CN111481679B - siRNA纳米胶囊及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种siRNA纳米胶囊及其制备方法和应用，涉及生物医学工程技术领域，本发明提供的siRNA纳米胶囊包括siRNA以及包封所述siRNA的由单体A和单体B聚合得到的壳，所述单体A一端带有双键，与所述siRNA通过静电结合，所述单体B包括用于增加肿瘤微环境敏感性的分子。基于本发明提供的新颖的自包封方式，使相比于现有的递送载体，本发明提供的siRNA纳米胶囊得包封率更高、粒径更小，具有强靶向性的同时，还具有良好的生物相容性和生物安全性，适于在临床中广泛应用。

Description

siRNA纳米胶囊及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医学工程技术领域，尤其是涉及一种siRNA纳米胶囊及其制备方法和应用。
背景技术
胶质母细胞瘤(GBM)是一种高死亡率和高发病率的侵袭性人颅内恶性肿瘤，迄今仍无法治愈。GBM患者的临床治疗手段是先最大程度的手术切除，然后进行化疗。尽管采用多种方式联合治疗，患者的总生存期中位值并未延长至15个月以上。越来越多的证据证明，GBM的复杂性和患者个体差异是目前治疗方法无效的原因。
具有高特异性和低毒性的RNA干扰(RNAi)被认为是治疗各种顽固性GBM的极有前途的方法。双链小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)是RNA干扰的效应分子之一，理论上可抑制任何靶基因表达，已被列为最有潜力的基因型疾病治疗剂。但是，裸露的siRNA进入血清易被核酸酶降解，且siRNA带负电荷，亲水性强，导致其不易透过细胞膜进入细胞质发挥高效的RNAi作用。因此，siRNA应用的关键在于寻找安全、有效的递送载体。病毒显示出出色的siRNA传递能力，但是，诱变毒性和免疫原性严重阻碍了它们的临床应用。相比较而言，非病毒载体，例如阳离子脂质体，聚合物和无机纳米颗粒能够传递siRNA，但它们仍然面临递送效率和安全问题。大多数非病毒递送纳米载体是阳离子或脂质体材料，它们具有过量的表面正电荷，通常会引起全身毒性，并且在体内选择性较低。此外，血脑屏障和低的药物释放效率也限制了药物的治疗效果。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种siRNA纳米胶囊，以至少缓解了现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供上述siRNA纳米胶囊在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明的第三个目的在于提供上述siRNA纳米胶囊的制备方法。
本发明提供了一种siRNA纳米胶囊，包括siRNA以及包封所述siRNA的壳，所述siRNA与所述壳通过静电结合连接；
所述壳主要由单体A和单体B聚合得到，在所述壳外还连接有靶向配体；
所述单体A能够与所述siRNA通过静电结合，包括一端带有双键的分子；
所述单体B包括用于增加肿瘤微环境敏感性的分子。
进一步的，所述单体A包括胍基丙烯酸酯、丙烯酸精胺或N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺；
优选地，所述用于增加肿瘤微环境敏感性的分子包括增加还原敏感性的分子、增加酸敏感性的分子或增加ROS响应的分子，优选增加还原敏感性的分子；
优选地，所述增加还原敏感性的分子包括含有二硫键的分子，更优选包括双胱胺丙烯酰胺；
优选地，所述单体B还包括用于连接靶向配体的分子；
优选地，所述用于连接靶向配体的分子一端与用于增加肿瘤微环境敏感性的分子相连，另一端连接有靶向配体，优选包括丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯、丙烯酸酯聚乙二醇马来酰亚胺或丙烯酸酯透明质酸琥珀酰甲酯；
优选地，所述靶向配体包括Angiopep-2、RGD肽、apolipoprotein E或transferrin，优选为Angiopep-2。
本发明还提供了上述的siRNA纳米胶囊在制备治疗肿瘤的药物中的应用；
优选地，所述肿瘤为胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌或宫颈癌。
此外，本发明还提供了上述的siRNA纳米胶囊的制备方法，包括使与siRNA静电结合的单体A与单体B发生聚合反应，得到壳，再在所述壳上连接靶向配体，得到所述siRNA纳米胶囊；
所述单体A包括一端带有双键的分子；
所述单体B包括用于增加肿瘤微环境敏感性的分子以及用于连接靶向配体的分子。
进一步的，将siRNA与单体A混合后，再加入单体B，在引发剂和任选地催化剂的作用下使siRNA表面的自由基发生聚合反应，形成包封所述siRNA的壳；
优选地，所述单体A包括胍基丙烯酸酯、丙烯酸精胺或N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺；
优选地，所述用于增加肿瘤微环境敏感性的分子包括增加还原敏感性的分子、增加酸敏感性的分子或增加ROS响应的分子，优选增加还原敏感性的分子；
优选地，所述增加还原敏感性的分子包括含有二硫键的分子，更优选包括双胱胺丙烯酰胺；
优选地，所述单体B还包括用于连接靶向配体的分子；
优选地，所述用于连接靶向配体的分子一端与用于增加肿瘤微环境敏感性的分子相连，另一端连接有靶向配体，优选包括丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯、丙烯酸酯聚乙二醇马来酰亚胺或丙烯酸酯透明质酸琥珀酰甲酯；
优选地，所述靶向配体包括Angiopep-2、RGD肽、apolipoprotein E或transferrin，优选为Angiopep-2；
优选地，所述引发剂包括过硫酸铵，优选为0.05％-0.2％w/v的过硫酸铵溶液，更优选为0.1％w/v的过硫酸铵溶液；
优选地，所述催化剂包括N，N，N'，N'-四甲基乙二胺，优选为0.2％-0.8％w/v的N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液，更优选为0.5％w/v的N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液。
