CN105315455B - 谷氨酸修饰的聚乙二醇单硬脂酸酯的制备及其在靶向药物传递中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种谷氨酸‑聚乙二醇单硬脂酸酯的制备及该两亲性靶向材料修饰的纳米粒在疾病靶向传递中的应用。所述的两亲性靶向材料，以谷氨酸作为靶头，聚乙二醇增加靶头的柔韧性，疏水性的单硬脂酸酯为与聚乳酸聚羟基乙酸共聚物的锚钉部位。该靶向材料修饰的纳米粒可作为多种抗肿瘤药物靶向传递的工具，并能通过表面修饰的谷氨酸与肿瘤细胞膜上高表达的大中性氨基酸转运体1相互作用，有效提高纳米粒的细胞摄取和抗肿瘤活性。该纳米粒稳定性好，靶向性佳，可用于静脉注射，有较大的市场应用前景。

Description

谷氨酸修饰的聚乙二醇单硬脂酸酯的制备及其在靶向药物传 递中的应用

技术领域

本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，涉及不同PEG链长的谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯的制备，及其作为靶向材料在主动靶向药物传递系统中的应用。

背景技术

肿瘤的快速生长和转移与肿瘤部位高表达的营养型转运体，如：维生素转运体、氨基酸转运体、葡萄糖转运体，密切相关。因此，这些肿瘤不可或缺的营养型转运体可以开发为肿瘤主动靶向治疗的新靶点。纳米载体由于能够提高抗癌药物的疗效并且减少药物副作用而被广泛用于靶向药物传递系统，PEG化的纳米载体更能显示出一些独特的优越性，如：延长纳米粒体内循环时间、增加配体的柔韧性和靶向性等。以纳米载体为药物递送工具，以肿瘤高表达转运体为靶点，是一种有效地药物传递系统。

近几年来，越来越多目光转移至肿瘤转运体靶向的纳米粒制剂的研究，它们通过对纳米制剂进行转运体底物的表面修饰，底物在接触到转运体时，通过转运体对其表面的底物进行高亲和性识别、结合，然后内陷、入胞。纳米制剂可以依靠肿瘤细胞膜上高表达的转运体达到提高细胞摄取量，增加抑瘤效果的目的。但是，更多的研究将转运体的作用与受体等同，忽略了转运体自身的特性和优势。在此，我们旨在研究不同底物柔韧性和密度的主动靶向纳米粒对肿瘤细胞膜上高表达的中性氨基酸转运体1(LAT1)靶向效果的影响，以及该靶向纳米粒对转运体活性的调控。本发明制备了靶向材料-谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯，并将其修饰于纳米粒的表面，该靶向递送工具，具有载药量高、稳定性好、靶向性佳等优势，能够提高体外细胞摄取以及体内抑瘤效果。将此种靶向材料作为载体或纳米制剂的修饰剂应用于药物传递系统，将具有很大的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有肿瘤靶向性、延长药物半衰期、既可以自身自组装形成胶束又可以作纳米粒修饰剂的两亲性材料-谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯。

本发明第二个目的在于提供上述不同PEG链长的谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯的制备方法。

本发明的第三个目的是提供谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯在靶向药物传递中的作用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯两亲性共聚物以谷氨酸作为靶头，聚乙二醇提供靶头的柔韧性，疏水性的单硬脂酸酯为与其它药物载体内核的锚钉部位。是一种稳定性好、靶向性佳的主动靶向材料。

所述的谷氨酸修饰的聚乙二醇单硬脂酸酯的结构通式如下：

所述的靶向材料，其特征在于，所用的聚乙二醇的分子量范围500-2000,n为10～40。

其制备过程：将羧基和氨基保护的谷氨酸，如：N-苄氧羰基-L-谷氨酸-1-苄酯(Z-Glu-OBzl,Ⅱ)，溶于适量二氯甲烷、二甲基亚砜等有机良溶剂中，在催化剂的作用下，如：1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，避光冰浴1h-2h，然后与不同链长聚乙二醇单硬脂酸酯(SP_n,Ⅰ)在30℃N2保护下反应12h-48h，经分离纯化得到淡黄色固体的Ⅲ。Ⅲ化合物经过钯碳还原反应，脱掉谷氨酸的保护基团，再经过进一步分离纯化得到最终化合物-谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯(SPG_n,Ⅳ)。

