CN104231193B

CN104231193B - 一种pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104231193B
Application number: CN201410366575.5A
Authority: CN
Inventors: 董岸杰; 黄平升; 邓联东
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin Bohua Xinchuang Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2014-07-29
Filing date: 2014-07-29
Publication date: 2016-10-05
Anticipated expiration: 2034-07-29
Also published as: CN104231193A

Abstract

本发明涉及一种pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒及其制备方法和应用。纳米粒表面是至少含有聚羧酸甜菜碱(PCB)或聚乙二醇(PEG)的亲水层，内部是至少含有pH敏感的聚合物单元的疏水核，亲水层与疏水核之间是由聚甲基丙烯酰胺乙基吡啶二硫醚(PDS)单元间经交联反应形成的二硫键(S‐S)交联层。在pH与氧化还原双敏感层交联纳米粒的表面亲水层上可修饰上肿瘤靶向基团，通过纳米粒对肿瘤细胞的特异性靶向作用，促进纳米粒在肿瘤组织的富集和肿瘤细胞的内吞。本发明提供的双敏感层交联纳米粒，其生物相容性好，毒性低。在肿瘤细胞内谷胱甘肽作用下交联结构解离，促进药物释放。制备方法简便、稳定性良好、便于操作推广。

Description

一种pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及高分子化学和生物医学工程领域，特别是涉及一种pH与氧化还原双敏感聚合物层交联纳米粒，及其制备方法和应用。

背景技术

目前，癌症(即恶性肿瘤)是世界上发病率和死亡率都比较高的疾病之一。在众多治疗癌症的手段中，化疗是最重要的治疗方法之一，但由于体循环的清除作用、肿瘤组织低渗透性、肿瘤细胞耐药性等问题，严重阻碍了抗肿瘤药物向肿瘤细胞的递送效率，导致疗效差。此外，现有抗肿瘤药物在杀伤肿瘤细胞的同时对正常组织也产生严重的毒副作用，导致临床治疗往往因毒副作用大而失败，或因毒副作用的限制无法提高剂量而达不到理想治疗效果。可见，要提高化疗效果、降低毒副作用，必须提高抗肿瘤药物的靶向递送效率，降低药物在正常组织内的聚集。纳米载体与各种促进肿瘤靶向递送手段的结合，为抗肿瘤药物的靶向递送带来了希望。

此外，肿瘤组织具有有别于正常组织的特异微环境，首先表现为肿瘤组织与正常组织之间存在pH梯度：血液和正常组织的pH约为7.4，而肿瘤组织的pH在6.8左右，肿瘤细胞内的内涵体及溶酶体的pH为4.0～6.5。其次，肿瘤细胞质内的谷胱甘肽(GSH)的浓度(～10mmol)远高于血液和正常组织内的谷胱甘肽浓度(2～20μmol)。因此，为提高抗肿瘤药物的靶向递送效率，人们设计了多种pH、氧化还原敏感的纳米载体，旨在促进药物在肿瘤组织及肿瘤细胞内的释放。但是，非交联结构的pH或GSH敏感的纳米载体，不仅体循环稳定性较差，而且在正常生理环境里24h内有高于20％的药物被释放出来。为提高纳米粒的稳定性，人们采用pH或GSH敏感的化学键进行核或壳交联。虽然单一敏感的交联结构能够有效降低药物在体循环过程中的释放，但难以实现肿瘤细胞内的药物快速释放。

本发明目的在于提供一种肿瘤靶向并响应肿瘤细胞内环境药物释放的纳米粒，特点是：在人体循环中结构稳定并有效抑制药物释放，能够靶向肿瘤组织并在肿瘤细胞内协同响应低pH和GSH刺激，快速释放药物的纳米粒，解决抗肿瘤药物肿瘤靶向递送问题。

发明内容

本发明中，以活性可逆加成链转移(RAFT)聚合方法，制备结构和组成可控的两亲性两性离子聚合物，键合对恶性肿瘤具有特定靶向作用的配体，即靶向基团，构建抗肿瘤药物靶向递送的纳米载体。旨在通过靶向基团，亲水段，二硫键可逆交联壳层、pH敏感疏水内核的协同作用，提高纳米载体的靶向递送效率，实现药物在肿瘤细胞内的定位可控释放，以解决现有技术中纳米药物载体的体循环清除速率快、靶向性差、控释效果差等诸多问题。

