CN103193979A

CN103193979A - 含羟基交联聚合物的胍基化产物在基因传递中的应用

Info

Publication number: CN103193979A
Application number: CN2012100018133A
Authority: CN
Inventors: 董伟; 王伯良; 丰连东; 刘洋洋; 赵玉瑜; 谢阿明
Original assignee: Nanjing University of Science and Technology
Current assignee: Nanjing University of Science and Technology
Priority date: 2012-01-05
Filing date: 2012-01-05
Publication date: 2013-07-10

Abstract

本发明公开了用于输送核酸和其它生物活性剂的含羟基交联聚合物及其胍基化产物的制备方法和应用。具体为：以分子量为100-30000Da的线性或分枝状的聚乙烯亚胺或各种多胺基化合物与分子量为100-5000Da的各种含有二个或二个以上环氧基团的交联剂的一种或几种的复合物反应，合成出含羟基交联聚合物。同时还提供了新型胍基化试剂3-胍基丙醇丙烯酸酯或5-胍基戊醇丙烯酸酯的合成方法，采用这种胍基化试剂对前述含羟基交联聚合物或其它聚合物进行胍基化可以明显提高其基因转染效率，同时降低细胞毒性。本发明筛选出性能优异的聚合物其基因转染效率在A549，B16F10，3T3，U87等多种细胞系中的转染效率明显高于常规的商业化基因转染试剂，是一些低毒高效的非病毒基因转染载体。使用本发明制备的载体可以在体外实现对各种细胞的高效，低毒性的转染，在体内可实施高效,低毒性的局部给药，具有广泛的应用前景。

Description

含羟基交联聚合物的胍基化产物在基因传递中的应用

技术领域

本发明涉及聚乙烯亚胺及其类似物与含有二个或二个以上环氧基交联剂交联合成含羟基的交联聚合物的方法。同时还涉及具有一定链长的胍基化试剂，即3-胍基丙醇丙烯酸酯，5-胍基戊醇丙烯酸酯等的合成方法和采用这些试剂与聚乙烯亚胺或前述的交联聚合物反应制备胍基化聚合物的方法。

技术背景

早期人们发现，人类免疫缺陷病毒（HIV）1型的反式激活因子（TAT），具有穿透各种类型细胞膜的能力，可以极大提高HIV基因组的转录和复制水平。根据TAT功能，人们发现了一类具有细胞膜穿透能力的小分子多肽，称为细胞穿透肽（Cell Penetrating Peptides, CPPs），其长度一般不超过30个氨基酸且富含碱性氨基酸。它们具有强大的细胞膜穿透能力，几乎不受细胞类型的限制。更重要的是，将CPPs偶联到大分子物质上，CPPs能有效地携带这些物质进入细胞内（Eric Vives. Journal of Controlled Release. 2005; 109: 77–85. Bhawna Gupta, Tatiana S. Levchenko, Vladimir P. Torchilin. Adv Drug Deliv Rev. 2005; 57: 637– 651）。这类小分子多肽除TAT外，还包括Ant、VP22、Poly-lysine 和Poly-arginine 等。近年来研究发现，8-10个精氨酸构成的聚合物（Polyarginine）, 例如：R8（Octaarginine）－R10（Decaarginine）是一类细胞穿透能力较强的细胞穿透肽(Elena A. Goun, Rajesh Shinde, Karen W. Dehnert, Angie Adams-Bond, Paul A. Wender. Bioconjugate Chem. 2006;17: 787- 796. Lars T?nges, Paul Lingor, Roman Egle, Gunnar P.H. Dietz, Alfred Fahr and Mathias B?hr. RNA 2006; 12:1431–1438.)，其细胞穿透能力甚至超过原来最初发现的TAT等，因为精氨酸（Arginine）主要含有胍基，进一步研究发现人为设计的含有8－15个胍基的低分子量的聚合物也具较高的细胞穿透能力，因此获得高的细胞穿透能力不必具有肽结构或精氨酸结构，胍基才是重要的提高转染效率的基团(Elena A. Goun, Thomas H. Pillow, Lisa R. Jones, Jonathan B. Rothbard, and Paul A. Wender. ChemBioChem 2006, 7, 1497–1515)。

