CN105833294A - 一种生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体，其特征在于，包括肽类树状大分子体系和抗肿瘤药物前驱体；所述肽类树状大分子体系包括肽类树状大分子和成像分子，肽类树状大分子包括可逆化学键和羧基，成像分子包括可逆化学键或能与可逆化学键反应的官能团，成像分子引发肽类树状大分子交联，形成肽类树状大分子体系；所述抗肿瘤药物前驱体由抗肿瘤药物经过物理或化学处理制得，抗肿瘤药物前驱体和肽类树状大分子体系通过弱相互作用形成自组装单元。本发明的肽类树状大分子自组装体具有结构稳定、响应于体内特征的生物学信号、集诊断与治疗一体的优点。

Description

一种生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体的制备方法及其在生物医学领域的应用研究。
背景技术
近年来，我们通过发展肽类树状大分子及其自组装策略，获得了一系列性能优越的树状大分子组装系统，很大程度上减少了树状大分子精确合成的繁琐步骤、改善了树状大分子递送系统的生物相容性；更为重要的是，树状大分子组装系统更有利于实现纳米系统的功能整合与优化，大幅度提高了生物活性分子的传递效率。但是，树状大分子组装体在作为纳米递送系统的应用中也逐渐显露出其不足之处：(1)基于弱相互作用形成的树状大分子组装体在稳定性存在不足，难以应对体内复杂的生理屏障；(2)缺乏诊断治疗一体化的多功能集成，无法满足现代医学的个体化治疗需求。因此，利用现代分子与超分子构建策略，发展体内循环稳定、肿瘤特定响应、诊疗一体的树状大分子组装系统具有重要的基础研究和应用研究价值。
发明内容
本发明针对现有技术中制备的肽类树状大分子组装体存在的结构不稳定，在粒径、形貌和功能保持上的不足，本发明提供了一种结构稳定同时能够响应于体内特征的生物学信号的诊疗一体化的肽类树状大分子组装体。
本发明采用的技术方案如下：一种生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体，包括肽类树状大分子体系和抗肿瘤药物前驱体；所述肽类树状大分子体系包括肽类树状大分子和成像分子，肽类树状大分子包括可逆化学键和羧基，成像分子包括可逆化学键或能与可逆化学键反应的官能团，成像分子引发肽类树状大分子交联，形成肽类树状大分子体系；所述抗肿瘤药物前驱体由抗肿瘤药物经过物理或化学处理制得，抗肿瘤药物前驱体和肽类树状大分子体系通过弱相互作用形成自组装单元。
作为可选方式，所述肽类树状大分子为一代肽类树状大分子、二代肽类树状大分子或三代肽类树状大分子，优选为三代肽类树状大分子。
作为可选方式，所述肽类树状大分子为扇形肽类树状大分子。所述扇形肽类树状大分子的外围包括羧基，扇形肽类树状大分子的核心分子包括可逆化学键，内核具有疏水性。所述扇形肽类树状大分子的结构式如下：
式1
其中，R1和Rm一起构成扇形肽类树状大分子的核心分子，m代表核心分子的官能度，m为1或2；E为谷氨酸，赖氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，天冬氨酸，组氨酸中的至少一种；D为酸性氨基酸，端基为羧基；G1.0、G2.0和G3.0分别代表一代肽类树状大分子、二代肽类树状大分子和三代肽类树状大分子；
作为可选方式，所述可逆化学键pH敏感化学键、氧化还原敏感化学键、活性氧(ROS)敏感化学键或酶敏感化学键中的一种。pH敏感化学键可以为腙键、酯键等；氧化还原敏感化学键为二硫键、单硫键等；活性氧(ROS)敏感化学键为苯硼酸酯键等；酶敏感化学键为组织蛋白酶敏感键、金属基质蛋白酶敏感化学键等。可逆化学键能够保证组装体在循环过程中稳定存在及肿瘤微环境响应敏感药物释放。
作为可选方式，肽类树状大分子的核心分子中具有类似缩醛、缩酮或缩硫酮的结构。
作为可选方式，所述成像分子由可修饰的成像分子制得。可修饰的成像分子可以采用荧光分子，如钙黄绿素(Calcein)，异硫氰酸荧光素(FITC)，罗丹明，菁染料(Cy系列染料)中任意一种，也可以为核素分子(含11C、13N、15O、18F或82Rb等中至少一种)。优先Cy5.5。
作为可选方式，所述可逆化学键为HS-或-S-S-。HS-或-S-S-在氧化还原环境中能够实现二者之间的相互转化，能够保证系统的稳定性及响应性。所述成像分子结构式如下：
式2
其中，F为可修饰的成像分子。
作为可选方式，所述抗肿瘤药物采用疏水性抗肿瘤药物或亲水性肿瘤药物。疏水性抗肿瘤药物可以为紫杉醇(PTX)、疏水阿霉素(DOX)或甲氨蝶呤(MTX)等；所述亲水性抗肿瘤药物可以为替伊莫单抗、贝伐单抗或修饰的金属药物等。优选亲水性抗肿瘤药物。
作为可选方式，所述抗肿瘤药物采用亲水性抗肿瘤药物，其结构式如下：
式3
其中，M为金属原子。K为碱性氨基酸，能够提供氨基并与金属发生配位作用，优选为赖氨酸；R2为亲水高分子聚合物，能够增加抗肿瘤药物的亲水性。所述亲水高分子聚合物R2可采用聚乙二醇、聚乙二醇单甲醚和聚乙烯醇中任意一种，优选为聚乙二醇单甲醚。
本发明还提供了一种生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体的制备方法，包括如下步骤：
1)制备肽类树状大分子；
2)制备成像分子；
3)将成像分子加入到肽类树状大分子的水溶液中，成像分子引发肽类树状大分子的交联，制备肽类树状大分子体系；
4)抗肿瘤药物的负载。包括疏水性抗肿瘤药物或亲水性肿瘤药物的负载。首先制备抗肿瘤药物前驱体，再将去质子化的肽类树状大分子体系和抗肿瘤药物前驱体混合，通过弱相互作用形成肽类树状大分子组装体。
疏水性抗肿瘤药物的装载：将肽类树状大分子体系与疏水性抗肿瘤药物共溶于少量溶剂中，于超声条件下缓慢滴加至大量去离子水中，超声10min后，室温下搅拌24h，浓缩，过滤，滤液冻干，即可得到负载疏水性抗肿瘤药物的肽类树状大分子组装体；