首先，本发明提供了一种pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒，其特征在于，所述的纳米粒表面是至少含有聚羧酸甜菜碱(PCB)或聚乙二醇(PEG)的亲水层，内部是至少含有pH敏感的聚合物单元的疏水核，亲水层与疏水核之间是由聚甲基丙烯酰胺乙基吡啶二硫醚(PDS)单元间经交联反应形成的二硫键(S-S)交联层。

优选的，所述的pH敏感的聚合物为聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯(PDPA)。PDPA在pH＝7.4环境下疏水，即保持纳米粒内核的疏水性，用于药物负载和体循环稳定性；在pH6.5以下能质子化变为亲水。因此，在体循环(pH7.4)下，PDPA为内核的纳米粒保持稳定；但被肿瘤细胞摄取后，在内涵体/溶酶体pH 4.0～6.5条件下，PDPA链上的二异丙氨基发生质子化而使内核由疏水变为亲水，协同交联层二硫键(S-S)的GSH响应性断裂，促进纳米粒在肿瘤细胞内崩解并快速释放药物。

优选的，pH与氧化还原双敏感层交联纳米粒的表面亲水段为两性离子聚合物聚羧酸甜菜碱(PCB)，其能够通过静电作用形成稳定的水化层，降低RES对纳米粒的体循环清除。

优选的，在pH与氧化还原双敏感层交联纳米粒的表面亲水层上可修饰上肿瘤靶向基团，通过纳米粒对肿瘤细胞的特异性靶向作用，促进纳米粒在肿瘤组织的富集和肿瘤细胞的内吞。

优选的，靶向基团与聚合物的摩尔比为0.01～1。

优选的，肿瘤靶向基团选自多肽RGD、CRGDRGPDC、CRGDKGPDC、CGNKRTRGC、CRGDK、CGNKRTRGC、RPARPAR，以及白细胞介素IL-13p、叶酸等；其中的R、G、D、C、K等大写字母是各种氨基酸的单字符缩写符号，如R代表精氨酸，G代表甘氨酸。

进一步优选的，由式1所示的1)RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA或2)RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA与PCB-b-PDS-b-PDPA聚合物共组装形成纳米粒，再经PDS的交联反应形成层交联纳米粒。其特征在于(如附图1所示)，该纳米粒最外层为能够与肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞表面过表达的整合素受体结合的RGD和两性离子PCB；内部为高度pH敏感的PDPA疏水核；亲水层与疏水核之间为二硫键交联层。该纳米粒，通过亲水段两性离子的静电作用形成稳定的水化层，使得纳米粒在血液循环中能够稳定存在，减少RES系统的清除，延长体循环时间；RGD靶向配体，提高纳米载体在肿瘤组织的富集和滞留，增强肿瘤细胞对纳米药物载体的摄取；二硫键壳层交联，抑制药物在正常生理条件下的释放以降低毒副作用，而被肿瘤细胞摄取后，在肿瘤细胞内谷胱甘肽(GSH～10mM)作用下，二硫键断裂使交联结构快速解离；酸敏感的疏水内核在内涵体/溶酶体微酸环境中(pH 4.0～6.5)，发生疏水-亲水转变而使纳米粒解体，促进药物快速释放，提高药效。

...............式1

优选的，RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA或PCB-b-PDS-b-PDPA嵌段聚合物中，PCB聚合度x为25～70的整数，PDS聚合度y为1～15的整数，PDPA聚合度z为25～70的整数。

优选的，可通过调节三个嵌段的聚合度，调节聚合物的数均分子量；RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA聚合物的数均分子量优选为11000～35000Da。

第二，本发明提供了第一方面所述pH与氧化还原双敏感的聚合物的制备方法，是采用活性可逆加成链转移(RAFT)聚合方法制备，特征是：1)采用三硫代十二烷基-2-异丙酸酯(CTAm)为RAFT链转移剂，偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，逐步引发羧酸甜菜碱叔丁酯甲基丙烯酸甲酯(CB-tBU)、甲基丙烯酰胺乙基吡啶二硫醚(DS)和甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯(DPA)聚合，得到PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA三嵌段聚合物；2)二甲基亚砜(DMSO)中，PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)在室温下反应2-4h后，加入巯基乙醇淬灭未反应的EDC.HCl，之后加入RGD，于室温下继续反应12-36h，得到RGD-PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA三嵌段聚合物；3)将RGD-PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA或PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA三嵌段聚合物在室温下用三氟乙酸(TFA)水解PCB(tBU)链段上的叔丁酯，得到RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA或PCB-b-PDS-b-PDPA三嵌段聚合物。