步骤中n为10～40。该聚合物为淡黄色固体，易溶于二氯甲烷、N、N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等有机溶剂。

所述的谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯是一种稳定性好、靶向性佳的主动靶向材料。

所述的谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯可以用于修饰包载紫杉烷类、喜树碱类、蒽醌类抗肿瘤药或二氢吡啶类、非甾体抗炎药中的任一物质或其衍生物；基因类药物为DNA或SiRNA的聚乳酸聚羟基乙酸共聚物纳米粒(SPG_n PLGA NPs)，其修饰方法可采用乳化溶剂挥发法制备，并采用下述步骤：将上述的谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯和聚乳酸聚羟基乙酸共聚物(质量比1：1-5)完全溶解于适量的二氯甲烷中，再加至适量的聚乙烯醇水溶液中，探头超声并搅拌适当的时间后，得到具有靶向性的纳米粒。

本发明具有以下有益效果：制备一种新型的靶向性强的两亲性聚合物-谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯，载体制备过程温和，易操作。所制备谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的纳米粒，制备简便，粒径较小且均一，包封率高，稳定性好，靶向性佳。体外细胞实验和体内抑瘤实验证明本发明的谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的纳米粒具有较好的肿瘤靶向性和抑瘤效果。

附图说明

图1为本发明实施例1的谷氨酸-聚乙二醇500单硬脂酸酯(SPG₁₀)嵌段共聚物结构的¹HNMR谱图。

图2为本发明实施例1的谷氨酸-聚乙二醇1000单硬脂酸酯(SPG₂₅)嵌段共聚物结构的¹HNMR谱图。

图3为本发明实施例1的谷氨酸-聚乙二醇2000单硬脂酸酯(SPG₄₀)嵌段共聚物结构的¹HNMR谱图。

图4为本发明实施例2的载药谷氨酸-聚乙二醇500单硬脂酸酯修饰的聚乳酸聚羟基乙酸共聚物纳米粒(SPG₁₀PLGA NPs)的动态光散射测定胶束粒径图和透视电镜图。

图5为本发明实施例2的谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的紫杉醇纳米粒(PTXSPG_n PLGA NPs)在血浆中稳定性试验；

5％SPG10 NPs 5％SPG10修饰的紫杉醇PLGA纳米粒；

5％SPG25 NPs 5％SPG25修饰的紫杉醇PLGA纳米粒；

5％SPG40 NPs 5％SPG40修饰的紫杉醇PLGA纳米粒；

10％SPG10 NPs 10％SPG10修饰的紫杉醇PLGA纳米粒；

10％SPG25 NPs 10％SPG25修饰的紫杉醇PLGA纳米粒；

10％SPG40 NPs 10％SPG40修饰的紫杉醇PLGA纳米粒。

图6为本发明实施例2的谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的紫杉醇纳米粒(PTXSPG_n PLGA NPs)体外释放试验；

5％SPG10 NPs 5％SPG10修饰的紫杉醇PLGA纳米粒；

5％SPG25 NPs 5％SPG25修饰的紫杉醇PLGA纳米粒；

5％SPG40 NPs 5％SPG40修饰的紫杉醇PLGA纳米粒；

10％SPG10 NPs 10％SPG10修饰的紫杉醇PLGA纳米粒；

10％SPG25 NPs 10％SPG25修饰的紫杉醇PLGA纳米粒；

10％SPG40 NPs 0％SPG40修饰的紫杉醇PLGA纳米粒。

图7为本发明实施例2的谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的紫杉醇纳米粒(PTXSPG_n PLGA NPs)对Hela细胞细胞抑制率曲线；

Taxol紫杉醇溶液剂；

5％SPG10 NPs 5％SPG10修饰的紫杉醇PLGA纳米粒；

5％SPG25 NPs 5％SPG25修饰的紫杉醇PLGA纳米粒；

5％SPG40 NPs 5％SPG40修饰的紫杉醇PLGA纳米粒；

10％SPG10 NPs 10％SPG10修饰的紫杉醇PLGA纳米粒；

10％SPG25 NPs 10％SPG25修饰的紫杉醇PLGA纳米粒；

10％SPG40 NPs 10％SPG40修饰的紫杉醇PLGA纳米粒。

图8为本发明实施例2的谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒(C6SPG_n PLGA NPs)和聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒(C6 SP_n PLGA NPs)在LAT1高表达的Hela细胞中的细胞摄取情况；

