基再孵育Ang-RBCm@NM-(Dox/Lex)样品。
动物实验：
①药代动力学研究：
在体内药代动力学研究中，6-8周BALB/c小鼠随机分组(每组平行3 只)，由尾静脉注射200μL的Ang-RBCm@NM-(Dox/Lex),RBCm@NM-(Dox/Lex), NM或Free Dox(Dox剂量为10mg/kg)，在预定时间点眼眶取血。血样经有机溶剂萃取分离出药物，并通过HPLC或多功能酶标仪定量。由软件拟合可计算得到药物在体内的消除半衰期(t1/2)、药物浓度-时间曲线下面积 (AUC)、清除率(CL)等药代动力参数，并逐一与无红细胞膜包裹的传统纳米药物进行比较，可以断定仿生纳米药物的血液稳定性。
②抗肿瘤效果：
U87MG脑胶质肿瘤原位模型的建立是在BALB/c裸鼠(18-20g，6-8周龄) 脑部移植肿瘤组织。当肿瘤体积为20-30mm3时用于治疗实验；肿瘤体积为 100-150mm3时用于生物分布实验。
以荧光素酶标记的人脑胶质瘤细胞(U87MG-Luc)建立原位模型，通过尾静脉注射方式单剂量或多剂量给药，由IVIS III定性及定量跟踪肿瘤生长情况。在治疗过程层中，通过小鼠体重变化及生存率来评估纳米药物的系统毒副作用及抗肿瘤活性。治疗结束后，由H&E和TUNEL等组织学染色方法分析纳米药物治疗后小鼠各正常器官健康状况及肿瘤组织凋亡情况。通过治疗实验，可以断定仿生纳米药物对荷U87MG-Luc裸鼠的系统毒性及抗肿瘤活性。
③生物分布：
尾静脉注射纳米药物至荷原位U87MG裸鼠体内，在不同时间点收取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑和肿瘤等主要组织，用IVIS III离体成像。随后，将各组织匀浆、有机溶剂萃取、离心分离得后，荧光分光光度计定量分析药物在不同时间点的体内生物分布。通过此实验可以推断仿生纳米药物体内稳定性、主动靶向性能及释放出的瑞加德松对药物在肿瘤部位富集、滞留及渗透的影响。
④BBB跨越作用及靶向性：
用近红外染料DiR代替Dox自组装形成纳米粒子，通过尾静脉注射纳米药物至荷原位人脑胶质瘤U87MG裸鼠体内，由小动物成像仪(IVIS III) 跟踪纳米药物在体内不同时间点的分布情况，并重点考察在脑肿瘤部位的积累及滞留，通过与无靶向对照组及无包裹瑞加德松组进行定性及定量比较，考察BBB跨越效率及纳米药物肿瘤靶向能力。
结果与讨论：
(1)缩醛接枝葡聚糖的合成：
葡聚糖在催化的条件下与2-乙氧基丙烯经一步反应合成得到线性和环形的缩醛,其接枝比为66.72％，其中线性的占11.28％，环形的占55.44％。如图1所示，线性缩醛在酸性条件下分解产生一分子的丙酮和一分子的乙醇，其比例通过比较丙酮(2.08ppm，6H)和乙醇(0.95ppm，3H)的特征峰与葡聚糖的特征峰(3.4-4.0ppm，6H)计算得到。环形的缩醛在酸性条件下，只产生一分子的丙酮，其比例可通过比较乙醇的特征峰和葡聚糖的特征峰计算得到。
(2)Ang-RBCm@NM-(Dox/Lex)的制备和表征：
m-dextran在水溶液中可自组装形成稳定的纳米粒子，包裹细胞膜后其粒径由171nm增加至189nm，电位由-40mV变化为-30.1mV(图2a),由DLS 测试可知，纳米粒径分布均一。由酶标仪和荧光分光光度计测得，在Dox的理论载药量为20％时，其包封率为52％。
(3)体外释放以及体外细胞实验测试
体外释放实验结果(图2b)显示在37℃生理环境下(pH7.4)，Dox的释放量很低(24小时不到15％)，而在酸性条件下，24小时的释放量超过75％，这是纳米粒子在酸性条件下溶胀致使药物释放。这意味着Ang-RBCm@NM-Dox同时解决了传统生物可降解纳米药物的泄露和细胞内释放缓慢两大难题。
由MTT测试纳米粒子的生物相容性和细胞毒性。结果可知，即使当Ang-RBCm@NM浓度高达0.8mg/mL时，对U87MG细胞仍然无毒(图2c)，证实了Ang-RBCm@NM良好的生物相容性。Ang-RBCm@NM-Dox对U87-MG细胞表现出显著的抗肿瘤活性(图2d)。流式细胞实验证明Ang-RBCm@NM-Dox能够很好的被细胞内吞，其效果仅次于通过自由扩散进入细胞的Free Dox(图2e)。图2e中，1-5依次为PBS,free Ang+Ang-RBCm@NM-Dox,RBCm@NM-Dox, Ang-RBCm@NM-Dox,free Dox。CLSM观察到在Ang-RBCm@NM-Dox孵育4小时后，U87MG细胞核内有很强的Dox荧光，甚至强于自由药物在核内的荧光强度(图2f)，这证实了Ang-RBCm@NM-Dox的细胞内快速溶胀及Dox细胞质内有效释放。