聚乙烯亚胺（PEI）是迄今为止转染效率较高的非病毒载体之一，目前经常被用来做为新的基因转染载体评价物，将新设计与新开发的基因转染载体与之比较。但它的高转染效率往往伴随着较大的细胞毒性。一般来说2000Da以下的聚乙烯亚胺无细胞毒性，但也没有转染效率(Gosselin M A, Guo W, Lee R J. Bioconjugate Chem. 2001, 12: 989–994. Godbey WT, Wu KK, Mikos AG. Proceed. Int. Symp. Control. Relat. Bioact. Mater. 1997, 25: 230–231)，25 kDa聚乙烯亚胺有较高的转染效率，但有较大的细胞毒性(Thomas M. and Klibanov A. M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99: 14640–14645)。以往的高效转染系统注意力主要集中在提高聚合物链的正电荷、分子量及支化度上，但正电荷过高会导致包裹了DNA/RNA后所形成的纳米颗粒过于紧密，被细胞内吞后无法在胞内打开释放DNA/RNA，分子量大会导致细胞毒性增加。因此许多研究致力于采用各种交联剂交联小分子的聚乙烯亚胺从而希望获得低细胞毒性的高效转染载体，有的交联剂含有可水解的酯键及体内易于断裂的S-S键等(Gosselin M A, Guo W, Lee R J. Bioconjugate Chem. 2001, 12: 989–994. Thomas M., Ge Q., Lu J. J. Pharmaceutical Research 2005; 22: 373–380)。这些方法明显地降低了细胞毒性和部分地提高了转染效率，但仍然不能满足使用的要求。近来采用组合化学合成方法合成出了大量的类似于PEI的聚β-氨基酯，对这些结构的化合物库进行结构与性能研究发现带有羟基的化合物的转染效率明显地高，而且进一步的研究发现带有羟基的类脂化合物的转染效率也较高，目前这类优选出的化合物已经用于体内的基因传递且取得了优异的效果(Jordan J. Green, Robert Langer, and Daniel G. Anderson A. Accounts of Chemical Research 2008; 41: 6749-759. Kevin T. Lovea, Kerry P. Mahonb, Christopher G. Levins, Kathryn A. Whitehead, William Querbes, J. Robert Dorkind, June Qind, William Cantleyd, Liu Liang Qind, Timothy Racied, Maria Frank-Kamenetskyd, Ka Ning Yipa,Rene Alvarezd, Dinah W.Y. Sahd, Antonin de Fougerollesd, Kevin Fitzgeraldd, Victor Kotelianskyd, Akin Akincd, Robert Langer, and Daniel G. Andersonb. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010；107(5):1864-9)。但由于这类分子结构中的胺基远远少于PEI，所以所得最优结构的聚合物必须进行末端的进一步的胺基化提高转染效率(Green J J, Zugates G T, Tedford N C. Adv Mate 2007, 19:2836–42)。基于对大量的文献的分析，我们认为在聚合物母链上带有羟基不仅可以改善其溶解性，而且可以提高转染效率，同时我们前期的采用简单结构的含有双环氧基团的脂肪族醇或酸的缩水甘油醚或酯交联剂交联小分子的PEI的探索实验已经证实，在PEI结构中引进羟基可以减低其细胞毒性，同时提高转染效率。所以本发明采用无细胞毒性的PEI或多胺基化合物与含有二个或二个以上环氧基交联剂反应合成羟基化聚乙烯亚胺，由于这种产物有足够的胺基，所以不进行端位氨化也可以有较高的转染效率，在此基础上进行胍基化可以大大地提高转染效率且减低毒性。本发明也采用本身无毒的分子量较小的PEI或多胺等类似结构的分子经合适的结构设计在一些合理的位点上偶联具有一定臂长的胍基，优化胍基数量和聚合物结构，筛选高效低毒的基因转染载体。

近年来许多研究者通过各种胍基化试剂将不同的聚合物胍基化，以期望提高聚合物的基因转染性能。

Tziveleka等人用1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐将四代聚丙烯亚胺树枝状聚合物胍基化，结果大大提高了树枝状聚合物的转染效率，其中胍基基团的数目，所用细胞系，以及血清存在与否都对转染效率有所影响。但是在任何条件下，完全胍基化的树枝状聚合物的转染效率都是最高的，这是因为树枝状聚合物表面富含胍基基团，从而提高了细胞穿透能力(Tziveleka L A, Psarra A G, Tsiourvas D. J Controlled Release. 2007, 117:137–146)。

Nimesh等人用O-甲基异脲半硫酸盐修饰了25kDa PEI，合成了不同取代比例(18%，37%，56%，74%)的PEI衍生物，他们认为胍基化有利于聚合物上的伯胺正电荷的分散，从而降低毒性。转染HEK293细胞系的结果表明，经过胍基化修饰的PEI的转染效率较商业试剂Lipofectin和25kDa PEI有所提高，且毒性下降，其中修饰度为56%时转染效果最好(Nimesh S, Chandra R. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2008, 68:647–655)。

Kim等人合成了具有生物还原性的胍基化聚合物(GBP)，他们首先通过N-叔丁氧羰基-1, 6-己二胺(N-Boc-DAH)和N, N-胱胺双丙烯酸酯(CBA)的麦克尔加成反应得到poly(CBA-DAH)，然后用1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐将poly(CBA-DAH)上的伯胺胍基化，得到GBP。实验结果表明，对于C2C12细胞系，GBP的转染效率几乎达到PEI25kDa的40倍，对于HEK293细胞系和HepG2细胞系，GBP的转染效率与PEI25kDa相当或略有提高。与未胍基化的poly(CBA-DAH)相比，在三种细胞系中，GBP的转染效率均高出8倍，因此GBP由于胍基化而具有了很好的转染效率，作为基因载体具有很大的应用前途(Kima T, Lee M, Kima S W. Biomaterials. 2010, 31:1798–1804)。