更具体地，RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA或PCB-b-PDS-b-PDPA制备方法：

1)PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA三嵌段聚合物的制备：以三硫代十二烷基-2-异丙酸酯(CTAm)为RAFT链转移剂，偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，在二甲基甲酰胺(DMF)中和氮气保护下，68～72℃下引发羧酸甜菜碱叔丁酯甲基丙烯酸甲酯(CB-tBU)聚合；反应24h后，降至室温，在氮气保护下，加入甲基丙烯酰胺乙基吡啶二硫醚(DS)并补加AIBN，在68～72℃下继续引发DS聚合；反应24h后，降至室温后，加入甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯(DPA)并补加引发剂AIBN，氮气保护下，68～72℃下继续反应24h；反应结束后，产物用截留分子量为8000～14000的透析袋进行去离子水透析提纯，冷冻干燥得到PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA三嵌段聚合物。

2)RGD-PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA三嵌段聚合物的制备：二甲基亚砜(DMSO)中，PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)于室温下反应2～4h后，加入巯基乙醇淬灭未反应的EDC.HCl；之后加入RGD，于室温下继续反应12～36h；反应产物用截留分子量为8000～14000透析袋进行去离子水透析提纯，冷冻干燥得到RGD-PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA三嵌段聚合物。

3)RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA或PCB-b-PDS-b-PDPA三嵌段聚合物的制备：将RGD-PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA或PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA三嵌段聚合物溶解于三氟乙酸(TFA)中，在室温下反应2～6h，水解PCB(tBU)链段上的叔丁酯；反应结束后，用旋转蒸发仪旋出TFA后，溶解于DMSO中，用去离子水透析72h，每12h更换一次透析液，冷冻干燥得到RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA或PCB-b-PDS-b-PDPA三嵌段聚合物。

上述的pH与氧化还原双敏感的聚合物的制备方法，操作简便、稳定性好、便于推广应用。

第三，本发明实施例提供了第一方面所述的双敏感层交联纳米粒作为疏水抗肿瘤药物载体的应用，核内负载疏水性药物。

优选的，所述疏水药物选自阿霉素(DOX)、紫杉醇(PTX)、多西他赛(TXT)、喜树碱(CPT)、羟基喜树碱(HCPT)、长春花碱(VLB)、地塞米松(DXM)、姜黄素(CUR)或博来霉素(BLM)中的一种或多种组合。

优选的，所述双敏感层交联载药纳米粒的药物的释放速率可以通过调控PDS链段的聚合度实现，PDS聚合度越大，交联密度越高，药物释放速率越低。

优选的，所述载药双敏感层交联纳米粒的平均粒径为50～300nm，载药量为纳米粒质量的0.5～15％。

所述的pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒的载药制备方法，是：将疏水性药物与嵌段共聚物如RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA或(和)PCB-b-PDS-b-PDPA溶解于二甲基亚砜中，加入二硫苏糖醇(DTT),在氮气保护下至少反应15min；然后将有机相溶液经脱氧的pH＝7.4的0.01M的磷酸盐缓冲溶液透析提纯，形成载药纳米粒溶液，然后在超声作用下至少反应10min，完成二硫键层交联，得到pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒水分散液，冻干，得到可再分散的纳米粒冻干粉。

具体地，pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒的制备方法是：将疏水性药物与嵌段共聚物如RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA或(和)PCB-b-PDS-b-PDPA溶解于二甲基亚砜中，聚合物的浓度为3～5mg/mL，加入二硫苏糖醇(DTT),DTT与聚合物的摩尔比为15～30:1，在氮气保护下反应15～25min；然后将有机相溶液置于薄膜透析袋中，在1000～2000倍体积的脱氧的pH＝7.4的0.01M的磷酸盐缓冲溶液中透析36～48h，每12～16h换一次透析液；透析结束后，透析袋中形成的载药纳米粒溶液，在超声作用下(100～150W)反应10～15min，完成二硫键层交联；将得到的双敏感的层交联载药纳米粒水分散液冻干，得到可再分散的纳米粒冻干粉。

