CN103550781A - 树状大分子自组装药物载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肽类树状大分子自组装药物载体系统，包括肽类树枝状大分子和端基功能化的短肽以及疏水性药物，所述短肽包括疏水端和亲水端，所述端基功能化是指让所述短肽的亲水端的表面电荷与所述肽类树枝状大分子表面电荷相反，所述肽类树枝状大分子与端基功能化的短肽通过弱相互作用形成自组装体，所述疏水性药物被包裹在所述自组装体中。

Description

树状大分子自组装药物载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种药物载体。

背景技术

随着自然科学的不断发展，人们对疾病的认识不断深入，人类健康和疾病治疗引起了全世界范围内的高度关注。药物治疗是目前最常用、最有效的疾病治疗方法之一；通过药物分子作用于机体疾病，以实现对抗疾病和维持健康的目的。近年来，新型药物载体成为药物治疗的研究热点；有效的药物载体在疾病治疗过程中不仅能够大幅度提高药物治疗效果，还能够显著地降低药物副作用。

目前，构建靶向性和智能性药物传递系统是提高药效和降低副作用的主要途径和手段。药物载体系统的靶向性主要通过主动靶向和被动靶向实现，靶向性载体使药物选择性的富集于病变部位。智能型药物载体主要体现在载体系统根据pH、温度、磁场及化学物质等引起的微环境变化而具有相应的响应性，以实现对药物分子的控制释放。化学、材料和纳米技术的进展很大程度上促进了新型药物载体的发展，一系列具有不同尺度、结构和功能的药物载体被成功构建，其中小分子和线型大分子自组装药物载体系统占有重要地位，如脂质体、胶束和聚合物泡囊等。

基于树状分子组装体稳定性、机械强度、仿生性等方面的优势，树状大分子组装体被认为是最具潜力的新一代的药物载体。开发新型的树状分子组装载体系统研究有益于丰富和完善新型药物载体系统。到目前为止，树状大分子组装体药物载体的研究还处于研究初期；因此，开发靶向性和智能性树状分子组装体药物载体具有重要意义。

发明内容

目前，不同类型、功能各异药物载体被开发以期望更好的提高药物效果和降低毒副作用，如脂质体、胶束和聚合物泡囊等；这些载体系统的结构单元多为小分子或者线型大分子。然而，研究表明由支化结构分子组装体具有更适合被开发为药物载体系统的优势，如好的稳定性、高的机械强度，优越的仿生特性。因此，开发和研制树状分子自组装体载药系统具有重要意义。

针对上述问题，本发明提供了一种以肽类树状分子自组装作为载体的载药系统，通过一种新的驱动肽类树状分子自组装的策略，使肽类树状分子形成稳定的自组装体，并将药物包裹在其中，便于药物在体内的传递。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种肽类树状大分子自组装药物载体系统，包括肽类树枝状大分子和端基功能化的短肽以及疏水性药物，所述短肽包括疏水端和亲水端，所述端基功能化是指让所述短肽的亲水端的表面电荷与所述肽类树枝状大分子表面电荷相反，所述肽类树枝状大分子与端基功能化的短肽通过弱相互作用形成自组装体，所述疏水性药物被包裹在所述自组装体中。通过引入端基功能化的短肽，使肽类树枝状大分子与短肽的亲水端通过静电吸附和\或氢键等弱相互作用形成两亲性的组装单元，使肽类树枝状大分子获得了自组装的驱动力，形成一种外围是亲水性肽类树枝状大分子内核是疏水短肽的纳米尺度的自组装体，其疏水内核有利于包裹疏水药物，其外围大量的氨基酸基团一方面有利于保证材料的生物相容性，便于在体内传递，同时保证药物载体的稳定性、机械强度、仿生性；另一方面便于对疏水载体进行进一步的改性，如连接各种靶向基团等。

作为可选方式，在上述肽类树状大分子自组装药物载体系统中，所述肽类树枝状大分子是以氨基酸为重复单元的一代、二代或三代肽类树状大分子，优选为二代。所述肽类树状大分子为扇形或球形。

作为可选方式，在肽类树状大分子自组装药物载体系统中，所述短肽的主链重复单元为脂肪族和芳香族氨基酸中的至少一种，所述的端基功能化是在所述主链的一端接枝亲水性的基团，所述基团可以是单个氨基酸（G0），也可以是一代（G1）、二代（G2）或三代（G3）的扇形肽类树状大分子。

作为可选方式，在上述肽类树状大分子自组装药物载体系统中，所述肽类树枝状大分子为球形，所述短肽的亲水端是树枝化的肽类大分子。通过选择球形肽类树枝状大分子作为组装主体部分，和端基树枝化的短肽作为协调组装部分，使得两者之间具有更多的作用位点，增加弱相互作用，使亲疏水片段与肽类树状分子结合更牢固，提高两者在共溶剂中形成的非共价结合两亲性的组装单元的稳定性，从而保证最终的自组装体的稳定性和机械强度。