对细胞穿透肽以及R8的研究表明，胍基基团是此类物质具有良好的细胞膜穿透功能的主要原因，而细胞摄取是非病毒基因载体取得较好转染效率的一大障碍，因此我们希望将胍基基团偶联到非病毒载体骨架上，从而赋予载体很好的细胞膜穿透能力，以提高转染效率。此外，胍基基团还能分散聚合物上伯胺的正电荷，从而降低载体的毒性。目前市场上销售的胍基化试剂，如前所述的1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐、O-甲基异脲半硫酸盐等都是将胍基基团直接偶联到聚合物上，不能伸出一定的臂长，而对精氨酸及其类似物的结构研究发现胍基基团与聚合物骨架通过一定长度的碳链连接有利于提高转染性能。以往的研究都是在分子量较大的PEI或树枝状聚合物（20kDa以上）上直接将胺基转化成胍基，尽管这样可以提高转染效率，但仍然表现出了明显的细胞毒性。八个精氨酸的均聚物的小分子量化合物表现出来的高的细胞穿透能力提示我们几千分子量的化合物也可以有高的细胞转染能力。因此，我们设计合成了具有一定链长的胍基化试剂，并用它们修饰无细胞毒性的2000分子量的PEI聚合物，也用它修饰所合成的带有羟基的交联聚合物，从而获得高性能的基因转染载体。

发明内容

本发明通过在一些无细胞毒性的多胺类化合物或聚合物中引入羟基和/或胍基，从而提高其基因转染效率，降低其细胞毒性。最终筛选出高效，低毒的基因转染载体。具体的发明目的如下。

(1) 采用PEI或各种多胺基化合物与交联剂反应合成含羟基的交联聚合物。

(2) 采用氨基保护的方法合成具有一定链长的胍基化试剂。

(3) 用所合成的胍基化试剂作为修饰剂修饰所合成的含羟基的交联聚合物，制得一系列的胍基化的交联聚合物。

(4) 对合成的交联聚合物（含羟基的交联聚合物或胍基化后的交联聚合物）进行基因转染实验，筛选出毒性较低，转染效率较高的基因运送载体。

实现本发明目的(1)的技术解决方案为：

将100-30000分子量的PEI，如分枝状的bPEI((600Da，1200Da，2000Da)或其类似的多胺基化合物与含有二个或二个以上环氧基的分子量为100-5000Da的交联剂反应合成含羟基的交联聚合物，所述的PEI或多胺基化合物如表1所示。

所述的交联剂是各种含有二个或二个以上环氧反应基团，同时其母链上带有脂环基、苯基、杂环基或S-S键的交联剂的一种或几种的复合物，如表2所示。

交联反应的温度15-90℃，优选的反应温度为25-50℃，优选30-45℃。为了控制产物的分子量，反应时间应视反应物的不同有所变化，PEI600（线性或分支状）与所述的几种交联剂交联时，反应时间为10小时以上，一般为15-20小时。PEI1200（线性或分支状）与所述的几种交联剂交联时，反应时间为8小时左右，一般为6-12小时。PEI2000（线性或分支状）与所述的几种交联剂交联时，反应时间为4小时左右，一般为3-8小时。其它的多胺化合物的交联反应时间为12小时以上，一般为18-24小时。反应的溶剂为：水、甲醇、二氯甲烷、THF或DMSO，优选为：二氯甲烷、THF或DMSO。胺类化合物与交联剂的比例为：0.1:1-5:1，优选为0.5:1-4:1。

与现有技术相比，这种交联聚合物基因转染效率在293，Hela，EL-4，A549，B16F10，3T3，U87等多种细胞系中的转染效率是25kDa PEI的3-11倍，具有比25kDa PEI更好的基因转染性能，同时由于这类交联产物具有羟基，所以其水溶性得到了改善，其细胞毒性均较低。

表1 本发明优选实施方案的多胺类化合物及小分子量的PEI的结构

表2 本发明优选实施方案中使用的交联剂分子结构

.

实现本发明目的(2)的技术解决方案为：胍基化试剂3-胍基丙醇丙烯酸酯或5-胍基戊醇丙烯酸酯的合成工艺路线为：硫脲在THF溶液中与NaH和二叔丁酯反应将硫脲的胺基进行Boc保护；产物在三乙胺和HgCl₂作用下与3-氨基丙醇/5-氨基戊醇在DMF中反应，获得Boc保护的3-胍基丙醇/5-胍基戊醇；最后与丙烯酰氯反应，获得所说的新型的胍基化试剂，Boc保护的3-胍基丙醇丙烯酸酯或5-胍基戊醇丙烯酸酯。

如图2所示，3-胍基丙醇丙烯酸酯或5-胍基戊醇丙烯酸酯的具体合成说明如下：

（1）以硫脲为原料合成Boc保护的硫脲，当然也可以采用其它胺基保护方法，但优选为Boc保护。该步反应温度为0℃以下，优选为-5℃-0℃。溶剂为二氯甲烷、THF、乙醚或DMF等，优选为乙醚或THF。反应时间为2-8小时，优选为2-4小时；

（2）Boc保护的硫脲与3-氨基丙醇/5-氨基戊醇反应合成Boc保护的3-胍基丙醇/5-胍基戊醇，该步反应温度为0℃以下，优选为-5℃-0℃。溶剂为二氯甲烷，乙醚，THF或DMF等，优选为DMF或THF。反应时间为3-10小时，优选为4-6小时；