亲水性抗肿瘤药物的装载：将亲水性抗肿瘤药物于水中活化制备抗肿瘤药物前驱体，将抗肿瘤药物前驱体滴加至肽类树状大分子体系的水溶液中，室温反应24h后，浓缩，透析冻干，即可得到负载亲水性抗肿瘤药物的肽类树状大分子组装体。
作为可选方式，步骤1)中所述的肽类树状大分子的制备可选用发散法或收敛法或发散-收敛相结合的方法。
作为可选方式，步骤2)中成像分子的制备方法具体为：
按比例称取可修饰的成像分子(1n当量)，含引发基团的单官能团分子(1.2n当量)，缩合剂(1.2n当量)和催化剂(1.2n当量)，室温条件下在水中反应，反应结束后，透析除去缩合剂及未反应的分子，冻干得到产物并于-20℃条件下储存。
作为可选方式，可采用以下制备方法制备步骤4)中所述亲水性抗肿瘤药物：
a)称取氨基保护的的碱性氨基酸(1n当量)，亲水高分子聚合物(1n当量)，缩合剂(1.2n当量)和催化剂(1.2n当量)，在0℃，氮气保护下，加入到无水溶剂中，再往以上混合溶液中加入有机碱(4n当量)，而后在室温条件下反应，反应结束后，所得溶液经洗涤，干燥，过滤，减压浓缩，经过柱层析分离得到带有保护基团的碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物。
b)准确称取带有保护基团的碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物(1n当量)，加入溶剂溶解后，再加入脱保护试剂(20n当量)，在氮气保护下室温反应，脱除保护后，减压浓缩，通过萃取或沉淀处理得到碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物。
c)称取抗肿瘤药物(1n当量)，碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物(1n当量)于室温条件下反应24h，浓缩透析得到亲水性抗肿瘤药物。
本发明还提供一种生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体(TSPDSs)的应用，该组装体在正常生理环境中具有良好的稳定性，但在体内特定环境的响应性实现组装体的迅速崩解。同时，通过成像分子和抗肿瘤药物分子的引入，形成集成像和治疗于一体，能够实现其在肿瘤诊断和肿瘤治疗的应用。
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本发明的有益效果：
1.本发明提供了一种超分子组装方法，成功将成像分子及抗肿瘤药物整合到同一个纳米粒子中，实现肿瘤的治疗及载药粒子体内外分布监测。
2.本发明所述肽类树状大分子组装体，具有精确的结构，以肽类树状大分子为基础赋予该体系良好的生物相容性，提高了整个系统的生物安全性。
3.本发明所述肽类树状大分子组装体通过分层次组装的方式制备，工艺简单，可以通过控制各原料的配比进行形貌，荧光强度，载药量的控制，具有很强的可控性。
4.本发明所述肽类树状大分子组装体通过分层次组装的方式制备，能够通过不同化学键的引入设计制备得到具有不同肿瘤微环境响应的载药组装体，实现粒子在循环过程中的稳定性及肿瘤微环境响应性药物释放。
5.本发明所述肽类树状大分子组装体，提供了一种普适性的方法构建诊生物响应型诊断治疗一体化的纳米粒子，可以有更广的生物医学应用。
附图说明
图1为本发明实施例2中所肽类树状大分子的合成示意图。
图2为本发明实施例4中所述荧光分子前驱体的合成示意图。
图3为本发明实施例7中所述亲水高分子聚合物修饰的抗肿瘤药物前驱体的合成示意图。
图4为本发明生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体的制备流程图。
图5为本发明实施例10中所述动态化学键稳定的组装体包载疏水药物DOX的荧光光谱图
图6为本发明实施例11中所述肽类树状大分子的临界聚集浓度。
图7至图9为本发明实施例12中所述肽类树状大分子，肽类树状大分子体系及TSPDSs的粒径和电位。
图10至图12为本发明实施例12中所述肽类树状大分子，肽类树状大分子体系及TSPDSs的透射电镜图片。
图13为本发明实施例12中所述TSPDSs的能谱分析图。
图14为本发明实施例12中所述TSPDSs的X-射线电子能谱分析图。
图15为本发明实施例12中所述TSPDSs的热重分析图。
图16至图20为本发明实施例13中所述TSPDSs在不同环境中孵育不同时间时的粒径分布图。
图21为本发明实施例14中所述TSPDSs体外药物释放结果。
图22为本发明实施例15中所述TSPDSs的蛋白吸附结果。
图23为本发明实施例16中所述TSPDSs对A549细胞的毒性结果。
图24为本发明实施例16中所述TSPDSs对A549细胞周期分布影响图。
图25为本发明实施例16中所述TSPDSs及商品化顺铂作用后细胞内Pt的分布定量图。
图26和图27为本发明实施例17中所述TSPDSs胞内递送过程研究的激光共聚焦图片(附彩色图)。
图28为本发明实施例18中所述TSPDSs的活体成像图片(附彩色图)。
图29为本发明实施例18中所述TSPDSs的离体分布图片。
图30为本发明实施例19中所述TSPDSs对A549荷瘤鼠肿瘤体积影响结果。
图31为本发明实施例19中所述TSPDSs对A549荷瘤鼠体重影响结果。
图32为本发明实施例19中所述TSPDSs对A549荷瘤鼠的肿瘤进行组织形态学及免疫组化分析图片。
图33为本发明实施例19中所述TSPDSs对A549荷瘤鼠的心、肝、脾和肺进行组织形态学分析图片。
图34为本发明实施例19中所述TSPDSs对A549荷瘤鼠的肾脏进行组织形态学及免疫组化分析图片。