作为可选方式，所述药物载体系统具有pH敏感特性，即所述肽类树枝状大分子和端基功能化的短肽中至少有一个是以等电点在5.0-7.0范围的氨基酸作为重复单元的。通过对所述药物载体中的氨基酸单元进行这种选择可以使所述药物载体具有pH环境响应性，能够实现对肿瘤细胞内微环境的响应，在肿瘤细胞附近微酸性的环境中载体系统会发生解组装，从而实现药物的敏感释放。

作为可选方式，所述等电点在5.0-7.0范围的氨基酸，具体为丙氨酸，亮氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸，脯氨酸和色氨酸中的至少一种。

作为可选方式，在上述肽类树状大分子自组装药物载体系统中，所述自组装体为阳离子型肽类树状大分子组装体或阴离子型肽类树状大分子组装体，在所述阳离子型肽类树状大分子组装体中，肽类树状大分子表面带正电荷，短肽的亲水端带负电荷，所述阴离子型肽类树状大分子组装体中，肽类树状大分子表面带负电荷，短肽的亲水端带正电荷。当采用阴离子型肽类树状大分子组装体时，所得的药物载体还有利于屏蔽血液对药物载体的清除作用，延长药物载体在血液中的循环时间。

作为可选方式，在上述肽类树状大分子自组装药物载体系统中，所述肽类树状大分子的结构式如下：

式1；

其中，Rm代表球形分子的核心分子，m代表核心分子的官能度，核心分子的官能度可以为3、4、6或8；K为氨基酸支化单元，G1，G2和G3分别表示一代，二代和三代肽类树状大分子。

作为可选方式，在上述肽类树状大分子自组装体中，所述核心分子为：

（n=3）、  

（n=4）、

（n=4） 、

（n=6）、

（n=8）中的一种。

作为可选方式，在上述肽类树状大分子自组装药物载体系统中，所述氨基酸支化单元为谷氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸中的至少一种。

作为可选方式，在上述肽类树状大分子自组装药物载体系统中，所述阳离子型肽类树状大分子自组装体中的短肽为阴离子化疏水短肽，其结构式如下：

------------------式2；

所述阴离子型肽类树状大分子自组装体中的短肽为阳离子化疏水短肽，其结构式如下：

------------------式3；

式2和式3中，Gm 代表m代的树枝状分子，m可以为0、1、2、3或4，其支化单元为氨基酸，式2中为阴离子型支化单元，可为谷氨酸或天冬氨酸等，式3中为阳离子型支化单元，可为赖氨酸和精氨酸或组氨酸等；R表示主链氨基酸的侧基，n表示聚合度(n=10~20)，所述主链氨基酸为脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸，R可选异丙基，仲丁基，异丁基和苯环等。作为可选方式，所述短肽的主链氨基酸为为等电点在5.0-7.0范围的氨基酸，具体可选丙氨酸，亮氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸，脯氨酸和色氨酸中的至少一种。

本发明还提供了一种制备上述肽类树状大分子自组装药物载体系统的方法，具体步骤如下：

1) 制备肽类树状大分子；

2）通过N-羧基环内酸酐开环聚合，制备端基功能化短肽；

3）将肽类树状大分子和端基功能化短肽以及疏水药物按照一定质量比例溶解在共溶剂中，在超声条件下使三组份充分复合，实现一级自组装，形成两亲性自组装前驱体；

4）在超声的条件下将上述溶液缓慢的滴加入去离子水中，通过亲疏水作用实现二级自组装，形成包裹药物的自组装体；作为可选方式，在该步骤中也可将极性溶剂加入到步骤3）中所得的溶液中。

5）通过透析除去有机溶剂及其他杂质，再经过冷冻干燥，制得肽类树状大分子自组装载药粒子。

作为可选方式，步骤1）中所述肽类树状大分子的制备可以采用发散法或收敛法或发散-收敛相结合的方法。

作为可选方式，步骤1）中所述肽类树状大分子的制备方法具体为：

a）对氨基酸进行官能团保护：根据所要制备的肽类树状大分子的核心分子表面官能团的不同对氨基酸进行保护，如核心分子表面官能团为氨基则对氨基酸的氨基进行保护，如核心分子表面官能团为羟基或羧基则对氨基酸的羧基进行保护；

b）制备一代树状大分子：按比例称取支化核（官能度为n，n>1）、含保护基团的氨基酸（1.5n当量）、缩合剂（1.5n当量）、催化剂（1.5n当量）和有机碱（4n当量），在0℃，氮气保护条件下，加入溶剂进行脱水缩合反应；然后在室温下反应，反应结束后，所得溶液经洗涤，干燥，减压浓缩，以柱层析分离得到带有保护基团第一代肽类树状大分子；

c）脱保护：准确称取第一代肽类树状大分子，脱保护试剂（20n当量），加入溶剂溶解，在氮气保护下室温反应4小时，脱除保护，减压浓缩，通过萃取或沉淀，获得第一代肽类树状大分子；

d）制备二代树状大分子：按比例称取第一代肽类树状大分子（官能度为2n）、含保护基团的氨基酸（3n当量）、缩合剂（3n当量）、催化剂（3n当量）和有机碱（8n当量），在0℃，氮气保护条件下，加入溶剂进行脱水缩合反应；然后在室温下反应，反应结束后，所得溶液经洗涤，干燥，减压浓缩，以柱层析分离得到带有保护基团第二代肽类树状大分子；