进一步的，将siRNA与胍基丙烯酸酯混合后，再加入双胱胺丙烯酰胺和丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯，在过硫酸铵和N，N，N'，N'-四甲基乙二胺的作用下使siRNA表面的自由基发生聚合反应，形成包封所述siRNA的壳；
优选地，混合后siRNA与胍基丙烯酸酯的摩尔比为1:200-250，优选为1:220；
优选地，胍基丙烯酸酯、双胱胺丙烯酰胺与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为3-8:3-8:1，优选为5:5:1。
进一步的，通过搅拌的方式将siRNA与胍基丙烯酸酯混合；
优选地，所述搅拌包括如下条件中的至少一个：
时间为10-20分钟，温度为20-25℃；
优选搅拌的时间为15分钟，温度为20-25℃。
进一步的，所述聚合反应包括如下条件中的至少一个：
在无氧环境下进行，温度为0-5℃，时间为25-35分钟；
优选聚合反应在无氧环境下进行，温度为0℃，时间为30分钟。
进一步的，在形成壳后加入靶向配体进行连接反应，得到所述siRNA纳米胶囊；
优选地，所述靶向配体包括Angiopep-2；
优选地，所述Angiopep-2与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为2-5:1，优选为3:1；
优选地，所述连接反应包括如下条件中的至少一个：
温度为20-25℃，时间为1.8-2.2小时；
优选连接反应的温度为20-25℃，时间为2小时。
进一步的，向500μL siRNA水溶液中加入10μL胍基丙烯酸酯，在20-25℃下搅拌15分钟，得到siRNA与胍基丙烯酸酯的摩尔比为1:220的混合液；向所述混合液中加入20μL双胱胺丙烯酰胺和90μL丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯，使胍基丙烯酸酯、双胱胺丙烯酰胺与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为5:5:1，然后加入20μL的0.1％过硫酸铵溶液和10μL的0.5％N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液，在0℃的无氧环境下进行30分钟聚合反应后，加入45μg Angiopep-2并在20-25℃下进行2小时连接反应，得到siRNA纳米胶囊；所述Angiopep-2与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为3:1；
优选地，在连接反应后还包括除杂的步骤，然后得到siRNA纳米胶囊；
优选地，通过截留分子量10kDa进行除杂。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的siRNA纳米胶囊包括siRNA以及包封所述siRNA的由单体A和单体B聚合得到的壳。其中，单体A能够与siRNA通过静电结合，一方面使得单体B与单体A聚合后能够自然形成包封siRNA的壳，实现近100％的siRNA包封，最大程度上保护siRNA免受降解；另一方面也更有利于siRNA的浓缩，实现了小尺寸的siRNA纳米胶囊，增加细胞膜穿透率。其中单体A一端带有双键，能够与其他单体进行有效连接，增加纳米胶囊的稳定性。
(2)通过引入用于增加肿瘤微环境敏感性的分子能够增强本发明提供的siRNA纳米胶囊的肿瘤微环境敏感性，为siRNA纳米胶囊在病灶部位的触发释放提供了便利条件，提高siRNA的释放效率。
(3)本发明将靶向配体连接在siRNA纳米胶囊表面，从而赋予本发明提供的siRNA纳米胶囊靶向能力，使其具有更高的递送效率。
(4)相比于现有的递送载体，本发明提供的siRNA纳米胶囊同时具有良好的生物相容性和生物安全性，有潜力在临床中广泛应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的siRNA纳米胶囊制备、有效的血脑屏障渗透、高度特异性的GBM靶向、响应性药物释放和基因沉默的图解；
图2为本发明实施例1提供的siRNA纳米胶囊的DLS测试结果图；
图3为本发明实验例1提供的流式细胞实验结果图；
图4为本发明实验例1提供的CLSM实验结果图；
图5为本发明实验例1提供的MTT实验结果图；
图6为本发明实验例2提供的药代动力学实验结果图；
图7为本发明实验例2提供的体内成像结果图；
图8A为本发明实验例2提供的Lumina IVIS III近红外荧光成像系统采集到的生物分布结果图；
图8B为本发明实验例2提供的生物分布柱状结果图；
图9为本发明实验例2提供的对于荷瘤小鼠的体内治疗效果的结果图；
图10位本发明实验例2提供的H&E染色的组织学分析结果图。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
根据本发明的一个方面，提供了一种siRNA纳米胶囊，包括siRNA以及包封所述siRNA的壳，所述siRNA与所述壳通过静电结合连接；
所述壳主要由单体A和单体B聚合得到，在所述壳外还连接有靶向配体；
所述单体A能够与所述siRNA通过静电结合，包括一端带有双键的分子；
所述单体B包括用于增加肿瘤微环境敏感性的分子。
siRNA
小干扰RNA(siRNA)能够特异性及直接调控靶基因的表达同时具有极低的细胞毒性，因此被认为是治疗各类恶性肿瘤的有效手段。当用于治疗GBM时，所述siRNA可以选自PLK1、Bcl-2，VEGFR2或PDL1等。
靶向配体
靶向配体能够通过肿瘤细胞过表达的受体介导内吞，选择性地浓集定位于靶组织、靶器官、靶细胞的分子结构，在本发明提供的siRNA纳米胶囊的壳外连接靶向配体，能够赋予siRNA纳米胶囊主动靶向能力，使其具有更高的递送效率，更有助于提高所需siRNA在靶点的聚集量，同时避免被健康组织吞噬及引发损伤，提高生物安全性。可选地，靶向配体包括Angiopep-2、RGD肽、apolipoprotein E或transferrin。