优选的，所述载药双敏感层交联纳米粒为冻干粉或者为生理盐水分散液针剂。

本发明中的pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒也可用于药物、核酸、蛋白、多肽、多糖类大分子的体内递送，或用于诊断试剂、荧光探针的递送。

本发明提供的双敏感聚合物层交联纳米粒及其制备方法，具有如下优点：

(1)本发明提供的双敏感层交联纳米粒，其生物相容性好，毒性低。

(2)本发明提供的双敏感层交联纳米粒，表面的RGD可以与肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞表面过表达的整合素受体结合，提高纳米载体在肿瘤组织的富集和滞留，增强肿瘤细胞对纳米药物载体的摄取，降低药物对正常组织的毒副作用。

(3)本发明提供的双敏感层交联纳米粒，二硫键交联的壳层，能够抑制药物在正常生理条件下的释放以降低药物突释带来的毒副作用，被肿瘤细胞摄取后，在肿瘤细胞内谷胱甘肽(GSH～10mM)作用下交联结构解离，促进药物释放。

(4)本发明提供的双敏感层交联纳米粒，酸敏感的疏水内核在内涵体/溶酶体微酸环境下(pH4.0～6.5)，发生疏水-亲水转变而使纳米粒解体，促进药物快速释放，从而有效杀灭肿瘤细胞。

(5)本发明提供的双敏感层交联纳米粒，靶向基团，两性离子亲水段，二硫键可逆交联壳层和pH敏感疏水内核的可以协同发挥作用，提高纳米药物的递送效率，实现药物在肿瘤细胞内的可控释放。

(6)本发明提供的双敏感层交联纳米粒，制备方法简便易行，稳定性良好，便于操作推广。

附图说明：

图1为本发明实施例的双敏感层交联纳米粒示意图，图中的RGD-PCSSD聚合物中的PCSSD代表PCB-b-PDS-b-PDPA三嵌段。

图2为本发明实施例I-1中(A)RGD-PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA和(B)RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA三嵌段聚合物的核磁共振氢谱。

图3为本发明实施例的(A)载药II-1纳米粒和(B)空白纳米粒II-1b的粒径分布和微观形态。

图4为本发明实施例的空白纳米粒II-1b在(A)谷胱甘肽(GSH 10mM)；(B)pH变化；(C)谷胱甘肽(GSH 10mM)与pH变化条件下纳米粒粒径的变化；(D)空白纳米粒II-1b的微观形态：(a)纳米粒在正常生理条件下,(b)在pH＝5.0条件下；(c)在谷胱甘肽(GSH 10mM)条件下；(d)在谷胱甘肽(GSH 10mM)和pH＝5.0条件下。

图5为本发明实施例的双敏感层交联载药纳米粒的体外释放。(A)层交联密度对药物释放的影响，其中PCSS₁₀D/DOX SCNPs、PCSS₅D/DOX SCNPs和PCD/DOX NPs分别为实施例18、19和20中的II-4、II-5和II-6纳米粒；(B)II-4纳米粒的pH与氧化还原双敏感响应释放。

图6为本发明实施例的双敏感层交联载药纳米粒细胞胞吞：细胞对裸药DOX、靶向交联纳米粒II-1(RGD-PCSS₁₀D/DOX SCNPs)、非靶向交联纳米粒II-4(PCSS₁₀D/DOX SCNPs)和非交联非靶向纳米粒II-6(PCD/DOX NPs)的摄取。

图7为本发明实施例的双敏感层交联载药纳米粒细胞毒性评价：空白II-1(RGD-PCSS₁₀DSCNPs)、II-4(PCSS₁₀D SCNPs)和II-6(PCD NPs)纳米粒对(A)HepG2和(B)HeLa细胞的细胞毒性；裸药DOX、载药纳米粒II-1(RGD-PCSS₁₀D/DOX SCNPs)、II-4(PCSS₁₀D/DOXSCNPs)和II-6(PCD/DOX NPs)对(C)HepG2和(D)HeLa细胞的细胞毒性。

图8为本发明实施例的双敏感层交联载药纳米粒静脉注射后，药物的瘤内分布：(A)药物在瘤内的平均荧光强度和(B)药物在单位质量瘤内的浓度。其中RGD-PCSS₁₀D/DOX、PCSS₁₀D/DOX和PCD/DOX纳米粒分别为实施例14、18、20中的纳米粒II-1、II-4和II-6。