重复以上脱保护和缩合反应步骤，可得到第三、第四代树状大分子。

作为可选方式，步骤2）中所述端基功能化短肽的制备方法具体为：

a）中间体N-羧基环内酸酐的合成：可以在以下两种合成方法中任意选择：

方法1：将氨基酸加入支管瓶中，在氮气保护下，加入重蒸四氢呋喃使其溶解后，将体系升温至50℃。加入三光气（较氨基酸摩尔量过量30%）反应（分三次添加），待反应液转为清亮，停止加热，冷却到室温。继续通氮气半小时，旋走溶剂，加入大量石油醚沉淀，在-20℃温度下结晶12小时，得到的粗产品用四氢呋喃重结晶一次，真空干燥，得到氨基酸的N-羧基环内酸酐；

方法2：称取干燥的苄氧羰基-氨基酸，在氮气保护下，加入重蒸的四氢呋喃溶解，体系温度升至40℃，滴加二氯亚砜。反应4小时后，将反应液加入重蒸正己烷中，-20℃静置12小时，过滤得到固体。将得到的固体在无水乙酸乙酯/正己烷反复重结晶，真空干燥得到氨基酸的N-羧基环内酸酐；

b) 开环聚合：采用氨基酸或扇形树枝状大分子引发步骤a）中制备的N-羧基环内酸酐开环聚合。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本发明的有益效果：

1. 本发明所述肽类树状大分子自组装药物载体系统，通过引入端基功能化的短肽，使肽类树枝状大分子与短肽的亲水端通过静电吸附和\或氢键等弱相互作用形成两亲性的组装单元，使肽类树枝状大分子获得了自组装的驱动力，形成一种外围是亲水性肽类树枝状大分子内核是疏水短肽的纳米尺度的自组装体，其疏水内核有利于包裹疏水药物，其外围大量的氨基酸基团一方面有利于保证材料的生物相容性，便于在体内传递，同时保证药物载体的稳定性、机械强度、仿生性；另一方面便于对疏水载体进行进一步的改性，如连接各种靶向基团等。

2.本发明所述的肽类树状大分子自组装药物载体系统，具有精确的分子结构、丰富的表面官能团，还具有良好的生物相容性、类蛋白结构、容易被细胞内吞等生物学特点。

3. 本发明所述的肽类树状大分子自组装药物载体系统，能够制成纳米级的药物载体，有利于通过实体瘤的高通透性和滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR effect），实现对肿瘤部位的被动靶向。

4.在本发明所述肽类树状大分子自组装药物载体系统可选方式中，通过选择等电点在5.0-7.0范围的氨基酸作为所述药物载体中的氨基酸单元，可以使所述药物载体具有pH环境响应性，能够有实现对肿瘤细胞内微环境的响应，在肿瘤细胞微酸性的环境中载体系统会发生解组装，从而实现药物的敏感释放。本发明所述pH敏感的药物载体的工作原理如图15所示。

5.本发明所述的制备方法，工艺简单，通过弱相互作用，驱动低代数的肽类树状大分子快速形成一个结构有序和外围官能团丰富的肽类树状大分子自组装体，使其具有类似于蛋白质外壳的一些特征，且能够通过控制各原料的配备来精确控制自组装体的形貌。

附图说明

图1是本发明实施例2中所述肽类树状大分子的合成路线图。

图2是本发明实施例4中所述端基功能化短肽的合成路线图。

图3是本发明实施例5中所述端基功能化短肽的合成路线图。

图4是本发明实施例2中制备的一代和二代肽类树状大分子的氢谱。

图5是本发明实施例2中制备的一代和二代肽类树状大分子的碳谱。

图6是本发明实施例4中制备的N-羧基环内酸酐的氢谱。

图7是本发明实施例4中制备的N-羧基环内酸酐的红外图谱。

图8是本发明实施例4中所述的引发剂、重复单元和聚多肽的红外图谱。

图9是本发明所述的载药纳米粒子透射电镜图。

图10是本发明实施例9中所述药物载体在不同pH条件下的体外释放曲线图。

图11是本发明实施例10中所述药物载体解组装过程示意图及透射电镜照片。

图12是本发明实施例10中所述药物载体解组装过程的原子力显微镜照片。

图13是本发明实施例11中所述CCK-8检测结果的柱状图。

图14是本发明实施例11中所述体外细胞摄取和胞内释放实验的激光共聚焦照片。

图15是本发明所述pH敏感的药物载体工作原理的示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。以下实施例中所述原料均为市售。