图35为本发明实施例19中所述TSPDSs对A549荷瘤鼠治疗结束后的血尿素氮及肌酐两项生化指标进行检测的结果。
图36为本发明实施例20中所述TSPDSs的药代动力学分析结果。
图37为本发明实施例21中所述TSPDSs单次给药后，Pt在肾及肿瘤组织处的分布结果。
具体实施方式
下面结合是实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的保护范围。以下实施例中所述原料选用分析纯且均为市售。
实施例1：肽类树状大分子的制备
a)对氨基酸进行官能团保护：根据所要制备的肽类树状大分子的核心分子表面官能团的不同对氨基酸进行保护，如核心分子表面官能团为氨基则对氨基酸的氨基进行保护，如核心分子表面官能团为羧基则对氨基酸的羧基进行保护；
b)制备一代肽类树状大分子：按比例称取核心分子(官能度为n，n＝1或2)、含保护基团的氨基酸(1.5n当量)，缩合剂(1.5n当量)和催化剂(1.5n当量)，在0℃，氮气保护下，加入到无水溶剂中，再往混合溶液中加入有机碱(4n当量)进行脱水缩合反应，而后在室温条件下反应，反应结束后，所得溶液经洗涤，干燥，过滤，减压浓缩，经过柱层析分离得到带有保护基团的第一代肽类树状大分子；
c)脱保护：准确称取带有保护基团的第一代肽类树状大分子(1n当量)和脱保护试剂(20n当量)，用溶剂溶解，在氮气保护下室温反应，脱除保护，减压浓缩，通过萃取或沉淀处理得到第一代肽类树状大分子；
d)制备二代肽类树状大分子：按比例称取第一代肽类树状大分子(官能度为2n)、含保护基团的氨基酸(3n当量)，缩合剂(3n当量)和催化剂(3n当量)，在0℃，氮气保护下，加入到无水溶剂中，再加入有机碱(8n当量)进行脱水缩合反应，而后在室温条件下反应，反应结束后，所得溶液经洗涤，干燥，过滤，减压浓缩，经过柱层析分离得到带有保护基团的第二代肽类树状大分子。
e)脱保护：准确称取带有保护基团的第二代肽类树状大分子(1n当量)和脱保护试剂(40n当量)，用溶剂溶解，在氮气保护下室温反应，脱除保护，减压浓缩，通过萃取或沉淀处理得到第二代肽类树状大分子；
重复以上缩合反应和脱保护步骤，可得到第三、第四代负电荷表面的肽类树状大分子。
本实施例中所述缩合剂、催化剂、有机碱、溶剂，可选择现有技术中已知的用于羧基与氨基的脱水缩合的各种缩合剂、催化剂、有机碱、溶剂。
实施例2：肽类树状大分子的具体合成例(合成路线如图1)
a)一代肽类树状大分子(LA-Glu-COOH)的合成
称取1g硫辛酸(LA),1.51g H-Glu(OtBu)-OtBu,1.12g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和0.79g1-羟基苯并三唑(HOBT)于100mL带支管的烧瓶中，抽真空，充氮气，反复三次，加入50mL重蒸二氯甲烷(DCM),冰浴搅拌溶解，加入19.2mLN,N-二异丙基乙胺(DIPEA),继续反应0.5h，撤去冰浴反应24h。依次用饱和NaCl，NaHCO3和HCl(1mol/L)洗涤，Na2SO4干燥后，过滤，减压除去溶剂，柱层析(洗脱剂为二氯甲烷/甲醇(DCM/MeOH＝15：1))分离得到浅黄色固体LA-Glu(OtBu)-OtBu。
b)脱保护
称取1.50gLA-Glu(OtBu)-OtBu于50mL带支管的单颈瓶中，抽真空，充氮气，加入5mL重蒸DCM溶解原料，接着加入5.2mL三氟乙酸(TFA)反应4h，减压除去TFA,油泵抽干后加入无水乙醚搅拌得到白色沉淀，即为LA-Glu-COOH。产物无需提纯，直接用于下一步反应。
c)二代肽类树状大分子(LA-Glu(G2)-COOH)的合成
称取1.00gLA-Glu-COOH,1.87g H-Glu(OtBu)-OtBu,1.39g EDCI和0.98g HOBT于100mL带支管的烧瓶中，抽真空，充氮气，反复三次，加入50mLDCM,冰浴搅拌溶解，加入24.0mLDIPEA,继续反应0.5h，撤去冰浴反应24h。依次用饱和NaCl，NaHCO3和HCl(1mol/L)洗涤，Na2SO4干燥后，过滤，减压除去溶剂，柱层析(洗脱剂为DCM/MeOH＝15：1)分离得到浅黄色固体LA-Glu(G2)(OtBu)-OtBu。
d)脱保护
称取1.00gLA-Glu(G2)(OtBu)-OtBu于50mL带支管的单颈瓶中，抽真空，充氮气，加入3mL重蒸DCM溶解原料，接着加入3.7mL TFA反应4h，减压除去TFA,油泵抽干后加入无水乙醚搅拌得到白色沉淀，即为LA-Glu(G2)-COOH。产物无需提纯，直接用于下一步反应。
e)三代肽类树状大分子(LA-Glu(G3)-COOH)的合成
称取0.50gLA-Glu(G2)-COOH,1.00g H-Glu(OtBu)-OtBu,0.73g EDCI和0.52g HOBT于100mL带支管的烧瓶中，抽真空，充氮气，反复三次，加入50mLDCM,冰浴搅拌溶解，加入2.1mLDIPEA,继续反应0.5h，撤去冰浴反应48h。依次用饱和NaCl，NaHCO3和HCl(1mol/L)洗涤，Na2SO4干燥后，过滤，减压除去溶剂，柱层析(洗脱剂为DCM/MeOH＝15：1)分离得到浅黄色固体LA-Glu(G3)(OtBu)-OtBu。
f)脱保护
称取1.00gLA-Glu(G3)(OtBu)-OtBu于50mL带支管的单颈瓶中，抽真空，充氮气，加入3mL重蒸DCM溶解原料，接着加入3.7mL TFA反应8h，减压除去TFA,油泵抽干后加入无水乙醚搅拌得到浅黄色沉淀，即为LA-Glu(G3)-COOH。产物无需提纯，直接用于下一步反应。
如图1中所示的LA-Glu(G3)-COOH的结构式，可以明显看出LA-Glu(G3)-COOH是外围包括羧基，核心分子包括可化学逆键-S-S-的扇形肽类树状大分子。
实施例3：荧光分子前驱体的制备