具体实施方式

以下所述是本发明实施例的优选实施方式：

图1为本发明实施例的双敏感层交联纳米粒示意图。从图1中可以看出，本发明双敏感层交联纳米粒具有三层结构，外层为具有肿瘤靶向功能的RGD和两性离子聚合物PCB，间层为二硫键交联的壳层，疏水性药物通过与疏水链段PDPA的疏水相互作用负载在内核中。

实施例1(I-1)

三嵌段RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA聚合物的制备方法，包括如下步骤：

(a)PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA聚合物的制备

在shlenk反应管中依次加入可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)链转移剂三硫代十二烷基-2-异丙酸酯(CTAm)(36.5mg,0.1mM)、两性离子单体羧酸甜菜碱叔丁酯甲基丙烯酸甲酯(CB-tBU)(816mg,2.5mM)、引发剂(AIBN)(1.64mg,0.01mM)和3mL溶剂二甲基甲酰胺(DMF)，抽真空/通氮气三个循环后，密闭反应管,在68～72℃的油浴中反应24h；反应体系降至室温后，加入含活性二硫键单体甲基丙烯酰胺乙基吡啶二硫醚(DS)(127mg,1.0mM)，补加AIBN(1.64mg,0.01mM)，抽真空/通氮气三个循环后，密闭反应管,在68～72℃的油浴中继续反应24h；最后，反应体系降至室温后，加入甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯(DPA)(640mg,2.5mM)并补加引发剂AIBN(1.64mg,0.01mM)，抽真空/通氮气三个循环后，密闭反应管,在68～72℃的油浴中继续反应24h；反应结束后，加入DMF溶解，装入透析袋中，用去离子水透析72h，每12h更换一次透析液，冷冻干燥得到PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA三嵌段聚合物，结构式如式1-1所示：

..........式1-1

(b)RGD-PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA聚合物的制备

将所得到的PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA(0.01mM)聚合物溶解于5mL精制的DMSO中，依次加入NHS(0.2mM)和(EDC.HCl)(0.1mM)，于室温下活化反应2h后，加入0.2mM巯基乙醇淬灭未反应的EDC.HCl，加入RGD(0.01mM)，于室温下继续反应24h；反应结束后，装入透析袋中，用去离子水透析72h，每12h更换一次透析液；冷冻干燥得到RGD-PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA三嵌段聚合物，结构式如式1-2所示：

..........式1-2

(c)RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA聚合物的制备

将RGD-PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA三嵌段聚合物溶解于3mL三氟乙酸(TFA)中，在室温下反应2h，水解PCB(tBU)链段上的叔丁酯。反应结束后，用旋转蒸发仪旋出TFA后，溶解于DMSO中，用去离子水透析72h，每12h更换一次透析液。冷冻干燥得到RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA三嵌段聚合物，结构如式1-3所示：

..........式1-3

利用核磁共振波谱随对RGD-PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA和RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA聚合物进行表征，结果如图2所示。对本实施例中所得聚合物的特征峰进行分析，结果表明，该聚合物被成功合成，组成与投料比一致。

实施例2～实施例12

装置与操作同实施例1，只是通过调节羧酸甜菜碱叔丁酯甲基丙烯酸甲酯(CB-tBU)、甲基丙烯酰胺乙基吡啶二硫醚(DS)和甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯(DPA)等单体与链转移剂三硫代十二烷基-2-异丙酸酯(CTAm)的比例，得到聚合度不同的三嵌段聚合物，如表1所示：

表1：pH与氧化还原双敏感聚合物

N^a为RGD与PCB-b-PDS-b-PDPA三嵌段聚合物的摩尔比。

实施例13(I-13)：

按实施例1(a)方法和装置，把CB-tBU换成RGD键接的聚乙二醇丙烯酸酯(RGD-PEG480-AC)，聚乙二醇段数均分子量为480，得到RGD-PEG480-b-PDS-b-PDPA。核磁共振表征其组成RGD-PEG480₁₀-b-PDS₁₀-b-PDPA₂₅(I-13)，下标为相应单体的聚合度。