（3）Boc保护的3-胍基丙醇/5-胍基戊醇与丙烯酰氯反应合成Boc保护的3-胍基丙醇丙烯酸酯或5-胍基戊醇丙烯酸酯，该步反应温度为0℃以下，优选为-5℃-0℃。溶剂为二氯甲烷、乙醚、THF或DMF等，优选为二氯甲烷或THF。反应时间为2-6小时，优选为2-3小时。

与现有技术相比，目前市场上销售的胍基化试剂都不具有一定的链长，用它们与聚合物反应只能将聚合物与胍基基团直接相连，而无法使胍基基团以一定的臂长与聚合物结合，采用精氨酸偶联到聚合物母链上，虽然可以使胍基基团以一定的臂长与聚合物结合，但精氨酸与聚合物的胺基反应活性较低，偶联困难，胍基化率低。本发明设计合成出了3-胍基丙醇丙烯酸酯，5-胍基戊醇丙烯酸酯，用它们修饰聚合物，反应活性高，可以使胍基基团以一定的臂长连接到聚合物骨架上，使胍基在空间结构上更加灵活，使其易于结合细胞膜或核膜上的基团，从而提高转染效率和降低细胞毒性。另外，胍基上有多个活泼的胺，由于胺能与双键共轭加成，3-胍基丙醇，5-胍基戊醇与丙烯酰氯反应时副反应较多，产物本身也容易发生自聚，因此本发明采用Boc酸酐(二碳酸二叔丁酯)保护法将胍基上的胺保护后与丙烯酰氯反应，大大减少了副反应的发生，提高了反应产率，且脱保护简单易行。

实现本发明目的(3)的技术解决方案为：采用上述胍基化试剂作为修饰剂修饰含羟基的交联聚合物后再进行脱Boc保护。

含羟基的交联聚合物在干燥的溶剂中与所合成的胍基化修饰剂，如Boc保护的3-胍基丙醇丙烯酸酯或5-胍基戊醇丙烯酸酯反应获得胍基化的含羟基的交联聚合物，该步反应温度为25-90℃下，优选为25℃-40℃。溶剂为二氯甲烷，乙醚，THF或DMF等，优选为二氯甲烷和THF。反应时间为6-48小时，优选为12-20小时。修饰剂与被修饰的含羟基的交联聚合物的摩尔比为0.1:1-10:1，优选为0.5:1-5:1。

胍基脱保护反应：上述的胍基化试剂修饰后的化合物在干燥的溶剂中，0℃以下，滴加三氟乙酸，然后升温至反应温度，继续搅拌几小时后，加入无水乙醚沉淀，洗涤，干燥，最终得到脱去Boc保护的胍基化产物。该步反应温度为20-50℃，优选为20℃-30℃。溶剂为二氯甲烷、乙醚、THF或DMF等，优选为二氯甲烷和THF。反应时间为2-18小时，优选为2-10小时。

采用所合成的胍基化试剂修饰所合成的含羟基交联聚合物后，分散了聚合物上伯胺的正电荷，从而降低载体的毒性，同时提高转染效率，特别是，胍基化的交联聚合物对一些较为难转染的细胞系如HepG2、3T3和Jurkat等有更为明显的效果。

实现本发明目的(4)的技术解决方案为：将所合成的含羟基的交联聚合物或其胍基化产物作为基因运送载体构成转染组合物用于细胞转染实验。

所述的基因转染组合物的制备方法如下：将所制得含羟基交联聚合物或胍基化的产物分别溶于PBS（140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, pH 7.4）中，配成1mg/ml的储备液。将质粒DNA（pEGFP-C1）用ddH₂O稀释为1mg/ml储备液。按一定的聚合物/DNA(质量比)配制转染复合物，例如配制聚合物/DNA=2:1的组合物，具体过程如下：取1μl核酸（如质粒DNA）的溶液（1mg/ml）溶于50 μl PBS中，轻轻混匀，再取2 μl 聚合物溶液溶于50μl PBS中，轻轻混匀，然后将二者混合，振荡10秒钟，室温静置10-15分钟，即可用于表征其性能和细胞转染的实验。这里所述的核酸可以是DNA、治疗基因、RNA、催化活性核酸、反义寡核苷酸或修饰的核酸等。

所述的核酸转染细胞的方法为：各种细胞培养在含10％新生牛血清的DMEM或RPMI1640培养液（含100 U/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素）中，并放置37℃，5％CO₂的孵箱中生长。各种合成的聚合物、PEI 25kDa或其它商品化的转染试剂与DNA的复合物与细胞接触，转染细胞的具体步骤如下：转染前24小时，取处于对数生长期的细胞，用含0.02% EDTA 和 0.25%胰蛋白酶消化液消化后以每孔1×10⁵个细胞接种于24孔板，每孔加0.5 ml完全培养液，将培养板移入孵箱，培养24小时。当细胞汇合度达到70-80％时，除去培液，采用前述方法制备转染复合物，具体为：取1μl质粒DNA的溶液（1mg/ml）溶于50 μl PBS中，轻轻混匀，再取2 μl所合成的聚合物溶液分散在50μl PBS中，轻轻混匀，然后将二者混合，振荡10秒钟，室温静置10-15分钟，然后加入900 μl含10％新生牛血清的DMEM培养液，混匀后得到共计1000 μl的转染液，然后加入24孔细胞培养板的一个孔中。37℃下，培养24小时，在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析转染效果。