实施例1：肽类树状大分子的制备

a）对氨基酸进行官能团保护：根据所要制备的肽类树状大分子的核心分子表面官能团的不同对氨基酸进行保护，如核心分子表面官能团为氨基则对氨基酸的氨基进行保护，如核心分子表面官能团为羟基或羧基则对氨基酸的羧基进行保护；

b）制备一代树状大分子：按比例称取支化核（官能度为n，n>1）、含保护基团的氨基酸（1.5n当量）、缩合剂（1.5n当量）、催化剂（1.5n当量）和有机碱（4n当量），在0℃，氮气保护条件下，加入溶剂进行脱水缩合反应；然后在室温下反应，反应结束后，所得溶液经洗涤，干燥，减压浓缩，以柱层析分离得到带有保护基团第一代肽类树状大分子；

c）脱保护：准确称取第一代肽类树状大分子，脱保护试剂（20n当量），加入溶剂溶解，在氮气保护下室温反应4小时，脱除保护，减压浓缩，通过萃取或沉淀，获得第一代肽类树状大分子；

d）制备二代树状大分子：按比例称取第一代肽类树状大分子（官能度为2n）、含保护基团的氨基酸（3n当量）、缩合剂（3n当量）、催化剂（3n当量）和有机碱（8n当量），在0℃，氮气保护条件下，加入溶剂进行脱水缩合反应；然后在室温下反应，反应结束后，所得溶液经洗涤，干燥，减压浓缩，以柱层析分离得到带有保护基团第二代肽类树状大分子；

重复以上脱保护和缩合反应步骤，可得到第三、第四代树状大分子。

分别选取（n=3）、  

（n=4）、

（n=4） 、

（n=6）、

（n=8）中的一种作为支化核，以谷氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸中的一种或几种作为支化单元，制得一系列一至四代的肽类树状大分子。其结构式如式1所示（式1中只给出了最高位三代的肽类树状大分子结构式，通过在三代大分子外围再增加一层氨基，本领域技术人员很容易推知四代氨基酸的结构）。在所述肽类树状大分子外围再接枝等电点在5.0-7.0范围的氨基酸，如丙氨酸，亮氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸，脯氨酸和色氨酸中的至少一种，将接枝后的肽类树状大分子与本发明所述端基功能化短肽和疏水药物自组装可获得具有pH敏感特性的药物载体。

本实施例中所述缩合剂、催化剂、有机碱、溶剂，可选择现有技术中已知的用于羧基与氨基的脱水缩合的各种缩合剂、催化剂、有机碱、溶剂。

实施例2： 肽类树状大分子的具体合成例(合成路线如图1)

一代肽类树状大分子（G1-Poss-Lys-Boc）的合成

称取2.0g 笼型八聚(3-氨丙基)倍半硅氧烷盐酸（OAS·HCl）(化合物1，本课题组合成)、8.0g HBTU和2.5g HOBT 加入到100ml 单颈瓶中，将5.0gBoc-lys(Boc)-OH加入50ml 恒压滴液漏斗中，抽真空，充氮气。用注射器各加入约40ml 重蒸过的N,N-二甲基甲酰胺（DMF），冰浴搅拌下加入3ml 的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，继续搅拌半小时后撤去冰浴，改为室温下反应48h。减压除去溶剂后，加入氯仿溶解，依次用饱和NaHCO₃、NaHSO₄、NaCl洗涤。用无水MgSO₄ 干燥后，旋除溶剂，在乙腈中重结晶，得到白色粉状固体G1-Poss-Lys-Boc。1HNMR (400 MHz, DMSO) δ 8.31 (s, 1H), 6.72 (s, 4H),3.80 (t, J= 25.2 Hz, 2H), 3.14 –2.80 (m, 9H), 2.51 (s,1H), 1.45 (d, J= 7.0 Hz, 9H), 1.37 (s, 47H), 0.55 (d, J=5.6 Hz, 5H)。

脱保护

将1.0g的G1-Poss-Lys-Boc 的白色粉末，加入6ml的三氟乙酸（TFA），室温反应6h。减压旋去TFA，用油泵抽干，加入无水乙醚搅拌有白色沉淀产生，得到化合物2。产物无需提纯，直接用于下步反应。产物无需提纯，直接用于下步反应。

二代肽类树状大分子（G2-Poss-Lys-Boc）的合成

重复G1-Poss-Lys-Boc 的合成步骤，合成G2-Poss-Lys-Boc。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.32 (s, 1H), 8.05–7.58 (m, 3H), 6.72 (s, 4H), 4.23 (s, 1H), 3.76 (d, J=57.3 Hz, 2H), 2.88 (s, 9H), 2.51 (s, 1H), 1.49 (d, J= 24.1Hz, 8H), 1.67 –0.81 (m, 63H), 1.67 –0.82 (m, 63H),0.57 (s, 2H)。