实施例14(II-1)：

负载药物的双敏感层交联纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

称取I-1聚合物20mg，阿霉素3mg，用5mL DMSO超声溶解，后加入20mg DTT在氮气保护下于室温下反应10min；随后将有机相溶液至于薄膜透析袋中，在1000～2000倍体积的脱氧的pH＝7.4的0.01M的磷酸盐缓冲溶液中透析36h，每12h换一次透析液；最后，透析结束后，透析袋中形成的载药纳米粒溶液，在超声作用下(100～150W)反应10min，完成二硫键层交联，即得到的负载阿霉素的双敏感型层交联II-1载药纳米粒。利用紫外分光光度计，测得纳米粒的载药量为5.6％。

实施例15(II-1b)：空白纳米粒可用与实施例14相同的方法制备得到。此外，非靶向纳米粒的制备，采用实施例1～13中相应的未键和RGD靶向配体(N^a＝0)的聚合物制备。非交联纳米粒的制备采用实施例1～13中相应的y＝0的聚合物制备。

利用激光粒度仪和透射电子显微镜检测双敏感型层交联空白纳米粒和载药纳米粒的粒径和形态，测定结果如图3所示，本实施例中制备的双敏感型层交联载药纳米粒II-1和空白纳米粒II-1b的粒径分别为153nm和142nm，粒径分布窄，且呈现明显的核-壳结构。

实施例16～实施例31：

装置与操作同实施例14，只是通过改变聚合物和所负载的药物种类，如阿霉素(DOX)、紫杉醇(PTX)、多西他赛(TXT)、喜树碱(CPT)、羟基喜树碱(HCPT)、长春花碱(VLB)、地塞米松(DXM)、姜黄素(CUR)等，获得不同的双敏感型层交联载药纳米粒，如表2所示：

表2：pH与氧化还原双敏感层交联纳米粒

实施例	纳米粒	聚合物	药物/载药量(％)	粒径(nm)
					14	II-1	I-1	DOX/5.6	153
15	II-1b	I-1	----	142
					16	II-2	I-2	DOX/5.8	150
17	II-3	I-3	DOX/5.7	152
					18	II-4	I-4	DOX/5.6	152
19	II-5	I-5	DOX/5.6	155
					20	II-6	I-6	DOX/5.7	150
21	II-7	I-7	PTX/15	200
					22	II-8	I-7	CPT/8.9+HCPT/3.1	180
23	II-9	I-8	HCPT/8.1	145
					24	II-10	I-8	TXT/8.2	255
25	II-11	I-9	DXM/8.3+CUR/0.6	163
					26	II-12	I-9	CUR/0.9	80

27	II-13	I-10	CUR/0.5	50
					28	II-14	I-10	BLM/6.5+TXT/2.2	130
29	II-15	I-11	DXM/6.4	149
					30	II-16	I-12	VLB/1.3	170
31	II-17	I-13	VLB/0.8	210

实施例32：双敏感层交联纳米粒的敏感性表征，具体步骤如下：

将制备的双敏感层交联空白纳米粒II-1b溶液分为三组，调控纳米粒溶液的条件，利用激光粒度仪和透射电镜检测纳米粒粒径和形态的变化。条件如下:(i)Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲溶液(10mM)，pH＝7.4～5.0；(ii)Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲溶液(pH＝7.4，10mM)+GSH(10mM)；(iii)Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲溶液(10mM)，pH＝7.4～5.0和GSH(10mM)。

检测结果如图4所示，层交联纳米粒在不加GSH的酸性条件下(pH＝5.0)，由于交联壳层的束缚，纳米粒发生膨胀，粒径从pH＝7.4条件下的160nm增加到354nm；层交联纳米粒在还原性GSH(10mM)作用下，二硫键层交联发生解离，亲水段进一步伸展，纳米粒粒径从163.4nm增加到183.7nm；而在还原性GSH(10mM)和酸性条件(pH＝5.0)的双重作用下，纳米粒发生解体。用透射电镜检测纳米粒形态的变化的结果与粒径的变化一致，在还原性GSH(10mM)和酸性条件(pH＝5.0)的双重作用下，只能观察到解离的聚合物的随机分布。

实施例33：双敏感层交联载药纳米粒的体外释放行为表征，具体步骤如下：

①层交联密度对药物释放的影响：5mL载药II-4纳米粒、II-5纳米粒和II-6纳米粒(1mg/mL)封装在截留分子量为3500Da的透析袋中，加入40mL透析液，透析液为pH分别为7.4与5.0的磷酸盐缓冲溶液，释放在37℃的恒温振荡器中进行。在预定的时间点，取出5mL的释放液，补加相同体积的新鲜释放液。药物的释放量，利用紫外分光光度计进行测定。