血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的存在使得药物很难到达人脑胶质瘤部位，使其成为癌症治疗中最棘手的肿瘤之一。BBB，其为脑补的自我平衡防御机制，一方面，它保证中枢神经系统免受外来物质侵扰，维持高效的稳态，同时为脑内输入营养物质；另一方面，BBB的致密结构也阻碍了治疗药物通过非入侵性给药进入脑内。由于BBB内皮细胞和GBM组织均高表达受体相关蛋白1(LRP-1)，当应用本发明提供的siRNA纳米胶囊用于治疗GBM时，靶向配体优选为Angiopep-2。将特定的LRP-1配体Angiopep-2偶联在本发明提供的siRNA纳米胶囊表面上，Angiopep-2(ANG)修饰的siRNA纳米胶囊可与脑内皮细胞及脑胶质瘤细胞上过度表达的低密度脂蛋白(LRP)受体特异性结合，靶向脑胶质瘤细胞的同时，也可显著增强siRNA纳米胶囊的BBB渗透性。
单体A
本发明中siRNA纳米胶囊的壳由单体A和单体B聚合得到，单体A与siRNA通过静电结合，一方面使得单体B与单体A聚合后能够自然形成包封siRNA的壳，实现近100％的siRNA包封，最大程度上保护siRNA免受降解；另一方面也更有利于siRNA的浓缩，实现了小尺寸的siRNA纳米胶囊，增加细胞膜穿透率。特别是单体A一端带有双键能够连接其他的单体，增强纳米胶囊的稳定性。
在一些优选的实施方式中，所述单体A包括胍基丙烯酸酯、丙烯酸精胺或N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺。上述单体A均带有正电，有利于细胞的内吞。
需要说明的是，胍基丙烯酸酯为发明人实验室自制得到，其具有如式I所示的分子结构：
Figure BDA0002459853140000091
单体B
传统的纳米药物载体一般靠扩散或者聚合物的水解而缓慢释放抗癌药物，这样会降低抗癌药物对癌细胞的毒性同时增加癌细胞对药物的耐药性，降低药物的治疗效果。因此，本发明通过单体B引入用于增加肿瘤微环境敏感性的分子，增强本发明提供的siRNA纳米胶囊的肿瘤微环境敏感性，为siRNA纳米胶囊在病灶部位的触发释放提供了便利条件，提高siRNA的释放效率。
需要说明的是，本发明对增加肿瘤微环境敏感性的分子的具体选择不做限定，例如可以为，但不限于增加温度敏感性的分子、增加pH敏感性的分子、增加还原敏感性的分子、增加酶敏感性的分子或增加物理信号刺激敏感性的分子。
在一些优选的实施方式中，单体B包括增加还原敏感性的分子。谷耽甘肽(GSH)能使二硫键断裂，从而达到药物释放的目的。癌症组织中的谷胱甘肽浓度比正常组织的高4倍多。这种差别为抗癌纳米药物在病灶部位的触发释放提供了便利条件。因此，当应用本发明提供的siRNA纳米胶囊用于治疗癌症时，单体B优选包括含有二硫键的分子。当选择双胱胺丙烯酰胺作为单体B时，能够有效实现环境响应性释放药物。
需要说明的是，双胱胺丙烯酰胺具有如式II所示的分子结构：
Figure BDA0002459853140000101
在本发明中，用于增加肿瘤微环境敏感性的分子可以直接与靶向配体相连，也可以通过用于连接靶向配体的分子与靶向配体相连。优选通过用于连接靶向配体的分子与靶向配体相连。在一些优选的实施方式中，所述用于连接靶向配体的分子一端与用于增加肿瘤微环境敏感性的分子相连，另一端连接有靶向配体。靶向配体例如可以为，但不限于丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯、丙烯酸酯聚乙二醇马来酰亚胺或丙烯酸酯透明质酸琥珀酰甲酯。优选地，选择丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯作为用于连接靶向配体的分子，具有提高纳米胶囊稳定性、延长血液循环时间、有利于靶向分子的修饰等优势。
需要说明的是，丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯具有如式III所示的分子结构：
Figure BDA0002459853140000102
基于本发明提供的新颖的自包封方式，使相比于现有的递送载体，本发明提供的siRNA纳米胶囊得包封率更高、尺寸更小，具有强靶向性的同时，还具有良好的生物相容性和生物安全性，有潜力在临床中广泛应用。
具体地，当单体A为胍基丙烯酸酯、单体B为双胱胺丙烯酰胺和丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯、且靶向配体为Angiopep-2时，siRNA分子通过二硫键(SS)交联自形成的壳被封装，以保护siRNA免受降解，在大量谷胱甘肽(GSH)的情况下能够触发细胞内siRNA释放在细胞质中，将特定的LRP-1配体Angiopep-2偶联在壳的表面上，以促进BBB渗透和GBM肿瘤组织的靶向。重要的是，通过这种新颖的自包封策略，实现了小尺寸的siRNA纳米胶囊和近100％的siRNA包封，导致高效的siRNA BBB渗透和GBM RNAi治疗。本实施方式提供的siRNA纳米胶囊的脑传递能力和GBM RNAi效应已在体外和体内进行了系统评估，结果表明，它可以有效地渗透BBB，被U87MG GBM细胞主动内化，并能将siRNA响应性地释放到细胞质，实现特异性基因敲除。此外，本实施方式提供的siRNA纳米胶囊还可以通过抑制抑癌基因达到诱导强效抗GBM的作用，并延长原位人源GBM异种移植小鼠的存活时间，且几乎没有毒副作用。这些大脑靶向响应性siRNA纳米胶囊具有出色的RNAi递送能力、基因沉默和优异的生物相容性，使其对GBM治疗展现出较大的潜力。
根据本发明的第二个方面，本发明还提供了上述siRNA纳米胶囊在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
优选地，当选择特定的单体A、单体B和靶向配体，如胍基丙烯酸酯、双胱胺丙烯酰胺、丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯和Angiopep-2时，本发明提供的siRNA纳米胶囊可以用于制备治疗胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌或宫颈癌，对U87MG、A549、Hela和X01等细胞系均有良好的抑制作用。
根据本发明的第三个方面，还提供了上述siRNA纳米胶囊的制备方法，包括使与siRNA静电结合的单体A与单体B发生聚合反应，得到壳，再在所述壳上连接带有靶向配体的聚合终止剂，得到所述siRNA纳米胶囊；
所述单体A包括一端带有双键的分子；
所述单体B包括用于增加肿瘤微环境敏感性的分子以及用于连接靶向配体的分子。