脱保护与纯化

将1.0g 的G1-Poss-Lys-Boc 的白色粉末，加入5ml的TFA，室温反应6h。减压旋除TFA，用油泵抽干，加入无水乙醚搅拌有白色沉淀产生，得到化合物3。将得到的G2 肽类树状分子溶于去离子水中，用Na₂CO₃ 调节pH 值，透析3d，冷冻干燥备用。

经核磁共振检测（见图4和图5）显示通过该方法成功制备了一代和二代肽类树状大分子。为进一步对所合成的化合物进行确定，还使用质谱仪（美国Bruker公司，AutoFlex III）对所得化合物的分子量进行了测定。结果也证实所得产物是目标化合物。

实施例3： 端基功能化短肽的制备

a）中间体N-羧基环内酸酐的合成：可以在以下两种合成方法中任意选择：

方法1：将氨基酸加入支管瓶中，在氮气保护下，加入重蒸四氢呋喃（THF）使其溶解后，将体系升温至50℃。加入三光气（较氨基酸摩尔量过量30%）反应（分三次添加），待反应液转为清亮，停止加热，冷却到室温。继续通氮气半小时，旋走溶剂，加入大量石油醚沉淀，在-20℃温度下结晶12小时，得到的粗产品用四氢呋喃重结晶一次，真空干燥，得到氨基酸的N-羧基环内酸酐；

方法2：称取干燥的苄氧羰基-氨基酸，在氮气保护下，加入重蒸的四氢呋喃溶解，体系温度升至40℃，滴加二氯亚砜(SOCl₂)。反应4小时后，将反应液加入重蒸正己烷中，-20℃静置12小时，过滤得到固体。将得到的固体在无水乙酸乙酯/正己烷反复重结晶，真空干燥得到氨基酸的N-羧基环内酸酐；

b）开环聚合：采用氨基酸或扇形树枝状大分子引发步骤a）中制备的N-羧基环内酸酐开环聚合。

通过调整反应原料中氨基酸的种类制备出一系列如式3或式4所示的端基功能化短肽。式2和式3中，Gm 代表m代的树枝状分子，m可以为0、1、2、3或4，其支化单元为氨基酸，式2中为阴离子支化单元，可为谷氨酸或天冬氨酸等，式3中为阳离子型支化单元，可为赖氨酸和精氨酸或组氨酸等；R表示主链氨基酸的侧基，n表示聚合度，(n=10-20)，所述主链氨基酸为脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸 R为异丙基，仲丁基，异丁基和苯环等，所述主链氨基酸为等电点在5.0-7.0范围的氨基酸，如丙氨酸，亮氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸，脯氨酸和色氨酸中的至少一种时，最终制得的自组装药物载体系统具有pH敏感特性。

实施例4： 端基功能化短肽的合成例一(合成路线如图2)

中间体N-羧基-L-亮氨酸-环内酸酐(L-Leu-NCA)的合成

称取2.0g 干燥无水的苄氧羰基-亮氨酸(Cbz-Leu)，加入装有回流冷凝管、恒压滴液漏斗、碱吸收装置的三口瓶中，在氮气保护下溶于20ml 无水THF 中，磁力搅拌并升温至40℃。将4ml 的SOCl₂加入恒压滴液漏斗中，控制滴加速度，恒温下反应4h。把反应液倒入过量的无水正己烷中，在低温静置12h。在干燥的条件下，将得到白色沉淀用无水乙酸乙酯/无水正己烷反复重结晶3 次，真空干燥得到白色针状晶体(化合物4)。核磁共振图谱（图6）和傅里叶-红外光谱分析结果（图7）均证实所得到的产物为N-羧基-L-亮氨酸-环内酸酐。

开环聚合

按照摩尔比1:10 的比例，准确称取干燥处理后的谷氨酸和L-Leu-NCA 投入反应瓶中，抽真空然后通入氮气保护。加入DCM/DMF 的混合溶剂，磁力搅拌，在常温下反应48h。反应液在搅拌下滴加到过量的无水乙醇中得到白色沉淀。沉淀过滤，用乙醚洗涤、干燥得白色固体产物(化合物5)。傅里叶-红外光谱分析结果（图8）证实通过此法成功合成了一种端基功能化的聚亮氨酸短肽。