释放行为的评价结果如图5A所示，层交联壳层的引入，可以有效地降低药物在正常生理条件下的释放，并且释放速率随着交联密度的增加而降低。即使在酸性条件下，层交联的壳层也能在一定程度上抑制药物的释放。

②双敏感层交联载药纳米粒的刺激响应性释放：5mL的II-4纳米粒溶液(1mg/mL)封装在截留分子量为3500Da的透析袋中，释放液为pH＝7.4、6.5或5.0的磷酸盐缓冲溶液，为了模拟细胞内的还原环境，GSH的浓度为10mM。释放在37℃的恒温振荡器中进行。在预定的时间点，取出5mL的释放液，补加相同体积的新鲜释放液。药物的释放量，利用紫外分光光度计进行测定。

释放结果如图5B所示，在单一刺激条件下，无论酸性pH或加入GSH(10mM),药物的释放速率依然达不到要求。而一旦在双重刺激作用下，药物发生快速释放，在8h内能够释放出全部负载的药物。

实施例34：层交联载药纳米粒的细胞胞吞，具体步骤如下：

以含l0％胎牛血清(FBS；Biochrom Ag,Germany)的DMEM(Sigma-Aldrich,USA)为基础培养液，将细胞(HepG2，中国医学院放射研究所)以1×10⁵个/mL细胞浓度接种于24孔板中，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养。将裸药DOX、靶向交联II-1纳米粒(RGD-PCSS₁₀D/DOX)、非靶向交联II-4纳米粒(PCSS₁₀D/DOX)、非交联非靶向II-6纳米粒(PCD/DOXNPs)溶液用DMEM稀释，得到药物浓度在10～100μg/mL的溶液。取500μL各浓度的上述溶液分别加到接种过细胞的孔板中替代原培养液。加入等体积生理盐水的培养在DMEM中的细胞作为对照组。与载药纳米粒孵化培养一段时间后，取出培养板，用流式细胞仪检测细胞对纳米载体的胞吞能力。

检测结果如图6所示，可见HepG2细胞对II-1纳米粒的胞吞能力远远高于非靶向的II-4纳米粒和非靶向非交联的II-6纳米粒，这是由于II-1纳米粒带有RGD靶向基团，能够通过整合素受体介导的胞吞进入肿瘤细胞。

实施例35：层交联载药纳米粒的细胞毒性评价，具体步骤如下：

以含l0％胎牛血清(FBS；Biochrom Ag,Germany)的DMEM(Sigma-Aldrich,USA)为基础培养液，将细胞(HepG2和HeLa，中国医学院放射研究所)以1×10⁵个/mL细胞浓度接种于96孔板中，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养。首先，将空白II-1b、II-4和II-6纳米粒用DMEM稀释，得到纳米粒浓度在10～500μg/mL的溶液，取100μL各浓度的上述溶液分别加到接种过细胞的孔板中替代原培养液。其次，裸药DOX、II-1、II-4和II-6纳米粒溶液，用DMEM稀释，得到药物浓度在10～100μg/mL的溶液，取100μL各浓度的上述溶液分别加到接种过细胞的孔板中替代原培养液。培养在DMEM中的细胞作为对照组。分别培养一段时间后，取出培养板，用MTT法检测材料的毒性。

结果如图6所示，空白纳米粒均表现出良好的细胞相容性，即使在浓度高达5mg/mL。如图6所示，细胞毒性成像明显的浓度依赖性。并且，II-1纳米粒对肿瘤细胞的抑制能力显著高于非靶向的II-4纳米粒和非靶向非交联的II-6纳米粒，这与细胞胞吞实验的实验结果一致。

实施例36：双敏感层交联载药纳米粒静脉注射后，药物的肿瘤内分布，具体步骤如下：

取健康Bab/c小鼠，雌性，体重19±2g，将培养的HepG2细胞在无菌条件下进行快速接种，于小鼠右后腿皮下注射细胞瘤液0.2mL/只，细胞浓度为5.0×10⁶/只。在接种一周以后，肿瘤体积达到100mm³(V＝1/2(a×b²))时，小鼠被随机分成4组，即裸药DOX、II-1、II-4和II-6纳米粒溶液组，给药剂量为5mg/kg。尾静脉注射给药后，在预定的时间处死小鼠，解剖取出肿瘤组织。利用活体成像仪检测药物在肿瘤内的分布。将组织匀浆，用萃取的方法提取各器官中的DOX，用高效液相色谱测定药物在各组织的浓度。