其中图2c为Ang-RBCm@NM和RBCm@NM的MTT细胞活性图；图2d为Ang-RBCm@NM-Dox、Free Ang+Ang-RBCm@NM-Dox、RBCm@NM-Dox和Free Dox在U87MG细胞中孵育48h后的抗肿瘤活性图；图2e为Ang-RBCm@NM-Dox(曲线4)、Free Ang+Ang-RBCm@NM-Dox(曲线2)、RBCm@NM-Dox(曲线3)、 Free Dox(曲线5)和PBS(曲线1)在U87MG细胞中孵育2h的流式细胞图；图2f为Ang-RBCm@NM-Dox、Free Ang+Ang-RBCm@NM-Dox、RBCm@NM-Dox和Free Dox在U87MG细胞中孵育4h后的激光共聚焦显微镜图。Dox剂量： 10.0μg/mL。
体内实验研究靶向纳米药物Ang-RBCm@NM-(Dox/Lex)药代动力学、生物分布：
体内药代动力学研究结果表明，靶向纳米药物Ang-RBCm@NM-(Dox/Lex) 在体内的循环时间较长，与RBCm@NM-(Dox/Lex)相当(图3a)，而长于NM，说明细胞膜修饰的纳米粒子的生物相容性较好，同时也说明在细胞膜表面修饰20％的Ang对纳米粒子在体内药代动力学未产生负效应。靶向纳米药物Ang-RBCm@NM-(DiR/Lex)的肿瘤靶向性实验(图3b)的结果表明，Ang-RBCm@NM-(DiR/Lex)的荧光强度明显高于对照组，说明其具有很好的靶向肿瘤的能力。荷U87MG脑胶质瘤的BALB/c小鼠的体内生物分布实验结果 (图3c)显示，Ang-RBCm@NM-(Dox/Lex)在肿瘤部位的富集量和对照组相比有显著提高，注射8小时后Dox的富集量为5.4％ID/g(每克组织中的Dox含量占注射总量的百分比，图3d )，分别为RBCm@NM-(Dox/Lex)、Ang-RBCm@NM-Dox、Free Dox的1.8，2.1，2.3倍。
其中，图3a为药代循环动力学曲线图，图3b为生物荧光图，3c中1-6 分别为Dox在心、肝、脾、肺、肾和脑中的定性分布图，图3d中1-6分别Dox为在心、肝、脾、肺、肾和脑中的定量分布图。
Ang-RBCm@NM-(Dox/Lex)的抑瘤实验及组织学分析：
Ang-RBCm@NM-(Dox/Lex)在荷U87MG-Luc的BALB/c裸鼠中的治疗实验结果显示，其可通过剂量依赖方式有效抑制肿瘤增长，在Dox剂量为10mg Dox/kg时,能显著抑制肿瘤增长(图4a,b)。当自由Dox浓度为10mg Dox/kg 时，7天里小鼠体重降低22％(图4c)。相比较下，Ang-RBCm@NM-(Dox/Lex) 治疗的小鼠体重变化微小，说明载药纳米粒子毒副作用小。引人注目的是，小鼠在Ang-RBCm@NM-(Dox/Lex)剂量为10mg Dox/kg治疗后，在治疗周期 22天内存活率为100％(图4d)。由H&E染色的组织学分析结果证明，Ang-RBCm@NM-(Dox/Lex)在10mg Dox/kg剂量给药时，对心、肝、脾、肺、肾在内的主要器官危害很小(图4e)。结果再次说明Ang-RBCm@NM-(Dox/Lex) 具有极低的系统毒性。
其中图4a为U87MG-Luc的生物荧光图，图4b为不同纳米粒子的相对光子量，图4c为小鼠治疗过程的体重变化图，图4d为小鼠治疗过程的存活率图，图4e为小鼠主要器官H&E染色对比图。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；本领域的普通技术人员应当理解：在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些替换和修改。

Claims (15)

1.一种仿生酸敏感纳米药物，其特征在于，所述仿生酸敏感纳米药物包括内核和外壳，所述内核包覆在外壳内部；
所述内核包括侧链含有敏感键的载体，所述侧链含有敏感键的载体上负载药物；
所述外壳包括靶向修饰的血红细胞膜；
所述侧链含有敏感键的载体为缩醛接枝葡聚糖；
所述药物为瑞加德松；
所述靶向分子为磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-巯基靶向多肽分子。