可修饰的成像分子采用荧光分子制备的成像分子即为荧光分子前驱体。
方法一：单官能团反应
按比例称取荧光分子(1n当量)，含引发基团的单官能团分子(1.2n当量)，缩合剂(1.2n当量)和催化剂(1.2n当量)，室温条件下在水中反应，反应结束后，透析除去缩合剂及未反应的分子，冻干得到产物并于-20℃条件下储存。
方法二：双官能团反应
按比例称取含引发基团的双官能团分子(1n当量)，荧光分子(2.2n当量)，缩合剂(2.2n当量)和催化剂(2.2n当量)，室温条件下在水中反应，反应结束后，透析除去缩合剂及未反应的分子，冻干得到产物冰浴-20℃条件下储存。
实施例4：荧光分子前驱体的具体合成例(合成路线如图2)
称取1.10mgCy5.5-活性酯(Cy5.5-NHS)溶于200μl二甲基亚砜(DMSO)，缓慢加至0.10mg胱胺的1mL水溶液中，室温避光反应24h后，4℃透析(截留分子量为1000)除去有机溶剂及未反应的分子。冻干得到Cy5.5-cystamine-Cy5.5，并于-20℃条件下储存。根据图2中Cy5.5-cystamine-Cy5.5的结构式可知，Cy5.5-cystamine-Cy5.5包括可逆化学键-S-S-。
实施例5：肽类树状大分子体系的制备
称取100mg LA-Glu(G3)-COOH溶于水中，在其临界胶束浓度之上，成为LA为疏水内核，谷氨酸羧基为亲水外围的纳米粒子。0.90mg三(2-羧乙基)膦(TCEP)于水中与8.79mgCy5.5-cystamine-Cy5.5反应45min将二硫键原位还原为巯基，并将其加入上述纳米粒子溶液中引发纳米粒子的交联，反应24h后去离子水中透析48h，冻干得到核稳定的肽类树状大分子体系。
实施例6：亲水高分子聚合物修饰的抗肿瘤药物前驱体的制备
a)称取氨基保护的的碱性氨基酸(1n当量)，亲水高分子聚合物(1n当量)，缩合剂(1.2n当量)和催化剂(1.2n当量)，在0℃，氮气保护下，加入到无水溶剂中，再往以上混合溶液中加入有机碱(4n当量)，而后在室温条件下反应，反应结束后，所得溶液经洗涤，干燥，过滤，减压浓缩，经过柱层析分离得到带有保护基团的碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物。
b)脱保护：准确称取带有保护基团的碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物(1n当量)，加入溶剂溶解后，再加入脱保护试剂(20n当量)，在氮气保护下室温反应，脱除保护后，减压浓缩，通过萃取或沉淀处理得到碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物。
c)亲水性抗肿瘤药物前驱体制备：称取抗肿瘤药物(1n当量)，碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物(1n当量)于室温条件下反应24h，浓缩透析得到亲水性抗肿瘤药物。碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物中的端基为氨基，氨基和亲水性抗肿瘤药物中的金属原子形成配位键。将亲水性抗肿瘤药物(1n当量)与AgNO3(1.9n当量)于37℃条件下避光反应4h，得到的白色沉淀通过10000rpm离心15min，通过0.22μm滤膜过滤即得抗肿瘤药物前驱体。
实施例7：亲水高分子聚合物修饰的抗肿瘤药物前驱体的具体合成例(合成路线如图3)
a)称取1g甲氧基聚乙二醇(mPEG),0.35g Boc-Lys(Boc)-Boc，0.23g EDCI和0.16g HOBT于100mL带支管的烧瓶中，抽真空，通氮气，反复三次，加入50mL DCM，冰浴搅拌溶解，加入0.7mL DIPEA，继续反应0.5h，撤去冰浴反应24h。依次用饱和NaCl，NaHCO3和HCl(1mol/L)洗涤，Na2SO4干燥后，过滤，减压除去溶剂，柱层析(洗脱剂为DCM/MeOH＝20：1)分离得到白色固体Boc-Lys(Boc)-mPEG(mPEG-K-Boc)。
b)脱保护：称取1g mPEG-K-Boc于50mL带支管的单颈瓶中，抽真空，充氮气，加入1mL重蒸DCM中溶解原料，接着加入1.1mLTFA反应4h，减压除去TFA，油泵后加入无水乙醚搅拌得到白色沉淀，即为具有良好亲水性的NH2-Lys-mPEG(mPEG-K)。产物无需提纯，直接用于下一步反应。
c)称取100.00mg K2PtCl4溶于2mL水中，向其中缓慢滴加68μL DMSO,室温避光搅拌4h，得到浅黄色沉淀，冰水洗，乙醇洗，乙醚洗，真空干燥得到Pt(DMSO)2Cl2。
c)亲水性抗肿瘤药物前驱体制备：称取50.00mg Pt(DMSO)2Cl2分散于1mLMeOH中，缓慢滴加至133.89mg mPEG-K的MeOH中，室温反应24h，mPEG-K的一端的NH2-中的氮原子与Pt(DMSO)2Cl2中的Pt原子形成配位键，过滤除去未反应的固体，滤液浓缩得到亲水性抗肿瘤药物Pt(II)-K-mPEG。称取100.0mgPt(II)-K-mPEG溶于水中，并与25.84mg AgNO3于室温避光条件下反应4h以除去氯离子。白色沉淀通过10000rpm离心15min，再通过0.22μm滤膜过滤去除上清液即得到亲水高分子聚合物修饰的抗肿瘤药物前驱体。
实施例8：环境响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体的制备
称取88.70mg核稳定的肽类树状分子体系，在3.20mg NaOH的水溶液中反应去质子化，再与AgNO3处理的Pt(II)-K-mPEG于37℃条件下反应24h。去离子水中透析(截留分子量为3500)48h，冻干得到稳定的环境响应型的肽类树状大分子组装体(TSPDSs)。Pt(II)-K-mPEG中的Pt能够和肽类树状大分子体系中外围的羧基通过配位键实现药物的装载。图4为制备环境响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体的流程图。