使用本发明制备的载体可以在体外实现对各种细胞的高效，低毒性的转染，在体内可实施高效,低毒性的局部给药，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明可能发生的交联反应及产物结构（a为实施例8交联反应及产物结构，b为实施例3交联反应及产物结构）。

图2 为本发明实施例9胍基化试剂的合成路线。

图3为实施例10胍基化PEI的合成路线。

图4为本发明的胍基化产物结构式（a为实施例8的胍基化产物结构式，b为实施例3胍基化产物结构式）。

图5为本发明实施例3中PEI2000 L2 L5 介导EGFP质粒转染293T细胞24h后的显微照片（a为荧光显微分析转染情况，b为白光显微分析细胞形态，c为荧光和白光叠加分析转染效率）。

图6为本发明实施例3胍基化产物（PEI2000 L2 L5-Gua3）介导siRNA-FITC转染恶性胶质瘤细胞(U87) 24h后的显微照片（a为荧光显微分析转染情况，b为白光显微分析细胞形态，c为荧光和白光叠加分析转染效率）。

图7为本发明实施例8的胍基化产物C15 L5-Gua3介导EGFP质粒转染Jurkat细胞24h后的显微照片（a为荧光显微分析转染情况，b为白光显微分析细胞形态）。

图8为实施例13的C15 L5-Gua3介导GFP质粒在C57小鼠肌肉部位转染的荧光照片（a为荧光显微分析转染情况, b为白光显微分析细胞形态）。

图9为代表性聚合物与其它转染试剂细胞毒性对比结果。

图10为本发明实施例3胍基化产物PEI2000 L2 L5-GU3对不同细胞的转染效率。

图11为各种不同的转染试剂对NIH 3T3细胞的转染效率。

具体实施方式

实施例1：含羟基的PEI衍生物的合成

0.5克的二乙烯三胺（可以看成是分子量为103的PEI）溶于5ml的二氯甲烷置于50ml的反应瓶中，一定量的交联剂L1，即N',N'-四环氧丙基-4,4'-二氨基二苯甲烷（也可以是L2-L5中的一种或二种，依据反应的摩尔比定量）溶于5ml的二氯甲烷在30-35℃下，磁力搅拌下滴加至上述反应瓶中，然后继续反应22小时，反应液通过旋转蒸发使其体积减少一半以上，然后透析72小时以上，冻干后获得含羟基的PEI衍生物产品。

实施例2：含羟基的PEI衍生物的合成

0.5克的PEI（可以是线性或分支状，分子量为600）溶于5ml的二氯甲烷置于50ml的反应瓶中，一定量的交联剂L5（也可以是L1-L4中的一种或二种，依据反应的摩尔比定量）溶于5ml的二氯甲烷在20-25℃下，磁力搅拌下滴加至上述反应瓶中，然后继续反应18小时，反应液通过旋转蒸发使其体积减少一半以上，然后透析72小时以上，冻干后获得含羟基的PEI衍生物产品。采用上述各种含有环氧基的交联剂与各种PEI进行交联反应可以得到各种含羟基的PEI衍生物（原料如表1；表2所示），各种反应组合及所得到的聚合物结构示意于图1。

实施例3：含羟基的PEI衍生物的合成

0.5克的PEI（可以是线性或分支状，分子量为2000）溶于5ml的二氯甲烷置于50ml的反应瓶中，一定量的交联剂L2和L5（也可以是L1-L4中的一种或二种，依据反应的摩尔比定量）溶于5ml的二氯甲烷在20-25℃下，磁力搅拌下滴加至上述反应瓶中，然后继续反应6小时，反应液通过旋转蒸发使其体积减少一半以上，然后透析72小时以上，冻干后获得含羟基的PEI衍生物产品。采用上述各种含有环氧基的交联剂与各种PEI进行交联反应可以得到各种含羟基的PEI衍生物（原料如表1；表2所示），各种反应组合及所得到的聚合物结构示意于图1。

实施例4：含羟基的PEI衍生物的合成

0.5克的PEI（可以是线性或分支状，分子量为10000）溶于5ml的二氯甲烷置于50ml的反应瓶中，一定量的交联剂L3（也可以是L1-L4中的一种或二种，依据反应的摩尔比定量）溶于5ml的二氯甲烷在20-25℃下，磁力搅拌下滴加至上述反应瓶中，然后继续反应3小时，反应液通过旋转蒸发使其体积减少一半以上，然后透析72小时以上，冻干后获得含羟基的PEI衍生物产品。采用上述各种含有环氧基的交联剂与各种PEI进行交联反应可以得到各种含羟基的PEI衍生物（原料如表1；表2所示），各种反应组合及所得到的聚合物结构示意于图1。