2.如权利要求1所述的一种仿生酸敏感纳米药物的制备方法，其特征在于，包括：将内核和外壳按比例混合后，用脂质体挤出仪在滤膜下反复挤压多次，得到一种仿生酸敏感纳米药物。
3.根据权利要求2所述的一种仿生酸敏感纳米药物的制备方法，其特征在于，100μL小鼠血液所得到的红细胞膜采用0.5mg以下药物。
4.根据权利要求3所述的一种仿生酸敏感纳米药物的制备方法，其特征在于，100μL小鼠血液所得到的红细胞膜采用0.5mg药物。
5.根据权利要求2所述的一种仿生酸敏感纳米药物的制备方法，其特征在于，所述滤膜的孔径为200nm以下。
6.根据权利要求5所述的一种仿生酸敏感纳米药物的制备方法，其特征在于，所述滤膜的孔径为200nm。
7.根据权利要求2所述的一种仿生酸敏感纳米药物的制备方法，其特征在于，所述内核的制备方法包括：
将侧链含有敏感键的载体溶于溶剂中，加入药物，透析除去游离药物，得到内核。
8.根据权利要求7所述的一种仿生酸敏感纳米药物的制备方法，其特征在于，所述缩醛接枝葡聚糖的制备方法包括：
在保护气氛下，将葡聚糖与乙氧基丙烯在溶剂中反应,反应结束后，用三乙胺终止反应，在碱性水中沉淀、洗涤，所得沉淀冷冻干燥后得到缩醛接枝葡聚糖。
9.根据权利要求8所述的一种仿生酸敏感纳米药物的制备方法，其特征在于，所述乙氧基丙烯的摩尔量为葡聚糖摩尔量的370倍以上；
所述碱性水溶液的pH为7.5-8.5；
所述反应的反应温度为10-40℃；
所述反应的反应时间为0.5h以上；
所述反应所采用的催化剂包括对甲苯磺酸吡啶盐中的一种或多种；
所述催化剂的用量为每1g葡聚糖使用15.6mg以上催化剂。
10.根据权利要求9所述的一种仿生酸敏感纳米药物的制备方法，其特征在于，所述乙氧基丙烯的摩尔量为葡聚糖摩尔量为370倍；
所述碱性水溶液的pH为8；
所述反应的反应温度为常温；
所述反应的反应时间为0.5h；
所述催化剂的用量为每1g葡聚糖使用15.6mg催化剂。
11.根据权利要求2所述的一种仿生酸敏感纳米药物的制备方法，其特征在于，所述外壳的制备方法包括：
提取血红细胞膜并进行靶向修饰；
所述提取血红细胞膜包括：
采集血液后，离心取下层血红细胞，生理盐水洗涤后，将红细胞分散于生理盐水中冰浴，离心除去血红蛋白；用生理盐水洗涤后超声，然后经过滤膜得到血红细胞膜；
所述冰浴的时间为30min以上；
所述经过滤膜包括依次经过400nm和200nm孔径滤膜；
所述进行靶向修饰包括：
将制备好的靶向分子和红细胞膜在摇床上孵育；
药物的摩尔量为靶向分子的摩尔量的5倍以上；
所述靶向分子包括靶向多肽分子中的一种或多种；
所述靶向分子为磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-巯基靶向多肽分子；
所述磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-巯基靶向多肽分子通过磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺与巯基靶向多肽分子进行迈克尔加成反应制备得到；
所述巯基靶向多肽分子的摩尔量为磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺的摩尔量的3倍以上；
所述迈克尔加成反应的时间为12h以上；
所述迈克尔加成反应结束后，透析并冷冻干燥得到磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-巯基靶向多肽分子。
12.根据权利要求11所述的一种仿生酸敏感纳米药物的制备方法，其特征在于，所述冰浴的时间为30min；
药物的摩尔量为靶向分子的摩尔量为5倍；
所述巯基靶向多肽分子的摩尔量为磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺的摩尔量的3倍；
所述迈克尔加成反应的时间为12h。
13.如权利要求1所述的一种仿生酸敏感纳米药物的应用方法，其特征在于，所述仿生酸敏感纳米药物用于制备靶向治疗药物。
14.根据权利要求13所述的应用方法，其特征在于，所述仿生酸敏感纳米药物用于制备肿瘤靶向治疗药物。
15.根据权利要求14所述的应用方法，其特征在于，所述仿生酸敏感纳米药物用于制备人脑胶质瘤靶向治疗药物。
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