实施例5：端基功能化短肽的合成例二（合成路线如图3）

将叔丁氧羰基保护的谷氨酸（Boc-Glu-COOH）和过量的苄基保护的谷氨酸（H-Glu(OBzl)-OBzl）在氮气保护下, 通过HOBT/EDC/DIEA 催化缩合,在CH₂Cl₂ 中常温反应24 h. 用饱和NaHCO₃ 溶液、NaHSO₄ 溶液、饱和NaCl 溶液反复洗涤产物. 无水MgSO₄干燥 24 h，对产物浓缩后在CH₂Cl₂/正己烷中重结晶, 过滤干燥后得到谷氨酸二代(G2-Glu)（产物1）；

谷氨酸二代(G2-Glu)在氮气保护下, 用TFA 脱除Boc 保护, 减压除去TFA, 得到产物2. 产物2 在氮气保护下加入到Boc-Glu-COOH 中, 通过HOBT/EDC/DIEA 催化缩合, 常温反应24 h. 用饱和NaHCO₃ 溶液、NaHSO₄ 溶液、饱和NaCl 溶液反复洗涤数次. 利用硅胶柱过柱分离, 得到聚谷氨酸三代树枝状大分子(G3-Glu)(产物3)；

聚谷氨酸三代树枝状大分子(G3-Glu)在氮气的保护下, 用TFA 脱除Boc 保护, 减压除去TFA 得到产物4. 将产物4 在NaOH 醇溶液中调节pH 值, 充分搅拌, 旋干溶剂, 将固体溶于CH₂Cl₂, 滤除固体, 将滤液旋干待用；

N-羧基-L-苯丙氨酸-环内酸酐(NCA-Phe)的合成：称取无水干燥的苄氧羰基-苯丙氨酸(Cbz-Phe),在氮气保护下溶于20 mL 无水THF 中, 升温至40 ℃，将SOCl2 滴入上述反应体系, 反应4 h. 把反应液加入过量无水正己烷中, 低温静置12 h. 将得到的白色沉淀用无水乙酸乙酯/无水正己烷反复重结晶3 次,真空干燥得到白色针状晶体；

按照摩尔比1:10 的比例, 准确称取干燥处理后的大分子引发剂和L-Phe-NCA 投入反应瓶中, 抽真空后通入氮气保护. 加入DCM/DMF 混合溶剂, 室温反应48 h, 得到产物5. 在压力约为0.8 MPa 的高压釜中, 以Pd/C 为催化剂, 加入H2, 室温反应24 h, 脱去OBzl. 过滤分离, 减压除去溶剂和苄醇。得到端基功能化短肽。通过核磁和傅里叶-红外光谱验证所得产物为目标化合物。

实施例6端基功能化短肽的合成例三

称取无水干燥的亮氨酸和三光气（摩尔比为1：2），在氮气保护下溶于20 mL无水THF中，在40 ℃条件下反应4小时。 减压旋蒸除去有机溶剂溶剂，得到白色固体；用无水乙酸乙酯/无水正己烷反复重结晶3次，真空干燥得到亮氨酸-N-羧基环内酸酐白色晶体。

称取无水谷氨酸和亮氨酸-N-羧基环内酸酐（摩尔比为1:15），在氮气保护下将亮氨酸溶解于无水二甲基甲酰胺中，亮氨酸-N-羧基环内酸酐溶于二氯甲烷，将其滴入谷氨酸的二甲基甲酰胺溶液中，室温反应48小时。经过洗涤和真空干燥，得到端基功能化聚亮氨酸。利用基质辅助激光解吸时间飞行质谱分析上述疏水短肽，分子量范围为2000-3000。

实施例7肽类树状大分子自组装药物载体系统的制备

分别将实施例1和实施例3制备的肽类树状大分子和端基功能化短肽按照一定质量比例溶解在共溶剂中（表面带正电荷的肽类树状大分子与阴离子化疏水短肽相混合，表面带负电荷的肽类树状大分子与阳离子化疏水短肽相混合）以及疏水药物（如阿霉素，紫杉醇，喜树碱，甲氨蝶呤等），在超声条件下使三组份充分复合，实现一级自组装，形成两亲性自组装前驱体；

在超声的条件下将上述溶液溶缓慢的滴加入去离子水中，通过亲疏水作用实现二级自组装，形成包裹药物的自组装体，然后通过透析除去有机溶剂及其他杂质，再经过冷冻干燥，制备出一系列肽类树状大分子自组装载药粒子。

实施例8：肽类树状大分子自组装药物载体系统合成例

首先，将实施例2中制备的分离纯化后的肽类树状大分子和实施例4或实施例6中制备的端基功能化短肽以及阿霉素，有机良溶剂（二甲基亚砜）中超声复合10min。肽类树状分子外围氨基和短肽的羧基端在弱相互作用下形成自组装单元。在超声条件下，将上述混合物逐滴加入去离子水中，去离子水作为超疏水短肽的不良溶剂，使疏水片段自动向内塌陷形成内核，肽类树状大分子形成自组装体的外壳并将疏水药物包裹在内核中；再转移到截留分子量为2000的透析袋中，4℃条件下透析48小时以除去有机溶剂及其他杂质。经过冷冻干燥，制得肽类树状大分子自组装载药粒子。