本发明提供的制备方法工艺简单、操作方便，利用单体A与siRNA的静电结合作用及单体B与单体A的聚合作用即可制备得到包封率更高、尺寸更小，具有强靶向性的同时，还具有良好的生物相容性和生物安全性的siRNA纳米胶囊。
在一些优选的实施方式中，将siRNA与单体A混合后，再加入单体B，在引发剂和任选地催化剂的作用下使siRNA表面的自由基发生聚合反应，形成包封所述siRNA的壳。
当同时选择引发剂和催化剂参与聚合反应时，反应速率更高，能够有效节约时间成本。
优选地，引发剂包括过硫酸铵，优选为0.05％-0.2％w/v的过硫酸铵溶液，例如可以为，但不限于0.05％w/v的过硫酸铵溶液、0.1％w/v的过硫酸铵溶液、0.15％w/v的过硫酸铵溶液或0.2％w/v的过硫酸铵溶液，更优选为0.1％w/v的过硫酸铵溶液；优选地，所述催化剂包括N，N，N'，N'-四甲基乙二胺，优选为0.2％-0.8％w/v的N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液，例如可以为，但不限于0.2％w/v的N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液、0.3％w/v的N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液、0.4％w/v的N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液、0.5％w/v的N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液、0.6％w/v的N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液、0.7％w/v的N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液或0.8％w/v的N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液，更优选为0.5％w/v的N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液。选择特定浓度的特定引发剂和催化剂，能够进一步提高聚合反应的反应速率。
具体地，将siRNA与胍基丙烯酸酯混合后，再加入双胱胺丙烯酰胺和丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯，在过硫酸铵和N，N，N'，N'-四甲基乙二胺的作用下使siRNA表面的自由基发生聚合反应，形成包封所述siRNA的壳。
优选地，混合后siRNA与胍基丙烯酸酯的摩尔比为1:200-250，例如可以为，但不限于1:200、1:210、1:220、1:230、1:240或1:250，优选为1:220；优选地，胍基丙烯酸酯、双胱胺丙烯酰胺与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为(3-8):(3-8):1，例如可以为，但不限于3:3:1、8:8:1、3:8:1、8:3:1或5:5:1，优选为5:5:1。通过限定各原料的用量比，能够使得原料利用率更高，反应进行的更完全，从而在保证siRNA纳米胶囊质量的基础上，有效节约成本。
在一些优选的实施方式中，通过搅拌的方式将siRNA与胍基丙烯酸酯混合；
优选地，所述搅拌包括如下条件中的至少一个：
时间为10-20分钟，例如可以为，但不限于10分钟、12分钟、15分钟、18分钟或20分钟；温度为20-25℃，例如可以为，但不限于20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃；优选搅拌的时间为15分钟，温度为20-25℃。通过对siRNA与胍基丙烯酸酯的混合条件进行进一步的优化，能够使siRNA与胍基丙烯酸酯的静电结合更充分，提高原料利用率，节约成本。
在一些优选的实施方式中，所述聚合反应包括如下条件中的至少一个：
在无氧环境下进行；温度为0-5℃，例如可以为，但不限于0℃、1℃、2℃、3℃、4℃或5℃；时间为25-35分钟，例如可以为，但不限于25分钟、28分钟、30分钟、32分钟或35分钟；优选聚合反应在无氧环境下进行，温度为0℃，时间为30分钟。其中可以通过置换稀有气体或氮气获得无氧环境，优选使用氮气，成本更低。通过对聚合反应的条件进行调整和优化，能够使聚合反应更充分，提高反应效率。
在一些优选的实施方式中，在形成壳后加入靶向配体进行连接反应，得到所述siRNA纳米胶囊；
优选地，所述靶向配体包括Angiopep-2；
优选地，所述Angiopep-2与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为2-5:1，例如可以为，但不限于2:1、3:1、4:1或5:1，优选为3:1。
优选地，所述连接反应包括如下条件中的至少一个：
温度为20-25℃，例如可以为，但不限于20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃；时间为1.8-2.2小时，例如可以为，但不限于1.8小时、1.9小时、2小时、2.1小时或2.2小时；优选连接反应的温度为20-25℃，时间为2小时。
通过对靶向配体与用于连接靶向配体的聚合物的用量及连接反应的条件进行优化限定，能够使连接反应进行的更完全，有效保证制备得到的siRNA纳米胶囊的靶向性。
在一些具体的实施方式中，向500μL siRNA水溶液中加入10μL胍基丙烯酸酯，在20-25℃下搅拌15分钟，得到siRNA与胍基丙烯酸酯的摩尔比为1:220的混合液；向所述混合液中加入20μL双胱胺丙烯酰胺和90μL丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯，使胍基丙烯酸酯、双胱胺丙烯酰胺与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为5:5:1，然后加入20μL的0.1％过硫酸铵溶液和10μL的0.5％N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液，在0℃的无氧环境下进行30分钟聚合反应后，加入45μg Angiopep-2并在20-25℃下进行2小时连接反应，得到siRNA纳米胶囊；所述Angiopep-2与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为3:1。在上述具体的反应条件下，各原料的利用率更高，各反应进行得更充分，制备得到的siRNA纳米胶囊包封率更高、靶向性更好，能够有效穿透BBB并对GBM起到治疗作用。反应过程如图1所示。