结果如图8所示，当各制剂组静脉注射后，纳米粒制剂组在肿瘤组织的药物富集量显著高于裸药DOX组。并且，II-1纳米粒组药物在肿瘤组织的富集量明显高于非靶向的II-4纳米粒组和非靶向非交联的II-6纳米粒组。这是由于肿瘤组织的间质高压，不能被肿瘤细胞摄取的纳米粒会被快速清除，因而非交联非靶向的纳米粒的肿瘤内药物聚集最低。因此，靶向基团的引入，不仅增强了纳米粒在肿瘤组织的富集，而且促进纳米载体的肿瘤摄取效率的提高。

Claims

1.一种pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒，其特征在于，所述的纳米粒表面是至少含有聚羧酸甜菜碱(PCB)或聚乙二醇(PEG)的亲水层，内部是至少含有pH敏感的聚合物单元的疏水核，亲水层与疏水核之间是由聚甲基丙烯酰胺乙基吡啶二硫醚(PDS)单元经二硫键(S-S)形成的交联层。

2.权利要求1所述的pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒，其特征在于所述的pH敏感的聚合物为聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯(PDPA)。

3.权利要求2所述的pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒，其特征在于表面亲水层带有肿瘤靶向基团。

4.权利要求3所述的pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒，其特征在于肿瘤靶向基团选自多肽RGD、CRGDRGPDC、CRGDKGPDC、CGNKRTRGC、CRGDK、RPARPAR，以及白细胞介素IL-13p或叶酸。

5.权利要求4所述的pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒，其特征在于是由式1所示的1)RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA或2)RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA与PCB-b-PDS-b-PDPA聚合物共组装形成纳米粒，再经PDS的交联反应形成二硫键(S-S)层交联；所述的嵌段聚合物RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA或PCB-b-PDS-b-PDPA中，PCB聚合度x为25～70的整数，PDS聚合度y为1～15的整数，PDPA聚合度z为25～70的整数；

6.权利要求1～5任意一项所述的pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒在制备药物中的应用，其特征是纳米粒核内包载疏水药物，其中药物含量为纳米粒质量的0.5-15％；所述的纳米粒的平均粒径为50-300nm。

7.权利要求6所述的应用，其特征是所述疏水性药物选自阿霉素、紫杉醇、多西他赛、喜树碱、羟基喜树碱、长春花碱、地塞米松、姜黄素或博来霉素中的一种或多种的任意组合。

8.权利要求6所述的应用，特征是：将疏水性药物与嵌段共聚物PCB-b-PDS-b-PDPA溶解于二甲基亚砜中，加入二硫苏糖醇(DTT),在氮气保护下至少反应15min；然后将有机相溶液置于薄膜透析袋中，在1000～2000倍体积的脱氧的pH＝7.4的0.01M的磷酸盐缓冲溶液中透析提纯；透析结束后，透析袋中形成的载药纳米粒溶液，在超声作用下反应，完成二硫键层交联，得到pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒水分散液，冻干，得到可再分散的纳米粒冻干粉。

9.权利要求6所述的应用，特征是：将疏水性药物与嵌段共聚物RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA和PCB-b-PDS-b-PDPA溶解于二甲基亚砜中，加入二硫苏糖醇(DTT),在氮气保护下至少反应15min；然后将有机相溶液置于薄膜透析袋中，在1000～2000倍体积的脱氧的pH＝7.4的0.01M的磷酸盐缓冲溶液中透析提纯；透析结束后，透析袋中形成的载药纳米粒溶液，在超声作用下反应，完成二硫键层交联，得到pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒水分散液，冻干，得到可再分散的纳米粒冻干粉。

10.权利要求1所述的pH与氧化还原双敏感的层交联纳米粒在制备药物中的应用，其特征在于负载药物、核酸、蛋白、多肽、多糖类大分子，或负载诊断试剂、荧光探针；所述载药双敏感层交联纳米粒剂型为冻干粉或者为生理盐水分散液针剂。