实施例9：疏水性抗肿瘤药物的装载
将核稳定的肽类树状分子体系与疏水性抗肿瘤药物(一定质量比)共溶于少量良溶剂(如二甲基亚砜)中，于超声条件下缓慢滴加至大量去离子水中，超声10min后，室温下搅拌24h，浓缩，过滤，滤液冻干，即可得到负载疏水性抗肿瘤药物的生物响应型诊疗一体化肽类树状大分子组装体。
实施例10：疏水药物DOX的具体装载实例
称取100.00mg核稳定的肽类树状分子体系和10.00mg疏水阿霉素(DOX),溶于100μL二甲基亚砜中，于超声条件下缓慢滴加至10mL去离子水中，超声10min后，室温下剧烈搅拌24h，浓缩，450μm滤膜过滤，收集滤液，冻干，即可得到负载疏水DOX的组装体。
DOX作为具有荧光的疏水模型药物。通过荧光光谱可以验证其是否包载入该组装体中。如图5所示，与游离DOX相比，相同浓度下包载入组装体内的DOX显示出更低的荧光强度，这是由于DOX聚集而导致的荧光淬灭，表明DOX被包载如组装体疏水空腔。
实施例11：肽类树状大分子临界聚集浓度的测定实例
肽类树状大分子的临界聚集浓度通过芘荧光法进行测定。具体的，将芘溶于丙酮中制备到浓度6.0×10-5mol/L。肽类树状大分子1mL水溶液配置成一系列浓度(1.010-6至1.0mg/mL)。向其中加入10μL芘的丙酮溶液，超声30min讲丙酮彻底挥干。固定395nm发射波长测定300nm至360nm的发射光谱。以浓度的对数为横坐标，I338/I334为纵坐标，拟合得到两条直线，两条直线的交点即为肽类树状大分子的临界聚集浓度。
如图6所示，该肽类树状大分子的临界聚集浓度为43.6μg/mL。
实施例12：TSPDSs的表征
1)粒径，电位及形貌表征
肽类树状大分子，肽类树状大分子体系及肽类树状大分子组装体(TSPDSs)配置成水溶液100μg/mL，采用动态光散射法(DLS)测定其水合粒径和Zeta电位，每个样品重复3次。
结果如图7，图8和图9所示，肽类树状大分子粒径为160.9±2.4nm，电位为-8.79±0.45mV,肽类树状大分子体系粒子粒径为67.6±5.7nm，电位为-9.12±0.20mV，结果表明肽类树状大分子交联后粒子具有更加紧实的结构，粒径较小。通过超分子作用实现药物装载及PEG化后，粒子粒径进一步变大为126.4±3.7nm，电位为-20.20±0.27mV。
对肽类树状大分子，肽类树状大分子体系及肽类树状大分子组装体用透射电镜(TEM)进行形貌及粒径的表征。将100μg/mL的样品滴在铜网上，室温条件下干燥后即可进行检测，如图10-图12所示，透射电镜的结果均与DLS的结果相符合。
2)特征能谱分析(EDS)及X-射线电子能谱(XPS)
铂元素在TSPDSs中的存在及存在形式通过特征能谱分析及X-射线电子能谱进行分析。
TSPDSs在进行扫描电镜检测时同时进行特征能谱分析，如图13所示，TSPDSs中可见C、O、S、Cl及Pt的特征峰。
TSPDSs进行X-射线电子能谱分析，如图14所示，Pt的结合能,75.8eV和72.3eV，表明Pt以+2价的形式存在。
3)热重分析(TGA)
准确称取10mg的TSPDSs，置于坩埚中，使用德国耐驰公司的热失重分析仪，在空气氛围中，以10℃/min的升温速率测定TSPDSs从40℃到900℃的质量变化曲线。同时相同条件下对肽类树状大分子及mPEG-K的混合物做热重分析用做对比。
结果如图15所示，肽类树状大分子及mPEG-K的混合物在温度上升至420℃时，残余质量趋于平稳，温度上升至600℃时，残余质量为1.46％，而TSPDSs在530℃时残余质量趋于平稳，最终残余质量为14.44％。该结果表明在空气氛围中，随着温度的上升，有机物逐渐被燃烧氧化并被吹扫气带走，最后至剩下无法被燃烧的金属。残余质量的差值为12.98％即为TSPDSs中Pt的含量。
实施例13：TSPDSs在不同生理环境中的粒径变化
将TSPDSs配置成100μg/mL不同条件(磷酸盐缓冲液、pH＝7.4、pH＝6.8、pH＝5.0、10μM DTT及10mM DTT)的水溶液,分别模拟正常生理环境，肿瘤组织环境及肿瘤细胞内环境。孵育不同时间(0h，0.5h，1.0h，6.0h和12.0h)后，通过DLS测定粒子的粒径变化。设置三个平行样。
如图16到图20所示，在正常生理环境及肿瘤组织环境中(即pH 7.4，pH 6.8及10μMDTT),TSPDSs的粒径变化不大，而在肿瘤细胞内环境中(pH＝5.0)，低pH条件下，TSPDSs粒径明显变小，表明在酸性条件下该TSPDSs脱去PEG层释放抗肿瘤药物。而在强还原环境中(10mM DTT)，该TSPDSs粒径变大，表明该组装体呈现解组装的过程。这一结果揭示了该TSPDSs在体内循环过程中稳定存在，当其到达肿瘤部位时能够实现抗肿瘤药物的释放，同时实现组装体的崩解。
实施例14：TSPDSs体外释放行为的研究
在1mL pH 7.4，pH 6.8+10μM DTT，pH 5.0，及pH 5.0+10mM DTT的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中分别溶解1mgTSPDSs。分别将上述制备的溶液转移至截留分子量为2000的透析袋中，并浸没于20mL相应的PBS中，于37℃条件摇床中孵育。在设定的时间点时，取出0.5mL透析袋外的液体，并及时补充相应的新鲜PBS。设置三个平行样。释放的Pt用电感耦合等离子共振质谱仪进行分析。