优选地，在连接反应后还包括除杂的步骤，然后得到siRNA纳米胶囊；
优选地，通过截留分子量10kDa进行除杂，除去未反应的单体。优选地，可以使用截留分子量10kDa的离心过滤器进行除杂。优选使用PBS进行超滤，将原反应溶液交换为PBS。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明实施例中用到的主要试剂信息如下：
胍基丙烯酸酯引用文献ROS-Responsive Polymeric siRNA NanomedicineStabilized by Triple Interactions for the Robust Glioblastoma CombinationalRNAi Therapy合成；
双丙烯胱胺(sigma)；
丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯(键凯)；
Angiopep-2(强耀)。
实施例1
本实施例提供了一种siRNA纳米胶囊，通过如下方法制备得到：
向500μL siRNA水溶液中加入10μL胍基丙烯酸酯，在20-25℃下搅拌15分钟，得到siRNA与胍基丙烯酸酯的摩尔比为1:220的混合液；向所述混合液中加入20μL双胱胺丙烯酰胺和90μL丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯，使胍基丙烯酸酯、双胱胺丙烯酰胺与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为5:5:1，然后加入20μL的0.1％过硫酸铵溶液和10μL的0.5％N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液，在0℃的无氧环境下进行30分钟聚合反应后，加入45μg Angiopep-2并在20-25℃下进行2小时连接反应，得到siRNA纳米胶囊；所述Angiopep-2与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为3:1。
实施例2
本实施例提供了一种siRNA纳米胶囊，通过如下方法制备得到：
向500μL siRNA水溶液中加入10μL胍基丙烯酸酯，在20-25℃下搅拌10分钟，得到siRNA与胍基丙烯酸酯的摩尔比为1:220的混合液；向所述混合液中加入20μL双胱胺丙烯酰胺和90μL丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯，使胍基丙烯酸酯、双胱胺丙烯酰胺与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为5:5:1，然后加入20μL的0.05％过硫酸铵溶液和10μL的0.8％N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液，在5℃的无氧环境下进行25分钟聚合反应后，加入45μg Angiopep-2并在20-25℃下进行2.2小时连接反应，得到siRNA纳米胶囊；所述Angiopep-2与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为3:1。
实施例3
本实施例提供了一种siRNA纳米胶囊，通过如下方法制备得到：
向500μL siRNA水溶液中加入10μL胍基丙烯酸酯，在20-25℃下搅拌20分钟，得到siRNA与胍基丙烯酸酯的摩尔比为1:220的混合液；向所述混合液中加入20μL双胱胺丙烯酰胺和90μL丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯，使胍基丙烯酸酯、双胱胺丙烯酰胺与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为5:5:1，然后加入20μL的0.2％过硫酸铵溶液和10μL的0.2％N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液，在2℃的无氧环境下进行35分钟聚合反应后，加入45μg Angiopep-2并在20-25℃下进行1.8小时连接反应，得到siRNA纳米胶囊；所述Angiopep-2与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为3:1。
实施例4
本实施例提供了一种siRNA纳米胶囊，其制备方法与实施例1的不同之处仅在于siRNA与胍基丙烯酸酯的摩尔比为1:200。
实施例5
本实施例提供了一种siRNA纳米胶囊，其制备方法与实施例1的不同之处仅在于siRNA与胍基丙烯酸酯的摩尔比为1:250。
实施例6
本实施例提供了一种siRNA纳米胶囊，其制备方法与实施例1的不同之处仅在于siRNA与胍基丙烯酸酯的摩尔比为1:180。
实施例7
本实施例提供了一种siRNA纳米胶囊，其制备方法与实施例1的不同之处仅在于胍基丙烯酸酯、双胱胺丙烯酰胺与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为3:3:1。
实施例8
本实施例提供了一种siRNA纳米胶囊，其制备方法与实施例1的不同之处仅在于胍基丙烯酸酯、双胱胺丙烯酰胺与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为8:8:1。
实施例9
本实施例提供了一种siRNA纳米胶囊，其制备方法与实施例1的不同之处仅在于胍基丙烯酸酯、双胱胺丙烯酰胺与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为2:10:1。
实施例10
本实施例提供了一种siRNA纳米胶囊，其制备方法与实施例1的不同之处仅在于Angiopep-2与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为2:1。
实施例11
本实施例提供了一种siRNA纳米胶囊，其制备方法与实施例1的不同之处仅在于Angiopep-2与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为5:1。