实施例5：含羟基的PEI衍生物的合成

0.5克的PEI（可以是线性或分支状，分子量为30000）溶于5ml的二氯甲烷置于50ml的反应瓶中，一定量的交联剂L4（也可以是L1-L3，L5中的一种或二种，依据反应的摩尔比定量）溶于5ml的二氯甲烷在20-25℃下，磁力搅拌下滴加至上述反应瓶中，然后继续反应2小时，反应液通过旋转蒸发使其体积减少一半以上，然后透析72小时以上，冻干后获得含羟基的PEI衍生物产品。采用上述各种含有环氧基的交联剂与各种PEI进行交联反应可以得到各种含羟基的PEI衍生物（原料如表1；表2所示），各种反应组合及所得到的聚合物结构示意于图1。

实施例6：含羟基的交联聚合物的合成

0.5克的精胺（C8）溶于5ml的二氯甲烷置于50ml的反应瓶中，一定量的交联剂L1（也可以是L2-L5中的一种或二种，依据反应的摩尔比定量）溶于5ml的二氯甲烷在35-40℃下，磁力搅拌下滴加至上述反应瓶中，然后继续反应23小时，反应液通过旋转蒸发使其体积减少一半以上，然后透析72小时以上，冻干后获得含羟基的交联聚合物产品。采用上述各种含有环氧基的交联剂与各种多胺进行交联反应可以得到各种含羟基的交联聚合物（原料如表1；表2所示），各种反应组合及所得到的聚合物结构示意于图1。

实施例7：含羟基的交联聚合物的合成

0.5克的C13溶于5ml的二氯甲烷置于50ml的反应瓶中，一定量的交联剂L2（也可以是L1-L5中其它的一种或二种，依据反应的摩尔比定量）溶于5ml的二氯甲烷在35-40℃下，磁力搅拌下滴加至上述反应瓶中，然后继续反应25小时，反应液通过旋转蒸发使其体积减少一半以上，然后透析72小时以上，冻干后获得含羟基的交联聚合物产品。采用上述各种含有环氧基的交联剂与各种多胺进行交联反应可以得到各种含羟基的交联聚合物（原料如表1；表2所示），各种反应组合及所得到的聚合物结构示意于图1。

实施例8：含羟基的交联聚合物的合成

0.5克的C15溶于5ml的二氯甲烷置于50ml的反应瓶中，一定量的交联剂L5（也可以是L1-L4中的一种或二种，依据反应的摩尔比定量）溶于5ml的二氯甲烷在30-35℃下，磁力搅拌下滴加至上述反应瓶中，然后继续反应22小时，反应液通过旋转蒸发使其体积减少一半以上，然后透析72小时以上，冻干后获得含羟基的交联聚合物产品。采用上述各种含有环氧基的交联剂与各种多胺进行交联反应可以得到各种含羟基的交联聚合物（原料如表1；表2所示），各种反应组合及所得到的聚合物结构示意于图1。

采用PEI600的交联产物其转染效率明显低于用PEI1200及PEI2000的交联产物。综合考虑，PEI2000与各种交联剂交联产物的转染效率高，而且细胞毒性小，更适合用于基因转染载体。C15与L2、L3及L5的交联产物也有较高的转染效率。最优转染效果的组合为图1所示的混合交联剂与C15或PEI2000的交联产物（结果见表3）。

实施例9：胍基化试剂的合成，如图2

(1) N, N-二叔丁氧羰基硫脲2的合成

硫脲(571mg，7.5mmol)溶于150mL THF中，不停搅拌，氩气保护下，0℃以下加入NaH(1.35g，33.8mmol)。五分钟后，撤去冰浴，室温下搅拌10分钟，然后将反应物再次冷却至0℃，加入二叔丁酯(3.60g，16.5mmol)，搅拌30分钟后撤去冰浴，泥浆状的混合物在室温下继续搅拌两个小时，然后加入10mL饱和碳酸氢钠水溶液猝灭反应。反应混合物倒入250mL水中，用乙酸乙酯萃取(3×70mL)，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，得到1.78g白色固体2，产率86%。

(2) 3-胍基丙醇/5-胍基戊醇3的合成

0.5mmol的3-氨基丙醇/5-氨基戊醇溶于2mL无水DMF中，冰浴搅拌下加入0.5mmol的试剂2及0.3mL的三乙胺，0.16g HgCl₂溶于1mL 无水DMF中，氩气保护下，逐滴加入上述反应液中，滴加完毕后，冰浴下继续反应20min，撤去冰浴，室温下反应4-6小时，停止反应。加入20mL乙酸乙酯，过滤，滤液依次用蒸馏水(2×30mL)，饱和食盐水(1×30mL)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂，得到白色固体3，产率88%或81%。

(3) 胍基化试剂4的合成

20mL烧瓶中，1mmol 试剂3溶于10mL CH₂Cl₂，冰浴下加入2mmol 三乙胺，2mmol丙烯酰氯溶于5mL CH₂Cl₂中，通过滴液漏斗加入烧瓶中，滴加完毕后，冰浴下继续反应0.5h，撤去冰浴，室温下反应2-4h。反应液分别用NaOH溶液，去离子水，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，柱层析分离(洗脱液：PE:EA=5:1)，得到透明粘稠液体4(Gua3, Gua5)，产率77%或65%。