SPG NPs SPG修饰的香豆素6PLGA纳米粒；

SP NPs SP修饰的香豆素6PLGA纳米粒。

图9为本发明实施例2的谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒(C6SPG_n PLGA NPs)和聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒(C6 SP_n PLGA NPs)在LAT1低表达的NIH3T3细胞中的细胞摄取情况；

SPG NPs SPG修饰的香豆素6PLGA纳米粒；

SP NPs SP修饰的香豆素6PLGA纳米粒。

图10为本发明实施例2的不同氨基酸底物对谷氨酸-聚乙二醇1000单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒(C6 SPG₂₅ PLGA NPs)与Hela细胞膜上中性大氨基酸转运体1(LAT1)低温结合的影响。

图11为本发明实施例2的钠离子对谷氨酸-聚乙二醇1000单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒(C6 SPG₂₅ PLGA NPs)摄取的影响；

Na+含钠离子的缓冲液；Na+free不含钠离子的缓冲液。

图12为本发明实施例2的不同氨基酸底物对谷氨酸-聚乙二醇1000单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒(C6 SPG₂₅ PLGA NPs)和聚乙二醇单硬脂酸酯香豆素6纳米粒(C6 SP_nPLGA NPs)与Hela细胞膜上中性大氨基酸转运体1(LAT1)摄取的影响；

SP：SP修饰的香豆素6PLGA纳米粒；SPG：SPG修饰的香豆素6PLGA纳米粒

图13为本发明实施例2的谷氨酸-聚乙二醇1000单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒(C6 SPG25 PLGA NPs)的摄取机制。

图14为本发明实施例2的谷氨酸-聚乙二醇1000单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒(C6 SPG25 PLGA NPs)对Hela细胞膜上中性大氨基酸转运体1(LAT1)的活性调控。

图15为本发明实施例2的谷氨酸-聚乙二醇1000单硬脂酸酯修饰的紫杉醇纳米粒(PTX SPG₂₅ PLGA NPs)和聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的紫杉醇纳米粒(PTX SP_n PLGA NPs)对肿瘤体积生长的影响。

Saline生理盐水组；Taxol紫杉醇溶液剂组；SPG25 PTX NPs 10％SPG25修饰的紫杉醇PLGA纳米粒组；SP25 PTX NPs 10％SP25修饰的紫杉醇PLGA纳米粒组。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例1

四种不同PEG链长谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯的制备。

N-苄氧羰基-L-谷氨酸-1-苄酯(Z-Glu-OBzl,Ⅱ)，溶于适量二氯甲烷、二甲基亚砜等有机良溶剂中，在催化剂的作用下，如：1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，避光冰浴1h-2h，然后与不同链长聚乙二醇单硬脂酸酯(SP_n,Ⅰ)在30℃N2保护下反应12h-48h，经分离纯化得到淡黄色固体的Ⅲ。Ⅲ化合物经过钯碳还原反应，脱掉谷氨酸的保护基团，再经过进一步分离纯化得到最终化合物-谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯(SPG_n,Ⅳ)。反应式如下：

步骤中n为10～40。即聚乙二醇的分子量为500,1000和2000，但是并不限于此，本发明的聚乙二醇亦可是一端为羟基修饰的聚乙二醇，但是并不局限于以上三种物质。聚乙二醇的分子量可以为500-5000范围内。

采用核磁共振测定¹H-NMR氢谱来确定实施例1中靶向材料的结构，选用的溶剂为d-DMSO，结果如图1。2.3ppm,1.8ppm和4.2ppm分别为谷氨酸上-CH₂-和-CH-上的H，3.52-3.75ppm间的质子峰为PEG中的H。0.8ppm为单硬脂酸酯的-CH₃-的特征峰。1.2ppm为单硬脂酸酯的-CH₂-的特征峰。

实施例2

乳化溶剂挥发法制备载紫杉醇或香豆素6的谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的纳米粒

称取1mg紫杉醇或香豆素6，溶于1mL二氯甲烷中，加入1mg或2mg实施例1制备的不同PEG链长的谷氨酸修饰的聚乙二醇单硬脂酸酯或聚乙二醇单硬脂酸酯，以及20mg的聚乳酸聚羟基乙酸共聚物。加至5mL 1％聚乙烯醇水溶液中，探头超声300W，10min，搅拌过夜，3500rpm离心10min，除去未包裹的药物。