实施例12
本实施例提供了一种siRNA纳米胶囊，其制备方法与实施例1的不同之处仅在于Angiopep-2与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为1:1。
实施例13
本实施例提供了一种siRNA纳米胶囊，其制备方法与实施例1的不同之处仅在于将胍基丙烯酸酯替换为丙烯酸精胺。
实施例14
本实施例提供了一种siRNA纳米胶囊，其制备方法与实施例1的不同之处仅在于将胍基丙烯酸酯替换为N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺。
实施例15
本实施例提供了一种siRNA纳米胶囊，其制备方法与实施例1的不同之处仅在于将丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯替换为丙烯酸酯聚乙二醇马来酰亚胺。
实施例16
本实施例提供了一种siRNA纳米胶囊，其制备方法与实施例1的不同之处仅在于将丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯替换为丙烯酸酯透明质酸琥珀酰甲酯。
对比例1
本对比例提供了一种siRNA纳米胶囊，其制备方法与实施例1的不同之处仅在于不包括连接靶向配体的步骤。
对比例2
本对比例提供了一种siRNA纳米胶囊，其制备方法与实施例1的不同之处仅在于将双胱胺丙烯酰胺替换为1,6-己二醇二甲基丙烯酸酯。
对比例3
现有商业化转染试剂Lipo2000。
为了验证本发明各实施例及对比例提供的siRNA纳米胶囊的效果，进行如下实验例：
实验例1细胞实验
①流式细胞仪及共聚焦显微镜表征细胞内吞和细胞内释放
在流式细胞仪测试中，将U87MG细胞种在6孔细胞培养板内(1×106细胞/孔)在37℃培养24小时后，加入500μL的实施例1-13级对比例1-3提供的siRNA纳米胶囊的PBS溶液(200nM Cy5-siRNA)孵育4小时，吸走样品，用500μL胰酶消化细胞。得到的细胞悬浮液在1000×g离心3分钟，用PBS洗两次，再次分散在500μL PBS，1小时内进行流式细胞仪(BDFACS Calibur，Becton Dickinson,USA)测试，用Cell Quest软件圈取10000个细胞获得。其中竞争性抑制实验是先用游离Ang(200μg/mL)对U87MG细胞进行预处理4h，然后加入实施例1提供的siRNA纳米胶囊。
细胞内吞及细胞内药物释放行为通过CLSM照片观察得到。将U87MG细胞铺于含显微镜载玻片的24孔细胞培养板里(1×105细胞/孔)培养24小时后，加入50μL的实施例1-13级对比例1-3提供的siRNA纳米胶囊的PBS溶液(200nM Cy5-siRNA)。孵育4小时后，将培养基移除用PBS清洗两遍。用溶酶体红色荧光探针(150nmol/L)染溶酶体1h，PBS清洗两次。4％的多聚甲醛固定15min，PBS清洗两次。Hoechst 33342染细胞核15分钟后清洗两次。荧光图片由CLSM(TCS SP5)拍摄获得。
通过实验对各组siRNA纳米胶囊在U87MG细胞中的细胞内吞和细胞内释放进行验证，结果如下表所示：
组别 细胞摄取 细胞内释放 组别 细胞摄取 细胞内释放
实施例1 170％ 155％ 实施例11 65％ 58％
实施例2 165％ 143％ 实施例12 58％ 43％
实施例3 168％ 149％ 实施例13 55％ 41％
实施例4 142％ 122％ 实施例14 74％ 59％
实施例5 128％ 102％ 实施例15 62％ 40％
实施例6 52％ 47％ 实施例16 70％ 52％
实施例7 90％ 76％ 对比例1 47％ 36％
实施例8 92％ 67％ 对比例2 28％ 20％
实施例9 85％ 50％ 对比例3 108％ 92％
实施例10 63％ 49％
从表中数据可以看出，本发明实施例1-16提供的siRNA纳米胶囊的细胞摄取及细胞内释放结果均优于对比例，说明本发明提供的siRNA纳米胶囊具有良好的靶向性及响应性释放的能力。其中，实施例1-5、7-8及10-11的效果均优于实施例6、9、12和13，说明应用本发明优选范围内的制备条件制备得到的siRNA纳米胶囊具有更好的靶向性及响应性释放的能力。实施例1的效果最好，说明通过对条件参数的进一步调整和优化，能够进一步提升siRNA纳米胶囊的靶向性及响应性释放的能力。将实施例1制备得到的siRNA纳米胶囊由DLS测试可知，纳米粒径分布均一，大小为25.3nm。电位为5.3mv，如图2所示。
为了节约实验成本，本发明以下实验例均选择效果最好的实施例1(Ang-NCss(siRNA))、不含有靶向配体的对比例1(NCss(siRNA))及不引入用于增加肿瘤微环境敏感性的分子的对比例2(Ang-NC(siRNA))进行。
流式细胞实验(图3)表明Cy5标记的Ang-NCss(siRNA)在U87MG细胞中的细胞摄取最好，分别是Ang-NC(siRNA)和NCss(siRNA)2.4倍和1.9倍。并且，用游离Ang对U87MG细胞进行预处理可显着降低Ang-NCss(siRNA)的细胞摄取，从而证实这些纳米胶囊对U87MG细胞具有主动的靶向能力。
CLSM(图4)结果显示，与Ang-NCss(siRNA)孵育的U87MG细胞表现出较强的胞质荧光，并在4h时可从内涵体逃逸，这证实了已开发的Ang-NCss(siRNA)的有效细胞摄取和响应性的胞内siRNA释放。经非靶向NCss(siRNA)和非还原性Ang-NC(siRNA)处理的细胞的荧光明显较少，在裸siRNA孵育的细胞中几乎没有检测到荧光。这证实了，Ang-NCss(siRNA)能够在Ang的帮助下通过主动内吞作用有效地靶向U87MG细胞，并且还能够在细胞内环境中将siRNA负载有效释放到细胞质中。
②体外细胞毒性测定
为了进行细胞毒性试验，将U87MG细胞接种在96孔板中(5×103细胞/孔)，并在含有10％FBS(100μL)的DMEM中孵育24小时。此后，将培养基替换为含有Ang-NCss(siRNA)，NCss(siRNA)，Ang-NC(siRNA)(siRNA 200nM，400nM)的新鲜培养基，并将细胞进一步孵育48小时。然后，加入10μL 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)溶液(5mg/mL)，并将样品在37℃下进一步孵育4h。除去培养基，并添加150μL二甲基亚砜(DMSO)以溶解由活细胞形成的MTT-甲瓒晶体。使用酶标仪在570nm处检测吸收值。通过将570nm处的吸光度与用PBS处理的细胞进行比较来确定相对细胞活力。每个实验数据平行做四组(n＝4)。