表3 各种合成的交联聚合物的性能。

实施例10：胍基化PEI衍生物的合成，如图3所示。

20mL烧瓶中，称取0.2 g PEI或含羟基交联聚合物溶于5mL干燥的二氯甲烷，然后加入适量的所合成的胍基化修饰剂(Gua3或Gua5)，其中PEI或含羟基交联聚合物与胍基化试剂摩尔比为1:1，1:3, 1:5，1:8，1:10，加入2~3滴三乙胺。35℃下搅拌12小时以上，旋蒸除去三乙胺和二氯甲烷。

胍基脱保护：20mL烧瓶中，将0.1g 胍基化试剂修饰后的产物溶于5mL干燥的二氯甲烷，0℃下滴加3mL 三氟乙酸(TFA)，搅拌一个小时后，升温至室温，继续搅拌3小时，停止反应，加入无水乙醚沉淀，无水乙醚洗涤，干燥，得到淡黄色油状产物。

前面合成的含羟基的交联聚合物，如实施例8中C15与L5的交联产物或图1所示的混合交联剂与C15或PEI2000的交联产物可以采用同样的方法进行胍基化，合成路线如图4所示。这样可以进一步地提高转染效率并且降低其细胞毒性。

实施例11：交联聚合物与pEGFP-C1复合物的制备及表征

转染组合物的制备

将例1-例8或例10中所合成的交联聚合物分别溶于PBS（140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, pH 7.4）中，配成1mg/ml的储备液。将质粒DNA（pEGFP-C1）用ddH₂O稀释为1mg/ml储备液。按一定的聚合物/DNA(质量比)配制转染复合物，例如配制聚合物/DNA=2:1的复合物，具体过程如下：取1μl质粒DNA的溶液（1mg/ml）溶于50 μl PBS中，轻轻混匀，再取2 μl 聚合物溶于50μl PBS中，轻轻混匀，然后将二者混合，振荡10秒钟，室温静置10－15分钟，即可用于表征其性能和细胞转染的实验，其转染效果如图5至图8所示。

细胞毒性实验

聚合物的细胞毒性通过四唑盐（MTT）比色法测定，并与PEI 25 kDa及其它商业化产品比较。293T 细胞培养在含10％新生牛血清的DMEM培养液（含100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素）中，并放置于37℃，5% CO₂ 的孵箱中生长。取处于对数生长期的293T 细胞，用含 0.02% EDTA 和 0.25% 胰蛋白酶消化液消化后以每孔1×104个细胞接种于 96 孔板,每孔体积为100 μl。将培养板移入 37℃，5% CO₂ 的孵箱中培养过夜。除去培液，用 1 × PBS 洗，每孔加入不同剂量的合成聚合物或对照物及无血清培液，培养 5 小时。除去培液，1 × PBS 洗，每孔加入100 μl 完全培液继续培养 24 小时。接着每孔加入 20 μl ( 5 mg/ml ) MTT 溶液，37℃ 反应 4 小时。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入100 μl 二甲亚砜（DMSO）, 室温温育 30 分钟。振荡后通过酶标仪（Bio-RAD，Microplate Reader3550）测定各孔在570 nm的光吸收值。

细胞存活率（％）＝(OD₅₇₀ 样品 / OD₅₇₀ 对照 )×100

结果如图9 所示，对293T细胞系，所合成的聚合物比Fugene6的细胞毒性还小一些。而且在最佳转染条件下（2μg/ml）, 所合成聚合物的细胞毒性很小，细胞存活率均达到95％以上。

实施例12 转染性能的测定

细胞转染实验

各种细胞培养在含10％新生牛血清的DMEM或RPMI1640培养液（含100 U/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素）中，并放置37℃，5％CO₂的孵箱中生长。各种合成的聚合物、PEI 25kDa或其它商品化的转染试剂与DNA的复合物转染细胞实验具体步骤如下：转染前24小时，取处于对数生长期的细胞，用含0.02% EDTA 和 0.25%胰蛋白酶消化液消化后以每孔1×10⁵个细胞接种于24孔板，每孔加0.5 ml完全培养液，将培养板移入孵箱，培养24小时。当细胞汇合度达到70-80％时，除去培液，采用前述方法制备转染复合物，具体为：取1μl质粒DNA的溶液（1mg/ml）溶于50 μl PBS中，轻轻混匀，再取2 μl所合成的聚合物溶于50μl PBS中，轻轻混匀，然后将二者混合，振荡10秒钟，室温静置10－15分钟，然后加入900 μl含10％新生牛血清的DMEM培养液，混匀后得到共计1000 μl的转染液，然后加入24孔板的一个孔中。37℃下，培养24小时，在荧光显微镜下观察或用流式细胞仪分析。结果如图10所示，所合成的聚合物对A549、B16F10、Hela等细胞系均有较高的转染效率，其中对Hela和A549二个细胞系的转染效率达到近90％。