将实施例2中制备的纳米粒通过动态光散射和透视电镜测定胶束的粒径大小和形态，结果如图4。动态光散射测定不同配体密度和PEG链长的谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的纳米粒，纳米粒的粒径范围在151.7-180.6nm，粒径分布窄；透视电镜图表明载药胶束为粒径均一的球形。

表1不同PEG链长和靶向材料密度对于Hela细胞的IC₅₀值。

实施例3

谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的载药纳米粒在血浆中的稳定性试验

按照实例2制备谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的载药纳米粒，将纳米粒置于含有10％FBS的pH 7.4磷酸盐缓冲液中，通过动态光散射测定各纳米粒在0h,1h,2h,4h,6h8h,10h,12h和24h的粒径。

图5结果表明不同配体修饰密度和PEG链长的谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的载药纳米粒具有较好的血浆稳定性。

实施例4

谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的载药纳米粒体外释放试验

采用透析法考察实例2制备谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的载药纳米粒的体外释药特征。移取200μg的载药胶束溶液于透析袋中，透析袋两端夹紧，分别置于含有30mLpH 7.4PBS(含2％Cremophore EL)的释放介质的锥形瓶中，在37℃恒温振荡器中以100r/min进行体外释放度考察。分别在0.5、1、2、4、6、8、10、12、24h取样2mL，同时将透析袋取出并放入新鲜的30mL释放介质中，样品经0.45μm微孔滤膜过滤，取20μL进行HPLC测定。

图6结果表明谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的载药纳米粒释药缓慢，并且随着PEG链长的增加，释药速度下降；随着靶向材料修饰密度的增加，释药速度也随之下降。不同链长的PEG对纳米粒的修饰能够在纳米粒表层形成不同状态的保护，PEG链延长和修饰密度的增加所形成的水化层均有利于延缓药物的释放。

实施例5

细胞毒性实验

将处于对数生长期的人宫颈癌细胞(Hela)以5×10⁴/孔/0.1mL的1640培养液埋于96孔板中，24h后将实施例2制备的谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的载药纳米粒以不同浓度分别加入各孔，每孔加入100μL含纳米粒溶液，每个浓度3个平行孔，置培养箱中孵育。培养48h和72h后，取出96孔板，每孔加入20μL的5mg/mL MTT，培养箱中孵育4h，甩板，将96孔板倒扣于滤纸中充分吸干残留液体，每孔加入150μL DMSO于振荡器中振荡10min，酶标仪测定各孔492nm处的吸光度。计算抑制率：

抑制率(％)＝(1-A_加药孔/A_对照孔)×100％

MTT法测定载有紫杉醇纳米粒细胞毒性结果如图7，不同浓度载药纳米粒作用于Hela细胞株48h和72h后，细胞抑制率随药物浓度和孵化时间增加而增大，并且对细胞的抑制作用随着靶向材料密度的增加而增强。

实施例6

细胞摄取实验

将LAT1高表达的Hela细胞和LAT1低表达的NIH3T3细胞以2×10⁵/孔/0.1mL的1640培养液和DMEM培养液埋于96孔板中，24h后将实施例2制备的谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒或聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒，由HBSS缓冲液稀释相同的香豆素6的浓度加入各孔中，每孔100μL，平行3孔，置培养箱中孵育1h和3h。弃上清，每孔加入50μl 0.5％TrtionX-100(含0.2N NaOH)的PBS溶液并置摇床中作用1h。随后，在激发波长为458nm，发射波长为525nm测定细胞内荧光强度，并对每孔进行蛋白含量测定，并计算摄取量。

细胞摄取的结果见图8，图9，在LAT1高表达瘤株中，谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒的细胞摄取量均比聚乙二醇单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒高，并且随着靶向材料修饰密度的增加，细胞摄取增加。而在LAT1低表达瘤株中，这两种纳米粒细胞摄取未体现出这样的趋势。

实施例7

不同氨基酸底物对谷氨酸修饰的纳米粒(C6 SPG₂₅PLGA NPs)与LAT1结合的影响实验

将LAT1高表达的Hela细胞细胞以2×10⁵/孔/0.1mL的1640培养液和埋于96孔板中，24h后将实施例2制备的谷氨酸-聚乙二醇1000单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒，由HBSS缓冲液稀释致相同的香豆素6的浓度，并与不同氨基酸混合均匀后，加入各孔中，每孔100μL，平行3孔，置4℃中孵育3h。弃上清，每孔加入50μl 0.5％TrtionX-100(含0.2N NaOH)的PBS溶液并置摇床中作用1h。随后，在激发波长为458nm，发射波长为525nm测定细胞内荧光强度，并对每孔进行蛋白含量测定，并计算摄取量。