结果如图21所示，pH 7.4条件下，释放48h时，Pt的释放量不足20％；pH 6.8+10μMDTT条件下，释放48h时，Pt的释放量不足50％。而在pH 5.0条件下，释放8h，Pt的释放量即到达50％以上。pH 5.0+10mM DTT条件下，释放8h，Pt的释放量达到了65％。表明肿瘤微环境低pH条件能够触发Pt的释放，同时强还原环境能够触发组装体的崩解进而加速Pt的释放。而在正常生理环境中，TSPDSs能够保持稳定，避免了药物的提前释放对正常组织造成损伤。
实施例15：TSPDSs抗蛋白吸附研究
以牛血清蛋白(BSA)为模型蛋白，考察TSPDSs的蛋白吸附行为。将BSA配置成100μg/mL的PBS(pH 7.4)溶液。与等体积等浓度的商品化顺铂溶液于37℃孵育1h，2h，4h和6h后，取1mL样品，8000rpm离心15min，上清液用紫外可见(UV-Vis)分光光度计检测280nm处的吸收，通过标准曲线法测定吸附的蛋白量。设置三个平行样。
结果如图22所示，商品化顺铂及TSPDSs的蛋白吸附量很低，均在20％以下。表明TSPDSs具有较好的抗蛋白吸附作用，具有较长的血液循环时间同时在血液循环过程中能够很好的保持其形态。
实施例16：TSPDSs体外生物学评价
1)细胞毒性评价
利用CCK-8法测定TSPDSs的体外细胞毒性。选取处于生长活跃期的人肺腺癌细胞(A549细胞)接种于96孔板中，初始细胞接种密度为8×103个/孔，加入100μL RPMI 1640培养基培养24h，配置不同Pt浓度(0.002、0.01、0.02、0.1、0.2、1、2、4、10和20μg/mL)的材料的培养基溶液与细胞孵育48h。不同Pt浓度下等量的肽类树状大分子(D)，mPEG-K，D+mPEG-K的培养基溶液作实验对照。细胞不做任何处理作为空白对照。孵育48h后，移除培养基，PBS(pH 7.4)洗涤三遍，加入100μL无血清培养基稀释10倍的CCK-8，无细胞仅100μL无血清培养基稀释10倍的CCK-8作对照，37℃孵育2h后，用酶标仪测定450nm处的吸光值。每个浓度设置6个平行样。相对细胞存活率按以下公式计算：
Cell Viability＝(ODsample-ODbackground)/(ODcontrol-ODbackground)×100％
结果如图23所示，D、mPEG-K，及两者的物理混合物(D+mPEG-K)在低浓度和高浓度时细胞存活率均在100％左右，显示出良好的生物相容性，而TSPDSs在Pt浓度为1μg/mL时从100％的细胞存活率降至90％，随着Pt浓度的增加，细胞存活率逐渐减低，4μg/mL时，细胞存活率降至50％左右，10μg/mL时细胞存活率将至10％以下。肽类树状大分子及mPEG-K作为基础材料显示出良好的生物安全性，而构建的TSPDSs具有较好的体外抗肿瘤效果。
2)细胞周期检测
采用碘化丙锭(PI)染色流式细胞术(FACS)对材料对细胞周期的影响进行检测。选取处于生长活跃期的A549细胞接种于6孔板中，初始细胞接种密度为2×105个/孔，将D+mPEG-K，商品化顺铂及TSPDSs(Pt浓度为1.5μg/mL)分别与细胞孵育，细胞不做任何处理作为空白对照。24h后，移除培养基，PBS(pH 7.4)洗涤一次，胰酶消化后收集细胞，1000rpm离心5min，弃掉上清液，用冰浴预冷的70％乙醇于4℃固定2h后，冰浴预冷的PBS洗两次，按照碧云天公司提供实验操作手册用500μLPI工作液重悬细胞，37℃条件下避光孵育30min，最后使用流式细胞仪检测细胞周期分布，488nm激发光，收集575nm处发射光。每个实验组设置三个平行样。
结果如图24所示，未进行任何材料处理的细胞及D+mPEG-K处理的细胞显示很低的凋亡(subG1期细胞不足2％)，同时60％左右细胞处于G0/G1期，10％左右细胞处于S期，30％左右细胞处于G2/M期。而商品化顺铂及TSPDSs处理的细胞显示较低的凋亡细胞(subG1期4％左右)，但仅15％左右的细胞处于G0/G1期，10％左右细胞处于S期，75％左右细胞处于G2/M期。相关研究表明，铂类药物能够与DNA碱基发生配位，抑制DNA的复制，使得细胞周期阻滞于G2/M期，最终引起细胞凋亡。实验结果显示通过设计制备得到的TSPDSs具有与顺铂类似的抗肿瘤机制，而肽类树状大分子及mPEG-K对细胞周期无影响。
3)胞内Pt分布
选取处于生长活跃期的A549细胞接种于6孔板中，初始细胞接种密度为2×105个/孔，将商品化顺铂和TSPDSs(Pt浓度为1.5μg/mL)分别与细胞孵育24h后，移除培养基，PBS(pH 7.4)洗涤一次，胰酶消化后收集细胞，进行细胞计数后，1000rpm离心5min，收集细胞，按照Thermo Fisher Scientific公司操作手册进行细胞核细胞质分离。H2O2和HNO3消解后，利用ICP-MS进行细胞质细胞核内Pt含量的测定。
结果如图25所示，TSPDSs在细胞内的富集量为211.4ng Pt/106个细胞，略多于商品化顺铂(196.5ng Pt/106个细胞)。同时TSPDSs能够递送更多的Pt进入细胞核(52.1％)，商品化顺铂仅能递送49.7％Pt如细胞核。
实施例17：TSPDSs体外细胞递送
选取处于生长活跃期的A549细胞按初始密度为5×103个/皿接种于玻底皿中，培养24h，加入TSPDSs分别孵育1h和3h，用PBS(pH 7.4)洗涤两遍，用4％多聚甲醛固定5min后，DiO进行细胞膜染色25min，PBS(pH 7.4)洗涤两遍，在激光共聚焦显微镜(confocal laserscanning microscope，CLSM)下观察并采集荧光图片。
结果如图26所示，红色荧光代表TSPDSs，绿色代表DiO标记的细胞膜，1h时即能在细胞能找到TSPDSs的红色荧光。随着孵育时间的增加，越来越多的红色荧光进入细胞内。