EGFP的表达及流式细胞仪分析

前述的转染后已经培养24小时的转染表达体系，采用流式细胞仪(FACS Calibur)分析其EGFP的表达情况。具体为：使用氩激光器，在 488 nm 进行分析，将未进行转染的细胞做为背景，进行转染实验的细胞用含 0.02% EDTA 和 0.25% 胰蛋白酶消化液消化后离心并重新悬浮于PBS中，然后进行流式细胞仪分析。随机收集10000个细胞，计算其中的EGFP表达的细胞所占的比例，数据采用CellQuest (Becton Dickinson) 处理， PEI2000 L2 L5-GU3对各种细胞系的转染结果如图-10所示，对所选择的9种细胞，除C6，Jurkat和MCF细胞系的转染效率不到50％，其他的细胞系均达到50％以上。

为了比较各种商业化的转染试剂与我们合成的含羟基交联聚合物及其胍基化产物对NIH 3T3细胞的转染效率，将各种转染试剂在各自的最佳转染条件下分别转pEGFP-C1质粒到NIH 3T3细胞中，然后用流式细胞仪分析转染效率，结果如图11所示，所合成的交联聚合物对3T3细胞系的转染效率明显高于其他几个商业化的转染试剂。

实施例13 交联聚合物的体内转染实验

EGFP在C57小鼠肌肉中的表达

10 μg pEGFP-C1 DNA (Clontech) 的 ddH₂O 溶液 (1mg/ ml)与C15 L5-Gua3的PBS溶液(1mg/ml) 按 1:2 混合均匀，配成总体积 50 μl 的转染复合物，室温下静置15 分钟，八周龄的C57小鼠（上海实验动物中心）在左右后腿上剪去腿毛，每只的左右后腿上分别注射 50 μl PBS 和 50 μl上述转染复合物。设置四组每组8只小鼠，分别在给药后的第一天，第三天，第五天，第七天将其杀死，然后制作冰冻切片，在荧光显微镜下观察其EGFP的表达情况。其结果如图-8所示，白光与荧光叠加表明转染效率达到90％。

EGFP在C57小鼠肿瘤中的表达

C57BL/6J小鼠(6 至 8 周)背部皮下接种B16F10细胞5×10⁵个/50μl，待肿瘤直径达50 mm³左右时将动物随机分组。转染组和空白对照组分别于肿瘤内注射C15 L5-Gua3－质粒复合物50 μl（注射质粒量为10 μg/50μl），对照组于瘤内注射等体积0.9%的生理盐水，第三天牺牲小鼠，取出皮下肿瘤，放在冷冻切片机内冷冻，然后冷冻切片, 在荧光显微镜下观察其EGFP的表达情况。

在阅读了本发明的上述内容之后，本领域的普通技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样落入本申请权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种交联聚合物，其特征是由线性或分枝状的聚乙烯亚胺或多胺基化合物与交联剂反应合成，其中，所述的聚乙烯亚胺或多胺基化合物与所述的交联剂的摩尔比是0.1:1-5:1。

2.如权利要求1所述的交联聚合物, 其特征是所述的交联剂为含有二个或二个以上环氧反应基团，同时其母链上带有脂环基、苯基、杂环基或S-S键的交联剂的一种或几种的复合物。

3.如权利要求1或2所述的交联聚合物, 其特征是所述的聚乙烯亚胺或其它多胺基化合物的分子量为100-30000Da，所述的交联剂的分子量为50-5000 Da。

4.一种胍基化交联聚合物，其特征是所述的胍基化交联聚合物是用胍基化试剂3-胍基丙醇丙烯酸酯或5-胍基戊醇丙烯酸酯作为修饰剂修饰权利要求1所述的交联聚合物后再脱掉Boc保护后获得。

5.如权利要求4所述的胍基化交联聚合物，其特征是所述的胍基化试剂3-胍基丙醇丙烯酸酯或5-胍基戊醇丙烯酸酯的合成工艺路线为：硫脲在THF溶液中与NaH和Boc酸酐反应将硫脲的胺基进行Boc保护；产物在三乙胺和HgCl₂作用下与3-氨基丙醇或5-氨基戊醇在DMF中反应，获得Boc保护的3-胍基丙醇或5-胍基戊醇；最后与丙烯酰氯反应，获得胍基化试剂3-胍基丙醇丙烯酸酯或5-胍基戊醇丙烯酸酯。

6.一种基因转染组合物，其特征是所述的组合物含有如权利要求1或4所述的交联聚合物和核酸。

7. 如权利要求6所述的基因转染组合物，其特征是所述的核酸是指DNA、治疗基因、RNA、催化活性核酸、反义寡核苷酸或修饰的核酸。

8.一种用核酸转染细胞的方法，其特征是所述的方法包括使细胞与权利要求6所述的组合物相接触的步骤。

9.一种试剂盒，其特征是所述的试剂盒含有如权利要求1或4所述的交联聚合物和指导将上述物质和核酸结合用于核酸转染细胞的说明。

10.如权利要求1或4所述的交联聚合物在基因传递中的应用，其特征是其在体外用于基因转染试剂或体内用于基因治疗的药物传输系统，或用做药物，蛋白，多肽生物活性剂的传输载体。