通过透射电子显微镜观察载药粒子的尺寸及形态，如图9所示，载药纳米粒子为球形，粒径约为50~200nm，且分布较窄。

实施例9：载药量及释放曲线测试。

取1mg实施例7中载药组装体，重新溶于有机良溶剂中，利用标准曲线法测定其载药量。另取1mg载药组装体，溶于1mL水中，转移至一定截留分子量的透析袋中，外部加入20mL不同pH值的缓冲溶液，将其置于恒温震荡器中，在37℃的恒温水浴条件下释放，每隔一段时间取1mL透析袋外部的溶液，同时补充1mL相同pH值的新鲜缓冲溶液。测定释放的疏水药物的含量，绘制释放曲线。

载药量测定结果显示，药物成功包覆到自主装体当中，其中药物质量占载体总质量的10%左右，被包覆的药物质量占投药质量的46%左右。

体外释放试验结果（如图10所示）表明在较低的pH条件下（pH 6.2），载药粒子发生解组装，很快将药物释放出来，在24小时内，药物的释放量可以达到80%以上，而在正常pH条件下（pH 7.4），载药粒子仍呈组装状态，大部分药物负载在组装体疏水内核，在24小时内，药物的释放量不足30%。这一实验结果验证了载药粒子的pH响应性。

实施例10：肽类树状大分子自组装药物载体系统的pH响应性和对药物的敏感释放

    酸碱滴定法，称取5mg实施例8中自组装载药粒子溶于5mL的去离子水中，每次滴加入20μL的标准盐酸溶液，通过精密pH微电极测定并记录体系pH值。

核磁共振法，称取5mg实施例8中自组装载药粒子溶于2mL重水中，然后将该溶液分为两部分，用氘代三氟乙酸和碳酸钠分别调节pH值至相应pH值，进行核磁共振检测组装单元分子骨架上氢原子特征化学位移的变化。

显微观测法，称取5mg实施例8中自组装载药粒子在超声的条件下溶于相同体积不同pH值的溶液中。将该溶液分别滴在铜网和云母片上，待样品彻底干燥，可分别进行透射电子显微镜和原子力显微镜检测。

荧光分子探针负载法，各称取5mg实施例8中自组装载药粒子溶于不同pH值的芘水中，超声15分钟，静置12小时。利用荧光分光光度计测定发射光为395nm的激发光范围为300nm到380nm的激发光谱。记录338nm和334nm处的荧光强度值，计算不同pH值下的I₃₃₈/I₃₃₄.

染料分子负载法，将肽类树状大分子、功能化疏水短肽和苏丹红7B（以苏丹红染料代替药物）按照一定质量比溶于二甲基亚砜中，在超声的条件下滴入水中，将此溶液转移到截留分子量为2000的透析袋中，透析除去有机溶剂，冷冻干燥得到载有染料的肽类树状大分子组装体。将载有染料的树状大分子自组装体分别溶于不同pH值的溶液中，观察染料的泄露情况。

试验结果表明，肽类树状大分子和功能化短肽具有一定的缓冲能力，且疏水短肽的等电点在pH5-7附近。通过核磁谱图验证表明，在pH值为6时，肽类树状大分子片段出现核磁信号，短肽未出现核磁信号；在pH值为9时，肽类树状大分子中质子化氨基转变为电中性的氨基，水溶性降低使得其核磁信号减弱，而随着羧基的离子化短肽的溶解性增强出现核磁信号。透射电子显微镜和原子力显微镜检测结果（图11和图12）证实所示药物载体在pH=6.2时发生了解组装，荧光分子探针法和染料负载法表明，在pH值为7.4时，纳米组装体具有较高的负载效果，在低pH值（6.2）时，客体分子更容易从纳米组装体中释放出来。综上所述，纳米粒子具有一定的pH敏感性。

实施例11：生物学评价

CCK-8法测定载药肽类树状大分子自组装体体外毒性实验。选择处于生长活跃期的肿瘤细胞接种于96孔板中，培养24小时后，加入空白药物载体、盐酸阿霉素、疏水阿霉素以及实施例8中制备包覆疏水阿霉素的载药系统，每个实验组设置6个平行样，并设置对照组。继续培养一定时间后，用PBS缓冲液（pH 7.4）冲洗后并更换新的培养基，加入CCK-8，继续培养2h，用酶标仪测定490nm处的吸光值，计算细胞存活率。实验结果如图13所示，空白载体具有良好的生物相容性，包覆疏水阿霉素的载药系统的药效优于裸药（疏水阿霉素）与盐酸阿霉素效果相当。