结合影响实验结果见图10，结果表明作为LAT1高亲和性底物，亮氨酸和苯丙氨酸对纳米粒和LAT1的结合过程有明显的抑制作用，而LAT1低亲和性底物，赖氨酸和谷氨酸对纳米粒和LAT1的结合过程并无明显抑制作用，证明靶向纳米粒在能识别并结合LAT1。

实施例8

钠离子对谷氨酸修饰的纳米粒(C6 SPG₂₅ PLGA NPs)摄取的影响

将LAT1高表达的Hela细胞细胞以2×10⁵/孔/0.1mL的1640培养液和埋于96孔板中，24h后将实施例2制备的谷氨酸-聚乙二醇1000单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒或聚乙二醇1000单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒，由含钠离子的缓冲液或不含钠离子的缓冲液稀释致相同的香豆素6的浓度，加入各孔中，每孔100μL，平行3孔，置37℃中孵育3h。弃上清，每孔加入50μl 0.5％TrtionX-100(含0.2N NaOH)的PBS溶液并置摇床中作用1h。随后，在激发波长为458nm，发射波长为525nm测定细胞内荧光强度，并对每孔进行蛋白含量测定，并计算摄取量。

结合影响实验结果见图11，缓冲液中是否含钠离子对谷氨酸-聚乙二醇1000单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒和聚乙二醇1000单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒的摄取并无影响，并且谷氨酸修饰的纳米粒的摄取依然高于未修饰的纳米粒，证明基于LAT1纳米粒的摄取是钠离子非依赖性的。

实施例9

不同氨基酸对谷氨酸修饰的纳米粒(C6 SPG₂₅ PLGA NPs)摄取的影响

将LAT1高表达的Hela细胞细胞以2×10⁵/孔/0.1mL的1640培养液和埋于96孔板中，24h后将实施例2制备的谷氨酸-聚乙二醇1000单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒，由HBSS缓冲液稀释致相同的香豆素6的浓度，并与相应氨基酸混合均匀后，加入各孔中，每孔100μL，平行3孔，置37℃中孵育3h。弃上清，每孔加入50μl 0.5％TrtionX-100(含0.2NNaOH)的PBS溶液并置摇床中作用1h。随后，在激发波长为458nm，发射波长为525nm测定细胞内荧光强度，并对每孔进行蛋白含量测定，并计算摄取量。

结合影响实验结果见图12，结果表明作为LAT1高亲和性底物，亮氨酸和苯丙氨酸对纳米粒和LAT1的结合过程有明显的抑制作用，而LAT1低亲和性底物，赖氨酸和谷氨酸对纳米粒和LAT1的结合过程并无明显抑制作用，证明靶向纳米粒的摄取是经LAT1介导的。

实施例10

谷氨酸修饰的纳米粒(C6 SPG₂₅ PLGA NPs)摄取机制实验

将LAT1高表达的Hela细胞细胞以2×10⁵/孔/0.1mL的1640培养液和埋于96孔板中，24h后，首先加入一定浓度的各内吞抑制剂，加入各孔中，每孔100μL，平行3孔，置37℃中孵育1h。随后将实施例2制备的谷氨酸-聚乙二醇1000单硬脂酸酯修饰的香豆素6纳米粒，由HBSS缓冲液稀释致相同的香豆素6的浓度，并与相应内吞抑制剂混合均匀后，加入各孔中，每孔100μL，平行3孔，置37℃中孵育2h。弃上清，每孔加入50μl 0.5％TrtionX-100(含0.2NNaOH)的PBS溶液并置摇床中作用1h。随后，在激发波长为458nm，发射波长为525nm测定细胞内荧光强度，并对每孔进行蛋白含量测定，并计算摄取量。

结合影响实验结果见图13，靶向纳米粒的内吞途径为能量依赖性的网格蛋白介导的内吞。

实施例11

谷氨酸修饰的纳米粒对LAT1活性的调控

将实施例2制备的谷氨酸-聚乙二醇1000单硬脂酸酯修饰的纳米粒用HBSS稀释到一定浓度加入Hela细胞中，置37℃中孵育1h和3h。收集细胞，并对Hela细胞中的中性大氨基酸转运体1(LAT1)进行提取，并进行蛋白电泳分析。电泳样品包括未加纳米粒孵化和加纳米粒作用1h和3h的LAT1总蛋白及LAT1在胞浆和膜中蛋白。