MTT(图5)分析表明，浓度为200nM或400nM的siRNA纳米胶囊，包括Ang-NCss(siRNA)，NCss(siRNA)和Ang-NC(siRNA)，对U87MG细胞无毒，表明它们具有良好的生物相容性。
实验例2动物实验
①药代动力学研究
将200μL的Ang-NCss(siRNA)，NCss(siRNA)，Ang-NC(siRNA)和naked siRNA(1mg/kg Cy5-siRNA)通过尾静脉静脉注射到裸鼠中(n＝3)。在注射后的规定时间点，从裸鼠的眼窝中取出～50μL血液。抽取后的血样立即溶解于0.1mL裂解缓冲液(1％Triton X-100)中，加入0.5mL DMSO中于R.T孵育过夜，然后离心(15k rpm，30分钟)来萃取Cy5-siRNA。荧光测定法测定上清液中的Cy5-siRNA的含量。通过使用Software Origin 8指数衰减2模型拟合实验数据，计算两个阶段(t1/2，α和t1/2，β)的半衰期。
药代动力学(图6)结果表明Ang-NCss(siRNA)半衰期(t1/2，β)46分钟，类似于NCss(siRNA)和Ang-NC(siRNA)。相比之下，裸露的siRNA快速被消除，半衰期短至5分钟。这些结果证实纳米粒子的生物相容性较好。
②BBB跨越作用及靶向性
将荷瘤小鼠随机分组，尾静脉注射200μL Ang-NCss(siRNA)，NCss(siRNA)，Ang-NC(siRNA)和naked siRNA(1mg/kg Cy5-siRNA)。静脉注射后在预定的时间点(0、1、2、4、8、12和24小时)使用近红外荧光成像系统(Lumina，IVIS III)扫描并分析荧光图像。
体内成像结果(图7)显示，Ang-NCss(siRNA)组观察到了强烈的Cy5荧光，并持续到24h。在NCss(siRNA)，Ang-NC(siRNA)和裸siRNA等对照组的小鼠中观察到相对较弱的荧光，说明其具有很好的靶向肿瘤的能力。
③生物分布
将荷瘤小鼠随机分组，尾静脉静脉注射Ang-NCss(siRNA)，NCss(siRNA)，Ang-NC(siRNA)和naked siRNA(1mg/kg Cy5-siRNA)。注射后4小时，处死荷瘤小鼠。收集，洗涤，干燥并称重心脏，肝脏，脾脏，肺，肾和脑等主要器官。用Lumina IVIS III近红外荧光成像系统采集荧光图像。为了量化主要器官Cy5-siRNA的积累量，0.6mL 1％Triton X-100在70KHZ下匀浆10分钟。然后加入0.9mL DMSO于R.T孵育过夜。离心(15k rpm，30分钟)后，通过荧光法测定上清液中的Cy5-siRNA，根据标准曲线计算计算每克组织的积累量(％ID/g)。
生物分布(图8A和图8B)结果显示，Ang-NCss(siRNA)组Cy5-siRNA在肿瘤中积累量6.69％(％ID/g)，显著高于free siRNA组。说明其具有很好的肿瘤积累的能力。
④Ang-NCss(siRNA)体内抗肿瘤效率
将小鼠随机分组，使用生物发光Lumina IVIS III系统进行光学成像。将荷瘤小鼠称重并随机分为六组(n＝7)：Ang-NCss(siPLK1)，Ang-NCss(siCtrl)，NCss(siPLK1)，Ang-NC(siPLK1)，裸siPLK1和PBS。每2天尾静脉注射，剂量为2mg/kg siRNA，治疗在第20天终止，并且每组随机选取一只小鼠做H&E和TUNEL等实验分析纳米药物治疗后小鼠各正常器官健康状况及肿瘤组织凋亡情况。为了跟踪U87MG-luc肿瘤增殖情况，在成像前10-15分钟腹膜内注射荧光素(150mg/kg)。
Ang-NCss(siRNA)在荷U87MG-luc的BALB/c裸鼠中的治疗实验结果显示，能显著抑制肿瘤增长。Ang-NCss(siCtrl)，free siPLK1和PBS组20天内体重明显减轻(约30％)。相比较下，Ang-NCss(siRNA)治疗的小鼠体重变化微小，说明载药纳米粒子毒副作用小。Ang-NCss(siPLK1)显著延长了小鼠的存活时间，中位存活时间长达42天，Ang-NCss(siCtrl)，free siPLK1和PBS均在28天内死亡(结果如图9所示，其中a为U87MG-luc的生物荧光，b为不同纳米粒子的相对光子量，c为小鼠治疗过程的体重变化，d为存活率)。由H&E染色的组织学分析结果证明，Ang-NCss(siPLK1)对心、肝、肾在内的主要器官危害很小(图10)。结果再次说明Ang-NCss(siPLK1)具有极低的系统毒性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (28)

1.一种siRNA纳米胶囊，其特征在于，包括siRNA以及包封所述siRNA的壳，所述siRNA与所述壳通过静电结合连接；
所述壳主要由单体A和单体B聚合得到，在所述壳外还连接有靶向配体；
所述单体A能够与所述siRNA通过静电结合，包括一端带有双键的分子；
所述单体B包括用于增加肿瘤微环境敏感性的分子；
所述单体A为胍基丙烯酸酯；
所述用于增加肿瘤微环境敏感性的分子为双胱胺丙烯酰胺；
所述单体B还包括用于连接靶向配体的分子；
所述用于连接靶向配体的分子一端与用于增加肿瘤微环境敏感性的分子相连，另一端连接有靶向配体，所述用于连接靶向配体的分子为丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯。
2.根据权利要求1所述的siRNA纳米胶囊，其特征在于，所述靶向配体包括Angiopep-2、RGD肽、apolipoprotein E或transferrin。
3.根据权利要求2所述的siRNA纳米胶囊，其特征在于，所述靶向配体为Angiopep-2。
4.权利要求1-3任一项所述的siRNA纳米胶囊在制备治疗肿瘤的药物中的应用；
所述肿瘤为胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌或宫颈癌。
5.权利要求1-3任一项所述的siRNA纳米胶囊的制备方法，其特征在于，包括使与siRNA静电结合的单体A与单体B发生聚合反应，得到壳，再在所述壳上连接靶向配体，得到所述siRNA纳米胶囊；