选取处于生长活跃期的A549细胞按初始密度为5×103个/皿接种于玻底皿中，24h后，加入TSPDSs分别孵育3h和6h，用PBS(pH 7.4)洗涤两遍，用含有LysoTracker BlueDND-22(50mM)的培养基标记溶酶体，然后用PBS(pH 7.4)洗涤两遍。细胞与谷胱甘肽乙酯(GSH-OEt)预先孵育2h后再与TSPDSs孵育3h后进行溶酶体染色作比较。利用CLSM进行荧光图像采集。
结果如图27所示，红色荧光代表TSPDSs，蓝色代表LysoTracker标记的溶酶体。孵育3h时，TSPDSs的红色荧光和溶酶体的蓝色荧光几乎重叠，表明TSPDSs内吞进入溶酶体，随着孵育时间的增长，6h时，TSPDSs的红色荧光和溶酶体的蓝色荧光部分分离，表明TSPDSs从溶酶体中逃逸出来。通过对细胞预先GSH-OEt处理，提高细胞内GSH含量，在孵育3h即可观察到明显的溶酶体逃逸现象。表明该TSPDSs通过溶酶体途径进入细胞，并在溶酶体弱酸性条件及高GSH浓度环境中发生崩解及药物的释放，同时荧光基团的引入能够有效的实现整个胞内途径的示踪。
实施例18：TSPDSs体内成像效果评价
1)体内成像
选取4周龄的BALB/c雄性裸鼠，在其腋下接种2×106个A549癌细胞，待其上肿瘤长至100mm3左右，尾静脉注射TSPDSs，单次给药剂量为3.25mg Pt/kg/只，将小鼠用4％的水合氯醛麻醉后，使用CRi Maestro EX活体成像仪，以675nm为激发波长，695nm为发射波长，在注射前，及注射后1h，3h，6h进行活体成像研究。使用Maestro measurement software对成像结果进行处理。
结果如28所示，TSPDSs在给药后1h开始在肿瘤组织处富集，随着时间的增加，TSPDSs在肿瘤组织处富集量增大。表明TSPDSs能够通过增强肿瘤渗透及滞留(EPR)效应在肿瘤组织处富集，通过诊疗粒子的构建能够有效的将粒子在肿瘤组织处的富集过程可视化，同时粒子在肿瘤组织处的富集能够有效的降低药物在其他组织的分布，从而降低药物的毒副作用。
2)离体成像
24h后，将裸鼠处死并将心、肝、脾、肺、肾及肿瘤进行剥离，用PBS(pH 7.4)洗涤两遍，置于CRi Maestro EX活体成像仪，以675nm为激发波长，695nm为发射波长进行成像研究，小鼠尾静脉注射生理盐水的脏器最为对照。使用Maestro measurement software对成像结果进行处理。
结果如图29所示，TSPDSs在肿瘤处富集量最大，与活体成像结果一致。
实施例19：TSPDSs体内抗肿瘤效果评价
1)小鼠肿瘤体积变化及体重变化
选取4周龄的BALB/c雄性裸鼠，在其右后腿上部接种2×106个A549癌细胞，待其上肿瘤长至100mm3左右，将老鼠随机分为4组(6只每组)，分别尾静脉注射生理盐水，D+mPEG-K，商品化顺铂及TSPDSs，给药剂量为3.25mg Pt/kg/只，每三天给药一次，共给药4次，同时进行肿瘤体积及小鼠体重的测量。每三天测量一次，共持续21天。
肿瘤体积变化结果如图30所示，生理盐水及D+mPEG-K组肿瘤体积增长至初始肿瘤的6倍左右，而商品化顺铂及TSPDSs组肿瘤体积仅增长至初始肿瘤的1.5倍左右，且TSPDSs的治疗效果稍稍好于商品化顺铂。
小鼠体重变化结果如图31所示，生理盐水及D+mPEG-K组小鼠体重变化不明显，到治疗结束，小鼠体重稍稍上升。商品化顺铂组在第四次给药时，小鼠体重开始下降，体重仅为初始体重的90％，第五次体重测量时，小鼠的体重下降至最低，仅初始体重的85％，整个治疗结束，小鼠的体重未能恢复，仅为初始体重的87％。而TSPDSs组小鼠体重未见下降，且小鼠体重有缓慢上升的趋势。
2)肿瘤及脏器切组织学及免疫组化分析
小鼠在完成21天治疗后，取其中三只断颈处死，剥离心肝脾肺肾及肿瘤，4％福尔马林固定24h，石蜡包埋后切片，用苏木精伊红(H&E)染色进行组织病理学分析，用CD31，Ki-67及TUNEL染色进行免疫组化分析。
结果如图32所示，肿瘤组织的病理学及免疫组化结果显示，生理盐水组及D+mPEG-K组，小鼠肿瘤组织肿瘤细胞形态正常，且分布密实紧凑，而商品化顺铂及TSPDSs组的肿瘤组织处肿瘤细胞明显变小，肿瘤组织疏松，不密实。通过CD31对新生血管进行染色，Ki-67对增殖细胞进行染色，及TUNEL对凋亡细胞进行染色，实验结果表明生理盐水及D+mPEG-K组新生血管，增殖细胞很明显，而凋亡的细胞较少。TSPDSs组小鼠肿瘤组织的新生血管及增殖的细胞明显减少，同时凋亡的细胞明显增多。这一结果显示，TSPDSs能够有效的杀伤癌细胞，抑制新生血管的生成及癌细胞的增殖，同时引起癌细胞的凋亡。
对心肝脾肺脏器进行H&E染色分析，结果如图33显示，生理盐水，D+mPEG-K及TSPDSs组对小鼠的心肝脾肺四个脏器无明显影响，商品化顺铂对小鼠的心脾肺无明显影响，但肝组织处干细胞的形态出现不正常，表明商品化顺铂对肝组织有一定的损伤。对肾脏进行H&E染色剂TUNEL染色分析，结果如图34所示，生理盐水，D+mPEG-K及TSPDSs组小鼠的肾脏形态正常，而商品化顺铂组小鼠的肾脏出现明显的病变，如肾小球的肿胀，边缘糊化，同时出现肾脏细胞的凋亡。
以上结果表明，通过整合纳米技术能够有效的进行癌症治疗其效果与商品化顺铂相当，减少小分子药物对正常组织产生的毒性从而降低药物的毒副作用。
3)生化指标分析
小鼠在完成21天治疗后，每组取三只，眼球取血至肝素管中，3000rpm离心15min，分离得到血清进行血尿素氮及肌酐含量测定。
结果如图35所示，血尿素氮及肌酐表征肾的生理机能，商品化顺铂组血尿素氮及肌酐两项指标均高于其他三组，表明商品化顺铂对于肾脏有相应的毒副作用，也正是铂类药物对肾脏的毒性限制着其在临床上的应用。
实施例20：TSPDSs药代动力学分析