活性调控结果见图14，加入靶向纳米粒后，LAT1总蛋白并没有发生变化，但是对于LAT1膜蛋白，在孵化1h发生下降，3h出现明显增加，而对于LAT1浆蛋白的变化与膜蛋白相反。说明靶向纳米粒在于LAT1识别结合后，与其一同内吞进入细胞，导致LAT1在膜上的含量下降，随后，靶向纳米粒与LAT1在内含体中分离，LAT1返回至膜上，膜上的LAT1含量出现上升。

实施例12

谷氨酸修饰的纳米粒的药效

将处于对数生长期的4T1乳腺癌细胞用PBS洗3次，用PBS调制细胞混悬液至细胞数为2×10⁶个/mL，将癌细胞悬液接种于小鼠右侧腋窝皮下，0.2mL/只。建立了鼠乳腺癌4T1瘤株腋下接种模型。接种7-14d，待肿瘤体积生长至100-200mm³，对荷瘤小鼠进行尾静脉注射给药。将荷瘤小鼠随机分成4组，分别为模型对照组(生理盐水)、Taxol、PTX SPG₂₅ PLGANPs、PTX SP₂₅ PLGA NPs组。对照组尾静脉给予生理盐水，其余各组分别尾静脉注射给予相应制剂，每隔2d给药1次，连续给药4次，给药剂量为10mg/kg。给药后，每天观察小鼠的存活状态，称重，用游标卡尺测量肿瘤体积。肿瘤体积计算公式为：

药效结果见图15，生理盐水组肿瘤体积快速增长，Taxol、PTX SPG₂₅ PLGA NPs和PTX SP₂₅ PLGA NPs组能明显抑制肿瘤生长，靶向纳米粒PTX SPG₂₅PLGA NPs组对于Taxol和未修饰的PTX SP₂₅ PLGA NPs组具有更慢的肿瘤生长速度。表明靶向纳米粒在体内能有效地识别并结合4T1肿瘤上高表达的LAT1促进纳米粒的摄取，释放药物，产生抗肿瘤作用。

Claims (8)

1.谷氨酸修饰的聚乙二醇单硬脂酸酯，其特征在于：以聚乙二醇为亲水端，单硬脂酸酯为疏水端，谷氨酸为靶头，结构式如下：

其中，n为10～40。

2.根据权利要求1所述谷氨酸修饰的聚乙二醇单硬脂酸酯的制备方法，其特征在于，采用如下步骤制备：

将羧基和氨基保护的谷氨酸，溶于适量二氯甲烷或二甲基亚砜中，在催化剂的作用下，避光冰浴1h-2h，然后与不同链长聚乙二醇单硬脂酸酯(SP_n,Ⅰ)在25-35℃，N₂保护下反应12h-48h，经分离纯化得到淡黄色固体的Ⅲ，Ⅲ化合物经过钯碳还原反应，脱掉谷氨酸的保护基团，再经过进一步分离纯化得到最终化合物-谷氨酸-聚乙二醇单硬脂酸酯(SPG_n,Ⅳ)；

反应式如下：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的羧基和氨基保护的谷氨酸为N-苄氧羰基-L-谷氨酸-1-苄酯。

4.权利要求1所述的谷氨酸修饰的聚乙二醇单硬脂酸酯在制备药物传递的载体中的应用。

5.权利要求1所述的谷氨酸修饰的聚乙二醇单硬脂酸酯在制备肿瘤主动靶向递送药物的载体或修饰剂中的应用。

6.权利要求1所述的谷氨酸修饰的聚乙二醇单硬脂酸酯在制备靶向中性大氨基酸转运体1(LAT1)药物的载体或修饰剂中的应用。

7.一种载药纳米粒，其特征在于，以权利要求1所述的谷氨酸修饰的聚乙二醇单硬脂酸酯为修饰剂，聚乳酸为药物储库，药物为疏水性药物。

8.根据权利要求7所述的载药纳米粒，其特征在于：所述的疏水性药物为紫杉烷类、喜树碱类、蒽醌类抗肿瘤药或二氢吡啶类、非甾体抗炎药中的任一物质或其衍生物；基因类药物为DNA或SiRNA药物。