体外细胞摄取和胞内释放实验。取肿瘤细胞，加入培养基稀释，按每孔固定个数的密度接种于玻底皿中，待细胞贴壁生长后，设定疏水阿霉素（红色荧光）的浓度，加入不同浓度的载药组装体（组装体用FITC标记，黄色荧光）。细胞培养几个时间点后，用PBS（pH 7.4）漂洗2遍后，再加入PBS，用激光共聚焦观察体外细胞摄取载药组装体的细胞内分布和变化情况。激光共聚焦实验结果（图14）表明制备的纳米自组装体能有效的运载药物进入细胞，实现细胞内pH敏感释放；同时，体内/体外抗肿瘤实验表明纳米自组装体有效的提高了药物的抗肿瘤效果，降低了药物的毒副作用。

动物体内抗肿瘤实验。在4周龄babc小鼠（约20-25g）建立肿瘤模型，待肿瘤长至100cm³时，将小鼠随机分组，每组8只，将载药组装体配置成一定浓度，每只老鼠进行尾静脉注射，每只100μL，每隔两天进行一次尾静脉给药，共给药四次，同时每隔2天对肿瘤大小及小鼠体重记录，观察期为21天。实验完毕后将小鼠解剖，制备重要组织和器官切片。结果显示，注射载药组装体后的小鼠肿瘤体积逐渐变小，精神状态良好，体重及其他生理指标均正常，说明该药物载体对肿瘤具有良好的抑制作用。

Claims (10)

1.一种肽类树状大分子自组装药物载体系统，其特征在于：包括肽类树枝状大分子和端基功能化的短肽以及疏水性药物，所述短肽包括疏水端和亲水端，所述端基功能化是指让所述短肽的亲水端的表面电荷与所述肽类树枝状大分子表面电荷相反，所述肽类树枝状大分子与端基功能化的短肽通过弱相互作用形成自组装体，所述疏水性药物被包裹在所述自组装体中。

2.如权利要求1所述的肽类树状大分子自组装药物载体系统，其特征在于：所述药物载体系统具有pH敏感特性，即所述肽类树枝状大分子和端基功能化的短肽中至少有一个是以等电点在5.0-7.0范围的氨基酸作为重复单元的。

3.如权利要求1所述的肽类树状大分子自组装药物载体系统，其特征在于：所述肽类树枝状大分子为球形，所述短肽的亲水端是树枝化的肽类大分子。

4.如权利要求1所述的肽类树状大分子自组装药物载体系统，其特征在于：所述自组装体为阳离子型肽类树状大分子组装体或阴离子型肽类树状大分子组装体，在所述阳离子型肽类树状大分子组装体中，肽类树状大分子表面带正电荷，短肽的亲水端带负电荷，所述阴离子型肽类树状大分子组装体中，肽类树状大分子表面带负电荷，短肽的亲水端带正电荷。

5.如权利要求1所述的肽类树状大分子自组装药物载体系统，其特征在于：所述肽类树状大分子的结构式如下：

式1；

其中，Rm代表球形分子的核心分子，m代表核心分子的官能度，核心分子的官能度可以为3、4、6或8；K为氨基酸支化单元，G 1，G2和G3分别表示一代，二代和三代肽类树状大分子。

6.如权利要求5所述的肽类树状大分子自组装药物载体系统，其特征在于：所述核心分子为

、  、

、

、

中的一种，所述氨基酸支化单元为谷氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸中的至少一种。

7.如权利要求4所述的肽类树状大分子自组装药物载体系统，其特征在于：所述阳离子型肽类树状大分子自组装体中的短肽为阴离子化疏水短肽，其结构式如下：

------------------式2；

所述阴离子型肽类树状大分子自组装体中的短肽为阳离子化疏水短肽，其结构式如下：

------------------式3；

其中，Gm 代表m代的树枝状分子，其支化单元为氨基； R表示主链氨基酸的侧基，n表示聚合度，所述主链氨基酸为脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸。

8.如权利要求7所述的肽类树状大分子自组装药物载体系统，其特征在于：所述短肽的主链氨基酸为等电点在5.0-7.0范围的氨基酸。

9.如权利要求7所述的肽类树状大分子自组装药物载体系统，其特征在于：所述等电点在5.0-7.0范围的氨基酸具体为丙氨酸，亮氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸，脯氨酸和色氨酸中的至少一种。

10.一种如权利要求1-9中任意一个所述的肽类树状大分子自组装药物载体系统的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

1) 制备肽类树状大分子；

2）通过N-羧基环内酸酐开环聚合，制备端基功能化短肽；

3）将肽类树状大分子和端基功能化短肽和疏水药物按照一定质量比例溶解在共溶剂中，在超声条件下使三组份充分复合，实现一级自组装，形成两亲性自组装前驱体；

4）在超声的条件下将上述溶液缓慢的滴加入极性溶剂中，通过亲疏水作用实现二级自组装，形成包裹药物的自组装体；

5）通过透析除去有机溶剂及其他杂质，再经过冷冻干燥，制得肽类树状大分子自组装载药粒子。

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