选取4周龄BALB/c雄鼠，商品化顺铂及TSPDSs进行尾静脉单次给药，给药剂量为3.25mgPt/kg/只，在给药后特定的时间点(0.05h，0.5h，1h，6h和12h)对小鼠进行眼球取血1mL，样品用H2O2和HNO3进行消解后定容成5mL水溶液，ICP-MS测定样品中Pt的含量。设置三个平行样。
结果如图36所示，0.05h时，商品化顺铂组Pt的血药浓度仅13μg/mL左右，0.5h时，血液中Pt的浓度已趋近于0，而TSPDSs组在0.05h时，血液中Pt的浓度约为100μg/mL,6h时，Pt的浓度约为10μg/mL，表明TSPDSs能够有效的增加药物的半衰期，增长药物在血液中的滞留时间。
实施例21：TSPDSs组织分布分析
选取4周龄的BALB/c雄性裸鼠，在其右后腿上部接种2×106个A549癌细胞，待其上肿瘤长至100mm3左右，商品化顺铂及TSPDSs进行尾静脉单次给药，给药剂量为3.25mg Pt/kg/只，在给药后2h和12h后将小鼠处死，剥肾和肿瘤，记录重量后，用H2O2和HNO3进行消解后定容成5mL水溶液，ICP-MS测定样品中Pt的含量。设置三个平行样。
结果如图37所示，2h和12h时，商品化顺铂组药物在肾组织处的量大于其在肿瘤处的量。而TSPDSs组，药物在肿瘤组织处的量明显大于其在肾脏处的量，同时随着时间的增长，药物在肿瘤组织处的量会明显增加。

Claims (10)

1.一种生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体，其特征在于，包括肽类树状大分子体系和抗肿瘤药物前驱体；所述肽类树状大分子体系包括肽类树状大分子和成像分子，肽类树状大分子包括可逆化学键和羧基，成像分子包括可逆化学键或能与可逆化学键反应的官能团，成像分子引发肽类树状大分子交联，形成肽类树状大分子体系；所述抗肿瘤药物前驱体由抗肿瘤药物经过物理或化学处理制得，抗肿瘤药物前驱体和肽类树状大分子体系通过弱相互作用形成自组装单元。
2.根据权利要求1所述的肽类树状大分子组装体，其特征在于，所述肽类树状大分子为一代肽类树状大分子、二代肽类树状大分子或三代肽类树状大分子，优选为三代肽类树状大分子。
3.根据权利要求1所述的肽类树状大分子组装体，其特征在于，所述肽类树状大分子为扇形肽类树状大分子。
4.根据权利要求3所述的肽类树状大分子组装体，其特征在于，所述扇形肽类树状大分子的外围包括羧基，扇形肽类树状大分子的核心分子包括可逆化学键，内核具有疏水性；所述扇形肽类树状大分子的结构式如下：
其中，R1和Rm一起构成扇形肽类树状大分子的核心分子，m代表核心分子的官能度，m为1或2；E为谷氨酸，赖氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，天冬氨酸，组氨酸中的至少一种；D为酸性氨基酸；G1.0、G2.0和G3.0分别代表一代肽类树状大分子、二代肽类树状大分子和三代肽类树状大分子。
5.根据权利要求4所述的肽类树状大分子组装体，其特征在于，所述可逆化学键pH敏感化学键、氧化还原敏感化学键、活性氧(ROS)敏感化学键或酶敏感化学键。
6.根据权利要求1所述的肽类树状大分子组装体，其特征在于，所述抗肿瘤药物采用亲水性抗肿瘤药物，其结构式如下：
其中，K为碱性氨基酸；R2为亲水高分子聚合物；M为金属原子。
7.根据权利要求6所述的肽类树状大分子组装体，其特征在于，所述亲水高分子聚合物R2为聚乙二醇、聚乙二醇单甲醚和聚乙烯醇中任意一种。
8.一种生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备肽类树状大分子；
2)制备成像分子；
3)将成像分子加入肽类树状大分子的水溶液中，成像分子引发肽类树状大分子的交联，制备肽类树状大分子体系；
4)抗肿瘤药物的负载。
9.根据权利要求8中所述的肽类树状大分子组装体的制备方法，其特征在于，所述抗肿瘤药物的负载包括以下步骤：
疏水性抗肿瘤药物的装载：将肽类树状大分子体系与疏水性抗肿瘤药物共溶于少量溶剂中，于超声条件下缓慢滴加至大量去离子水中，超声10min后，室温下搅拌24h，浓缩，过滤，滤液冻干，即可得到负载疏水性抗肿瘤药物的肽类树状大分子组装体；
亲水性抗肿瘤药物的装载：将亲水性抗肿瘤药物于水中活化制备抗肿瘤药物前驱体，将抗肿瘤药物前驱体滴加至肽类树状大分子体系的水溶液中，室温反应24h后，浓缩，透析冻干，即可得到负载亲水性抗肿瘤药物的肽类树状大分子组装体。
10.根据权利要求9中所述的肽类树状大分子自组装体的制备方法，其特征在于，所述亲水性抗肿瘤药物的制备包括以下步骤：
1)称取氨基保护的碱性氨基酸(1n当量)，亲水高分子聚合物(1n当量)，缩合剂(1.2n当量)和催化剂(1.2n当量)，在0℃，氮气保护下，加入到无水溶剂中；再往以上混合溶液中加入有机碱(4n当量)，室温条件下反应，反应结束后的溶液经洗涤、干燥、过滤、减压浓缩，经过柱层析分离得到带有保护基团的碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物；
2)准确称取带有保护基团的碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物(1n当量)，加入溶剂溶解后，再加入脱保护试剂(20n当量)，在氮气保护下室温反应，脱除保护后，减压浓缩，通过萃取或沉淀处理得到碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物；
3)称取抗肿瘤药物(1n当量)，碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物(1n当量)于室温条件下反应24h，浓缩透析得到亲水性抗肿瘤药物。
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