所述单体A包括一端带有双键的分子；
所述单体B包括用于增加肿瘤微环境敏感性的分子以及用于连接靶向配体的分子。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，将siRNA与单体A混合后，再加入单体B，在引发剂和任选地催化剂的作用下使siRNA表面的自由基发生聚合反应，形成包封所述siRNA的壳；
所述引发剂包括过硫酸铵；
所述催化剂包括N，N，N'，N'-四甲基乙二胺。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述引发剂为0.05%-0.2% w/v的过硫酸铵溶液。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述引发剂为0.1%w/v的过硫酸铵溶液。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述催化剂为0.2%-0.8% w/v的N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述催化剂为0.5%w/v的N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液。
11.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，将siRNA与胍基丙烯酸酯混合后，再加入双胱胺丙烯酰胺和丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯，在过硫酸铵和N，N，N'，N'-四甲基乙二胺的作用下使siRNA表面的自由基发生聚合反应，形成包封所述siRNA的壳。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，混合后siRNA与胍基丙烯酸酯的摩尔比为1:200-250。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，混合后siRNA与胍基丙烯酸酯的摩尔比为1:220。
14.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，胍基丙烯酸酯、双胱胺丙烯酰胺与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为3-8:3-8:1。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，胍基丙烯酸酯、双胱胺丙烯酰胺与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为5:5:1。
16.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，通过搅拌的方式将siRNA与胍基丙烯酸酯混合。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述搅拌包括如下条件中的至少一个：
时间为10-20分钟，温度为20-25℃。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，搅拌的时间为15分钟，温度为20-25℃。
19.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述聚合反应包括如下条件中的至少一个：
在无氧环境下进行，温度为0-5℃，时间为25-35分钟。
20.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，聚合反应在无氧环境下进行，温度为0℃，时间为30分钟。
21.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述靶向配体包括Angiopep-2。
22.根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述Angiopep-2与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为2-5:1。
23.根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，所述Angiopep-2与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为3:1。
24.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述连接靶向配体的反应包括如下条件中的至少一个：
温度为20-25℃，时间为1.8-2.2小时。
25.根据权利要求24所述的制备方法，其特征在于，连接反应的温度为20-25℃，时间为2小时。
26.根据权利要求5-25任一项所述的制备方法，其特征在于，向500 µL siRNA水溶液中加入10 µL胍基丙烯酸酯，在20-25℃下搅拌15分钟，得到siRNA与胍基丙烯酸酯的摩尔比为1:220的混合液；向所述混合液中加入20 µL双胱胺丙烯酰胺和90 µL丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯，使胍基丙烯酸酯、双胱胺丙烯酰胺与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为5:5:1，然后加入20 µL的0.1%过硫酸铵溶液和10 µL的0.5% N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液，在0℃的无氧环境下进行30分钟聚合反应后，加入45 µg Angiopep-2并在20-25℃下进行2小时连接反应，得到siRNA纳米胶囊；所述Angiopep-2与丙烯酸酯聚乙二醇琥珀酰羧甲酯的摩尔比为3:1。
27.根据权利要求26所述的制备方法，其特征在于，在连接反应后还包括除杂的步骤，然后得到siRNA纳米胶囊。
28.根据权利要求26所述的制备方法，其特征在于，通过截留分子量10 kDa进行除杂。
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